本发明涉及饲料添加剂
技术领域：
，特别涉及提高动物机体免疫功能的生物制剂及制备方法。
背景技术：
：自20世纪以来，多种抗生素和激素等被广泛用作饲料添加剂，虽然在畜禽生产与疫病防治及促进动物生长等方面发挥了不可或缺的作用，但由于长期使用及滥用，使抗生素的使用存在越来越多的问题，主要表现在：药物残留和毒性；喂养的家畜中大量应用广谱抗生素造成细菌快速耐药；长期使用抗生素扰乱了畜禽体内微生物系统中微生物群落相互制约的格局，继而破坏其体内的微生态平衡，导致消化功能紊乱，引起各种消化道疾病；降低动物的免疫功能。为了克服这些弊端，世界各国的科研工作者不断努力以寻求和开发一种安全、无毒副作用、无残留，既能促进动物生长，又能防治畜禽疾病、替代抗生素的新型添加剂。动物微生态制剂(微生物饲料添加剂)正是基于饲用抗生素的安全性问题应运而生，它不仅能够对致病菌起抑制作用、对畜禽产品无毒和促进生长，可改善畜禽产品的品质和风味，有利于生态环境和出口贸易，是未来绿色饲料的最佳解决方案。关于微生态制剂所用菌株的种类，1989年美国食品与药物管理局(fda)和饲料协会(aafco)发布了可以直接饲喂动物的安全菌株43种。1999年6月我国农业部公布的第105号公告所允许使用的饲料添加剂品种目录中，饲料级微生物添加剂菌种仅有12种。2005年版(修订318公告目录)饲料添加剂品种目录允许使用的微生物菌种增加到18种。2013年版饲料添加剂品种目录允许使用的微生物菌种添加到35种，包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种(原名：乳酸乳杆菌)、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种(原名：保加利亚乳杆菌)、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌(原名：侧孢芽孢杆菌)、红法夫酵母等。丁酸梭菌于2009年7月列入《监测期内的新饲料和新饲料添加剂品种目录》。丁酸梭菌细胞杆状，0.6-1.2×3.0-7.0μm，单个成对、短链、偶见长丝状菌体。以周生鞭毛运动，孢子卵圆，偏心到次端生，无孢子外壁和附属丝。是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，在老培养物中变成阴性。在营养洋菜上生长差或不生长；在葡萄糖洋菜上生长良好。表面菌落园到稍不规则，直径1-3μm，稍凸，白色到奶油色，表面有光泽到无光泽。在肉汤中生长差或不生长；在含有可发酵碳水化合物的肉汤培养基中生长良好并产气。丁酸梭菌是人和动物肠道的正常菌群，也广泛存在于土壤、奶酪和天然酸奶中。丁酸梭菌作为一种有益微生物已经在仔猪和仔鸡等畜牧养殖中得到成功运用并且收到良好效果。研究表明：丁酸梭菌能调节肠道微生态平衡，抑制肠道致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌的生长，同时显著促进肠道有益菌嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌等的生长。增强机体免疫力，促进动物生长，减少抗生素用量，提高经济效益。产生益生物质丁酸，是结肠上皮细胞的能量代谢和正常生长的主要营养物质，同时丁酸梭菌能产生乙酸、丙酸等短链脂肪酸，分解胺类、吲哚类硫化氢等有害物质，提高健康质量和改善环境。丁酸梭菌作为一种安全可靠、绿色环保的益生菌越来越受到人们的关注，并被广泛应用于水质净化、水产养殖、饲料添加剂等领域。为此，提出提高动物机体免疫功能的生物制剂及制备方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供提高动物机体免疫功能的生物制剂及制备方法，本发明使用的种子培养基和发酵培养基成分简单，成本低廉，适合于工厂的规模化生产。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：提高动物机体免疫功能的生物制剂的制备方法，包括下列步骤：(1)对丁酸梭菌菌种进行活化处理；(2)将经过活化处理的丁酸梭菌菌种转接到装有种子培养基的发酵罐中并在32～34℃下培养18～20h得到一级种子液，所述一级种子液中所述丁酸梭菌菌种占8vt％，随后将所述一级种子液转接至装有发酵培养基的种子罐中并在32～34℃下培养18～20h得到二级种子液，所述二级种子液中所述一级种子液占8vt％；(3)将所述二级种子液按照8％的接种量转接装有发酵培养基的发酵罐中得到培养液，将所述培养液在32～34℃以及0.05～0.06mpa下培养18～20h，培养过程中通过添加ph调节剂将所述培养液的ph值控制在6.0至6.5，间歇式搅拌，当镜检芽孢形成率10％以上，得到发酵液；(4)发酵液浓缩，利用碟片式离心机将发酵液5倍浓缩，得到发酵浓缩液；(5)冷冻干燥，在发酵浓缩液中添加载体保护剂并进行冷冻干燥，所述载体保护剂的添加量为20g/l，分五个阶段进行冷冻干燥处理，第一阶段在零下40℃的条件下冷冻4h，第二阶段在零下10～40℃的条件下冷冻10h，第三阶段在零度～零下10℃的条件下冷冻8h，第四阶段在零度～零上30℃的条件下干燥16h，第五阶段在零上30～零上32℃的条件下干燥3h，得到丁酸梭菌生物制剂；其中，所述种子培养基包括10g/l～15g/l的葡萄糖、8g/l～10g/l的蛋白胨、3g/l～5g/l的牛肉膏、12g/l～15g/l的琼脂、1g/l～3g/l的酵母粉、0.4g/l～0.6g/l的磷酸二氢钾和0.2g/l～0.3g/l的碳酸钙，所述种子培养基的ph值为7.1到7.2；所述发酵培养基包括20g/l～25g/l的玉米淀粉、3g/l～6g/l的酵母膏、1g/l～3g/l的蛋白胨、1g/l～2g/l的牛肉膏、0.2g/l～0.5g/l的磷酸二氢钾、0.5g/l～1g/l的碳酸氢钠、0.1g/l～0.2g/l的硫酸锰和0.05g/l～0.1g/l的氯化钙，所述发酵培养基的ph值为7.1到7.2。具体的，所述(5)步骤中载体保护剂包括3g/l～5g/l的海藻糖、6g/l～8g/l的大豆蛋白粉和4g/l～8g/l的脱脂奶粉。具体的，所述(3)步骤中ph调节剂为10wt％氢氧化钾溶液。具体的，所述发酵培养基按比例配好后在121℃灭菌30min，灭菌结束后，降温并同时通入氮气保压，控制发酵罐中的罐压为0.05～0.06mpa，当温度降低到培养温度时将经加热活化后的二级种子液接入。具体的，所述(5)步骤中丁酸梭菌生物制剂的含水率≤5％。具体的，所述(3)步骤中的间歇式搅拌的具体步骤为：每2h搅拌1～2min，控制搅拌速度为75r/min～100r/min。提高动物机体免疫功能的生物制剂，该丁酸梭菌生物制剂通过前述的制备方法制成。本发明的有益效果为：(1)本发明的丁酸梭菌生物制剂在冷冻干燥的阶段添加了载体保护剂，能够有效降低在冷冻干燥过程中对丁酸梭菌生物制剂中活氧菌的消耗，同时可有效改善丁酸梭菌生物制剂的储存有效期和存活率，并且该载体保护剂的原料成本较低；(2)本发明使用的种子培养基和发酵培养基成分简单，成本低廉，适合于工厂的规模化生产；(3)本发明的丁酸梭菌生物制剂能调节肠道微生态平衡，抑制肠道致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的生长，可预防猪由大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等引起的腹泻，增强机体免疫力，促进动物增重，提高经济效益。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1提高动物机体免疫功能的生物制剂的制备方法，包括下列步骤：(1)对丁酸梭菌菌种进行活化处理：将丁酸梭菌菌种接入到种子培养基中，并在恒温培养箱32～34℃下培养生长18～20h以实现丁酸梭菌菌种的活化处理；(2)将经过活化处理的丁酸梭菌菌种按照8％的接种量转接到装有种子培养基的发酵罐中并在32～34℃下培养18～20h以达到对数生长期，从而得到一级种子液；随后将一级种子液按照8％的接种量转接至装有种子培养基的发酵罐中并在32～34℃下再培养18～20h以达到对数生长期，从而得到二级种子液，一级种子液和二级种子液的培养终点均通过镜检来确定；(3)将所述二级种子液按照8％的接种量转接装有发酵培养基的发酵罐中得到培养液，其中，所述发酵培养基按比例配好后在121℃灭菌30min，灭菌结束后，降温并同时通入氮气保压，控制发酵罐中的罐压为0.05～0.06mpa，当温度降低到培养温度时将经加热活化后的二级种子液接入；将所述培养液在32～34℃以及0.05～0.06mpa下培养18～20h，培养过程中通过在线监控并自动添加作为ph调节剂的10wt％氢氧化钾溶液的方式将培养液的ph值控制在6.0至6.5，每2h搅拌1～2min，控制搅拌速度为75r/min～100r/min，当镜检芽孢形成率10％以上，得到发酵液；(4)发酵液浓缩，利用碟片式离心机将发酵液5倍浓缩，得到发酵浓缩液；(5)冷冻干燥，在发酵浓缩液中添加载体保护剂并进行冷冻干燥，所述载体保护剂的添加量为20g/l，其中，载体保护剂包括3g/l～5g/l的海藻糖、6g/l～8g/l的大豆蛋白粉和4g/l～8g/l的脱脂奶粉；分五个阶段进行冷冻干燥处理，第一阶段在零下40℃的条件下冷冻4h，第二阶段在零下10～40℃的条件下冷冻10h，第三阶段在零度～零下10℃的条件下冷冻8h，第四阶段在零度～零上30℃的条件下干燥16h，第五阶段在零上30～零上32℃的条件下干燥3h，得到丁酸梭菌生物制剂，丁酸梭菌生物制剂的含水率≤5％；其中，所述种子培养基包括10g/l的葡萄糖、8g/l的蛋白胨、3g/l的牛肉膏、12g/l的琼脂、1g/l的酵母粉、0.4g/l的磷酸二氢钾和0.2g/l的碳酸钙，所述种子培养基的ph值为7.1到7.2；所述发酵培养基包括20g/l的玉米淀粉、3g/l的酵母膏、1g/l的蛋白胨、1g/l的牛肉膏、0.2g/l的磷酸二氢钾、0.5g/l的碳酸氢钠、0.1g/l的硫酸锰和0.05g/l的氯化钙，所述发酵培养基的ph值为7.1到7.2。实施例2本实施例中的提高动物机体免疫功能的生物制剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，所述种子培养基包括15g/l的葡萄糖、10g/l的蛋白胨、5g/l的牛肉膏、15g/l的琼脂、3g/l的酵母粉、0.6g/l的磷酸二氢钾和0.3g/l的碳酸钙，所述种子培养基的ph值为7.1到7.2；所述发酵培养基包括25g/l的玉米淀粉、6g/l的酵母膏、3g/l的蛋白胨、2g/l的牛肉膏、0.5g/l的磷酸二氢钾、1g/l的碳酸氢钠、0.2g/l的硫酸锰和0.1g/l的氯化钙，所述发酵培养基的ph值为7.1到7.2。实施例3本实施例中的提高动物机体免疫功能的生物制剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，所述种子培养基包括13g/l的葡萄糖、9g/l的蛋白胨、4g/l的牛肉膏、14g/l的琼脂、2g/l的酵母粉、0.5g/l的磷酸二氢钾和0.25g/l的碳酸钙，所述种子培养基的ph值为7.1到7.2；所述发酵培养基包括23g/l的玉米淀粉、5g/l的酵母膏、2g/l的蛋白胨、1.8g/l的牛肉膏、0.4g/l的磷酸二氢钾、0.7g/l的碳酸氢钠、0.15g/l的硫酸锰和0.06g/l的氯化钙，所述发酵培养基的ph值为7.1到7.2。对比例1本对比例中的提高动物机体免疫功能的生物制剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，所述种子培养基包括9g/l的葡萄糖、7g/l的蛋白胨、2g/l的牛肉膏、10g/l的琼脂、0.5g/l的酵母粉、0.3g/l的磷酸二氢钾和0.1g/l的碳酸钙，所述种子培养基的ph值为7.1到7.2；所述发酵培养基包括18g/l的玉米淀粉、2g/l的酵母膏、0.5g/l的蛋白胨、0.5g/l的牛肉膏、0.1g/l的磷酸二氢钾、0.4g/l的碳酸氢钠、0.05g/l的硫酸锰和0.03g/l的氯化钙，所述发酵培养基的ph值为7.1到7.2。对比例2本对比例中的提高动物机体免疫功能的生物制剂的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，所述种子培养基包括16g/l的葡萄糖、11g/l的蛋白胨、6g/l的牛肉膏、17g/l的琼脂、5g/l的酵母粉、0.8g/l的磷酸二氢钾和0.4g/l的碳酸钙，所述种子培养基的ph值为7.1到7.2；所述发酵培养基包括30g/l的玉米淀粉、8g/l的酵母膏、5g/l的蛋白胨、3g/l的牛肉膏、0.6g/l的磷酸二氢钾、2g/l的碳酸氢钠、0.3g/l的硫酸锰和0.2g/l的氯化钙，所述发酵培养基的ph值为7.1到7.2。对比例3本对比例中采用丁酸梭菌菌种标准品(丁酸梭菌菌种)进行对照实验，丁酸梭菌菌种标准品为9014-01-1，其有效物质含量：100％，采购至潍坊瑞辰生物科技有限公司。丁酸梭菌体外抑菌试验将丁酸梭菌生物制剂进行平板培养，接种到液体培养基中，32～34℃厌氧条件下培养18～20h以大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌为靶标菌，采用管碟法测定丁酸梭菌生物制剂的抑菌活性，结果见表1。表1丁酸梭菌体外抑菌试验效果由表1可知，结果表明，丁酸梭菌生物制剂对大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌都具有很好的抑菌活性。丁酸梭菌生物制剂对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响试验动物：30±1日龄杜×大×长三元仔猪试验设计：试验采用单因子设计，选取30±1日龄体重基本一致的健康仔猪200头，随机分成5组。对照组饲喂基础日粮，选取实施例2和对比例3进行试验，在基础日粮的基础的上添加实施例2和对比例3，添加量为500g/t，试验期为30d。饲养管理：试验期间，每天08:00、12:00和20:00喂料，喂料量以料槽中有少量剩余料为宜，全期自由采食与饮水，预防免疫和饲养管理按常规方法进行。每日15:00进行腹泻统计，同时观察仔猪的健康状况，记录患病、死淘仔猪头数及其原因。指标测定：每天记录各重复仔猪头数、腹泻以及死淘情况，每周统计一次采食量与腹泻率，计算日均采食量；试验结束当天称重，统计全期采食量，计算全期料肉比，仔猪腹泻率与死淘率。盲肠微生物测定：大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌数量的变化。试验结果参照表2和表3所示。表2丁酸梭菌生物制剂对断奶仔猪生产性能和腹泻率的影响编号日均增重(g/d)日均采食量(g/d)料重比腹泻率(％)对照组218.72456.541.859.26实施例2252.33427.121.434.59对比例3231.25450.091.666.82表3丁酸梭菌生物制剂对断奶仔猪盲肠菌群的影响编号大肠杆菌(logcfu/g)沙门氏菌(logcfu/g)产气荚膜梭菌(logcfu/g)对照组6.736.658.41实施例25.195.467.69对比例35.916.248.15由表1和表2表明，在日粮中添加0.1％实施例2，可显著降低断奶仔猪的腹泻率，提高生产性能，并显著降低盲肠中大肠杆菌、沙门氏菌以及产气荚膜梭菌数量。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12