本发明涉及一种荞麦酵素及其制备方法。
背景技术：
：：荞麦(buckwheat)是蓼科类作物，别名乌麦、甜荞、花荞等。荞麦品种以甜荞和苦荞居多。在我国，甜荞主要集中北方地区，而苦荞则主要集中在南方如云南、贵州等地区。荞麦含有丰富的营养成分，如荞麦籽粒中蛋白质含量一般为10％～12％，高于大米、小麦、玉米和高粱；荞麦中含有抗性淀粉，其对糖尿病的控制和治疗发挥着重要的作用；荞麦中脂肪含量约为3％，富含多种脂肪酸，脂肪酸在调节人体生理机能方面有着重要的作用。其中油酸和亚油酸占有绝大部分，它们是合成前列腺和脑神经成分的重要前体物质，同时对人体有害的芥酸在荞麦脂肪中含量极低，食用荞麦可提高食用价值；在矿物质方面，除了常见的矿物质外，还含有叶绿素和维生素p等其他禾谷类粮食所没有的成分。荞麦含有多种功能成分，常见的有肽、黄酮类物质、膳食纤维、荞麦碱、活性蛋白、d-手性肌醇等生物活性成分在降血糖、降血脂、降血压、抗氧化及清除自由基等方面发挥着重要作用。其中黄酮类化合物含量可达3.27％，具有抗氧化的功能，能够防治与机体氧化相关的多种组织损伤。生命的存在方式就是新陈代谢，各种食物在体内不断地进行合成与分解，无时无刻不需要酶(酵素)参与其中，因此没有酵素就没有新陈代谢，也就没有生命。酵素是生命的原动力，是生物细胞中各种酶的统称，因此被称为一种生物催化剂。目前酵素的研究逐步增多，其中黄海等人对黑果腺肋花楸酵素的抗氧化活性进行了相关研究研究；葛瑞宏等人对桂圆酵素的制备以及抗氧化性进行了研究；赵光远等人研究了红枣发酵饮料的抗氧化性，李杰等人对核桃青皮果蔬酵素的组成成分进行了研究，并对酵素的抗氧化活性进行了体外测定。谷物酵素在生产和应用方面依然处于薄弱状态,目前，利用糙米加工的酵素食品已商业化，其研究成果处于保密状态。同时，荞麦酵素在市场上更是罕见，目前没有涉及到荞麦酵素的发酵工艺研究以及荞麦酵素的功能与开发的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种荞麦酵素及其制备方法。本发明所提供的荞麦酵素，为：在酵母作用下对荞麦进行发酵得到的产品。本发明所提供的荞麦酵素通过包括下述步骤的方法制备得到：将荞麦米与红糖混合，加入无菌水，加入蜂蜜，接种酵母，搅拌混匀，封口，发酵，得到含荞麦酵素的体系。上述方法中，所述荞麦米为荞麦经脱壳制得的产品。荞麦米与红糖的质量比为1:1-1:5，具体可为1:3。按荞麦米和无菌水的质量比1:8-1:12(具体可为1:10)加入无菌水。加入的蜂蜜的质量为荞麦米质量的6％-10％，具体可为8％。所述酵母具体可为酿酒高活性干酵母，简写为yd1酵母，购自安琪酵母股份有限公司。接种的酵母的量可为荞麦米质量的3％-11％，具体可为3％。所述发酵的温度为20℃-40℃，具体可为35℃。所述发酵的时间可为12-18天，具体可为15天。上述方法发酵过程中，前3d，每隔8h搅拌一次以放出在制备荞麦酵素的过程中产生的二氧化碳；从第4d开始，每隔1d搅拌一次。所得荞麦酵素的脂肪酶活力可为250.000u/l-269.939u/l，具体可为269.939u/l。上述方法还包括从所述含荞麦酵素的体系中分离得到荞麦酵素的操作。具体可为：将含荞麦酵素的体系离心，取上清液，即得荞麦酵素。所述离心可在高速离心机中进行。所述离心的条件为8000rpm的条件下离心5min。通过上述方法制备得到的荞麦酵素也属于本发明的保护范围。上述荞麦酵素在制备具备下述功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围：1)dpph自由基清除功能；2)abts自由基清除功能；3)ace酶抑制功能；4)抗氧化功能。本发明采用药食两用的资源—荞麦为原料，开发荞麦酵素产品，研究荞麦酵素的生产工艺。通过实验优化荞麦酵素的生产工艺，对制备的荞麦酵素的体外抗氧化、降血糖、降血压功能作用进行深入研究，为荞麦相关产品的研究开发提供新的思路。附图说明图1为不同接种量对荞麦酵素脂肪酶活力的影响。图2为不同红糖添加量对荞麦酵素脂肪酶活力的影响。图3为不同发酵温度对荞麦酵素脂肪酶活力的影响。图4为接种量与培养基(a和b)之间的响应面及等高线图。图5为接种量与发酵温度(a和c)之间的响应面及等高线图。图6为培养基与发酵温度(b和c)之间的响应面及等高线图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的yd1酵母购自安琪酵母股份有限公司，其商品名为酿酒高活性干酵母。实施例11材料与方法1.1材料与仪器荞麦米食品级水城县满全农业开发有限公司；洋槐蜂蜜食品级北京百花峰业科技发展股份公司；yd1酵母食品级安琪酵母股份有限公司；红糖食品级吉林省杞参食品有限公司；脂肪酶食品级北京畅华志诚科技有限公司。bsa224s电子天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；uv765crt紫外可见分光光度计上海精密仪器有限公司；80a旋涡振荡器海门市其林贝尔仪器制造有限公司；台式高速冷冻离心机北京京立离心有限公司；hhs数显恒温水浴锅常州翔天实验仪器厂；ws01恒温恒湿培养箱湖北黄石恒丰医疗器械有限公司；dhp500电热恒温培养箱天津市中环实验电炉有限公司；kq-700e超声波清洗器昆山市超声仪器公司；yxq-ls-sⅱ立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司；sw-cj-1d单人单面垂直净化工作台广州沪瑞明仪器有限公司；hzq-f100全温振荡培养箱苏州培英实验设备有限公司。1.2荞麦酵素制备工艺流程1.2.1工艺流程在无菌条件下除去荞麦米中的霉粒和杂质(荞麦米已脱壳)，将荞麦米和红糖紫外杀菌30min。在已灭菌的玻璃瓶中按荞麦米与红糖的质量比1:1加入已杀菌的红糖，按荞麦米和无菌水的质量比1:10加入无菌水，加入荞麦米质量8％的蜂蜜，接种荞麦米质量3％的yd1酵母，将所有的原料添加完成后，用灭菌的玻璃棒搅拌原料使其充分混匀，然后将玻璃瓶封口并放在暗处，常温发酵15d。前3d，每隔8h用玻璃棒搅拌以放出在制备荞麦酵素的过程中不断产生的二氧化碳；从第4d开始，每隔1d搅拌一次。制备酵素的过程中，所有试验操作都在无菌工作台中进行，以避免其他菌体和杂质的污染。经最佳制备工艺生产出的荞麦酵素的样品经高速离心机在8000rpm的条件下离心5min后，取离心沉淀后的上清液进行抗氧化活性的检测。1.3试验方法1.3.1单因素试验考察酵母接种量(3％、5％、7％、9％、11％)、培养基(红糖添加量1:1、1:2、1:3、1:4、1:5)、发酵温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)三种因素对荞麦酵素脂肪酶活力的影响。1.3.2荞麦酵素活性测定指标与方法脂肪酶可将中性脂肪分解成脂肪酸、甘油三酯、单甘油酯或双甘油酯。胰脂肪酶对三酸甘油酯之2、3位置(即α的位置)的酯键有特定的水解作用。甘油三酯和水制成的乳胶，因其胶束对入射光的吸收及散射而具有乳浊性状，胶束中的甘油三酯在脂肪酶的作用下发生水解，使胶束分裂，散射光或浊度因而减低，减低的速率与脂肪酶活力有关。试验以脂肪酶活力为指标来考察荞麦酵素的活性，通过比色法来测定脂肪酶的活力。采用1cm光径玻璃比色皿，用tris缓冲液调零，将底物缓冲液37℃预温5min以上，一方面，往相应编号的试管中加入50μl样品，吸取已预温好的底物缓冲液2ml冲入试管中，快速混匀，并计时，随后将底物缓冲液迅速倒入比色皿中，在分光光度计420nm处比浊，30s时读取吸光度值a1。另一方面，将此比色液倒入原试管中置37℃准确水浴10min，再迅速倒入比色皿中，10.5min时读取吸光度值a2。计算2次吸光度差值(δa＝a1－a2)计算公式如下：其中：a1为样品加缓冲液反应30s后的吸光值；a2为样品加缓冲液反应10.5min后的吸光值；as为标准管浓度(454μmol/l)的吸光值。1.3.3清除dpph自由基能力的测定参考zielinska等方法先配制dpph的标准溶液然后对样品荞麦酵素的清除dpph自由基的能力进行测定。标准溶液：准确称取20mgdpph，现用现配，用无水乙醇溶解并定容至250ml，避光保存。样品测定：将2ml待测液及2mldpph溶液置于一具塞试管中，摇匀，避光静置30min，以无水乙醇为空白，用紫外分光光度计于517nm测其吸光度ai、2ml样品与2ml无水乙醇混合溶液的吸光度aj、2mldpph与2ml无水乙醇混合溶液吸光度ac，避光测定。每个样品的测定管做三个平行。计算清除率：其中：ac为2ml无水乙醇加2mldpph溶液的吸光值；ai为2ml样品加2mldpph溶液的吸光值；aj为2ml样品加2ml无水乙醇的吸光值。1.3.4清除abts+自由基能力的测定参考karamac等方法并略有改动。配制abts原液：分别准确称取0.1942gabts，0.0312gk2s2o8，以去离子水溶解并定容至50ml容量瓶中，避光保存，使用时稀释100倍将其配制成工作液。样品测定：取0.2ml样品，加入3.8ml工作液混合均匀，暗处静置反应10min，在734nm处测定吸光度。计算清除率：其中：ac为0.2ml去离子水加3.8mlabts溶液的吸光值；ai为0.2ml样品加3.8mlabts溶液的吸光值；aj为0.2ml样品加3.8ml去离子水的吸光值。1.3.5体外抑制ace活性测定根据cushman方法略作修改，将提取液离心，准确移取100μl上清液与100μl5mmol/lhhl溶液混合均匀，立即37℃水浴，保温5min，然后加入0.1u/mlace溶液10μl，于37℃恒温水浴中充分反应30min，加入150μl，1mol/lhcl用于终止反应，再加入1.5ml乙酸乙酯充分振荡混合均匀，在4000rpm离心5min后吸取1ml酯层于另一支试管中，80℃烘干冷却后重新溶于3ml超纯水中，于228nm处测定吸光度。试验重复3次，计算平均值。ace抑制率计算下式所示：其中：a为ace和ace抑制剂同时存在时的吸光度值；b为不加ace抑制剂时的吸光度值(用去离子水代替ace抑制剂)；c为ace与ace抑制剂均不参加反应时的吸光度(用去离子水代替ace抑制剂，并在反应前加hcl终止反应)。1.4box-behken响应面优化设计根据box-behnken试验设计原理，利用design-expertv.8.0.6系统进行数据拟合优化制备荞麦酵素的工艺条件。基于酵母接种量、红糖添加量、发酵温度三种单因素的试验结果，选择接种量(x1)，红糖添加量(x2)，发酵温度(x3)作为响应面优化的试验点，自变量的试验水平分别用－1、0、1为代表，以脂肪酶的活力为响应值，进行响应面分析试验，对试验得出的数据进行回归方差分析。响应面分析设计水平方案见表1。表1box-behnken分析因素和水平设计table1factorsandlevelsofexperimentofresponsesurfaceanalysis2结果与分析2.1不同接种量对荞麦酵素活性的影响图1为不同接种量对荞麦酵素脂肪酶活力的影响。从图1可以看出，当yd1酵母的接种量为5％时，荞麦酵素的脂肪酶活力最高。当yd1酵母的接种量在3％～5％时，荞麦酵素的脂肪酶活力显著提高；当yd1酵母的接种量在5％～7％时，荞麦酵素的脂肪酶活力显著下降；当yd1酵母的接种量在7％～11％时，荞麦酵素的脂肪酶活力随着yd1酵母添加量的增加而下降缓慢趋于平稳。酵母发酵的过程中会发生复杂的生物化学变化，产生大量的二氧化碳和乙醇，这也就是在制备荞麦酵素的过程中需要不断搅拌以放出生成二氧化碳的原因。但是当yd1酵母接种量过大时，容易造成荞麦酵素的脂肪酶失活，从而导致脂肪酶活力降低。因此，生产荞麦酵素的最佳酵母接种量为5％，在此条件下，荞麦酵素的脂肪酶活力为197.172u/l。2.2不同培养基对荞麦酵素活性的影响图2为不同红糖添加量对荞麦酵素脂肪酶活力的影响。从图2可以看出，当红糖的添加量为1:3时，荞麦酵素的脂肪酶活力最高。当红糖的添加量在1:1～1:3时，荞麦酵素的脂肪酶活力随红糖添加量的增加不断升高；当红糖的添加量在1:3～1:5时，荞麦酵素的脂肪酶活力随红糖添加量的增加而逐渐降低。由于培养基中的红糖量发生变化，所以荞麦酵素的脂肪酶活力也随之变化。红糖添加量过多容易使得破坏荞麦酵素的发酵环境，导致脂肪酶活力降低。因此，生产荞麦酵素的最佳红糖添加比例为1:3，在此条件下，荞麦酵素的脂肪酶活力为267.591u/l。2.3不同发酵温度对荞麦酵素活性的影响图3为不同发酵温度对荞麦酵素脂肪酶活力的影响。从图3可以看出，当发酵温度为35℃时，荞麦酵素的脂肪酶活力最高。当发酵温度低于35℃时，荞麦酵素的脂肪酶活力随发酵温度的升高逐渐升高；当温度高于35℃时，荞麦酵素的脂肪酶活力随发酵温度的升高而有所下降。这是因为随着温度的升高，荞麦酵素的脂肪酶活性被激活，但温度过高会使得荞麦酵素及脂肪酶被破坏，从而使其脂肪酶活力降低。酵素属于蛋白质，不耐热，温度过高会破坏酵素的结构，使它丧失功能活性。大部分酵素在50℃开始发生热变形，温度升高，变性速度随之变快，酵素的活性急速降低。因此，生产荞麦酵素的最佳发酵温度为35℃，在此条件下，荞麦酵素的脂肪酶活力为239.423u/l。2.4响应面法优化荞麦酵素制备工艺试验结果分析2.4.1box-behnken试验设计根据酵母接种量、红糖添加量、发酵温度三种单因素对荞麦酵素脂肪酶活力的影响结果，利用design-expertsv.8.06统计软件，以酵母接种量(a)、红糖添加量比例(b)、发酵温度(c)三个因素为自变量，以荞麦酵素的脂肪酶活力为响应值，采用3因素3水平设计中心组合试验，以a(酵母接种量)、b(红糖添加量比例)、c(发酵温度)为自变量，以荞麦酵素的脂肪酶活力y为响应值，响应面设计方案及结果见表2。表2响应面设计方案及结果table2theresponsesurfaceexperimentaldesignandresults2.4.2脂肪酶活力拟合模型的建立与分析利用响应面统计分析软件分析表2的试验数据，获得荞麦酵素的脂肪酶活力(y)与酵母接种量(a)、红糖添加量(b)、发酵温度(c)之间的二次多项式方程为：y＝263.37+5.28a+15.55b+7.92c－18.78ab－19.95ac－26.41bc－80.34a2－64.49b2－49.23c2对脂肪酶活力与酵母接种量、红糖添加量、发酵温度的回归模型和模型相关的系数进行显著性分析，其结果见表3。由表3的方差分析结果可知，一共有17组试验，其中12个析因试验，5个为中心试验，以估计误差。模型培养基和发酵温度的交互项(bc)，接种量二次项(a2)、培养基二次项(b2)、发酵温度二次项(c2)对响应值脂肪酶活力影响极显著(p＜0.0001)；培养基一次项(b)，发酵温度一次项(c)，接种量和培养基的交互项(ab)、接种量和发酵温度的交互项(ac)对响应值脂肪酶活力影响差异显著(p＜0.05)；接种量一次项(a)对响应值脂肪酶活力影响不显著(p＞0.05)。说明酵母接种量、红糖添加量、发酵温度三种试验因素对响应值脂肪酶活力的影响不是简单的线性关系，是二次抛物线的关系。由f值可知，3个因素对荞麦酵素的脂肪酶活力影响的大小顺序为b(培养基)＞c(发酵温度)＞a(接种量)。由表3可以看出模型的决定系数r2＝0.9965，p<0.0001说明整体模型达到极显著水平，失拟项p＝0.2824表示不显著(p>0.05)，表明该模型拟合程度良好，反应出的误差较小，因此用该模型来描述对应关系是合适的。模型的调整确定系数r2abj＝0.9920，表明此回归模型可以解释99.20％响应值的变化。综上说明响应面试验所得的数据有较高的可靠性，可以用该模型来分析预测荞麦酵素脂肪酶活力随试验因素的变化。变异系数(c.v.)是衡量每个平均值偏离情况的参数，该值越小，重复性越好[37]。该模型c.v.为3.44％，说明模型的重复性一般。表3回归模型的方差分析结果table3thevarianceanalysistestresultofregressionmodel注：**表示p＝0.01水平下显著；*表示p＝0.05水平下显著；--表示不显著。2.4.3响应曲面交互作用根据线性回归模型绘制相应的响应面图和等高线图，直观分析3个因素对荞麦酵素的脂肪酶活力的交互影响，结果见图4、图5、图6。从图4～图6可以看出，3个响应曲面均为开口向下的凸形曲面，每个响应面都有极高值，出现在等高线的圆心处。由图可知：接种量与培养基、培养基与发酵温度、接种量与发酵温度的交互作用对荞麦酵素的脂肪酶活力影响显著。图4中接种量与培养基等高线近似圆形，表现为接种量和培养基的交互作用对荞麦酵素的脂肪酶活力影响小，图5中接种量与发酵温度的等高线近似圆形，表现为接种量和发酵温度的交互作用对荞麦酵素的脂肪酶活力影响小；图6中培养基与发酵温度等高线扁平，说明影响荞麦酵素的脂肪酶活力的主要因素是培养基和发酵温度，这和响应面方差分析试验结果基本一致，说明可以由试验数据所得的模型来分析优化荞麦酵素的生产工艺条件，确定最佳制备工艺。2.4.4最佳工艺条件的确定及验证试验利用design-expertv.8.0.6软件包，结合回归模型和响应面图分析得出荞麦酵素最佳制备工艺条件是酵母添加量为5％、红糖添加量为1:3、发酵温度为35℃，在此工艺条件下，荞麦酵素的脂肪酶活力最高，为269.939u/l。为验证试验结果的准确程度，在此制备工艺添加量的条件下进行3次验证试验，得出荞麦酵素的脂肪酶活力为269.807u/l，与理论预测值接近，证明响应面试验设计得到的荞麦酵素的最佳生产工艺的方案可靠，并达到试验过程中的最高脂肪酶活力，对实际生产具有指导意义。3讨论基于三种单因素的试验，以脂肪酶活力为响应值，对制备荞麦酵素的工艺进行响应面法优化。酵母接种量、红糖添加量、发酵温度三种试验因素对响应值脂肪酶活力的影响不是简单的线性关系。由f值可知，3个因素对荞麦酵素的脂肪酶活力影响的大小顺序为b(培养基)＞c(发酵温度)＞a(接种量)。模型的决定系数r2＝0.9965，p<0.0001说明整体模型达到极显著水平，失拟项p＝0.2824表示不显著(p>0.05)，表明该模型拟合程度良好，反应出的误差较小，因此用该模型来描述对应关系是合适的。此回归模型c.v.为3.44％，表明模型的重复性一般。综上说明响应面试验所得的数据有较高的可靠性，可以用该模型来分析预测荞麦酵素脂肪酶活力随试验因素的变化规律。试验结果表明，当yd1酵母的接种量为5％、红糖添加量为1:3、发酵温度为35℃，荞麦酵素的脂肪酶活力为269.939u/l。通过一个月的观察分析验证，荞麦酵素没有出现分层、凝聚、沉淀等现象。由试验结果并通过公式计算分析可得，荞麦酵素的对dpph自由基的清除率为75.56±0.84％，对abts自由基清除能力达到67.49±0.73％。结果分析可知，荞麦酵素对dpph自由基和abts自由基具有较强的清除能力，说明荞麦酵素具有较强的抗氧化活性。探究并优化荞麦酵素的生产工艺，提高脂肪酶活力，为荞麦酵素的综合研究提供理论指导，可应用到具体加工生产中。当前第1页12当前第1页12