本发明属于阿胶制剂
技术领域：
，具体涉及一种阿胶低分子肽、其制备方法及应用。
背景技术：
：阿胶是传统的滋补上品、补血圣药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。首先，新制成的阿胶总带有一些火毒，因而进服新鲜阿胶会使人产生火气亢盛及各种中毒症状；其次，阿胶性滋腻，脾胃虚寒者容易引起消化不良的症状；此外，纯正的阿胶多数具有特殊的腥味，难以被食用者接受，影响阿胶产品的使用及推广。阿胶蒸馏提取物中共检测出23种化合物，去掉不显示气味的化合物后，阿胶中存在16种有特殊气味的化合物。这16种化合物包括2种酯、4种酮、1种醇、1种醛、3种卤代烃、2种芳香族化合物、3种杂环化合物；酯类占41.67％,醇类占3.39％，酸类占0.56％，酮类占21.53％，醛类占2.53％，卤代烃占19.67％，芳香族化合物占3.26％，杂环化合物占7.39％。中药组分的复杂多样性，使通过剔除不良气味化合物来消除中药气味成为难以实现的途径。目前，通常采用添加矫味剂来调整、掩盖中药气味或短暂麻痹味蕾从而察觉不到中药气味。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供阿胶低分子肽，以及该阿胶低分子肽的制备方法和应用。为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种阿胶低分子肽，是由阿胶经蛋白酶水解后去苦制备而成；所述蛋白酶为纳豆激酶和黑曲霉酸性蛋白酶。在上述方案的基础上，阿胶先经纳豆激酶水解，再经黑曲霉酸性蛋白酶水解制备而成。在上述方案的基础上，所述阿胶的蛋白酶水解过程为：(1)阿胶加入6～8倍量的超纯水，化胶，制备成阿胶溶液；(2)调节阿胶溶液ph为8.5，加入纳豆激酶，37℃水解3h，100℃处理15min；(3)调节酶解后的阿胶溶液ph为4.0，加黑曲霉酸性蛋白酶，33℃水解4h，100℃处理15min。在上述方案的基础上，所述纳豆激酶的添加量为0.01～0.1％，所述黑曲霉酸性蛋白酶的添加量为0.3～0.6％。在上述方案的基础上，所述的去苦为将酶解后的阿胶溶液经柱层析洗脱法去除苦味。在上述方案的基础上，柱层析洗脱法为：(1)将酶解后的阿胶溶液过滤，去除杂质；(2)将过滤后的阿胶溶液加入大孔吸附树脂柱中，进行吸附和洗脱；(3)将洗脱液低温减压浓缩至相对密度为1.05～1.12的清膏。在上述方案的基础上，所述大孔吸附树脂柱为da201-c型大孔吸附树脂；所述洗脱液为30～50％的乙醇溶液。上述方法制备的阿胶低分子肽在制备阿胶制品中的应用。一种阿胶低分子肽制剂，是由上述方法制备的阿胶低分子肽与植物提取物制备而成。在上述方案的基础上，所述阿胶低分子肽与植物提取物的质量比为8.5～9.5:0.5～1.5。在上述方案的基础上，所述的植物提取物是陈皮、酸枣的提取物。在上述方案的基础上，所述植物提取物是通过超临界co2流体萃取制备而成。在上述方案的基础上，所述通过超临界co2流体萃取参数为：萃取温度45℃、萃取压力为35mpa、夹带剂为浓度为95％的乙醇溶液，co2体积流量6l/min，循环萃取3h。在上述方案的基础上，所述陈皮和酸枣的质量比为1:4。在上述方案的基础上，所述阿胶低分子肽制剂的制备方法，步骤如下：1)将植物提取物加入阿胶低分子肽中，再加入新橙皮苷二氢查耳酮，混合均匀；2)取水苏糖加入枣醋和适量水搅拌熔化后，过滤；3)将1)、2)中的混合物混合均匀，浓缩至膏状，灭菌，即得。在上述方案的基础上，所述新橙皮苷二氢查耳酮的添加量为0.015～0.025％；所述水苏糖的添加量为0.75～1.2％；所述枣醋的添加量为0.5～1.5％。上述方法制备的阿胶低分子肽制剂在制备阿胶保健品中的应用。一种阿胶糕，其特征在于：由上述方法制备的阿胶低分子肽制剂800～1000g、黑芝麻100～200g、红枣60～80g、枸杞60～80g、核桃80～100g、黄精10～20g、蛹虫草5～10g、木糖醇5～10g、玛咖3～5g制备而成。在上述方案的基础上，所述阿胶糕的制备方法，步骤如下：(1)将阿胶低分子肽制剂放入酒中，浸泡烊化48小时；(2)将烊化开的阿胶放入锅中，文火，顺时针搅拌直至出现“挂旗”；(3)将食材按顺序放入熬制好的阿胶中；(4)均匀搅拌，熬至拉丝；(5)熬制好的阿胶糕置入真空无菌容器中，低温凝固成形，切片封存。纳豆激酶购自武汉大华伟业医药化工有限公司；黑曲霉酸性蛋白酶购自宁夏夏盛实业集团有限公司；枣醋购自开封市恒达饮品有限公司；新橙皮苷二氢查耳酮购自四川吉晟生物医药有限公司；水苏糖购自河南金诚生物科技有限公司。本发明的有益效果本发明方法制备的阿胶低分子肽中低分子肽含量高，生物利用度高；通过大孔吸附树脂吸附，可将低分子肽中的苦味组分，添加的植物提取物不仅能够调节阿胶低分子肽的苦味腥味，与水苏糖、枣醋、新橙皮苷二氢查耳酮搭配，使制备的阿胶低分子肽制剂酸甜适口，无腥苦味，减少人们食用时的反感；此外，还能改善胃肠功能，避免服用阿胶引起的消化不良。本发明采用纳豆激酶和黑曲霉酸性蛋白酶对阿胶进行蛋白酶解，阿胶中丝氨酸的含量高达11％以上，纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，其能够水解丝氨酸，产生大量的小分子多肽；此外，地衣芽孢杆菌蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶相互协作，共同酶解阿胶生成低分子肽。阿胶的低聚制品均具有苦味，本发明采用柱层析洗脱法去除苦味，使其口感易于接受。本发明采用超临界co2流体萃取法提取陈皮、酸枣中的有效成分，不仅能够保护有效成分不被破坏，还能使有效成分提取充分。本发明中的阿胶补血滋阴；陈皮理气健胃、调中、燥湿；酸枣生津止渴、消食止滞；枣醋增进肝脏的血液流通，减少垃圾堆积；此外，陈皮的芳香气味、酸枣和枣醋的酸味还能改善阿胶的腥味；水苏糖能够促进胃肠道益生菌的增殖，调节胃肠环境，其甜味还能改善阿胶的口感；新橙皮苷二氢查耳酮不仅能够抑制苦味，改善口感，其与水苏糖、枣醋搭配，能够对阿胶的矫味起到显著增强的效果。附图说明图1纳豆激酶的用量对阿胶低分子肽产率的影响图2低聚阿胶生物利用度测试。具体实施方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例1一种阿胶低分子肽，制备方法为：(1)树脂预处理：先用95％的的乙醇浸泡24h，去除漂浮在液面上质量较差的颗粒，然后，分别用0.2mol/lhcl和4％的naoh溶液浸泡24h，以除去树脂在合成过程中混杂的各种有机物，最后用去离子水清洗至中性备用；(2)阿胶1000g加入7倍量的超纯水，化胶，制备成阿胶溶液；(3)调节阿胶溶液ph为8.5，加入总重0.06％纳豆激酶，37℃水解3h，100℃处理15min；(4)调节酶解后的阿胶溶液ph为4.0，加入总重0.5％黑曲霉酸性蛋白酶，33℃水解4h，100℃处理15min；(5)将(4)中酶解后的阿胶溶液过滤，去除杂质；(6)在室温下，将过滤后的阿胶溶液加入预处理后的da201-c型大孔吸附树脂中，吸附，并采用50％的乙醇溶液洗脱；(7)将(6)中的洗脱液于低温减压浓缩至相对密度为1.05～1.12的清膏，即得。实施例2一种阿胶低分子肽，制备方法为：(1)树脂预处理：先用95％的的乙醇浸泡24h，去除漂浮在液面上质量较差的颗粒，然后，分别用0.2mol/lhcl和4％的naoh溶液浸泡24h，以除去树脂在合成过程中混杂的各种有机物，最后用去离子水清洗至中性备用；(2)阿胶1000g加入6倍量的超纯水，化胶，制备成阿胶溶液；(3)调节阿胶溶液ph为8.5，加入总重0.01％纳豆激酶，37℃水解3h，100℃处理15min；(4)调节酶解后的阿胶溶液ph为4.0，加入总重0.6％黑曲霉酸性蛋白酶，33℃水解4h，100℃处理15min；(5)将(4)中酶解后的阿胶溶液过滤，去除杂质；(6)在室温下，将过滤后的阿胶溶液加入预处理后的da201-c型大孔吸附树脂中，吸附，并采用40％的乙醇溶液洗脱；(7)将(6)中的洗脱液于低温减压浓缩至相对密度为1.05～1.12的清膏，即得。实施例3一种阿胶低分子肽，制备方法为：(1)树脂预处理：先用95％的的乙醇浸泡24h，去除漂浮在液面上质量较差的颗粒，然后，分别用0.2mol/lhcl和4％的naoh溶液浸泡24h，以除去树脂在合成过程中混杂的各种有机物，最后用去离子水清洗至中性备用；(2)阿胶1000g加入8倍量的超纯水，化胶，制备成阿胶溶液；(3)调节阿胶溶液ph为8.5，加入总重0.1％纳豆激酶，37℃水解3h，100℃处理15min；(4)调节酶解后的阿胶溶液ph为4.0，加入总重0.3％黑曲霉酸性蛋白酶，33℃水解4h，100℃处理15min；(5)将(4)中酶解后的阿胶溶液过滤，去除杂质；(6)在室温下，将过滤后的阿胶溶液加入预处理后的da201-c型大孔吸附树脂中，吸附，并采用30％的乙醇溶液洗脱；(7)将(6)中的洗脱液于低温减压浓缩至相对密度为1.05～1.12的清膏，即得。实施例4一种阿胶低分子肽制剂，是由实施例1的阿胶低分子肽900g、植物提取物100g制备而成。所述植物提取物为陈皮、酸枣重量比为1:4的提取物；所述陈皮、酸枣的有效成分采用超临界co2流体萃取，操作为：将陈皮、酸枣粉碎至40目，投入萃取釜中；超临界co2流体萃取参数为：萃取温度45℃、萃取压力为35mpa、夹带剂为浓度为95％的乙醇溶液，co2体积流量6l/min，循环萃取3h。所述阿胶低分子肽制剂的制备方法为：1)将植物提取物加入阿胶低分子肽中，再加入混合物总重0.02％的新橙皮苷二氢查耳酮，混合均匀；2)取混合物总重1％水苏糖加入混合物总重0.8％的枣醋和适量水搅拌熔化后，过滤；3)将1)、2)中的混合物混合均匀，浓缩至含水量≤30％的膏状，灭菌，即得。实施例5一种阿胶低分子肽制剂，是由实施例1的低聚阿胶950g、植物提取物50g制备而成。所述新橙皮苷二氢查耳酮的添加量为0.015％；所述水苏糖的添加量为0.75％；所述枣醋的添加量为1.5％。其他制备方法同实施例4。实施例6一种阿胶低分子肽制剂，是由实施例1的低聚阿胶850g、植物提取物150g制备而成。所述新橙皮苷二氢查耳酮的添加量为0.025％；所述水苏糖的添加量为1.2％；所述枣醋的添加量为0.5％。其他制备方法同实施例4。实施例7一种阿胶糕，是由实施例4制备的阿胶低分子肽制剂800～1000g、黑芝麻100～200g、红枣60～80g、枸杞60～80g、核桃80～100g、黄精10～20g、蛹虫草5～10g、木糖醇5～10g、玛咖3～5g制备而成。阿胶糕的制备方法，步骤如下：(1)将阿胶低分子肽制剂放入绍兴花雕酒中，浸泡烊化48小时；(2)将烊化开的阿胶放入锅中，文火，顺时针搅拌直至出现“挂旗”；(3)将食材按顺序放入熬制好的阿胶中，其中，最后加入红枣；(4)均匀搅拌，熬至拉丝；(5)熬制好的阿胶糕置入真空无菌容器中，低温凝固成形，切片封存。一、纳豆激酶的用量对阿胶低分子肽产率的影响取未处理的阿胶，加无菌水化胶后，分别分为10等份，调节ph值8.5左右，分别加入0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％的纳豆激酶，于37℃水解3h，100℃处理15min；最后用三氯乙酸结合双缩脲法分别测定添加不同量的纳豆激酶对阿胶溶液中低分子肽产率的影响，结果如图1所示：由图1可知，低分子肽的产率随着纳豆激酶的添加量的增加而上升，最后趋于平稳；当纳豆激酶的添加量为0.06％时，低分子肽的产率达到46.78％，之后低分子肽的产率随纳豆激酶的添加量增加变化不大。二、阿胶低分子肽的生物利用度测试2.1试验分组2.1.1实施例1制备的阿胶低分子肽；2.1.2实施例2制备的阿胶低分子肽；2.1.3实施例3制备的阿胶低分子肽；2.1.4实施例1仅使用纳豆激酶处理的阿胶低分子肽；2.1.5实施例1仅使用黑曲霉酸性蛋白酶处理的阿胶低分子肽；2.1.6未经处理的普通阿胶；取体重相近的健康小鼠120只，雌雄各半，随机分为6组，分别给服2.1.1～2.1.6的阿胶低分子肽(1mg/10g体重)；服用前禁食12h，给药4h后统一进食。分别于给药后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h眼眶取血，采用氨基酸分析方法分析血液中羟脯氨酸含量用以标定样品的生物利用度。结果如图2所示，在生物利用度方面，本发明的阿胶低分子肽的生物利用度是未经处理的普通阿胶的3.2～3.8倍；单一蛋白酶处理的阿胶不如两种蛋白酶处理的阿胶低分子肽的生物利用度高，其中实施例1的阿胶低分子肽生物利用度最高。三、植物有效成分提取方法研究3.1试验分组方法1：将陈皮20g、酸枣80g粉碎至40目，采用本发明实施例4的超临界co2流体萃取。超临界co2流体萃取参数为：萃取温度45℃、萃取压力为35mpa、夹带剂为浓度为95％的乙醇溶液，co2体积流量6l/min，循环萃取3h。方法2：1)将陈皮20g、酸枣80g加入6～8倍量水，浸泡1h，加热，小火微沸1h，滤过；2)滤渣加6～8倍量水，加热，小火微沸1h，滤过，合并两次滤液，浓缩至相对密度为1.05～1.12的清膏。3.2指标测定采用高效液相色谱法，分别测定不同提取方法的提取物中橙皮苷、川陈皮素、总皂苷和斯皮诺素的含量。橙皮苷、川陈皮素含量测定：色谱柱：agilentzorbaxsb-c18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈(b)-0.5％醋酸水(a)进行梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长：283nm(橙皮苷)，330nm(川陈皮素)；柱温：25℃；进样量10μl。总皂苷含量测定：色谱柱系为sinochromods-bp(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为乙腈-水(40：60)，流速为1.0ml-min-1，进样量为20μl，柱温：25℃，检测波长：208nm。斯皮诺素含量测定：采用agilentc18柱(4.6×250mm5μm),乙腈-水(20:80)为流动相洗脱,流速为1.0ml/min,检测波长为335nm。3.3试验结果提取样品中橙皮苷、川陈皮素、总皂苷和斯皮诺素的含量如表1所示：表1不同提取方法对橙皮苷、川陈皮素、总皂苷和斯皮诺素含量的影响由表1可知，方法1能够有效的提取陈皮和酸枣中的有效活性成分，方法1是通过超临界co2流体萃取，不仅能够使有效活性成分充分释放出来，且能保护有效成分不被破坏。四、矫味效果的研究4.1试验分组4.1.1实施例4制备的阿胶低分子肽制剂；4.1.2实施例5制备的阿胶低分子肽制剂；4.1.3实施例6制备的阿胶低分子肽制剂；4.1.4实施例4不添加枣醋制备的阿胶低分子肽制剂；4.1.5实施例4不添加水苏糖制备的阿胶低分子肽制剂；4.1.6实施例4不添加新橙皮苷二氢查耳酮制备的阿胶低分子肽制剂；4.1.7未经处理的阿胶。4.2试验设计选择10名年龄在20～28岁之间的志愿者，5名男性，5名女性，不抽烟、不嗜酒，无感官方面的缺陷，身体健康，无过敏史。分别对4.1中的阿胶低分子肽制剂进行品尝，品尝完一种后，漱口，再品尝另一种。将阿胶低分子肽制剂的口味分为腥味：很腥、腥、微腥味、无腥味；酸味：很酸、酸、微酸、不酸；甜味：很甜、甜、微甜、不甜；苦味：很苦、苦、微苦、不苦；志愿者综合对上述4种口味进行描述。结果如表2所示。表2阿胶制剂的矫味效果由表2可知：本发明实施例4～6制备的阿胶低分子肽制剂无腥味，无苦味；其中实施例4制备的阿胶低分子肽制剂酸甜适中。五、阿胶制剂对胃肠功能的影响5.1试验分组5.1.1实施例1制备的阿胶低分子肽；5.1.2实施例4制备的阿胶低分子肽制剂；5.1.3未经处理的阿胶；5.1.4空白对照组。取体重相近的健康小鼠80只，雌雄各半，随机分为4组；其中，1～3组分别给服5.1.1～5.1.3的阿胶，给服量为1mg/10g体重，每日一次，连续14d；第4组不服用，正常饮食；其他试验条件一致。第14d禁食不禁水12h，在给服阿胶2h后，灌胃0.1％(0.001g/ml)的甲基橙溶液0.2ml，15min后，将小鼠脱臼处死，剖腹取胃，置于烧杯中，加入10ml蒸馏水，用手术剪沿胃大弯剪开，将胃内容物洗于蒸馏水中，用5％nahco3调节ph6.0～6.5，溶液5000r/min离心10min。上清在420nm处比色；测定吸光度。另0.1％的甲基橙溶液0.2ml，用蒸馏水定容至10ml，摇匀后测定吸光度，作为基数甲基橙吸光度。胃排空率按以下公式计算：胃排空率(％)＝(a1-a2)/a1×100式中a1为基数甲基橙吸光度，a2为胃中残留甲基橙吸光度。第7d给服阿胶后，收集小鼠粪便冷冻保存，第14天收集粪便后处死小鼠，取出直肠内容物无菌操作，放入带有玻璃珠的三角瓶中，称重后以1∶9(w/w)的比例加入无菌生理盐水，依次以10倍梯度稀释，选择适宜的稀释度，分别涂布在乳酸菌选择性培养基(mrs)、伊红美蓝琼脂培养基(emb)，每个梯度做3组重复，于37℃恒温培养箱分别培养72、24h后计算菌落数，并以用1g肠道内容物中细菌个数的对数[lg(cfu/g)]表示直肠内容物中主要微生物数量。表3阿胶制剂对胃肠功能的影响胃排空率(％)乳酸杆菌大肠杆菌实施例1制备的阿胶低分子肽59.36±5.477.12±0.657.75±0.42实施例4制备的阿胶低分子肽制剂62.24±7.737.47±0.587.18±0.45未经处理的阿胶；53.95±6.856.43±0.538.24±0.52空白对照组58.49±7.676.92±0.597.94±0.50由表3可知，本发明的实施例4的阿胶低分子肽制剂不仅不会影响胃肠功能，引起消化不良症状，而且还能进一步改善胃肠功能。六、阿胶糕的功效随访50名志愿贫血患者服用实施例7的阿胶糕的功效，纳入标准：受试者在进入研究时，晨起空腹抽血进行指标检测，其中70g/l≤hb＜100g/l，年龄25～40岁，中医辩证分型为“气血两虚证”，无过敏史，为纳入标准。每名志愿者每日食用实施例7的阿胶糕2片，分别于使用前、食用后第4周和第14周抽血检测血液hb、si和sf生化指标。若hb≥120g/l为治愈，可终止治疗。结果如表4所示：表4阿胶糕的功效结果其中，对照组阿胶糕，是由未经本发明方法处理的阿胶800～1000g、黑芝麻100～200g、红枣60～80g、枸杞60～80g、核桃80～100g、黄精10～20g、蛹虫草5～10g、木糖醇5～10g、玛咖3～5g制备而成。由表4可知，本发明实施例7的阿胶糕的补血功效优于对照组，而且食用本发明阿胶糕的贫血患者在食用期间未出现任何肠胃不适、消化不良的症状，对照组有5例出现消化不良症状；可见，本发明的阿胶糕不仅具有良好的补血功效，而且也不会产生任何副作用，食用安全。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页12