1.本发明属于生物技术领域,具体涉及一种以大鲵为原料的大鲵肽冻干粉产业化制备技术与大鲵肽冻干粉系列产品。
背景技术：
2.大鲵( andrias davidianus) 属于两栖纲有尾目隐鳃鲵科。是国家二级保护动物，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录ⅰ中。1996年国务院批准建立了国内第一个国家级保护区—湖南省张家界大鲵国家级自然保护区。2011年张家界大鲵获得国家地理标志保护产品。2015年张家界民康生物科技有限公司与吉首大学张家界校区联合建立大鲵资源保护与综合利用湖南省工程研究中心。
3.大鲵在营养、保健、药用等有多方面应用。（1）营养方面。大鲵富含蛋白质，干物质蛋白质含量高达85%作用；氨基酸含量高，可达91%，尤其是必需氨基酸占氨基酸总量的40%以上；氨基酸模式符合人体模式，根据fao评分模式和鸡蛋蛋白必需氨基酸含量作为评分标准，大鲵肉氨基酸评分符合fao记分模式，且总量明显超过fao模式；大鲵富含多种不饱和脂肪酸、微量元素，尤其是硒的含量高达0.37mg/kg，因此大鲵又被称为“水中活人生”“脑黄金”。（2）保健方面。据报道，大鲵有100多种活性物质，如活性胶原蛋白肽（collagenc）、表皮活性因子（chf）、低聚糖肽、硫酸软骨素、dha与epa等。（3）药用方面。《本草经集注》《本草纲目》记载：大鲵具有提高智力、美容养颜、补血行气、滋阴补肾、防癌、抗癌等功效，对补肾生血、治疗贫血、血经等有显著疗效。现代中医认为，大鲵性甘、平、淡，补气、养血、益智、滋补、强壮。大鲵肝具有明目、清热解毒、化解重金属毒素、补血益气的显著功，大鲵的皮粉拌桐油可以治疗烧伤、烫伤，尤其是对面部的烧烫伤的治疗不留疤痕。
4.大鲵产品的开发与应用。当前关于大鲵产品的开发涵盖多个领域，包括初级加工品、比如大鲵火锅、大鲵面条、大鲵休闲食品等，精深加工产品包括大鲵蛋白粉、大鲵酒、大鲵护肤品等。总体来说，大鲵产品主要集中在初级加工品，（1）国民对大鲵的认知度有限，导致加工产品市场不认可；（2）关于大鲵的研究，国内科研院校比较缺乏；（3）大鲵主要的成分含量在大鲵肌肉、油、骨、内脏。大鲵肌肉主要成分含量为蛋白质（干物质蛋白质含量高达80%以上），蛋白质中有限活性成分为肽，但目前利用大鲵肌肉加工的大鲵产品较为粗糙，表现在一方面产品的分子量大，活性物质成分肽没有释放出来，另一方面加工工艺存在问题，加工出来的含有的肽失去生物活性，产品腥味较重；同时大鲵蛋白粉类的产品经过人体口腔、胃、小肠等消化器官，很多活性物质被分解，导致产品失去原有功效。
5.舌下给药技术。舌头下方血管比较丰富，将一些药物置于舌下，药物就可以通过舌下黏膜直接吸收入血，发挥疗效，被称作“舌下给药”。舌下给药有以下特点：（1）吸收较迅速。（2）药物直接入血，避免消化系统中酶系对药物分解与破坏，也不会被肝脏的酶代谢，保持药物效果，对某些药物特别有意义。尤其是对于富含生物活性的食品、药物有非常好的效果。
6.目前以大鲵为原料制备大鲵肽的专利有多个。主要有：（1）专利号cn107446976a
《大鲵多肽粉的制备方法》，将活大鲵停食、宰杀、切肉块、脱腥烘烤、粉碎、除脂肪、酶解、喷雾干燥等公益制备大鲵肽。（2）专利号 cn110452949a《一种制备大鲵肉多肽粉的方法》，剥鲵皮、清洗大鲵肉、钝化处理、酶处理、离心分离、真空干燥，得到大鲵肉多肽粉。专利号cn111363773a《大鲵活性肽》，大鲵肉匀浆、加入合酶、离心取上清液、3000 da超滤膜分离器分离、冷冻干燥，得到冻干粉。（3）专利号cn111172227a《一种大鲵小分子多肽的制备方法》，大鲵粘液、低温真空干燥、蛋白酶酶解、灭酶、微孔滤膜过滤、截留量分子为500道尔顿的超滤膜进行超滤、干燥，得到大鲵小分子多肽粉。（4）专利号cn103361393a《一种大鲵低聚肽的制备方法》，大鲵肉冷冻干燥、粉碎（60目以下）、食用油浸提剂浸提去除脂肪、酶解、透析膜过滤、酶灭活处理、脱苦、脱色、巴氏杀菌处理、浓缩及冷冻干燥，得到成品大鲵低聚肽粉。（5）专利号cn105018555a《一种大鲵皮胶原蛋白肽的制备方法》，鲵皮、脱腥（柠檬酸钠和氯化钙）、大鲵皮搅碎、超高压处理、碱性蛋白酶、混料煮沸、搅拌脱色、离心、滤膜微滤（截留分子量为4～5kd）、冻干并粉碎，即得大鲵皮胶原蛋白肽。
7.总体来看，目前有关于大鲵肽的研究与专利有一下共性：一、原料：都是采用的大鲵相关部位为原料。二、工艺:都采用酶解工艺，多数是单酶酶解工艺。三、都仅限于实验研究。存在以下问题：一、不能产业化。仅限于实验研究，不能中试及规模化生产。
8.二、生产工艺问题。
9.（1）缺少脱腥工艺，导致最终产品腥味重，影响客户体验产品。
10.（2）酶解工艺：单酶酶解不彻底，导致小分子肽段的含量比较低。
11.（2）工艺难以产业化。肽的富集，采用微孔滤膜过滤，难以工业化生产。
12.（3）干燥工艺，导致肽在高温下失去生物活性。
13.三、大鲵肽产品的主要成分不清。表现在那个肽段的肽含量不清楚，主要肽的氨基酸组成不清楚。
14.四、大鲵肽产品没有统一标准。主要理化指标、污染物限量等没有相关数据。
15.五、大鲵肽产品功能功效不清，没有做过大鲵肽产品的功效研究。
16.为进一步做好大鲵产业，保证人工养殖子二代大鲵肽冻干粉产品能产业化，保证产品品质、生物活性，从产业化角度起草本专利，包括大鲵肽的产业化工艺、大鲵肽段含量的测定、大鲵肽标准制备、大鲵肽产品功效研究。
技术实现要素：
17.本发明的目的是克服现有技术中存在的问题，提供人工养殖子二代大鲵肽冻干粉制备方法及其产品。
18.本发明采用的技术方案：人工养殖子二代大鲵肽冻干粉制备方法，包括步骤：（1）活体大鲵宰杀，去粘液、去皮、去内脏、去尾部油脂，经过清洗得到大鲵肌肉；（2）大鲵肌肉绞碎，胶磨；（3）胶磨后的大鲵，调节温度50
‑
55℃，ph6
‑
7，加入1%
‑
5%的木瓜蛋白酶，酶解1
‑
3小时，灭酶，再调节ph6
‑
7，加入5%
‑
8%碱性蛋白酶，酶解1
‑
2小时，灭酶，调节ph至中性；（4）酶解液冷冻干燥；（5）冷冻干燥后的物料低温超微粉碎；
（6）过筛，超微粉碎后的物料过100目筛子；（7）灭菌，过筛后的物料通过60co辐照灭菌，辐照剂量3.0
‑
5.0kgy，得到人工养殖子二代大鲵肽冻干粉。
19.根据所述制备方法制备的人工养殖子二代大鲵肽冻干粉的肽段含量：通过采用高效体积排阻色谱法测定，人工养殖子二代大鲵肽冻干粉分子量大于 >10000da占总量的0%；分子量5000
‑
10000da占总量的0.025%；分子量3000
‑
5000da占总量的0.18%；2000
‑
3000da占总量的0.32%；分子量1000
‑
2000da占总量的2.8%；分子量500
‑
1000da占总量的19.8%；分子量<500da占总量的77.05%。
20.所述人工养殖子二代大鲵肽冻干粉分子量189
‑
500da占总量的65.4%；分子量<189da占总量的11.65%。
21.所述人工养殖子二代大鲵肽冻干粉质量标准：（1）理化与污染物限量蛋白质 ≥75（g/100g），肽含量 ≥90（g/100g），相对分子质量小于500da的蛋白质水解产物所占比例/%≥70（g/100g），灰分≤10（g/100g），水分≤10（g/100g），粗脂肪（以干基计）≤0.5（g/100g） ，无机砷（as）≤0.5（mg/kg），铅（pb）≤0.5（mg/kg），镉（cd）≤0.1（mg/kg），甲基汞（hg）≤0.5( mg/kg)；（2）营养成分能量 1689千焦（kj）、蛋白质 76.4克（g）、脂肪8.7克（g）、碳水化合物 4.0克（g）、纳823毫克（mg）、硒 37微克（g）。
22.将所述人工养殖子二代大鲵肽冻干粉制成粉剂、口服液或片剂。
23.所述大鲵肽冻干粉的粉剂、口服液或片剂均能通过舌下和口腔黏膜10s内能完全吸收。
24.本发明的有益效果：（1）工艺流程能产业化：清洗
‑
绞碎
‑
蛋白酶酶解
‑
冷冻干燥
‑
粉碎
‑
过筛
‑
灭菌
‑
包装，每个工艺都能规模化生产，不仅限于实验研究。
25.（2）双酶组合酶解保证产品质量：通过木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶酶解保证了酶解的彻底性，进而保证了产品的分子量肽段含量，同时结合超低温粉碎、过筛工艺，保证了肽分子量<500da占比达到70%以上。
26.（3）低温工艺保证生物活性：整个过程都在低温下进行，保证了人工养殖子二代大鲵肽空间结构，进而保证了产品的生物活性。
27.（4）大鲵产品中首次结合舌下给药技术和口腔黏膜吸收技术。大分子的能量物质、蛋白质、脂肪等只能通过口腔、胃、肠道等消化吸收，不能通过舌下和口腔黏膜；同时产品的渗透能力与产品的脂溶度、分子量大小等密切相关，通过选择有效的吸收渗透促进剂能促进产品渗透吸收进入舌下血液。通过酶解大鲵肌肉酶解成小分子肽（分子量小于500da的占70%以上）保证产品能有效通过舌下和口腔黏膜，同时通过选择吸收渗透促进剂，产品可以有效通过舌下和口腔黏膜屏障，进入血液直接在人体中发挥作用。
具体实施方式
28.一、人工养殖子二代大鲵肽冻干粉制备。
29.1、原料准备。
30.活体大鲵宰杀—刮去体表粘液—去皮—去内脏—去尾部油脂，清洗后得到大鲵肌肉。
31.2、胶磨大鲵液制备。
32.大鲵肌肉切块—绞碎机绞碎—胶体磨胶磨—胶磨大鲵液。
33.3、酶解。
34.胶磨大鲵液，调节温度50℃，ph6.5，加入3%的木瓜蛋白酶，酶解1.5小时，灭酶，再调节ph6.5，加入6%碱性蛋白酶，酶解2小时，灭酶，调节ph至中性。
35.4、酶解液冷冻干燥。
36.预冷冻：冷冻温度
‑
30℃，时间为2.5小时；真空冷冻干燥：升华干燥温度为
‑
22℃，冷冻压力15pa，干燥时间为10小时；解析温度为10℃，压力为180pa，时间为3.5小时。
37.5、低温超微粉碎冷冻干燥后的物料。
38.6、过筛，超微粉碎后的物料过300目筛子。
39.7、灭菌，过筛后的物料通过60co辐照灭菌，辐照剂量3.0
‑
5.0kgy，得到人工养殖子二代大鲵肽冻干粉。
40.二、大鲵肽段含量的测定。
41.1 测定方法—采用高效体积排阻色谱法测定。
42.以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长 220nm条件下检测，使用相对分子质量分布测定的专用数据处理软件（即gpc 软件），对标准品和样品的色谱图及其数据进行处理，根据相对分子质量校正曲线方程，计算得到蛋白肽的相对分子质量大小及分布范围。
43.2 试剂。
44.（1）乙腈∶ 色谱纯。 三氟醋酸∶分析纯。水∶ 超纯级或二次蒸馏水。
45.（2）相对分子质量校正曲线所用标准品∶细胞色素c（cytochrome c，mw12384）、抑酞酶（aprotinin，mw6512）、杆菌酶（bacitracin，mw1423）、乙氨酸一乙氨酸
‑
酪氨酸一精氨酸（mw451）、乙氨酸
‑
乙氨酸一乙氨酸（mw189）。
46.3 实验参数。
47.色谱柱∶tskgel g2000swxl300mm
×
7.8mm（gel lot 502r）或性能与此相近的同类型其他适用于测定肽的分子量分布的凝胶柱。
48.流动相∶ 乙腈∶水∶三氟乙酸的体积比为40 ∶60∶0.05。
49.检测波长∶ uv220 nm。流速∶ 0.5
ꢀ‑
0.8ml/min。
50.柱温∶ 30 ℃
‑
35℃。进样体积∶ 10μl
‑
15μ。
51.使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数n按三肽标准品（乙氨酸
‑
乙氨酸
‑
乙氨酸）峰计算不低于5000，蛋白肽的分配系数ka应在0～1之间。
52.4、相对分子质量校正曲线制作。
53.分别用流动相配制成 0.1%～0.2%（w/v）的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2μm～0.5μm 聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的
色谱图。以相对分子质量的对数（lgmw）对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。
54.5、 样品制备。
55.称取样品 125.0 mg左右于 25 ml 容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振荡 10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为 0.2 μm～0.5 μm 聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤，其滤液用于测定。
56.6、相对分子质量的计算。
57.将制备的样品溶液在 a.4色谱条件下进样分析，然后使用 gpc 数据处理软件，根据相对分子质量校正曲线方程对样品的色谱图及其数据进行计算处理，即可得到样品中蛋白肽的相对分子质量大小及分布范围。用峰面积归一化法计算相对分子质量在5000以下的蛋白质水解物相对百分比之和。
58.7、检测结果。
59.备注：nd=未检出。
60.三、人工养殖子二代大鲵肽产品指标。
61.根据《中华人民共和国食品安全法》《中华人民共和国标准法》的规定，对本产品主要指标进行测定。
62.1、理化指标与污染物限量。
[0063] 2、产品营养成分。
[0064]
四、大鲵肽冻干肽舌下渗透能力、吸收渗透促进剂选择、渗透时间的测定。
[0065]
1、大鲵肽冻干粉舌下渗透能力测定。
[0066]
渗透能力与产品的脂溶度、分子量大小等密切相关。一般来说分子量小于300da的多肽类药物才能被舌下吸收。测定了大鲵肽冻干粉的分子量大小对舌下渗透能力的影响。
[0067]
（1）不同大鲵肽冻干粉肽段制备。
[0068]
a.大鲵酶解液采用上述工艺制备；b.采用截留分子量小于1000da、截留分子量小于700da、截留分子量小于500da、截留分子量小于300da的设备。
[0069]
c.收集通过截留分子量的酶解液，放置冻干设备中冻干，得到大鲵肽冻干粉肽段。
[0070]
（2）不同大鲵肽冻干粉肽段渗透吸收能力测定。
[0071]
a.选取年龄、男女不同阶段的人群40人，进行舌下口服测定b.测定结果。
[0072]
不同人群、不同肽段吸收状况
不同人群、不同肽段完全吸收时间2、大鲵肽冻干粉吸收渗透促进剂选择根据本专利的大鲵肽冻干粉生产工艺生产出来的大鲵冻干粉90%以上均为分子量小于等于1000da，并且分子量小于500da的大鲵肽冻干粉才能被吸收。因此针对分子量小于1000da的大鲵肽冻干粉选择渗透吸收剂。
[0073]
吸收渗透剂选择直接能人体食用的，丙二醇、乙醇、β
‑
环糊精，按照剂量0.1%、0.5%、1%添加。
[0074]
选取年龄、男女不同阶段的人群40人，进行舌下口服测定。
[0075]
丙二醇对大鲵肽冻干粉吸收状况的影响乙醇对大鲵肽冻干粉吸收状况的影响
β
‑
环糊精对大鲵肽冻干粉吸收状况的影响五、大鲵肽冻干粉不同剂型产品的制备。
[0076]
1、大鲵肽冻干粉直接作为成品。
[0077]
a.大鲵肽冻干粉：宰杀（活体大鲵宰杀，去粘液、去皮、去内脏、去尾部油脂）—胶磨（大鲵肌肉绞碎）—酶解（调节温度50
‑
55℃，ph6
‑
7，加入1%
‑
5%的木瓜蛋白酶，酶解1
‑
3小时，灭酶，再调节ph6
‑
7，加入5%
‑
8%碱性蛋白酶，酶解1
‑
2小时，灭酶，调节ph至中性）—冷冻干燥（酶解液冷冻干燥）超低温粉碎（冷冻干燥后的物料低温超微粉碎）—过筛（超微粉碎后的物料过100目筛子）—灭菌（过筛后的物料通过60co辐照灭菌，辐照剂量3.0
‑
5.0kgy，）—人工养殖子二代大鲵肽冻干粉。
[0078]
b.大鲵肽冻干粉产品形式：粉剂（包括肽粉、肽冻干粉、固体饮料）、口服液（包括饮品、口服液）、片剂（包括压片糖果、片剂）、其他（以大鲵肽冻干粉为原料生产的其他产品）。
[0079]
2、大鲵肽冻干粉为原料的其他产品粉剂：大鲵肽冻干粉原料—包装—灭菌。
[0080]
口服液：大鲵肽冻干粉原料—配料—灌装—灭菌。
[0081]
片剂：大鲵肽冻干粉原料—配料—混合—造粒—干燥—整粒—压片—包衣。
[0082]
其他：以大鲵肽冻干为原料生产的其他产品。