生产顺-3-羟基-l-脯氨酸的方法

专利名称：生产顺-3-羟基-l-脯氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及作为药物和食品添加剂有用的顺-3-羟基-L-脯氨酸的工业生产方法，编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性之蛋白并可用于上述生产方法的基因(以下称为L-脯氨酸3-羟化酶基因)，含有该基因的转化子，和使用该转化子生产L-脯氨酸3-羟化酶的方法。
在此之前，生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的化学合成方法是已知的[J.Amer.Chem.Soc.，84，3980(1962)；J.Amer.Chem.Soc.，85，2824(1963)；Nature 289，310(1981)；J.Org.Chem.，54，1866(1989)；ActaChemica Scandinavica，43，290(1989)]。
没有关于通过同时位点选择性和立体选择性地羟化L-脯氨酸来生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的化学合成或生物方法的报道。
生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的常规化学合成方法不能满足工业生产的要求，这是因为(1)原料昂贵，(2)反应步骤太多，(3)分离和纯化产品的方法复杂，和/或(4)顺-3-羟基-L-脯氨酸的产率低。
需要一种利用高活性的L-脯氨酸3-羟化酶生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的工业方法。
本发明的目的是提供用L-脯氨酸3-羟化酶从廉价易得的L-脯氨酸有效地生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，为了更适于工业生产顺-3-羟基-L-脯氨酸，本发明还提供L-脯氨酸3-羟化酶基因和含有该基因的转化子。利用该基因和转化子可以大量生产L-脯氨酸3-羟化酶，利用该转化子或羟化酶可以低成本地工业生产顺-3-羟基-L-脯氨酸。
本发明涉及新的微生物衍生的L-脯氨酸3-羟化酶基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的转化子，利用该转化子产生L-脯氨酸3-羟化酶的方法，和利用转化子或羟化酶生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法。
本发明的L-脯氨酸3-羟化酶是在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下能将游离L-脯氨酸羟化成顺-3-羟基-L-脯氨酸的酶。
本发明包括任何具有羟化L-脯氨酸3-位的酶活性的蛋白，这包括例如具有序列号1或2所示氨基酸序列的蛋白，具有该蛋白产生的氨基酸序列的融合蛋白或具有该蛋白的部分序列并与具有大肠杆菌衍生β-半乳糖苷酶蛋白部分氨基酸序列的肽结合的蛋白，具有序列号1或2氨基酸序列蛋白产生的氨基酸序列的融合蛋白或具有该蛋白的部分序列并与具有大肠杆菌衍生麦芽糖结合蛋白部分氨基酸序列的肽结合的蛋白等。融合蛋白的实例包括具有如序列号15、16或17所示氨基酸序列的蛋白。
具有序列号1、2、15、16或17所示氨基酸序列的蛋白包括其中一个或多个氨基酸被取代、缺失或插入并具有羟化L-脯氨酸3-位的酶活性的蛋白。可以按照下列文献中描述的方法进行氨基酸的取代、缺失和插入NucleicAcids Research，Vol.10，pp.6487-6500(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.79，pp.6409-6413(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，Vol.81，pp.5662-5666(1984)；Science，Vol.224，pp.1431-1433(1984)；PCT WO85/00817(1985)；Nature，Vol.316，pp.601-605(1985)；Gene，Vol.34，pp.315-323(1985)；Nucleic Acids Research，Vol.13，pp.4431-4442(1985)；Current Protocols in Molecular Biology，Chap.8，Mutagenesis of Cloned DNA，John Wiley & Sons，Inc.(1989)。
本发明包括含有编码有羟化L-脯氨酸3-位酶活性之蛋白基因的任何L-脯氨酸3-羟化酶基因DNA片段，这可以包括例如基因如序列号1、2、15、16或17所示氨基酸序列之蛋白的编码基因，以及以下蛋白的编码基因该蛋白具有相应于序列号1、2、15、16或17所示氨基酸序列的氨基酸序列，是通过取代、缺失或插入至少一个氨基酸从中生产的，并具有羟化L-脯氨酸4-位的酶活性。具体可提及序列号3、4、13和14所示的DNA。
本发明的L-脯氨酸3-羟化酶基因包括以上定义的DNA，以及通过突变如取代突变、缺失突变、插入突变等而从中衍生的DNA，这种突变进行的限度是突变的DNA不丧失L-脯氨酸3-羟化酶活性，例如与序列号3、4、13和14所示序列同源的DNA。这种同源DNA是用具有序列号3、4、13和14所示核苷酸序列的DNA作为探针通过菌落杂交或斑点杂交所获得的DNA。可以按已知的体外重组技术进行这些操作[见MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，由Sambrook，Fritch，Maniatis编写，Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，1989]。
含有L-脯氨酸3-羟化酶基因的DNA片段可以从能够羟化L-脯氨酸产生顺-3-羟基-L-脯氨酸的微生物中获得。任何具有羟化L-脯氨酸产生顺-3-羟基-L-脯氨酸能力的微生物都可以用于本发明。这种微生物的优选实例可提及具有L-脯氨酸3-羟化酶活性的属于链霉菌属或芽孢杆菌属的微生物。更优选的实例包括链霉菌S.canus ATCC12647、链霉菌S.canus ATCC12646、链霉菌TH1(FERM BP-4399)、芽孢杆菌TH2(FERMBP-4397)、芽孢杆菌TH3(FERM BP-4398)或这些菌株的突变株或衍生物。
以下描述从具有生产L-脯氨酸3-羟化酶能力的微生物获得L-脯氨酸3-羟化酶基因的方法。
通过常规DNA分离方法如苯酚方法(Biochem.Biophys.Acta，72，619-629(1963))，从具有生产L-脯氨酸3-羟化酶能力的微生物制备染色体DNA。用适当的限制性内切酶酶切如此获得的染色体DNA，然后将限制性内切酶切割的片段插入载体DNA中，以构建该微生物染色体的染色体DNA文库。利用该染色体DNA文库可以转化宿主微生物。通过杂交方法从所获得的转化子中筛选含有L-脯氨酸3-羟化酶基因的转化子。从如此筛选的转化子中可以获得含有目的基因的DNA。
可以按已知的体外重组技术进行包括一系列这种步骤的方法[见Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，由Sambrook，Fritch，Maniatis编写，Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，1989]。
作为用于构建能产L-脯氨酸3-羟化酶微生物的染色体文库的载体DNA，可以使用噬菌体和质粒载体，只要它们能够在大肠杆菌K12菌株中自主复制。载体DNA的优选实例包括λZAPII、pUC18和pBluescript(STRATAGENE Co.出售)。
作为用于构建能产L-脯氨酸3-羟化酶微生物的染色体文库的宿主微生物，可以使用属于埃希氏菌属的任何微生物。宿主微生物的优选实例包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌NC1000等。
基于L-脯氨酸3-羟化酶氨基酸序列的信息合成DNA引物。利用这些DNA引物通过聚合酶链反应(以下称为PCR)合成DNA片段。利用如此获得的DNA片段通过杂交方法可以筛选到含有L-脯氨酸3-羟化酶基因的转化子。
用普通氨基酸序列仪如Protein Sequencer Model PPSQ-10(岛津制作所制造)分析纯的L-脯氨酸3-羟化酶可以获得关于L-脯氨酸3-羟化酶氨基酸序列的信息。这样获得的氨基酸序列具体可提及序列号1中氨基酸序列的部分氨基酸序列，例如，序列5-7所示氨基酸序列等。
可以利用普通的DNA合成仪例如Applied Biosystems制造的38OA·DNA合成仪来合成DNA引物作为杂交探针，可以使用L-脯氨酸3-羟化酶基因的部分片段，这可以通过PCR来获得。例如，化学合成了序列号8所示DNA(这相当于编码序列号1氨基酸序列中1-6氨基酸的正链DNA)和如序列号10中所示的DNA(这相当于编码序列号1氨基酸序列中21-25氨基酸的反义链DNA)。用这些DNA引物通过PCR获得了序列号11所示的74bp的DNA片段。这样获得的DNA片段可用作杂交探针。
从杂交筛选的转化子获得的含有L-脯氨酸3-羟化酶基因的DNA，用适当的限制性内切酶如PstI等消化，然后克隆到诸如pBluescriptKS(+)(STRATAGENE Co.出售)的质粒中。上述基因的核苷酸序列可通过常规核苷酸序列测定方法来确定，例如Sanger等的双脱氧链终止法[Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463，(1977)]。这种核苷酸序列测定可以在DNA自动序列仪上进行，例如Applied Biosystems的373A·DNA测序仪。
作为如此测定的L-脯氨酸3-羟化酶基因的核苷酸序列，例如可提及序列号3、4、13和14所示核苷酸序列。
可用常规方法将编码本发明的L-脯氨酸3-羟化酶的DNA导入载体中。作为含有编码本发明L-脯氨酸3-羟化酶的DNA的质粒，例如可提及pTH30、pTH71、pTH75等。含有pTH30的大肠杆菌XL2-Blue/pTH30和含有pTH75的大肠杆菌XL2-Blue/pTH75已按布达佩斯条约保藏在National Institute of Bioscience and Human-Technology of theAgency of Industrial Science and Technology(它位于日本1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305)，XL2-Blue/pTH30株的保藏日是1995年3月2日、保藏号是FERM BP-5026，XL2-Blue/pTH75株的保藏日是1996年2月22日、保藏号是FERM BP-5409。
为了在宿主中表达这样获得的L-脯氨酸3-羟化酶基因，先用限制性内切酶或脱氧核糖核酸酶(DNase)酶切含有L-脯氨酸3-羟化酶基因的DNA片段，以形成含有L-脯氨酸3-羟化酶基因的适当长度的DNA片段。将所获得的DNA片段插入表达载体中启动子的下游位置，然后将含有插入DNA的表达载体引入适于该表达载体的宿主细胞中。
可以使用任何能够表达目的基因的宿主细胞。宿主细胞的实例可提及埃希氏菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等的微生物细胞，以及酵母菌株、动物细胞宿主等。
可以使用能够在上述宿主细胞中自主复制或能够被插入染色体中并且在可转录L-脯氨酸3-羟化酶基因的位置含有启动子的表达载体。
当使用大肠杆菌等微生物作为宿主细胞时，该表达载体最好能够在该微生物中自主复制并且由启动子、核糖体结合序列、L-脯氨酸3-羟化酶基因和转录终止序列组成。其中可含有控制启动子的基因。
可提及的表达载体实例有pBTrp2，pBTac1，pBTac2(BehringerManheim Co.出售)；pKYP10(见日本公开而未审查的专利申请110600)；pKYP200[见Agric.Biol.Chem.，48，669-675(1984)]；pLSA1[见Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]；pGEL1[见Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)]；pBluescript(STRATAGENE Co.生产)；pTrs30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制得]；pTrs32[从大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制得]等。
作为启动子可以使用能够在诸如大肠杆菌的宿主中表达的任何启动子。例如可提及来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子，如trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子和PR启动子。还可以使用人工设计和改造的启动子例如两个Ptrp顺序连接而制得的Ptrp×2以及tac启动子(Ptac)。
可以使用能够在诸如大肠杆菌的宿主中表达的任何核糖体结合序列。但最好使用含有核糖体结合序列并且该序列与起始密码子有适当间隔(例如6-18个碱基)的质粒。
L-脯氨酸3-羟化酶基因包括任何编码L-脯氨酸3-羟化酶的基因。但是，组成该基因DNA序列的碱基最好被适当地取代，以使取代后的DNA序列由最适合在所用宿主微生物中表达的密码子组成。
本发明基因的表达不一定需要转录终止序列。但最好将转录终止序列安排在结构基因的紧下方。
适合于本发明的宿主细胞实例包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌B.immariophilum ATCC14068、短杆菌B.saccharolyticumATCC14066、短杆菌B.flavum ATCC14067、短杆菌B.lactofermentumATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、微杆菌M.ammoniaphilum ATCC15354等。
当使用酵母菌株作为宿主细胞时，例如可以使用Yep13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等作为表达载体。
可以使用任何能够在酵母宿主细胞中表达的启动子。启动子的实例有糖酵解基因如己糖激酶的启动子、gal1启动子、gal10启动子、热激蛋白启动子、MFα1启动子和CUP1启动子等。
宿主细胞的实例有酿酒酵母、裂殖酵母S.pombe、乳酸克鲁维酵母、出芽丝孢酵母和Schwanniomyces alluvius等。
当使用动物细胞作为宿主细胞时，例如pcDNA I/Amp、pcDNAI和pcDM8(均由Funakosi Co.出售)可用作表达载体。可以使用任何在动物细胞宿主中表达的启动子，例如人CMV的IE基因(即早基因)启动子。人CMVIE基因的增强子可与该启动子一起使用。
可使用的宿主细胞例如为Namalwa细胞、HBT5637(日本公开而未审查的专利申请299/88)，COS细胞、CHO细胞等。
为将DNA引入动物细胞，可使用任何能够将DNA引入动物细胞的方法。例如可使用电穿孔法[见Miyaji et al.，Cytotechnoligy，3，133(1990)]、磷酸钙法[见日本公开而未审查的专利申请227075/90]、脂质体转染法[见Philip L.Felgner，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)]等。形成的转化子可以按日本公开而未审查的专利申请227075/90和257891/90中描述的方法进行收集和培养。
这样获得的转化子用普通培养方法培养。
培养这些微生物转化子如大肠杆菌、酵母等的培养基可以使用天然培养基和合成培养基，只要它适当地含有可以被该微生物吸收的碳源、氮源、无机盐和其他物质并且转化子在其中可以有效地培养。
可以使用能被微生物吸收的任何碳源。碳源的实例包括碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖和含有这些成分的糖浆、淀粉和淀粉水解物；有机酸如乙酸和丙酸；及醇如乙醇和丙醇。
作为氮源可使用氨、无机和有机酸的铵盐如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵，其它含氮化合物蛋白胨、肉浸膏、酵母膏、玉米浸液、酪蛋白水解物、豆饼、豆饼水解物、培养的发酵细胞、它们的消化产物等。
作为无机盐可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
在通气条件下进行培养，例如摇床培养或液下通气搅拌培养。培养温度为15-40℃。培养时间一般为16-96小时。培养过程中保持培养基的pH为3.0-9.0。用无机和有机酸碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来调节pH。
向培养基中加入适量的L-脯氨酸，使其浓度为5-1000mM，优选20-200mM，以更有效地产生L-脯氨酸3-羟化酶。
如果需要在培养过程中可以向培养基中加入抗生素如氨苄青霉素、四环素等。
在培养用可诱导启动子进行了表达载体转化的微生物时可向培养基中加入诱导物。例如用lac启动子进行了表达载体转化的微生物，在培养时可向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)。用trp启动子进行了表达载体转化的微生物，在培养时可向培养基中加入吲哚丙烯酸(IAA)。
作为培养用动物细胞作为宿主细胞所获得的转化子的培养基，一般使用RPMI1640培养基和Eagle’s MEM培养基，或者可以使用含有胎牛血清的那些培养基。
在5％CO2存在下进行细胞培养。培养温度优选为35-37℃，培养时间通常为3-7天。
向培养基中加入适量的L-脯氨酸，使其浓度为5-1000mM，优选20-200mM，以更有效地产生L-脯氨酸3-羟化酶。
如果需要在培养过程中可以向培养基中加入抗生素如卡那霉素、青霉素等。
与用作基因源的微生物菌株如链霉菌TH1等相比，这样培养的转化子产生了大量的L-脯氨酸3-羟化酶并在其中积累。因此，与用非基因工程菌作为基因源如链霉菌TH1等从L-脯氨酸生产顺-3-羟基-L-脯氨酸相比，可以更有效地进行酶的分离和纯化或用该酶从L-脯氨酸生产顺-3-羟基-L-脯氨酸。
转化子中L-脯氨酸3-羟化酶的产生可以这样进行向适于酶反应的含水介质中加入培养物细胞或处理后的细胞，同时加入L-脯氨酸、二价铁离子和2-氧代戊二酸，并且必要时加入表面活性剂或有机溶剂以保证产生顺-3-羟基-L-脯氨酸。对于已证实在细胞中形成了的L-脯氨酸3-羟化酶的活性，在下列条件下每分钟催化产生1nmol的顺-3-羟基-L-脯氨酸的酶活性被定义为1单位(U)。微生物细胞和动物细胞这里都称为细胞。
L-脯氨酸3-羟化酶活性的测定将细胞、处理后的细胞或酶制剂加入到含有12mM L-脯氨酸、24mM2-氧代戊二酸、4mM硫酸亚铁和8mM L-抗坏血酸的200mM MES[N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]缓冲液(pH7.5)中，总体积为250μl。混合物在35℃保温10分钟。将反应混合物在100℃下加热2分钟以终止反应，用高效液相色谱(以下称为HPLC)测定反应混合物中的顺-3-羟基-L-脯氨酸的量。
为测定形成的顺-3-羟基-L-脯氨酸的量，可以使用能够测定它的方法。例如，可以使用以配体交换色谱柱如SUMICHIRAL OA5000(由Sumika Analysis Center Co.生产)进行HPLC分离并洗脱顺-3-羟基-L-脯氨酸，过柱后使其与7-氯-4-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑(以下称为NBD)反应生产其衍生物，再检测生成的衍生物的方法(柱后衍生物法)；反应混合物中的产物先与NBD反应生成其衍生物，然后用反相HPLC分离并检测所生成的与NBD的衍生物(柱前衍生物法)[见William J.Lindblad and Robert F.Diegelmann，Analytical Biochemitry，Vol.138，pp.390-395，1984]等。这两种方法中都是通过测定其荧光来检测NBD衍生物的(激发波长503nm，荧光波长541nm)。
如上所述证实了培养细胞中形成了L-脯氨酸3-羟化酶后，按常规方法从转化子培养物中分离和纯化该酶。例如，将转化子培养液离心以从中收集培养细胞，洗涤细胞并用超声波细胞破碎仪、法式压力、Manton-Gauline均化器、Dyno磨等打碎细胞，以得到无细胞提取物。可以通过硫酸铵沉淀、离子交换色谱如二乙氨基乙基(DEAE)琼脂糖、疏水色谱如丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等、凝胶过滤、电泳如等电点电泳从离心获得的无细胞上清液获得纯化的酶制剂。
可以在上述相同条件下培养已证明含有L-脯氨酸3-羟化酶的转化子细胞，以使这些细胞产生并在细胞中积累顺-3-羟基-L-脯氨酸，从中收集并获得这样产生的顺-3-羟基-L-脯氨酸。
如果转化子细胞是从能够以糖源产生L-脯氨酸并在培养液中积累L-脯氨酸的宿主细胞产生的，则在细胞培养过程中不向培养基中加入L-脯氨酸也可能产生顺-3-羟基-L-脯氨酸。但最好向培养基中加入浓度为5-1000mM，优选20-200mM的L-脯氨酸，以更有效地产生L-脯氨酸-3-羟化酶。
如果转化子细胞具有从糖源产生并在培养液中积累2-氧代戊二酸的能力并使用这种细胞，甚至在细胞培养过程中不向培养基中加入2-氧代戊二酸也可能产生顺-3-羟基-L-脯氨酸。当使用这种转化子细胞时，可以向培养基中适当加入糖源如葡萄糖，以使细胞产生并在培养液中积累2-氧代戊二酸，从而更有效地生成L-脯氨酸-3-羟化酶。相反，如果使用没有从糖源生成2-氧代戊二酸能力的转化子细胞，则在细胞培养过程中必要时可加入2-氧代戊二酸。
必要时，在转化子细胞培养过程中可以向培养基中加入二价铁离子。
为产生顺-3-羟基-L-脯氨酸，还可以使用下面提及的另一种方法，其中作为酶源可以使用已证明生成L-脯氨酸3-羟化酶的转化子细胞的培养物，使用从该培养物中分离的细胞或从该细胞加工而成的产品。
生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法如下向适于酶反应的含水介质中加入转化子细胞培养物、从培养物中分离的细胞或加工该细胞获得的产品，以及L-脯氨酸、二价铁离子和2-氧代戊二酸，任选地加入表面活性剂和有机溶剂，从而将L-脯氨酸转化为顺-3-羟基-L-脯氨酸，然后从反应混合物中收集得到生成的顺-3-羟基-L-脯氨酸。
可以使用的加工细胞的实例有干燥细胞、冷冻干燥细胞、表面活性剂处理的细胞、酶处理的细胞、超声处理的细胞、机械研磨的细胞、机械压碎的细胞、溶剂处理的细胞、分级分离的细胞蛋白、固定化细胞、固定化的细胞加工所得材料等。还可使用从1-脯氨酸3-羟化酶活性的细胞提取获得的酶制剂、这些酶的纯化产品和其固定化产物。
作为含水介质的实例可提及水，缓冲液如磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐和tris缓冲液，醇如乙醇和甲醇，酯如乙酸乙酯，酮如丙酮，和酰胺如乙酰胺。
作为表面活性剂的实例可提及阳离子表面活性剂如聚氧乙烯-硬脂基胺(例如，Nippon Oils & Fats Co.生产的Nymeen S215)，鲸蜡基三甲基溴化铵，Cation FB，Cation F2-40E等；阴离子表面活性剂如油酰氨基硫酸钠，Newrex TAB和Rapizole 80；两性表面活性剂如聚氧乙烯-脱水山犁醇单硬脂酸酯(例如Nonion ST221)等；和其它叔胺PB，十六烷基二甲基胺等。可以使用能促进反应的任何表面活性剂。表面活性剂的浓度一般为0.1-50mg/升，优选1-20mg/升。
作为有机溶剂的实例可提及甲苯、二甲苯、脂肪醇、苯和乙酸乙酯。有机溶剂的浓度通常为0.1-50μl/ml，优选1-20μl/ml。
该反应可以在具有L-脯氨酸3-羟化酶活性的转化子培养过程中进行，或在培养结束后用从培养液中制得的细胞、处理后的细胞、纯化酶或粗酶在含水介质中进行。
根据所用底物的量来确定向反应混合物中加入的酶量。通常为1,000-10,000,000U/升，优选10,000-3,000,000U/升含水介质。当使用细胞或处理后的微生物细胞时，湿细胞的浓度通常为1-300g/升。
该反应一般在15-50℃的温度和6.0-9.0的pH下进行1-96小时。
用于本反应的L-脯氨酸浓度可为1mM到2M。可以向反应混合物中加入L-脯氨酸本身，或加入从糖源产生并积累L-脯氨酸的微生物培养物来提供L-脯氨酸。另外，如果使用具有从糖源产生L-脯氨酸能力的微生物作为转化子的宿主细胞，由宿主微生物从糖源产生的L-脯氨酸可用于该反应。即，由具有产生L-脯氨酸能力之微生物衍生的转化子所产生的L-脯氨酸，在培养液中用转化子产生的L-脯氨酸3-羟化酶转化为顺-3-羟基-L-脯氨酸，从而在不向培养液中加入L-脯氨酸的情况下能够产生顺-3-羟基-L-脯氨酸。
该反应需要二价铁离子。这种二价铁离子的使用浓度一般为1-100mM。可以使用任何二价铁离子，只要它不抑制本反应。二价铁离子的实例可提及硫酸亚铁；氯化物如氯化亚铁；碳化亚铁；有机酸盐如柠檬酸盐、乳酸盐、富马酸盐。当细胞、处理后的细胞或反应混合物中含有二价铁离子时，则不必加入二价铁离子。
可以向反应混合物中加入2-氧代戊二酸本身或从可被所用细胞或处理后的细胞的代谢活性转化为2-氧代戊二酸的前体获得。这种前体的实例可提及糖如葡萄糖；氨基酸如谷氨酸；和有机酸如琥珀酸。这些化合物可以单独使用或联合使用。
通过任何普通分离方法，例如用离子交换树脂进行柱层析、结晶等方法从培养物或含水介质中回收顺-3-羟基-L-脯氨酸。
这样得到的顺-3-羟基-L-脯氨酸的结构可通过常规分析方法如13C-NMR谱、1H-NMR谱、质谱、比旋光度等来鉴定。
可以用上述柱后衍生法或柱前衍生法定量测定本发明产生的顺-3-羟基-L-脯氨酸。


图1表示质粒pTH30和质粒pTH40的构建步骤。
图中每个粗的实黑线表示链霉菌TH1的克隆位点。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。Plac表示大肠杆菌乳糖启动子；lacZ表示β-半乳糖苷酶结构基因；MCS表示多克隆位点。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。
图2表示质粒pTH71和质粒pTH75的构建步骤。
图中每个粗的实黑线表示链霉菌RH1的克隆位点。沿着箭头方向实黑线部分表示相应于序列号14的核苷酸序列的位置。每个箭头的方向表示从序列号14的起始端至末端的方向。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。Plac表示大肠杆菌乳糖启动子；lacZ表示β-半乳糖苷酶结构基因；MCS表示多克隆位点。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。
图3表示质粒pTH50的构建步骤。
图中每个粗的实黑线表示含有来自链霉菌TH1染色体的L-脯氨酸-3-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。Plac表示大肠杆菌乳糖启动子；lacZ表示β-半乳糖苷酶结构基因；MCS表示多克隆位点。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。
图4表示质粒pEX1-5的构建步骤。
图中每个粗的实黑线表示含有来自链霉菌TH1染色体的L-脯氨酸-3-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。Plac表示大肠杆菌乳糖启动子；lacZ表示β-半乳糖苷酶结构基因；MCS表示多克隆位点。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。
图5表示质粒pTH60的构建步骤。
图中每个粗的实黑线表示含有来自链霉菌TH1染色体的L-脯氨酸-3-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。Plac表示大肠杆菌乳糖启动子；lacZ表示β-半乳糖苷酶结构基因；MCS表示多克隆位点。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。
图6表示质粒pTH70的构建步骤。
图中每个粗的实黑线表示含有来自链霉菌TH1染色体的L-脯氨酸-3-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。Plac表示大肠杆菌乳糖启动子；lacZ表示β-半乳糖苷酶结构基因；MCS表示多克隆位点。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。
图7表示质粒pTH80的构建步骤。
图中每个粗的实黑线表示含有来自链霉菌TH1染色体的L-脯氨酸-3-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的氨苄青霉素抗性基因。Plac表示大肠杆菌乳糖启动子；lacZ表示β-半乳糖苷酶结构基因；MCS表示多克隆位点。图中只显示了与质粒的构建有关的限制性酶切位点。实施例1编码链霉菌TH1的L-脯氨酸-3-羟化酶蛋白质的基因的部分DNA的制备(1)链霉菌TH1染色体DNA的分离利用常法按如下所示分离链霉菌TH1的染色体DNA。将10ml添加有5％甘露糖醇、0.05％甘氨酸的SK#2培养基(含有0.25％葡萄糖、1.0％可溶性淀粉、0.25％酵母提取物、0.25％胨、0.15％肉膏、0.01％磷酸二氢钾、0.03％硫酸镁，用6N NaOH调节PH为7.6的培养基)分别注入试管内，120℃灭菌20分钟。然后将在HT琼脂平板培养基上生长的链霉菌TH1用一接种环接种到上述SK#2培养基中，28℃振荡培养3天。将该培养液离心分离，将得到的菌体用10ml的10.3％蔗糖溶液洗涤后，悬浮在6ml的TS〔10.3％蔗糖、50mM Tris·HCl(PH8.0)、25mM EDTA〕中，加入1ml溶菌酶溶液(50mg/ml TS)，37℃培养60分钟。然后在该溶菌酶处理液中加入0.6ml蛋白酶K(Sigma社制)溶液(2mg/mlTS)，慢慢混合，再一边慢慢混合一边加入3.6ml的3.3％(w/v)SDS溶液，37℃培养60分钟。将该混合液在50℃下加热30分钟后水冷，加入等量的TE〔10mM Tris·HCl(PH8.0)1mM EDTA〕饱和的苯酚/氯仿(1/1、v/v)，平稳振荡30分钟。离心分离后取上层，再次利用TE饱和的苯酚/氯仿进行萃取操作，离心分离后在得到的上层中加入等量的氯仿，混合后再次进行离心分离。取上层，在该上层中加入100℃下加热处理10分钟后得到的R Nase A水溶液(10mg/ml)20μl，37℃培养45分钟。在该R Nase A处理液中加入1/10容量的5M食盐水及1/4容量的50％PEG 6000，缓慢混合后，冰冷下放置一夜。将该混合液以12000rpm离心分离10分钟后，完全弃去上清，将剩下的沉淀溶于5ml的TE中。加入1/10容量的3M醋酸钠溶液及1/30容量的66mM氯化镁溶液，混合后加入2.2倍容量的冷乙醇，缓慢混合。将该混合液以10000rpm离心分离10分钟后，弃去上清，将得到的沉淀用70％冷乙醇洗涤2次。将该沉淀(含有250μg的染色体DNA)溶于TE，作为染色体DNA用于以后的实验。(2)由链霉菌TH1得来的L-脯氨酸-3-羟化酶蛋白的部分氨基酸序列的确定按照参考例1的方法将产生链霉菌TH1的L-脯氨酸-3-羟化酶分离精制，使用岛津制作所制Protein sequencer model PPSQ-10分析该精制酶蛋白的N末端氨基酸序列，确定序列号5中所示的N末端氨基酸序列。
另外，在0.1M Tris-HCl、4M脲(PH9)中，使精制酶标准品与赖氨酰肽内切酶在37℃下反应6小时后，利用HPLC得到肽片段，同样分析其氨基酸序列，确定序列号6及7所示的部分氨基酸序列。
(3)L-脯氨酸-3-羟化酶基因的部分DNA的制备使用Applied Biosystems社制的380A·DNA合成仪，合成对应于序列号5记载的氨基酸序列的1-6个氨基酸的序列号8记载的正义链混合DNA引物及、对应于序列号5记载的氨基酸序列的第24～28个氨基酸的序列号9记载的反义链混合DNA引物。
将该合成DNA作为引物，将链霉菌TH1染色体DNA作为模板，进行PCR。使用Perkin Elmer Cetus社制的DNA Thermal Cycler 480进行PCR。使用以下组成的反应液20μl进行反应。
反应液组成链霉菌TH1染色体DNA21ng/μl、正义链混合DNA引物及反义链混合DNA引物各10μM、pfu DNA聚合酶(STRATAGENE社制)0.125U/μl、DMSO 10％、Tris·HCl(pH8.2)20mM、KCl10mM、硫酸铵6mM、氯化镁2mM、Triton X-100 0.1％、胎牛血清血蛋白10ng/μl。
反应是在95℃培养5分钟后，将95℃-0.5分钟、25℃-0.5分钟、75℃-1分钟三步的培养工序重复进行40次，将反应液以15％聚丙烯酰胺(Atto株式会社制、PAGEL NPU-15L)进行电泳后，使用日本Eido株式会社制的da Vincikun(pen Touch Recovery-NB-7000型)回收扩增的83bp的DNA。
将回收的83bp的DNA片段作为模板，将序列号8记载的正义链混合DNA和对应于序列号5记载的氨基酸序列的第21～25氨基酸的序列号10记载的反义链混合DNA作为引物，再次进行与上述相同的PCR，回收扩增的74bp DNA。将回收的片段用Pharmacia社制的Sure Clone LigationKit插入到pUC18的SmaI位点，使用Applied Biosystems社的核苷酸序列测定试剂盒(Taq Dye DeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit)确定其核苷酸序列。
被确定的核苷酸序列如序列号11及序列号12所示。确定了2种核苷酸序列，由序列号11的核苷酸序列推定的氨基酸序列，与序列号5记载的精制酶的N末端氨基酸序列、除去用N末端氨基酸序列测定时不能鉴定的第2号氨基酸外完全一致。另外，由序列号12的核苷酸序列推定的氨基酸序列与序列号5记载的精制酶的N末端氨基酸序列显示出高度的同源性(homology)。实施例2 含有L-脯氨酸3-羟化酶基因的DNA片段的克隆(1)DIG化探针的制备将由实施例1(3)得到的序列号11及序列号12所示的2种74bp的片段分别插入UC18的SmaI位点，将得到的2种质粒作为模板，分别用含有序列号8记载的正义链合成DNA及序列号10记载的反义链合成DNA各100μM的反应液50μl进行与实施例1(3)相同的操作，进行PCR。将该反应液分别进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认分别生成了74bp的扩增片段，进行与实施例1(3)同样的操作，从凝胶上回收该扩增片段。
该74bp片段的DIG(洋地黄毒苷)化，使用Boehringer Mannheim社制的PCR DIG标记试剂盒进行。
将回收的该2种74bp片段作为模板，对其分别用含有Pfu DNA聚合酶(STRAT AGENE社)2.5U、Pfu DNA聚合酶的X10缓冲液(STRATA GENE社)5μl、DSMO 5μl、×10PCR DIG mix(BoehringerMannheim社制)5μl、序列号8记载的正义链合成DNA及序列号10记载的反义链合成DNA各10μM的反应液进行PCR。
反应是在95℃、5分钟培养后，重复进行95℃-0.5分钟、50℃-0.5分钟、75℃-1分钟的三步培养工序40次，分别进行12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认分别生成74bp的扩增片段。进行与实施例1(3)同样的操作，从凝胶中回收该扩增片段，将该2种扩增片段作为探针使用。以下将由序列号11所示的核苷酸序列得来的探针称为探针A，将由序列号12所示的核苷酸序列得来的探针称为探针B。(2)Southern杂交在20μg链霉菌TH1的染色体DNA中加入限制性内切酶PstI(宝酒造社制)20U，37℃反应2小时，将该DNA酶切后，将该DNA进行琼脂糖凝胶电泳。使用由实施例2(1)得到的探针，使用BoehringerMannheim社制的DIG荧光检测试剂盒，按附带的说明书中记载的方法进行Southern杂交。
即，在琼脂糖凝胶电泳后，将琼脂糖凝胶在0.25N盐酸中缓慢振荡20分钟，使用Atto社制的Genopirator Pump AE 6680 P及Atto社制的Genopirator AE-6680C，7.5mmHg进行抽吸，在0.4M NaOH溶液中在Hybond-N+膜(Amersham社制)上进行印途。印迹后将膜风干。将这样得到的膜在DIG荧光检测试剂盒的杂交缓冲液〔在SSC(SSC的组成为150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)中含有甲酰胺50％v/v、封阻试剂2％、N-月桂基肌氨酸0.1％w/v、SDS 0.02％w/v的溶液〕10ml中于42℃浸泡1小时后，在探针溶液〔将由实施例2(1)得到的探针A3μl添加到200μl的杂交缓冲液中，95℃热处理2分钟后，添加杂交缓冲液至1.5ml得到的溶液〕中，于42℃浸泡一夜。将该膜再用含有0.1％SDS的25ml SSC在室温下洗涤5分钟2次后，用含有0.1％SDS的0.1倍浓度的25ml SSC在68℃下洗涤15分钟2次。
将该膜按下列顺序处理，用洗涤缓冲液〔含有0.3w/v Tween-20的缓冲液1(0.1M马来酸、0.15M氯化钠、PH7.5)〕室温下1-5分钟、使用50ml的缓冲液2(含有1％封阻试剂的缓冲液1)室温下30分钟、使用含有1μl的抗洋地黄毒苷-AP Fab的10ml的缓冲液2室温下30分钟、使用50ml的缓冲液2室温下30分钟2次、使用10ml的缓冲液3(0.1MTris·HCl、0.1M氯化钠、50mM氯化镁、PH9.5)室温下2～5分钟、使用含有Lumigen PPD 50μl的5ml缓冲液3室温下5分钟，然后在滤纸上快速除去水分，用Saran包装膜(聚氯乙烯膜)包裹后，37℃静置15分钟。使用Hyperfilm-ECL(Amersham社制)将其在室温下曝光30分钟。
可以判明在约6kb的位置与探针强烈杂交的DNA片段的存在。
另外，使用由实施例2(1)得到的探针B，使用kpnI(宝酒造社制)20U代替限制性内切酶PstI，进行与该实施例2(2)同样的操作，检测出在约5kb的位置处与探针强烈杂交的DNA片段。
(3)染色体DNA的分级分离在链霉菌TH1的染色体DNA 20μg中加入限制性内切酶PstI(宝酒造社)20U，37℃反应2小时，将该DNA酶切后，加入等量的TE饱和的苯酚/氯仿，混合。离心分离后取上层，加入2.2倍容量的冷乙醇，缓慢混合。10000rpm离心分离10分钟，弃去上清后，用70％冷乙醇洗涤沉淀2次，得到乙醇沉淀。以下将使用TE饱和的苯酚/氯仿、冷乙醇得到乙醇沉淀的操作称为乙醇沉淀法。将该沉淀溶于120μlTE中，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后，使用Prep-A-gene(Biorad社制)利用琼脂糖凝胶将6kb附近的DNA级分提取精制，得到约0.5μg的PstI酶切染色体DNA级分。
另外，使用KpnI 20U代替限制性内切酶PstI，进行与该实施例2(3)相同的操作，得到约5kb附近的KpnI酶切染色体DNA级分约0.5μg。(4)质粒文库的制备使用限制性内切酶PstI(宝酒造社制)将pBluescript II KS(+)(STRATA GENE社)1μg酶切后，使用宝酒造社制的碱性磷酸酶(得自牛肠)，按附带说明书记载的方法进行脱磷酸化反应。反应后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该沉淀溶于5μl的TE。将这样得到的PstI酶切pBluescriptIIKS(+) DNA与由实施例2(3)得到的PstI酶切染色体DNA 0.1μg用连接试剂盒(TAKARA ligation Kit，宝酒造社制)在26℃下反应2.5小时，进行连接。使用该连接DNA，利用常法将大肠杆菌XL2-Blue转化后，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养一夜，得到约240个菌落。②使用限制性内切酶kpnI(宝酒造社制)将pBluescriptIIKS(+)(STRATAGENE)1μg酶切后，使用宝酒造社制的碱性磷酸酶(来自牛肠)按附带说明书记载的方法进行脱磷酸化反应。反应后利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该沉淀溶于5μl TE。将这样得到的kpnI酶切pBluescriptIIKS(+)DNA与由实施例2(3)得到的kpnI酶切染色体DNA0.1g用连接试剂盒(TAKARA ligation Kit，宝酒造社制)，在26℃下反应2.5小时，进行连接。使用该连接DNA按照常法将大肠杆菌XL2-Blue转化后，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养一夜，得到约200个菌落。(5)目标克隆的选择从上述菌落中按如下方法选择具有目标克隆的菌落。
将在LB琼脂培养基上出现的菌落，转移到用5倍浓度的SSC洗涤过的尼龙膜(Schleicher&Schuell社制尼龙膜Nytran)上，然后将该膜在用0.5M氢氧化钠浸泡过的滤纸上静置5分钟，再在用1.5M NaCl-1.0MTris-HCl(pH8.0)浸泡过的滤纸上静置5分钟，用2倍浓度的SSC轻洗后，利用紫外线照射(120mJ/cm2)进行交联(Crosslinking)。然后用含有0.1％SDS的2倍浓度的SSC洗涤膜表面后风干。
使用由实施例2(1)得到的DIG化探针及Boehringer Mannheim社制的DIG荧光检测试剂盒按照实施例2(2)记载的方法进行检测。
通过由实施例2(4)①得到的约240个菌落与由实施例2(1)得到的探针A的菌落杂交，检测到1个具有目标克隆的阳性菌落。通过由实施例2(1)得到的探针B的菌落杂交，检测出5个具有目标克隆的阳性菌落。
从该菌落利用常法提取质粒，得到PTH 30、pTH71及pTH75。
利用限制性内切酶消化确认该质粒的结构。pTH30具有在pBluescriptII KS(+)的PstI部位插入有约6kb的pstI酶切DNA片段的结构(图1)，pTH71及pTH 5具有在pBluescriptIIKS(+)的kpnI部位分别逆向插入有约5kb的kpnI酶切DNA片段的结构(图2)。(6)碱基序列的确定①对于质粒pTH30，使用宝酒造社制的千碱基序列缺失试剂盒(deletionkitfor kilosequence)，制成各种缺失变异质粒.具体的试剂及方法按试剂盒中附带的说明书进行。使用Applied Biosystems社的碱基序列确定试剂盒(Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit)分析该缺失质粒的核苷酸序列，确定了序列号13中所示的1081b的kpnI-ECO RI片段的核苷酸序列。
在该核苷酸序列中存在编码序列号1所示的由290个氨基酸残基构成的蛋白质的序列号3所示的核苷酸序列。在该氨基酸序列中，含有使用纯化L-脯氨酸-3-羟化酶确定的序列号5记载的N末端氨基酸序列，以及序列号6及7记载的内部氨基酸序列，这说明在得到的约6kb的PstI片段中存在作为目标的L-脯氨酸-3-羟化酶基因。以下将该基因称为L-脯氨酸-3-羟化酶I型基因。②使用Applied Biosystems社的碱基序列确定试剂盒(Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle Sequencing Kit)分析由质粒pTH71及TH75的链霉菌得来的插入片段末端的碱基序列。以由上述分析得到的碱基序列为基础，使用Applied Biosystems社制的380A.DNA合成仪合成测序用引物，使用该引物，分析在链霉菌片段的下游的pTH71和pTH75的部分核苷酸序列。以由上述分析得到的碱基序列为基础，合成测序用引物，使用该引物解析位于更下游位置的碱基序列。重复进行该碱基序列解析操作，确定如序列号14记载的NruI-kpnI片段1826bp的序列。
在该核苷酸序列中，存在编码由序列号2所示的290个氨基酸残基构成的蛋白的序列号4记载的核苷酸序列。在序列号4中记载的核苷酸序列中存在序列号12中记载的序列。另外，该序列号4所示的核苷酸序列，显示出与L-脯氨酸-3-羟化酶I型基因具有78.5％的同源性。以下将序列号4中记载的基因称为L-脯氨酸-3-羟化酶II型基因。实施例3 L-脯氨酸-3-羟化酶表达质粒的构建①L-脯氨酸-3-羟化酶I型基因表达质粒的构建用限制性内切酶EcoRI酶切由实施例2得到的质粒pTH30，使用宝酒造社制的连接试剂盒进行自身连接。使用由该自身连接得到的DNA，利用常法转换化大肠杆菌XL1-Blue MRF’株。从该转化子利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。
结果得到了在L-脯氨酸-3-羟化酶基因的3’侧存在的约3kb的EcoRI片段被除去的质粒pTH40(图1)。
然后用kPnI及SmaI酶切质粒pTH40，利用琼脂糖凝胶电泳确认含有L-脯氨酸-3-羟化酶I型基因的约0.95kbp的片段后，通过琼脂糖凝胶按常法回收该片段。将该kpnI-SmaI酶切片段利用宝酒造社制连接试剂盒插入到pBluescriptIIKS(+)的kpnI-SmaI酶切位点，使用该DNA，利用常法转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’株。将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上后，37℃培养一夜。从生成的该转化子的菌落按常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。
结果，得到了在与lac启动子的转录方向相同的方向上插入了编码L-脯氨酸-3-羟化酶I型基因的DNA片段的质粒pTH50(图3)。②L-脯氨酸-3-羟化酶II型基因表达质粒的构建用限制性内切酶NruI和SacI酶切由实施例2得到的质粒pTH75，利用琼脂糖凝胶电泳法回收含有L-脯氨酸-3-羟化酶II型基因的约1900bp的片段。将该NruI-SacI酶切片段用宝酒造社制的连接试剂盒插入到pBluescriptIIKS(+)的HincII-SacI酶切位点，使用该DNA，利用常法转化大肠杆菌XL2-Blue MRF’株，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上之后，37℃培养一夜。从生成的该转化子的菌落按常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。
结果，得到了在与lac启动子的转录方向相同方向上插入了编码L-脯氨酸-3-羟化酶II型基因的DNA片段的质粒pEX1-5(图4)。实施例4由转化子生产L-脯氨酸-3-羟化酶①从含有L-脯氨酸-3-羟化酶I型基因的转化子生产L-脯氨酸-3-羟化酶使用由实施例3得到的质粒pTH50，转化大肠杆菌ATCC12435。将得到的转化子分别接种到含有50μg/ml的氨苄青霉素的3ml LB培养基中，30℃振荡培养一夜。将该培养液离心分离，将得到的细胞在-20℃冻结。
将该冻结细胞熔化后，在反应液〔在200mM的TES缓冲液(PH7.5)中含有12mM L-脯氨酸、24mM 2-氧代戊二酸、4mM硫酸亚铁及8mM L-抗坏血酸〕250μl中加入湿细胞，使浓度为4％(w/v)。35℃下反应10分钟，将反应液在100℃下加热2分钟，使反应停止。
将该反应混合液离心分离，在得到的上清100μl中加入0.3M硼酸缓冲液(pH10.7)100μl、10％(v/v)巯基乙醇水溶液4μl及5％(w/v)邻苯二甲醛的乙醇溶液16μl，60℃下放置30秒后，加入2％(w/v)NBD的乙醇溶液50μl，60℃下反应40分钟。在该反应液中加入1N盐酸30μl，使反应停止。将该反应混合液离心分离后，滤膜过滤除去沉淀后，用高速液相色谱法进行分析，定量分析生成的顺-3-羟基-L-脯氨酸。
高速液相色谱法按以下条件进行。
流动相10mM柠檬酸(PH4.0)/甲醇＝3/1(v/v)流速1ml/分柱YMC Pack ODS AQ-312(YMC社制、6×150mm)柱温50℃检测萤光检测，激发波长503nm、萤光波长541nm如表1所示，转化子大肠杆菌ATCC12435 pTH50与作为基因源使用的链霉菌TH1株相比，每个细胞产生了约34倍的L-脯氨酸-3-羟化酶。
表1由转化子生产的L-脯氨酸-3-羟化酶活性菌株 细胞活性1)相对活性2)大肠杆菌ATCC12435/pTH50 1.94 34.0大肠杆菌ATCC12435/pBluescriptII KS(+)未检出 -链霉菌TH13)0.05711)细胞活性以每1mg湿细胞的酶活性(U/mg Wet Cells)表示。1U是指每分钟生成1nmol的顺-3-羟基-L-脯氨基的酶活性。
2)相对活性是指将链霉菌TH1株生产的酶活性作为1。
3)在参考例2中记载。②利用含有L-脯氨酸-3-羟化酶II型基因的转化子生产L-脯氨酸-3-羟化酶使用由实施例3得到的质粒pEX1-5，转化大肠杆菌ATCC 12435。将得到的转化子分别接种到含有50μg/ml的氨苄青霉素的3ml TB培养基上，30℃下振荡培养一夜。将该培养液离心分离，得到细胞。该细胞根据需要在-20℃冻结保存，使用时解冻。
将该细胞加入到反应液〔在200mM TES缓冲液(PH7.5)中，含有25mM L-脯氨酸、50mM 2-氧代戊二酸、4mM硫酸亚铁及8mM L-抗坏血酸〕500μl中，使湿细胞量为2.2％(w/v)，35℃下反应15分钟。将反应液在100℃下加热2分钟，使反应停止。
将该反应混合液离心分离，在得到的上清100μl中加入0.3M硼酸缓冲液(PH10.7)100μl、10％(v/v)巯基乙醇水溶液4μl及5％(w/v)邻苯二甲醛(OPA)的乙醇溶液16μl，60℃下放置30秒后，中和溶液。通过该操作，1级氨基酸与OPA反应，但2级氨基酸羟基脯氨酸未受到修饰。将这样处理得到的反应液利用高速液相色谱法进行分析，对产物顺-3-羟基-L-脯氨酸定量测定。高速液相色谱法按如下条件进行。流动相1mM硫酸铜水溶液流速1ml/分柱SUMICHIRAL OA-5000(Sumika Chemical Analysis Service CO.，制，4.6×250mm)柱温38℃将按上述条件光学检测收集的洗脱液直接按以下条件与反应液混合，在反应槽CRB-6A(岛津制作所制)中进行NBD反应，通过萤光法定量测定NBD化的2级氨基酸量。反应液及添加量300mM硼酸、25mMEDTA水溶液(PH9.6)-0.2ml/分1g/lNBD甲醇溶液-0.5ml/分反应温度60℃检测萤光检测、激发波长503nm、萤光波长541nm如表2所示，转化子大肠杆菌ATCC 12435 PEX1-5与作为基因源使用的链霉菌TH1株相比，每个细胞产生约77倍的L-脯氨酸-3-羟化酶。
表2由转化子生产的L-脯氨酸-3-羟化酶活性菌株 细胞活性1)相对活性2)大肠杆菌ATCC12435/pEX1-5 4.42 77.5大肠杆菌ATCC12435/pBluescriptII KS(+)未检出 -链霉菌TH13)0.05711)细胞活性以每1mg的湿细胞的酶活性(U/mg Wet cells)表示。1U是指每分钟生成1nmol的顺-3-羟基-L-脯氨酸的酶活性。2)相对活性是指将链霉菌TH1株生产的酶活性作为1。3)在参考例2中记载。实施例5构建与β-半乳糖苷酶蛋白的融合蛋白表达质粒(1)pTH60质粒的构建用MluI酶切pTH40 DNA 4μg后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于36μl的TE后，使用宝酒造社制的Takara DNABlunting Kit将该DNA的两末端钝化。利用乙醇沉淀法回收该DNA片段，用EcoRI酶切该DNA后进行琼脂糖凝胶电泳，利用琼脂糖凝胶按常法提取含有L-脯氨酸-3-羟化酶的结构基因的约1kb的片段，用prep-A-gene(Biorad社)回收。将该DNA片段溶于10μl TE。
另一方面，将质粒pBlue ScriptII KS(+)DNA 2.4μg用ApaI酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，然后利用凝胶按常法回收纯化DNA片段。使用宝酒造社制Takara DNA Blunting Kit将该DNA片段的2末端钝化，用EcoRI酶切后利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于5μl的TE中。
将上述得到的含有L-脯氨酸-3-羟化酶的结构基因的约1kb的MluI-EcoRI片段，使用宝酒造社制的连接试剂盒，与用ApaI-EcoRI处理的pBluescriptII KS(+)连接。
使用该连接DNA，按照常法转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’株，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，然后在37℃下培养一夜。从生成的该转化子的菌落利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。
结果得到了质粒pTH60，在其中在与lac启动子的转录方向相同的方向上插入了与β-Gal的N末端氨基酸序列融合的L-脯氨酸-3-羟化酶的结构基因(图5)。构建的融合蛋白氨基酸序列中，通过在DNA的连接部分新生成的精氨酸(第22号)，形成了β-Gal的N末端21个氨基酸与L-脯氨酸-3-羟化酶蛋白融合的结构。但是L-脯氨酸-3-羟化酶蛋白的最初氨基酸即蛋氨酸(GTG)被翻译成缬氨酸。融合蛋白的氨基酸序列如序列号15所示。(2)pTH70质粒用AccI酶切pBluescriptII KS(+)DNA 2.4μg，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀(DNA片段)。使用宝酒造社制的Takara DNA Blunting Kit将该DNA片段的两末端钝化，用EcoRI酶切后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于5μl的TE。
将由实施例5(1)得到的含有L-脯氨酸-3-羟化酶的结构基因的约1kb的MluI-EcoRI片段与用AccI-EcoR处理得到的pBluescriptII KS(+)，使用宝酒造社制的连接试剂盒连接。
使用该连接DNA，利用常法转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’株，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上之后，37℃下培养一夜。从生成的该转化子的菌落利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。
结果得到了质粒pTH70，在其中在与lac启动子的转录方向相同的方向上，插入了与β-Gal的N末端氨基酸序列融合的L-脯氨酸-3-羟化酶的结构基因(图6)。构建的融合蛋白氨基酸序列中，通过在DNA的连接部分处新生成的精氨酸(第28号)，形成了β-Gal的N-末端27个氨基酸与L-脯氨酸-3-羟化酶融合的结构。但L-脯氨酸-3-羟化酶蛋白的第一个氨基酸即蛋氨酸(GTG)被翻译成缬氨酸。融合蛋白的氨基酸序列如序列号16所示。(3)pTH80质粒用MluI酶切pTH40 DNA 4μg后，通过乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀(DNA片段)溶于36μg的TE。使用宝酒造社制TakaraDNA Blunting Kit将该DNA片段的两末端钝化，用SacII酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后利用常法提取含有L-脯氨酸-3-羟化酶的结构基因的约0.95kb的片段，用Prep-A-gene(Biorad社)回收，溶于10μl的TE。
另一方面，将质粒pBluescriptII KS(+)DNA 2.4μg用PstI酶切后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该DNA片段溶于36μlTE，使用宝酒造社制Takara DNA Blunting Kit将该DNA片段的两末端钝化，用SacII酶切后，利用乙醇沉淀法得到乙醇沉淀。将该乙醇沉淀溶于5μlTE。
将如上所述得到的含有L-脯氨酸-3-羟化酶的约1kb的MluI-SacII片段，使用宝酒造社制的连接试剂盒，连接到用PstI-SacII处理的pBluescriptIIKS(+)上。
使用该连接DNA，利用常法转化大肠杆菌XL1-Blue MRF’株，将该转化子涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上后，于37℃下培养一夜。从生成的该转化子的菌落利用常法提取质粒，利用限制性内切酶消化确认其结构。
结果得到了质粒pTH80，在其中在与lac启动子的转录方向相同方向上插入了与β-Gal的N末端氨基酸序列融合的L-脯氨酸-3-羟化酶的结构基因(图7)。构建的融合蛋白氨基酸序列中，通过在DNA的连接部分处新生成的精氨酸(第38号)，形成了β-Gal的N末端37个氨基酸与L-脯氨酸-3-羟化酶蛋白融合的结构。但作为L-脯氨酸-3-羟化酶蛋白的起始氨基酸的蛋氨酸(GTG)被翻译成缬氨酸。融合蛋白的氨基酸序列如序列号17所示。实施例6利用含有融合蛋白表达质粒的转化子生产L-脯氨酸-3-羟化酶使用由实施例5得到的质粒pTH60、pTH70及pTH80，转化大肠杆菌ATCC12435。按照实施例4的方法，检测得到的转化子的培养与该转化子的L-脯氨酸-3-羟化酶的生产率。
如表3所示，该转化子与作为基因源使用的链霉菌TH1株相比，每个细胞生产了46～121倍的L-脯氨酸-3-羟化酶。
表3由转化子生产的L-脯氨酸-3-羟化酶活性菌株 细胞活性1)相对活性2)大肠杆菌ATCC12435/pTH605.1991.1大肠杆菌ATCC12435/pTH706.90121.1大肠杆菌ATCC12435/pTH80 2.63 46.1大肠杆菌ATCC12435/pBluescriptIIKS(+)未检出 -链霉菌TH13)0.0571.01)细胞活性以每1mg湿细胞的酶活性(U/mg wetcells)表示。1U是指每分钟生成1nmol的顺-3-羟基-L-脯氨酸的酶活性。2)相对活性是指将链霉菌TH1株生产的酶活性作为1。3)在参考例2中记载。实施例7利用转化子生产顺-3-羟基-L-脯氨酸(1)使用转化子大肠杆菌ATCC12435/pTH 70生产顺-3-羟基-L-脯氨酸使用由实施例6得到的转化子大肠杆菌ATCC12435/pTH70生产顺-3-羟基-L-脯氨酸。
将该转化子接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的3ml的TB培养基(在1升的蒸馏水中含有细菌培养用胰化蛋白胨12g、细菌培养用酵母提取物24g、甘油4g、磷酸二氢钾2.3g、磷酸氢二钾12.5g，120℃灭菌20分钟)中，30℃振荡培养16小时。将该培养液离心分离，定量测定得到的上清中的顺-3-羟基-L-脯氨酸的量。
结果，在大肠杆菌ATCC12435/pTH的培养液上清中生成了620μM(81.2mg/l)的顺-3-羟基-L-脯氨酸。
另一方面，在作为宿主使用的大肠杆菌ATCC12435的培养液上清中未检测到顺-3-羟基-L-脯氨酸。(2)使用转化子大肠杆菌ATCC12435/pTH70生产顺-3-羟基-L-脯氨酸将转化子大肠杆菌ATCC12435/pTH70接种在含有100μg/ml氨苄青霉素的50ml Med 4培养基中，30℃下振荡培养16小时。
将该培养液作为种子培养液，接种到装入了2升的Med 6培养基的5升发酵缸中。再添加L-Pro 200mM及氨苄青霉素100μg/ml，在培养温度30℃、搅拌数400转/分、通气量1升/培养液1升/分的条件下运转。
在培养中要适时添加葡萄糖和L-脯氨酸，以保证葡萄糖经常存在及L-脯氨酸的浓度为50mM，使用NH4OH调节PH的下限为6.5。
将该培养液离心分离，定量测定得到的上清中的顺-3-羟基-L-脯氨酸。培养72小时后，在大肠杆菌ATCC12435/pTH70的培养液上清中生成并蓄积了115mM(15g/L)的顺-3-羟基-L-脯氨酸。
另一方面，在作为宿主使用的大肠杆菌ATCC12435的培养上清中未检测到游离的顺-3-羟基-L-脯氨酸。实施例8使用转化子从L-脯氨酸转化成顺-3-羟基-L-脯氨酸使用由实施例6得到的转化子大肠杆菌ATCC12435/pTH70，从L-脯氨酸转化成顺-3-羟基-L-脯氨酸。
将该转化子接种到含有50μg/ml的氨苄青霉素的10ml LB培养基中，30℃下振荡培养一夜。将7ml该培养液离心分离，得到细胞(湿细胞)。将该细胞根据需要在-20℃下冷冻保存，使用时解冻。
将该细胞加入到500μl的反应液〔在200mM的TES缓冲液(PH7.5)中，含有24mM L-脯氨酸、24mM 2-氧代戊二酸、4mM硫酸亚铁及8mM L-抗坏血酸〕中，使湿细胞含量为10％(w/v)，35℃下反应60分钟。定量测定在反应液中生成的顺-3-羟基-L-脯氨酸的含量，结果是生成了17.7mM(2.3g/l)的顺-3-羟基-L-脯氨酸。参考例1 L-脯氨酸-3-羟化酶的分离和精制(1)链霉菌TH1的冻结细胞的制备将10mlSR3培养基(含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母提取物0.5％、胰化蛋白胨0.5％、肉膏0.3％及磷酸镁0.05％，用6N NaOH调节PH为7.2的培养基)注入试管中，120℃灭菌20分钟。在该培养基中用接种环接种生长在HT琼脂平板培养基(含有可溶性淀粉1％、NZ胺0.2％、酵母提取物0.1％、肉膏0.1％及琼脂1.5％，用6N NaOH调节至PH7.2后，120℃灭菌20分钟得到的培养基)上的链霉菌TH1，28℃下振荡培养2天，作为种子培养液使用。将该种子培养液再分别注入2升的三角烧瓶中，接种到120℃下灭菌20分钟的200ml的SR3培养基中，28℃下振荡培养2天。将该培养液无菌接种到在5升的发酵缸中的2升的Df3培养基(含有可溶性淀粉5％、玉米浸液3.0％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁7水和物0.05％及碳酸钙0.5％，用6N NaOH调节PH至7.0的培养基)中，在700rpm、1vvm的条件下28℃下培养2天。在培养过程中不调节PH。将得到的培养液在1500xg、4℃的条件下离心分离10分钟，每1升培养液得到湿细胞75。将该湿细胞在4℃下用生理盐水洗涤后离心分离，在-80℃下冻结保存，使用时熔解。(2)无细胞提取液的制备将由(1)得到的冻结细胞30g溶解后，在冰冷下悬浮在200ml的缓冲液(A)〔含有二硫苏糖醇(DTT)1mM、0.2mM EDTA、0.1％(v/v)Tween 20及10％(v/v)甘油的20mM哌嗪缓冲液(用6N HCl调节PH为5.3)〕中。将悬浮液中的细胞在冰冷下超声波破碎，4℃、30000xg、离心30分钟后，得到上清。
之后的操作全部在冰冷下～4℃的温度范围内进行。(3)利用柱色谱法的分离及精制(3)-1酸处理将由上述工序得到的上清液用6N盐酸调节PH为4.5后，将生成的沉淀以15000xg、30分钟离心除去，得到上清。(3)-2 Resource Q柱色谱法(I)将由上述工序得到的上清通过用缓冲液(A)平衡的Pharmacia社制的Resource Q柱(RESOURCETMQ，6ml)。用缓冲液(A)洗涤后，将含有该酶的级分用在缓冲液(A)中制成的0～0.3M的食盐直线浓度梯度洗脱。(3)-3 Resource Q柱色谱法(II)将由上述工序得到的活性级分用缓冲液(B)〔含有1mM DTT、0.2mM EDTA及10％(v/v)甘油的20mM TES缓冲液(调节PH为7.5)〕稀释3倍后，通过用缓冲液(B)平衡的Pharmacia社制的Resource Q柱(RESOURCETMQ，1ml)。缓冲液(B)洗涤后，用在缓冲液(B)中制成的0～0.3M的食盐的直线浓度梯度将含有该酶的级分洗脱出来。(3)-4苯基琼脂糖凝胶色谱法在由上述工序得到的活性级分中加入NaCl至浓度为2M，通过用含有2M食盐的缓冲液(B)平衡的苯基琼脂糖凝胶柱(Phenyl Sepharose HPHiload，1ml)。用含有2M食盐的缓冲液(B)洗涤后，将含有该酶的级分用含有0.1％(v/v)Tween 20的缓冲液(B)洗脱。(3)-5 Resource Q柱色谱法(III)将由上述工序得到的活性级分用以缓冲液(A)平衡的Pharmacia社制的PD-10柱脱盐后，通过用缓冲液(A)平衡的Pharmacia社制的Resource Q柱(RESOORCETMQ，1ml)。用缓冲液(A)洗涤后，使用在缓冲液(A)中制成的0～0.3M的食盐的直线浓度梯度将含有该酶的级分洗脱出来。(3)-6 Resource Q柱色谱法(IV)将由上述工序得到的活性级分用含有0.1％(v/v)Tween 20的缓冲液(B)稀释3倍后，通过用缓冲液(B)平衡的Pharmacia社制的ResourceQ柱(RESOURCETMQ，1ml)。用缓冲液(B)洗涤后，使用在缓冲液(B)中制成的0～0.3M的食盐的直线浓度梯度将含有该酶的级分洗脱出来。
L-脯氨酸-3-羟化酶的分离及精制的概要如表4所示。
表4L-脯氨酸-3-羟化酶的分离及精制的概要级分 总蛋白 总活性 相对活性 收率(mg)(U) (U/mg蛋白) (％)无细胞提取液 54235407.5100PH4.5处理上清 106180017 56ResourceQ(I)PH5.3 7.5153320744ResourceQ(II)PH7.5 3.3103630629苯基琼脂糖凝胶 0.43 188 4375.3ResourceQ(III)PH5.30.16 90.55662.6ResourceQ(IV)PH7.5 0.035 60.31723 1.7参考例2利用链霉菌生产L-脯氨酸-3-羟化酶将10mlSR3培养基注入试管中，120℃灭菌20分钟。在该培养基中用一接种环接种生长在HT琼脂平板培养基上的链霉菌TH1，28℃振荡培养2天，作为种子培养液使用。
另一方面，将10ml Df3培养基注入试管中，120℃灭菌20分钟。在该培养基中无菌接种种子培养液1ml，28℃振荡培养2天。将得到的培养液8000rpm、4℃下离心分离10分钟。将得到的细胞悬浮在80mM TES〔N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸〕缓冲液(PH7.5)中洗涤后，离心分离，得到湿细胞。将该湿细胞1.0g悬浮在10ml的反应液〔在100mM的TES缓冲液(含有50mM L-脯氨酸、5mM 2-氧代戊二酸、5mM L-抗坏血酸、1mM硫酸亚铁，PH7.5)中加入Nymeen溶液(在10ml二甲苯中溶解4g Nymeen S-215(日本油脂株式会社制))〕中，30℃下反应30分钟。反应后从细胞反应液中离心分离除去细胞后，定量测定在上清液中生成的顺-3-羟基-L-脯氨酸的含量。结果如表1所示。
利用本发明，可以提供工业上制造作为药品或食品添加剂合成原料有用的顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，用于该方法的编码具有L-脯氨酸-3-羟化酶活性的蛋白的基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的转化子，使用该转化子制造L-脯氨酸-3-羟化酶的方法，以及该L-脯氨酸-3-羟化酶。序列表序列号1序列长度290序列类型氨基酸链数直链状序列种类蛋白质(protein)起源生物名链霉菌株名TH1序列Met Arg Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu1 5 10 15Gly Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val Glu Glu Glu20 25 30Tyr Asp Glu Phe Ser Asn Gly Phe Trp Lys Asn Ile Pro Leu Tyr Asn35 40 45Ala Ser Gly Gly Ser Glu Asp Arg Leu Tyr Arg Asp LeuGlu Gly Ser50 55 60Pro Ala Gln Pro Thr Lys His Ala Glu Gln Val Pro Tyr Leu Asn Glu65 70 75 80Ile Ile Thr Thr Val Tyr Asn Gly Glu Arg Leu Gln Met Ala Arg Thr85 90 95Arg Asn Leu Lys Asn Ala Val Val Ile Pro His Arg Asp Phe Val Glu100 105 110Leu Asp Arg Glu Leu Asp Gln Tyr Phe Arg Thr His Leu Met Leu Glu115 120 125Asp Ser Pro Leu Ala Phe His Ser Asp Asp Asp Thr Val Ile His Met130 135 140Arg Ala Gly Glu Ile Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala Val His Ser Ala145 150 155 160Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Arg Gln Ser Leu Cys Val Asp Leu Ala165 170 175Phe Asp Gly Ala Phe Asp Glu Lys Glu Ala Phe Ala Asp Ala Thr Val180 185 190Tyr Ala Pro Asn Leu Ser Pro Asp Val Arg Glu Arg Lys Pro Phe Thr195 200 205Lys Glu Arg Glu Ala Gly Ile Leu Ala Leu Ser Gly Val Ile Gly Arg210 215 220Glu Asn Phe Arg Asp Ile Leu Phe Leu Leu Ser Lys Val His Tyr Thr225 230 235 240Tyr Asp Val His Pro Gly Glu Thr Phe Glu Trp Leu Val Ser Val Ser245 250 255Lys Gly Ala Gly Asp Asp Lys Met Val Glu Lys Ala Glu Arg Ile Arg260 265 270Asp Phe Ala Ile Gly Ala Arg Ala Leu Gly Glu Arg Phe Ser Leu Thr275 280 285Thr Trp290序列号2序列长度290序列类型氨基酸链数直链状序列种类蛋白质(protein)起源生物名链霉菌株名TH1序列Met Arg Ser His Ile Leu Gly Lys Ile Glu Leu Asp Gln Thr Arg Leu1 5 10 15Ala Pro Asp Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Val Pro Thr Val Glu Glu Glu20 25 30Tyr Asp Glu Phe Ser Asn Gly Phe Trp Lys His Val Pro Leu Trp Asn35 40 45Ala Ser Gly Asp Ser Glu Asp Arg Leu Tyr Arg Asp Leu Lys Asp Ala50 55 60Ala Ala Gln Pro Thr Ala His Val Glu His Val Pro Tyr Leu Lys Glu65 70 75 80Ile Val Thr Thr Val Phe Asp Gly Thr His Leu Gln Met Ala Arg Ser85 90 95Arg Asn Leu Lys Asn Ala Ile Val Ile Pro His Arg Asp Phe Val Glu100 105 110Leu Asp Arg Glu Val Asp Arg Tyr Phe Arg Thr Phe Met Val Leu Glu115 120 125Asp Ser Pro Leu Ala Phe His Ser Asn Glu Asp Thr Val Ile His Met130 135 140Arg Pro Gly Glu Ile Trp Phe Leu Asp Ala Ala Thr Val His Ser Ala145 150 155 160Val Asn Phe Ser Glu Ile Ser Arg Gln Ser Leu Cys Val Asp Phe Ala165 170 175Phe Asp Gly Pro Phe Asp Glu Lys Glu Ile Phe Ala Asp Ala Thr Leu180 185 190Tyr Ala Pro Gly Ser Thr Pro Asp Leu Pro Glu Arg Arg Pro Phe Thr195 200 205Ala Glu His Arg Arg Arg Ile Leu Ser Leu Gly Gln Val Ile Glu Arg210 215 220Glu Asn Phe Arg Asp Ile Leu Phe Leu Leu Ser Lys Val His Tyr Lys225 230 235 240Tyr Asp Val His Pro Ser Glu Thr Tyr Asp Trp Leu Ile Glu Ile Ser245 250 255Lys Gln Ala Gly Asp Glu Lys Met Val Val Lys Ala Glu Gln Ile Arg260 265 270Asp Phe Ala Val Glu Ala Arg Ala Leu Ser Glu Arg Phe Ser Leu Thr275 280 285Ser Trp290序列号3序列长度870序列类型核酸链数二条链序列种类基因组DNA起源生物名链霉菌株名TH1序列GTGCGCTCGC ACATACTCGG CCGCATTGAA CTCGACCAGG AACGCTTAGG CAGGGACCTC 60GAATATCTCG CCACGGTGCC CACCGTGGAA GAGGAGTACG ACGAGTTCAG CAACGGGTTC 120TGGAAGAACA TCCCGCTGTA CAACGCGAGC GGCGGCAGCG AGGACCGGCT GTACCGCGAC 180CTCGAGGGCT CACCGGCGCA GCCCACCAAA CACGCCGAGC AGGTTCCGTA CCTCAACGAG 240ATCATCACCA CGGTCTACAA CGGCGAGCGG CTCCAGATGG CGCGTACGCG GAACCTGAAG 300AACGCCGTCG TCATCCCGCA CCGCGACTTC GTGGAGCTCG ACCGCGAACT CGACCAGTAC 360TTCCGCACCC ATTTGATGCT TGAGGACAGC CCGCTGGCCT TCCACTCGGA CGACGACACC 420GTCATCCACA TGCGGGCCGG CGAGATCTGG TTCCTCGACG CGGCCGCCGT CCACTCGGCC 480GTCAACTTCG CCGAGTTCAG CAGGCAGTCG CTCTGCGTCG ACCTCGCCTT CGACGGCGCG 540TTCGACGAGA AGGAAGCCTT CGCGGACGCC ACGGTCTACG CCCCGAACCT CAGCCCCGAC 600GTCCGCGAAC GCAAGCCGTT CACCAAGGAG CGGGAGGCCG GGATCCTCGC CCTGTCCGGC 660GTGATCGGAC GCGAGAACTT CCGGGACATC CTCTTTCTGC TGTCCAAGGT CCACTACACC 720TACGACGTCC ATCCGGGTGA AACCTTCGAG TGGCTCGTGA GCGTCTCCAA GGGTGCGGGA 780GACGACAAGA TGGTGGAGAA GGCCGAGCGG ATCAGGGACT TCGCCATCGG CGCACGGGCA 840CTCGGCGAGC GTTTCTCGCT GACCACCTGG 870序列号4序列长度870序列类型核酸链数二条链序列种类基因组DNA起源生物名链霉菌株名TH1序列ATGCGCTCGC ACATCCTTGG CAAGATCGAA CTCGATCAGA CCCGGTTGGC GCCGGATCTC 60GCATACCTCG CCGCAGTTCC GACCGTGGAG GAGGAGTACG ACGAGTTCAG CAACGGGTTC 120TGGAAGCACG TGCCCCTGTG GAACGCCTCC GGGGACAGCG AGGACCGGCT CTACCGCGAC 180CTCAAGGACG CCGCCGCACA GCCGACCGCG CACGTGGAGC ACGTCCCCTA CCTCAAGGAG 240ATCGTGACCA CGGTCTTCGA CGGCACGCAC CTGCAGATGG CGCGGAGCCG GAACCTGAAG 300AACGCCATCG TCATCCCGCA CCGCGACTTC GTGGAGCTGG ACCGCGAAGT CGACCGGTAC 360TTCCGCACGT TCATGGTGCT GGAGGACAGC CCGCTCGCCT TCCACTCGAA CGAGGACACC 420GTCATCCACA TGCGCCCGGG CGAAATATGG TTCCTGGACG CGGCGACGGT GCACTCCGCG 480GTCAACTTCT CGGAAATCAG CCGTCAGTCC CTGTGCGTCG ACTTCGCCTT CGACGGTCCC 540TTCGACGAGA AGGAGATCTT CGCGGACGCC ACCCTCTACG CTCCGGGCTC CACGCCCGAC 600CTGCCCGAGC GCCGCCCCTT CACCGCGGAG CACCGGCGGC GGATCCTCTC CCTGGGCCAG 660GTGATCGAGC GGGAGAACTT CCGGGACATT CTGTTCCTGC TGTCCAAGGT GCACTACAAG 720TACGACGTGC ACCCCAGCGA GACGTACGAC TGGCTGATCG AGATCTCGAA ACAGGCCGGC 780GACGAGAAGA TGGTCGTGAA GGCGGAGCAG ATCAGGGACT TCGCCGTCGA GGCCCGCGCC 840CTGAGCGAGC GCTTCTCCCT GACCTCCTGG 870序列号5序列长度29序列类型氨基酸链数直链状序列种类肽片段类型N末端片段起源生物名链霉菌株名TH1序列Met Xaa Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu1 5 10 15Gly Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val20 25序列号6序列长度25序列类型氨基酸链数直链状序列种类肽片段类型中间部分片段起源生物名链霉菌株名TH1序列Glu Ala Phe Ala Asp Ala Thr Val Tyr Ala Pro Asn Leu Ser Pro Asp1 5 10 15Val Arg Glu Arg Lys Pro Phe Thr Lys20 25序列号7序列长度25序列类型氨基酸链数直链状序列种类肽片段类型中间部分片段起源生物名链霉菌株名TH1序列Asn Ile Pro Leu Tyr Asn Ala Ser Gly Gly Ser Glu Asp Arg Leu Tyr1 5 10 15Arg Asp Leu Glu Gly Ser Pro Ala Gln20 25序列号8序列长度17序列类型核酸拓扑结构1条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列ATGTGYTCNC AYATHYT 17序列号9序列长度14序列类型核酸拓扑结构1条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GTNGGNACNG TWGC 14序列号10序列长度14序列类型核酸拓扑结构1条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GTNGCNAGRT AYTC14序列号11序列长度74序列类型核酸链数二条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列ATG TGT TCG CAT ATA CTC GGC CGC ATT GAA CTC GAC CAG GAA CGC TTA48Met Cys Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu1 5 10 15GGC AGG GAC CTC GAA TAC CTC GCC AC 74Gly Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala20序列号12序列长度74序列类型核酸链数二条链序列种类其它的核酸、合成DNA序列ATG TGC TCG CAT ATC CTT GGC AAG ATC GAA CTC GAT CAG ACC CGG TTG48Met Cys Ser His Ile Leu Gly Lys Ile Glu Leu Asp Gln Thr Arg Leu1 5 10 15GCG CCG GAT CTC GAG TAC CTC GCC AC 74Ala Pro Asp Leu Glu Tyr Leu Ala20序列号13序列长度1081序列类型核酸链数二条链序列种类基因组DNA起源生物名链霉菌株名TH1序列GGTACCCATT CCGTCACCGA AAGCTGAACT CGACACCAGG AGGACGACGC GTGCGCTCGC 60ACATACTCGG CCGCATTGAA CTCGACCAGG AACGCTTAGG CAGGGACCTC GAATATCTCG120CCACGGTGCC CACCGTGGAA GAGGAGTACG ACGAGTTCAG CAACGGGTTC TGGAAGAACA180TCCCGCTGTA CAACGCGAGC GGCGGCAGCG AGGACCGGCT GTACCGCGAC CTCGAGGGCT240CACCGGCGCA GCCCACCAAA CACGCCGAGC AGGTTCCGTA CCTCAACGAG ATCATCACCA300CGGTCTACAA CGGCGAGCGG CTCCAGATGG CGCGTACGCG GAACCTGAAG AACGCCGTCG360TCATCCCGCA CCGCGACTTC GTGGAGCTCG ACCGCGAACT CGACCAGTAC TTCCGCACCC420ATTTGATGCT TGAGGACAGC CCGCTGGCCT TCCACTCGGA CGACGACACC GTCATCCACA480TGCGGGCCGG CGAGATCTGG TTCCTCGACG CGGCCGCCGT CCACTCGGCC GTCAACTTCG540CCGAGTTCAG CAGGCAGTCG CTCTGCGTCG ACCTCGCCTT CGACGGCGCG TTCGACGAGA600AGGAAGCCTT CGCGGACGCC ACGGTCTACG CCCCGAACCT CAGCCCCGAC GTCCGCGAAC660GCAAGCCGTT CACCAAGGAG CGGGAGGCCG GGATCCTCGC CCTGTCCGGC GTGATCGGAC720GCGAGAACTT CCGGGACATC CTCTTTCTGC TGTCCAAGGT CCACTACACC TACGACGTCC780ATCCGGGTGA AACCTTCGAG TGGCTCGTGA GCGTCTCCAA GGGTGCGGGA GACGACAAGA840TGGTGGAGAA GGCCGAGCGG ATCAGGGACT TCGCCATCGG CGCACGGGCA CTCGGCGAGC900GTTTCTCGCT GACCACCTGG TAGACGGCCG AAGAACGGGG CCCGGGGGAA CAGTGATCGA960GGAGATACTT CCCGTCGACG TGATGTCCGC GGAGGCGTTC GACGACGATG CGGACATCCA1020GCTCTTCGCC GAGGAACGCG CGGCCGTCGC CGATGCCGTA CCGCGGCGCC GACGGGAATT1080C序列号14序列长度1826序列类型核酸链数二条链序列种类基因组DNA起源生物名链霉菌株名TH1序列TCGCGACCTG GAGGGTCGGA TGCGCTCGCA CATCCTTGGC AAGATCGAAC TCGATCAGAC60CCGGTTGGCG CCGGATCTCG CATACCTCGC CGCAGTTCCG ACCGTGGAGG AGGAGTACGA120CGAGTTCAGC AACGGGTTCT GGAAGCACGT GCCCCTGTGG AACGCCTCCG GGGACAGCGA180GGACCGGCTC TACCGCGACC TCAAGGACGC CGCCGCACAG CCGACCGCGC ACGTGGAGCA240CGTCCCCTAC CTCAAGGAGA TCGTGACCAC GGTCTTCGAC GGCACGCACC TGCAGATGGC 300GCGGAGCCGG AACCTGAAGA ACGCCATCGT CATCCCGCAC CGCGACTTCG TGGAGCTGGA 360CCGCGAAGTC GACCGGTACT TCCGCACGTT CATGGTGCTG GAGGACAGCC CGCTCGCCTT 420CCACTCGAAC GAGGACACCG TCATCCACAT GCGCCCGGGC GAAATATGGT TCCTGGACGC 480GGCGACGGTG CACTCCGCGG TCAACTTCTC GGAAATCAGC CGTCAGTCCC TGTGCGTCGA 540CTTCGCCTTC GACGGTCCCT TCGACGAGAA GGAGATCTTC GCGGACGCCA CCCTCTACGC 600TCCGGGCTCC ACGCCCGACC TGCCCGAGCG CCGCCCCTTC ACCGCGGAGC ACCGGCGGCG 660GATCCTCTCC CTGGGCCAGG TGATCGAGCG GGAGAACTTC CGGGACATTC TGTTCCTGCT 720GTCCAAGGTG CACTACAAGT ACGACGTGCA CCCCAGCGAG ACGTACGACT GGCTGATCGA 780GATCTCGAAA CAGGCCGGCG ACGAGAAGAT GGTCGTGAAG GCGGAGCAGA TCAGGGACTT 840CGCCGTCGAG GCCCGCGCCC TGAGCGAGCG CTTCTCCCTG ACCTCCTGGT AATGGCGCGA 900CCTCAGCCCG CGTGACAACA GTTCGGCCCC GGTGGCGCGG NGCGTCCCGG ACGCGCGCCG 960GNCGCTACCG GACACCGGGG CACGTAGGTG GTGTACCGNC TGNCGGTCTC CGGCAGTCAG 1020TTGCTGGTTC GACTCCAGCT GCCCCGACCG CCTCGCGCTC GGACGCGACC CCGGGCACCT 1080CCGNGGGCAC CGCGTTCGCA TCACGGACAC CCCACCCACA CCAGCCGGGC CCACCCGAGG 1140AGCCAGTTCA CATGTCCAGT GACATACACG CGGCGGCATC CAGACCGATT CCGCCGAAGC 1200CCGCCGCATC GACGGAGGTC GCGCCGCGCA CGCTGGTCAG CCGGCTGCCC TCGCTGACCG 1260GCCTGCGCTT CCCGGCGGCG TTCATCGTGT TCCTCTTCCA CGCCTCGCTG CCGTTTCCCG 1320CGGTGCGCCT GTTCGCCGAC GACGGGGTGG AACACCGCTA CGGGTGGGCC CTCGGCCCGA 1380GCGGCGCACT CGGCGTGACG TTCTTCTTCG CGCTCAGCGG ATTCGTGCTG ACGTGGTCGG 1440CTCCCGCCGG CGACACCGCA CCGTCCTTCT GGCGCCGGCG CTTCGTCAAG ATCCTGCCCA 1500ACTACGTCGT CGCGTGGGTC CTGGCGATGG TGCTGTACGC GGCCGCGACG CCCGTCCTGC 1560CCGCGCTCGG CGCCCTTTTC ATGCTCCAGG TGTGGACGCC GTACTTCACC GAGCACCTCC 1620CGGTGAACCC ACCGAGCTGG TCGCTGNCCG TGGAAGCCGT CTTCTATCTG GCCTTCCCGT 1680TCCTGCTGGC CGGGATCAGA CGGATACCGG CCGCCCGGCT GAAGTACTGG ATCGCCGGCA 1740CGGTGGCCGC CGTCTTCGCC ACGCCGCTGA TCACCTACCT CCTGGTGCCG GCGGGCCCGC 1800ACGTGATGCC GGGCACGGGC GGTACC 1826序列号15序列长度312序列类型氨基酸链数直链状序列种类蛋白质(protein)起源生物名链霉菌株名TH1序列的特征表示特征的记号肽存在位置23..312决定特征的方法S起源生物名大肠杆菌直接起源pBluescriptIIKS+序列的特征表示特征的记号肽存在位置1..21(22为DNA连接部)决定特征的方法S序列Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Ala Gln Leu Thr Leu Thr Lys Gly Asn1 5 10 15Lys Ser Trp Val Pro Arg Val Arg Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu20 25 30Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val35 40 45Pro Thr Val Glu Glu Glu Tyr Asp Glu Phe Ser Asn Gly Phe Trp Lys50 55 60Asn Ile Pro Leu Tyr Asn Ala Ser Gly Gly Ser Glu Asp Arg Leu Tyr65 70 75 80Arg Asp Leu Glu Gly Ser Pro Ala Gln Pro Thr Lys His Ala Glu Gln85 90 95Val Pro Tyr Leu Asn Glu Ile Ile Thr Thr Val Tyr Asn Gly Glu Arg100 105 110Leu Gln Met Ala Arg Thr Arg Asn Leu Lys Asn Ala Val Val Ile Pro115 120 125His Arg Asp Phe Val Glu Leu Asp Arg Glu Leu Asp Gln Tyr Phe Arg130 135 140Thr His Leu Met Leu Glu Asp Ser Pro Leu Ala Phe His Ser Asp Asp145 150 155 160Asp Thr Val Ile His Met Arg Ala Gly Glu Ile Trp Phe Leu Asp Ala165 170 175Ala Ala Val His Ser Ala Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Arg Gln Ser180 185 190Leu Cys Val Asp Leu Ala Phe Asp Gly Ala Phe Asp Glu Lys Glu Ala195 200 205Phe Ala Asp Ala Thr Val Tyr Ala Pro Asn Leu Ser Pro Asp Val Arg210 215 220Glu Arg Lys Pro Phe Thr Lys Glu Arg Glu Ala Gly Ile Leu Ala Leu225 230 235 240Ser Gly Val Ile Gly Arg Glu Asn Phe Arg Asp Ile Leu Phe Leu Leu245 250 255Ser Lys Val His Tyr Thr Tyr Asp Val His Pro Gly Glu Thr Phe Glu260 265 270Trp Leu Val Ser Val Ser Lys Gly Ala Gly Asp Asp Lys Met Val Glu275 280 285Lys Ala Glu Arg Ile Arg Asp Phe Ala Ile Gly Ala Arg Ala Leu Gly290 295 300Glu Arg Phe Ser Leu Thr Thr Trp305 310序列号16序列长度318序列类型氨基酸链数直链状序列种类蛋白质(protein)起源生物名链霉菌株名TH1序列的特征表示特征的记号肽存在位置29..318决定特征的方法S起源生物名大肠杆菌直接起源pBluescriptIIKS+序列的特征表示特征的记号肽存在位置1..27(28为DNA连接部)决定特征的方法S序列Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Ala Gln Leu Thr Leu Thr Lys Gly Asn1 5 10 15Lys Ser Trp Val Pro Gly Pro Pro Ser Arg Ser Arg Val Arg Ser His20 25 30Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly Arg Asp Leu35 40 45Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val Glu Glu Glu Tyr Asp Glu Phe50 55 60Ser Asn Gly Phe Trp Lys Asn Ile Pro Leu Tyr Asn Ala Ser Gly Gly65 70 75 80Ser Glu Asp Arg Leu Tyr Arg Asp Leu Glu Gly Ser Pro Ala Gln Pro85 90 95Thr Lys His Ala Glu Gln Val Pro Tyr Leu Asn Glu Ile Ile Thr Thr100 105 110Val Tyr Asn Gly Glu Arg Leu Gln Met Ala Arg Thr Arg Asn Leu Lys115 120 125Asn Ala Val Val Ile Pro His Arg Asp Phe Val Glu Leu Asp Arg Glu130 135 140Leu Asp Gln Tyr Phe Arg Thr His Leu Met Leu Glu Asp Ser Pro Leu145 150 155 160Ala Phe His Ser Asp Asp Asp Thr Val Ile His Met Arg Ala Gly Glu
165 170 175Ile Trp Phe Leu Asp Ala Ala Ala Val His Ser Ala Val Asn Phe Ala180 185 190Glu Phe Ser Arg Gln Ser Leu Cys Val Asp Leu Ala Phe Asp Gly Ala195 200 205Phe Asp Glu Lys Glu Ala Phe Ala Asp Ala Thr Val Tyr Ala Pro Asn210 215 220Leu Ser Pro Asp Val Arg Glu Arg Lys Pro Phe Thr Lys Glu Arg Glu225 230 235 240Ala Gly Ile Leu Ala Leu Ser Gly Val Ile Gly Arg Glu Asn Phe Arg245 250 255Asp Ile Leu Phe Leu Leu Ser Lys Val His Tyr Thr Tyr Asp Val His260 265 270Pro Gly Glu Thr Phe Glu Trp Leu Val Ser Val Ser Lys Gly Ala Gly275 280 285Asp Asp Lys Met Val Glu Lys Ala Glu Arg Ile Arg Asp Phe Ala Ile290 295 300Gly Ala Arg Ala Leu Gly Glu Arg Phe Ser Leu Thr Thr Trp305 310 315序列号17序列长度328序列类型氨基酸链数直链状序列种类蛋白质(protein)起源生物名链霉菌株名TH1序列的特征表示特征的记号肽存在位置38..328决定特征的方法S起源生物名大肠杆菌直接起源pBluescriptIIKS+序列的特征表示特征的记号肽存在位置1..37(38为DNA连接部)决定特征的方法S序列Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Ala Gln Leu Thr Leu Thr Lys Gly Asn1 5 10 15Lys Ser Trp Val Pro Gly Pro Pro Ser Arg Ser Thr Val Ser Ile Ser20 25 30Leu Ile Ser Asn Ser Arg Val Arg Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu35 40 45Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val50 55 60Pro Thr Val Glu Glu Glu Tyr Asp Glu Phe Ser Asn Gly Phe Trp Lys65 70 75 80Asn Ile Pro Leu Tyr Asn Ala Ser Gly Gly Ser Glu Asp Arg Leu Tyr85 90 95Arg Asp Leu Glu Gly Ser Pro Ala Gln Pro Thr Lys His Ala Glu Gln100 105 110Val Pro Tyr Leu Asn Glu Ile Ile Thr Thr Val Tyr Asn Gly Glu Arg115 120 125Leu Gln Met Ala Arg Thr Arg Asn Leu Lys Asn Ala Val Val Ile Pro130 135 140His Arg Asp Phe Val Glu Leu Asp Arg Glu Leu Asp Gln Tyr Phe Arg145 150 155 160Thr His Leu Met Leu Glu Asp Ser Pro Leu Ala Phe His Ser Asp Asp165 170 175Asp Thr Val Ile His Met Arg Ala Gly Glu Ile Trp Phe Leu Asp Ala180 185 190Ala Ala Val His Ser Ala Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Arg Gln Ser195 200 205Leu Cys Val Asp Leu Ala Phe Asp Gly Ala Phe Asp Glu Lys Glu Ala210 215 220Phe Ala Asp Ala Thr Val Tyr Ala Pro Asn Leu Ser Pro Asp Val Arg225 230 235 240Glu Arg Lys Pro Phe Thr Lys Glu Arg Glu Ala Gly Ile Leu Ala Leu245 250 255Ser Gly Val Ile Gly Arg Glu Asn Phe Arg Asp Ile Leu Phe Leu Leu260 265 270Ser Lys Val His Tyr Thr Tyr Asp Val His Pro Gly Glu Thr Phe Glu275 280 285Trp Leu Val Ser Val Ser Lys Gly Ala Gly Asp Asp Lys Met Val Glu290 295 300Lys Ala Glu Arg Ile Arg Asp Phe Ala Ile Gly Ala Arg Ala Leu Gly305 310 315 320Glu Arg Phe Ser Leu Thr Thr Trp32权利要求
1.编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性并在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下作用于游离L-脯氨酸生成顺-3-羟基-L-脯氨酸的蛋白的基因。
2.根据权利要求1的基因，其中该基因编码具有序列号1、2、15、16和17中任一氨基酸序列的蛋白，或编码在选自序列号1、2、15、16和17的任一氨基酸序列中有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的蛋白。
3.根据权利要求1的基因，其中该基因选自序列号3、4、13和14的DNA。
4.根据权利要求1的基因，其中该基因来自属于链霉菌属或芽孢杆菌属的微生物。
5.根据权利要求4的基因，其中微生物选自链霉菌S.canusATCC12647、链霉菌S.canus ATCC12646、链霉菌TH1(FERM BP-4399)、芽孢杆菌TH2(FERM BP-4397)、芽孢杆菌TH3(FERM BP-4398)。
6.一种重组DNA，它通过将含有编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性并在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下作用于游离L-脯氨酸生成顺-3-羟基-L-脯氨酸的蛋白的基因的DNA片段插入载体构建而成。
7.根据权利要求6的重组DNA，其中所述基因编码具有序列号1、2、15、16和17中任一氨基酸序列的蛋白，或编码在选自序列号1、2、15、16和17的任一氨基酸序列中有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的蛋白。
8.根据权利要求6的重组DNA，其中所述基因选自序列号3、4、13和14的DNA。
9.根据权利要求6的重组DNA，其中所述基因来自属于链霉菌属或芽孢杆菌属的微生物。
10.根据权利要求9重组DNA，其中微生物选自链霉菌S.canusATCC12647、链霉菌S.canus ATCC12646、链霉菌TH1(FERM BP-4399)、芽孢杆菌TH2(FERM BP-4397)、芽孢杆菌TH3(FERM BP-4398)。
11.一种含有重组DNA的转化子，其中重组DNA通过将含有编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性并在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下作用于游离L-脯氨酸生成顺-3-羟基-L-脯氨酸的蛋白的基因的DNA片段插入载体构建而成。
12.根据权利要求11的转化子，其中所述基因编码具有序列号1、2、15、16和17中任一氨基酸序列的蛋白，或编码在选自序列号1、2、15、16和17的任一氨基酸序列中有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的蛋白。
13.根据权利要求11的转化子，其中所述基因选自序列号3、4、13和14的DNA。
14.根据权利要求11的转化子，其中所述基因来自属于链霉菌属或芽孢杆菌属的微生物。
15.根据权利要求14的转化子，其中微生物选自链霉菌S.canusATCC12647、链霉菌S.canus ATCC12646、链霉菌TH1(FERM BP-4399)、芽孢杆菌TH2(FERM BP-4397)、芽孢杆菌TH3(FERM BP-4398)。
16.根据权利要求11的转化子，它是大肠杆菌XL2-Blue/pTH30(FERMBP-5026)和大肠杆菌XL2-Blue/pTH75(FERM BP-5409)。
17.具有序列号1、2、15、16和17中任一氨基酸序列，或在选自序列号1、2、15、16和17的任一氨基酸序列中有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，并具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性的蛋白。
18.一种产生L-脯氨酸3-羟化酶的方法，其包括在培养基中培养一种含有重组DNA的转化子，所述重组DNA通过将含有编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性并在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下作用于游离L-脯氨酸生成顺-3-羟基-L-脯氨酸的蛋白的基因的DNA片段插入载体而制成，从而产生并积累L-脯氨酸3-羟化酶，然后从生成的培养物中收集L-脯氨酸3-羟化酶。
19.根据权利要求18的产生L-脯氨酸3-羟化酶的方法，其中向培养基中加入L-脯氨酸。
20.根据权利要求18或19的产生L-脯氨酸3-羟化酶的方法，其中其中所述基因编码具有序列号1、2、15、16和17中任一氨基酸序列的蛋白，或编码在选自序列号1、2、15、16和17的任一氨基酸序列中有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的蛋白。
21.根据权利要求18或19的产生L-脯氨酸3-羟化酶的方法，其中所述基因选自序列号3、4、13和14的DNA。
22.根据权利要求18或19的产生L-脯氨酸3-羟化酶的方法，其中所述基因来自属于链霉菌属或芽孢杆菌属的微生物。
23.根据权利要求22的产生L-脯氨酸3-羟化酶的方法，其中微生物选自链霉菌S.canus ATCC12647、链霉菌S.canus ATCC12646、链霉菌TH1(FERM BP-4399)、芽孢杆菌TH2(FERM BP-4397)、芽孢杆菌TH3(FERM BP-4398)。
24.一种生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其包括在培养基中培养一种含有重组DNA的转化子，所述重组DNA通过将含有编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性并在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下作用于游离L-脯氨酸生成顺-3-羟基-L-脯氨酸的蛋白的基因的DNA片段插入载体构建而成，从而产生并积累顺-3-羟基-L-脯氨酸，然后从形成的培养物中收集顺-3-羟基-L-脯氨酸。
25.根据权利要求24的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生L-脯氨酸并在培养物中积累L-脯氨酸的活性。
26.根据权利要求24的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生2-氧代戊二酸并在培养物中积累2-氧代戊二酸的活性。
27.根据权利要求24的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中向培养基中加入L-脯氨酸。
28.根据权利要求24的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中向培养基中加入L-脯氨酸、2-氧代戊二酸和二价铁离子。
29.根据权利要求24的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述基因编码具有序列号1、2、15、16和17中任一氨基酸序列的蛋白，或编码在选自序列号1、2、15、16和17的任一氨基酸序列中有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的蛋白。
30.根据权利要求24的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述基因选自序列号3、4、13和14的DNA。
31.根据权利要求24的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述基因来自属于链霉菌属或芽孢杆菌属的微生物。
32.根据权利要求31的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中微生物选自链霉菌S.canus ATCC12647、链霉菌S.canus ATCC12646、链霉菌TH1(FERM BP-4399)、芽孢杆菌TH2(FERM BP-4397)、芽孢杆菌TH3(FERM BP-4398)。
33.一种生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中包括在培养基中培养一种含有重组DNA的转化子，所述重组DNA通过将含有编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性并在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下作用于游离L-脯氨酸生成顺-3-羟基-L-脯氨酸的蛋白的基因的DNA片段插入载体构建而成，然后用此培养物、培养的细胞或加工该细胞而制得的产品作为酶源在培养物或含水介质中在2-氧代戊二酸和二价铁离子存在下将L-脯氨酸转化为顺-3-羟基-L-脯氨酸，然后从培养物或含水介质中收集顺-3-羟基-L-脯氨酸。
34.根据权利要求33的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生L-脯氨酸并在培养物中积累L-脯氨酸的活性。
35.根据权利要求33的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述转化子具有从培养基中的糖源产生2-氧代戊二酸并在培养物中积累2-氧代戊二酸的活性。
36.根据权利要求33的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中从培养细胞加工制得的产品选自干燥细胞、冷冻干燥细胞、表面活性剂处理的细胞、酶处理的细胞、超声处理的细胞、机械研磨的细胞、溶剂处理的细胞、分级分离的细胞蛋白、固定化细胞、固定化细胞产物、从细胞提取的具有L-脯氨酸4-位羟化酶活性的粗酶、粗酶的纯化产物和固定化酶。
37.根据权利要求33的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述基因编码具有序列号1、2、15、16和17中任一氨基酸序列的蛋白，或编码在选自序列号1、2、15、16和17的任一氨基酸序列中有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的蛋白。
38.根据权利要求33的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述基因选自序列号3、4、13和14的DNA。
39.根据权利要求33的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中所述基因来自属于链霉菌属或芽孢杆菌属的微生物。
40.根据权利要求39的生产顺-3-羟基-L-脯氨酸的方法，其中微生物选自链霉菌S.canus ATCC12647、链霉菌S.canus ATCC12646、链霉菌TH1(FERM BP-4399)、芽孢杆菌TH2(FERM BP-4397)、芽孢杆菌TH3(FERM BP-4398)。
全文摘要
本发明涉及作为药物和食品添加剂有用的顺-3-羟基-L-脯氨酸的工业生产方法，编码具有L-脯氨酸3-位羟化酶活性之蛋白并可用于上述生产方法的基因，含有该基因的重组DNA，含有该重组DNA的转化子，和使用该转化子生产L-脯氨酸3-羟化酶的方法和该L-脯氨酸-3-羟化酶。
文档编号C12N15/53GK1150822SQ96190355
公开日1997年5月28日 申请日期1996年3月7日 优先权日1995年3月7日
发明者尾崎明夫, 森英郎, 柴崎刚 申请人:协和发酵工业株式会社