一种猪源抗菌肽pr-39突变体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体及其制备方法和应用。本发明通过生物软件对猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列进行空间结构分析，将其39个氨基酸中的3处氨基酸进行突变，获得一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型猪源抗菌肽PR-39突变体基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。
【专利说明】一种猪源抗菌肽PR-39突变体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因改造【技术领域】，具体涉及一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 世界上第一个抗菌肽天蚕素cecropin是瑞典科学家G. Boman等人于1980年从惜 比古天蚕蛹中诱导分离得到的，继而许多抗菌肽被分离、纯化。目前为止，已经有千余种抗 菌肽被分离，它们广泛分布于哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类、植物、细菌 和病毒等生物体内。
[0003] 天然的抗菌肽普遍抑菌活性偏低、抑菌谱窄以及存在溶血毒性等技术难题，大大 限制了其走向临床。近年来，随着人们对抗菌肽研究的深入，科研人员尝试人工合成抗菌 肽，并在医疗应用方面取得了一定的成果。利用抗菌肽研制的药物已进入市场，如：美国马 盖宁制药公司研发出来的马盖宁（magainin)药物可杀死病毒和肿瘤细胞，作蚕抗菌肽能 抑制乙型肝炎和杀灭肿瘤细胞，在医药上已制成肾肝宁胶囊治疗肾炎及肝炎等。
[0004] 猪源抗菌肽PR-39 (GenBank登录号：NM_214450. 1)由39个氨基酸组成，是 Agerberth B等于1991年首先从猪肠道分离得到的。其富含精氨酸（Arg)和脯氨酸（Pro) 两种氨基酸残基，形成一种Pro-Arg-Pro结构，可能与细菌磷脂膜相互作用有关。经圆二色 谱和傅立叶变换红外色谱分析表明，抗菌肽PR-39在水溶液中并不像其他抗菌肽形成a螺 旋或者P片层构象，而是呈伸展性螺旋构象，这可能与其脯氨酸含量有关。抗菌肽PR-39 对多种革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑制作用。但在实际使用过程中，抗菌肽PR-39的效价 不高，导致难以进行实际开发使用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种猪源抗菌肽PR-39突变体，从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体，其编码蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO:1 ;
[0007] 编码上述蛋白的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:2 ;
[0008] 本发明的猪源抗菌肽PR-39突变体可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和 治疗制剂。
[0009] 本发明还提供一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体的重组毕赤酵母的制备方法，其 制备步骤如下：
[0010] 1)根据新型猪源抗菌肽PR-39突变体的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子， 合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
[0011] 2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达猪源抗菌肽PR-39突变 体的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出猪源抗菌肽PR-39突变 体；
[0012] 3)对重组表达的猪源抗菌肽PR-39突变体进一步浓缩、纯化后，测定效价。稀释分 装，即为抗菌肽制剂。
[0013] 本发明在对猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将猪源 抗菌肽PR-39的39个氨基酸中的3处氨基酸进行突变（K9UH29G和K34F)，获得一种新型 猪源抗菌肽PR-39突变体，使其抗菌效力获得显著提高，从而使猪源抗菌肽PR-39具有广阔 的市场前景和开发价值。
【具体实施方式】
[0014] 本发明是通过碱基替换的方法对猪源抗菌肽PR-39 (GenBank登录号： NM_214450. 1)进行改造，获得一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体，大大提高了其抑菌，特别 是对革兰氏阳性菌的抑菌活性，极具市场开发价值
[0015] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0016] 实施例1新型猪源抗菌肽PR-39突变体及其基因的获得
[0017] 1、猪源抗菌肽PR-39 (GenBank登录号：NM_214450. 1)是由39个氨基酸组成的抗 菌肽。为了进一步提高其抑菌活性，通过对猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列进行空间结构 分析，最后完成猪源抗菌肽PR-39中3处氨基酸突变（K9UH29G和K34F)，获得一种新型猪 源抗菌肽PR-39突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0018] 2、根据获得的新型猪源抗菌肽PR-39突变体的氨基酸序列SEQ ID NO: 1，按照毕赤 酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型猪源抗菌肽PR-39突变体的核苷酸序 列SEQ ID N0:2。并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便 于克隆入毕赤酵母表达载体中。
[0019] 实施例2基因工程猪源抗菌肽突变体表达载体的构建与工程菌的获得
[0020] 1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回 收并连接，进行PCR鉴定、测序。
[0021] 2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后 均匀涂布于含100 y g/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30°C孵育3-5天。待YPDS平板上的 阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 ii g/mL、500ii g/mL、1000 ii g/ mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
[0022] 3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 ii g/mL Zeocin的YTO培养液中， 28°C振摇培养18个小时。取此菌液按4%体积比转接于5ml BMGY培养基中，28°C摇振培养 18-24h左右，0D600值约为5-6。培养物直接转接于25ml BMMY培养基中，28°C继续摇振培 养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%。48h后，4°C 5000r/min 离心lOmin，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新 型猪源抗菌肽PR-39突变体的阳性菌株。
[0023] 实施例3发酵、纯化新型猪源抗菌肽PR-39突变体的制备
[0024] 1、发酵工艺
[0025] 1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1% -10%接种量接种于三角瓶，28-30°C， 200r/min摇床培养16-24h后以5 % -20 %接种量接入IOL发酵罐（实装培养基6L)，温度 28-30°C，转速 500-1500r/min，培养基 pH 值 5. 0-6. 0,通气量 0? 1-1. 0VVM(1L 发酵液 Imin 通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突 然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。
[0026] 2)发酵结束后原罐蒸汽100°C灭菌10_20min，放料，5000r/min离心IOmin,收集发 酵上清即为抗菌肽半成品。
[0027] 3)新型抗菌肽制剂
[0028] 抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯 化后得到液体制剂。
[0029] 上述基因工程抗菌肽可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。
[0030] 实施例4新型猪源抗菌肽突变体的最小抑菌浓度测定（MIC)
[0031] 1、试验菌株
[0032] 金黄色葡萄球菌（Cowan I)、猪金黄色葡萄球菌肠毒素75-1、大肠杆菌K12D31、猪 大肠杆菌078、猪大肠杆菌0157-H71和猪副伤寒沙门氏菌C782
[0033] 2、菌株处理：将菌种复苏，在固体LB培养基中划线，在培养箱中37°C过夜培养。将 过夜培养的细菌挑单菌落于含有25ml液体MHB培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床37°C 培养12-18h。将培养后的菌液在0D600的条件下测其吸光度值，用MHB培养基调节菌液浓 度，使其处于〇. 6-0. 8之间。之后将菌液稀释成浓度为5 X 105CFU/mL，依次取90 ill加入到 96孔板的各孔内。
[0034] 3、抗菌肽定量后用MHB培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10 iU依 次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为IOOii 1。96孔板盖盖后，37°C振 荡培养24h后，观察并用酶标仪在600nm处测量并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀 释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度（MIC)。利用菌液和 MHB培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100%。同时设立猪源抗菌 肽PR-39标准品试验组作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。
[0035] 4、用微量稀释法测定重组新型猪源抗菌肽突变体对多种细菌的最低抑菌浓度，结 果表明其对革兰氏阳性菌和阴性菌均有显著的抑制效果，特别是改造的新型猪源抗菌肽 PR-39突变体与猪源抗菌肽PR-39标准品相比，在增加了抗菌肽对革兰氏阴性菌的抑菌能 力的同时，也大大提高了对革兰氏阳性菌的抑菌活性。
[0036] 表1 :抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度
[0037]
【权利要求】
1. 一种猪源抗菌肽PR-39,其特征在于，所述的猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2. -种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于编码权利要求1所述的猪源 抗菌肽PR-39。
3. 如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID N0:2。
4. 权利要求1所述的猪源抗菌肽PR-39在制备畜禽饲料添加剂或免疫增强剂中的应 用。
【文档编号】C12N15/12GK104356222SQ201410669038
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】王宏华 申请人:青岛宏昊生物科技有限公司