一种复合酶解-发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种复合酶解-发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法。
背景技术：
：现有发酵松花粉的方法通常是将松花粉破碎后直接在发酵罐内发酵，比如公开号为cn110037271a，名称为“一种发酵松花粉的制备方法”、公开号为cn109588598a“一种花粉的双歧杆菌发酵方法及其发酵产物的应用”、公开号为cn103141732a“一种利用益生菌进行松花粉发酵的新工艺”、公开号为cn109806190a“一种松花粉的发酵提取工艺”、公开号为cn104938965b“用凝结芽孢杆菌发酵的方法及其发酵产物和应用”等的中国专利申请。但在实际生产中，经常遇到由于松花粉破壁后易氧化而贮存时间较短的问题，或者因为有的人消化松花粉较困难而利用甚少的问题，或者因为过敏而无法食用松花粉产品的问题，其产品不能令一部分人满意。技术实现要素：本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种复合酶解-发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法，有效提高了松花粉提取物的提取率，且有效解决了松花粉或松花粉提取物过敏的问题；此外，本发明方法还有效提高了松花粉提取物的抗氧化活性，并有利于黄酮、皂苷的富集。具体技术方案如下：一种复合酶解-发酵偶联的发酵松花粉提取物的制备方法，包括如下步骤：(1)将破壁松花粉与水混合，使用纤维素酶和果胶酶进行酶解处理；(2)进行发酵环境调节，并灭菌；(3)接种菌种，发酵5-7天；(4)将步骤(3)获得的发酵液分离，得上清液与沉淀；(5)将步骤(4)获得的沉淀进行热回流提取，分离得上清液；(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，浓缩干燥得发酵松花粉提取物。松花粉外层存在细胞壁，异常坚硬，耐酸、耐碱且抗生物分解，由于细胞壁的“保护”作用，无论是直接发酵还是物理方式破碎后发酵，都无法使松花粉内的多种化合物充分释放使之充分发酵，造成发酵产品效果不如预期。此外，松花粉中的多糖类物质异常丰富，单纯的发酵难以使其彻底脱敏。本发明在发酵前使用纤维素酶和果胶酶(具体为酸性纤维素酶和酸性果胶酶)对松花粉进行了酶解，解决了上述技术问题，提高了发酵松花粉提取物的得率，显著降低了发酵松花粉提取物的致敏性，且显著提高了发酵松花粉的抗氧化活性。此外，还降低了发酵液的黏度，有助于发酵效率的提升和产品的分离澄清。进一步，步骤(1)中，所述的纤维素酶为酸性纤维素酶，所述的果胶酶为酸性果胶酶。再进一步，步骤(1)的工作条件为：破壁松花粉与水的质量比为1：(7-12)，酸性纤维素酶与酸性果胶酶的用量均为以破壁松花粉质量计0.08wt％-0.15wt％，调节ph至4.8-5.0，50-55℃酶解1.5-3h。ph值的调节可通过盐酸或氢氧化钠实现。进一步，步骤(2)的工作条件为：酶解完毕后向酶解产物中加入葡萄糖、蛋白胨与乳清蛋白粉,调节ph至7.0-7.5，进行灭菌处理；其中，葡萄糖的用量为破壁松花粉质量的0.06-0.1倍,蛋白胨的用量为破壁松花粉质量的0.03-0.05倍，乳清蛋白粉的用量为破壁松花粉质量的0.01-0.025倍。其中，所述的灭菌优选为80℃以上高温灭菌。进一步，步骤(3)中接种的菌种为植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。本发明在研发中将上述三种菌的混合与接种单一益生菌株进行对比。所述的单一益生菌株包括纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、啤酒酵母、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。实验结果表明，在单位菌活相同的前提下，本发明的混合菌显著获得了更高的提取物得率和更好的脱敏效果。再进一步，步骤(3)的工作条件为：植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计3wt％-4wt％，搅拌均匀，35-37℃静置发酵5-7天，每8-24h搅拌一次,使物料混匀。上述发酵结束时，发酵液的ph值≤3.0，还原糖为0.25％-0.35％。进一步，步骤(5)中所述的热回流提取的条件为沸水回流提取20-40min。热回流中水的用量优选为破壁松花粉质量的7-12倍。进一步，所述的破壁松花粉为松花粉8000-12000rpm超微粉碎10-15min获得。上述超微粉碎无法将松花粉完全破壁。如完全通过物理方法破壁，其能耗非常高，成本昂贵。进一步，步骤(4)与步骤(5)中，所述的分离为离心分离。进一步，步骤(6)中所述的干燥为喷雾干燥；优选在喷雾干燥前进行减压浓缩。本发明的有益效果如下：(1)将松花粉用于发酵中，在较低的发酵温度下，有利于保留风味物质，经发酵的辅助作用，充分浸提出其风味及营养成分，获得目标产品营养和功能增加的效果。(2)将松花粉经热水浸泡后加入发酵罐，可缩短前发酵的周期，提高设备利用率，并有利于高效率的浸提出花粉中的有效成分。(3)松花粉经复合酶水解，由于发酵醪的营养更为丰富，发酵微生物的生长繁殖更加旺盛，既可以在较低的温度下发酵，又有利于发酵更为彻底。另一方面，由于发酵微生物的代谢作用，可以将一些呈结合态而较难溶解的成分游离及溶解于发酵醪。(4)实验结果表明，本发明的工艺能显著提高发酵松花粉提取物的产率、解决松花粉制品的致敏问题、提高其抗氧化效果。附图说明图1为实验3中dpph自由基清除率对比图。具体实施方式以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中使用的酶制剂为：酸性纤维素酶(潍坊苏科汉生物工程有限公司)酶活15万u/g。酸性果胶酶(潍坊苏科汉生物工程有限公司)酶活4万u/g。实施例中使用的菌种均购买自齐鲁工业大学菌种库，经传代及种子液培养制备,最终用于实施方式的菌悬液的菌活为2*1010-3*1010cfu/g。菌种的传代及种子液培养制备方法如下。(1)菌种传代与保存：使用传代培养基，每个培养皿15ml，斜面(试管、茄瓶等)装液至倾斜后下液面刚好没过底端，上液面至瓶口三分之一处为佳。划线接种，37℃培养，24小时左右可见菌体生长。(2)菌种活化与复壮：使用传代培养基，37℃培养，由于活化培养慢于传代培养，一般24小时可见明显菌落。活化后的菌株用传代培养基进行复壮。一般2～3次传代后即可获得活力较旺盛的纯种菌株。(3)种子液(1l蓝盖瓶)培养：使用种子液体培养基，1l瓶每瓶装液0.9～1l，在超净台用接种环从固体传代培养基(平板、斜面)分别刮取植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌菌落，转接入种子培养瓶中。培养条件：37℃培养24小时左右。实施例1(1)松花粉9000rpm超微粉碎15min，得破壁松花粉，测得破壁率85％；将破壁松花粉投入发酵罐，按投入破壁松花粉质量的9倍向罐内加水，开搅拌；向发酵罐中投入以破壁松花粉质量计0.1wt％的酸性纤维素酶和0.1wt％的酸性果胶酶，用盐酸或氢氧化钠调节ph至5.0；升温至50℃并保温，酶解处理2h；(2)酶解完毕后向罐中加入葡萄糖，用量为破壁松花粉质量的0.1倍；加入蛋白胨，用量为破壁松花粉质量的0.05倍；加入乳清蛋白粉，用量为破壁松花粉质量的0.025倍；用氢氧化钠调节ph至7.5；85℃保温30min灭菌处理；(3)灭菌结束后将发酵罐降温至37℃，接种菌种(菌悬液)，植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计3.3wt％,搅拌均匀,37℃静置培养7天，每12h搅拌一次，使物料混匀；每日取样监测ph和还原糖，发酵结束时，发酵液的ph值为2.8，还原糖为0.25％；(4)将步骤(3)获得的发酵液4000rpm离心10min，得上清液与沉淀；(5)向步骤(4)获得的沉淀中加入以破壁松花粉质量计9倍的水，进行沸水回流提取30min；冷却至40℃以下后，4000rpm离心10min，分离上清液；(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，减压浓缩后喷雾干燥得发酵松花粉提取物。实施例2(1)松花粉9000rpm超微粉碎15min，得破壁松花粉，测得破壁率85％；将破壁松花粉投入发酵罐，按投入破壁松花粉质量的12倍向罐内加水，开搅拌；向发酵罐中投入以破壁松花粉质量计0.15wt％的酸性纤维素酶和0.15wt％的酸性果胶酶，用盐酸或氢氧化钠调节ph至5.0；升温至55℃并保温，酶解处理2h；(2)酶解完毕后向罐中加入葡萄糖，用量为破壁松花粉质量的0.08倍；加入蛋白胨，用量为破壁松花粉质量的0.04倍；加入乳清蛋白粉，用量为破壁松花粉质量的0.015倍；用氢氧化钠调节ph至7.5；85℃保温30min灭菌处理；(3)灭菌结束后将发酵罐降温至37℃，接种菌种，植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计3.0wt％,搅拌均匀,35℃静置培养5天，每8h搅拌一次，使物料混匀；每日取样监测ph和还原糖，发酵结束时，发酵液的ph值为3.0，还原糖为0.3％；(4)将步骤(3)获得的发酵液4000rpm离心10min，得上清液与沉淀；(5)向步骤(4)获得的沉淀中加入以破壁松花粉质量计8倍的水，进行沸水回流提取30min；冷却至40℃以下后，4000rpm离心10min，分离上清液；(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，减压浓缩后喷雾干燥得发酵松花粉提取物。实施例3(1)松花粉9000rpm超微粉碎15min，得破壁松花粉，测得破壁率85％；将破壁松花粉投入发酵罐，按投入破壁松花粉质量的7倍向罐内加水，开搅拌；向发酵罐中投入以破壁松花粉质量计0.08wt％的酸性纤维素酶和0.08wt％的酸性果胶酶，用盐酸或氢氧化钠调节ph至5.0；升温至50℃并保温，酶解处理2h；(2)酶解完毕后向罐中加入葡萄糖，用量为破壁松花粉质量的0.1倍；加入蛋白胨，用量为破壁松花粉质量的0.05倍；加入乳清蛋白粉，用量为破壁松花粉质量的0.025倍；用氢氧化钠调节ph至7.5；85℃保温30min灭菌处理；(3)灭菌结束后将发酵罐降温至37℃，接种菌种，植物乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的接种量均为以破壁松花粉质量计4wt％,搅拌均匀,37℃静置培养6天，每24h搅拌一次，使物料混匀；每日取样监测ph和还原糖，发酵结束时，发酵液的ph值为2.5，还原糖为0.28％；(4)将步骤(3)获得的发酵液4000rpm离心10min，得上清液与沉淀；(5)向步骤(4)获得的沉淀中加入以破壁松花粉质量计10倍的水，进行沸水回流提取30min；冷却至40℃以下后，4000rpm离心10min，分离上清液；(6)将步骤(4)与步骤(5)获得的上清液合并，减压浓缩后喷雾干燥得发酵松花粉提取物。对比例1与实施例1的区别在于：步骤(1)的酶解中，仅使用酸性纤维素酶，不使用酸性果胶酶，酸性纤维素酶的用量与实施例1相同；其余技术特征与实施例1相同。对比例2与实施例1的区别在于，不对松花粉进行酶解，直接调节发酵环境、灭菌并发酵。对比例3与实施例1的区别在于，步骤(1)中，通过超微粉碎制备破壁率100％的松花粉；酶解中，仅使用酸性果胶酶，酸性果胶酶的用量与实施例1相同；其余技术特征与实施例1相同。实验1比较实施例1和对比例1-3获得的发酵松花粉提取物的产率、黄酮、总皂苷含量的影响，检测结果见表1。产率＝发酵松花粉提取物质量/破壁松花粉质量×100％表1：松花粉发酵提取物功能性成分检测实验2比较实施例1和对比例1-3获得的发酵松花粉提取物以大鼠嗜碱性白血病细胞模型(rbl)进行过敏性评价，比较复合酶解-发酵偶联方法与直接发酵方法对花粉致敏性的影响。通过检测rbl细胞脱颗粒的生物标志物——组胺和氨基己糖苷酶来评价致敏性。检测结果见表2。表2：rblcell致敏性分析阴性对照阳性对照实施例1对比例1对比例2对比例3脱颗粒效率％01000.64.74.12.2实验3通过体外抗氧化检测(dpph自由基清除实验)分析实施例1和对比例1-3获得的发酵松花粉提取物的抗氧化效果。取dpph自由基1mg，与24ml无水乙醇充分混合震荡，配制得到深紫红色的dpph自由基母液，取2ml母液分别与实施例1和对比例1-3样品混合反应，用分光光度计在517nm处检测吸光度。dpph自由基清除计算公式为：dpph自由基清除率％＝(a对照-a样品)/a对照*100式中：a对照为未加样品的dpph自由基吸光度；a样品为加入样品反应后的dpph自由基吸光度。实验结果见图1。结果分析：实施例1条件所得发酵松花粉提取物在产率、黄酮和总皂苷含量、致敏性降低和抗氧化能力方面均明显优于对比例1-3。说明，本发明的工艺能显著提高发酵松花粉提取物的产率、达到功效富集、解决松花粉制品的致敏问题、提高其抗氧化效果。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12