发酵生产l－赖氨酸的方法

专利名称：发酵生产l－赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业，特别是涉及经发酵生产L-赖氨酸的方法，用于该生产方法中的DNA和微生物。
背景技术：
在以前的领域中，当L-赖氨酸用发酵法生产时，为了提高产率，使用从自然环境中分离的微生物菌株或用由此微生物菌株得到的人工突变株。已知的生产L-赖氨酸的人工突变株有很多。其中的大多数是S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性突变株，并且属于短杆菌属，棒杆菌属，芽孢杆菌属，埃希氏菌属或沙雷氏菌属。进而，已公开了多种技术用于提高氨基酸产量。例如，利用重组DNA转化子(美国专利No.4,278,765)。
例如，属于沙雷氏菌属的细菌被广泛用于生产不同种类的氨基酸，如L-脯氨酸，L-组氨酸，L-精氨酸，L-苏氨酸，L-缬氨酸和L-异亮氨酸并且作为氨基酸生产菌，正如Kodangha Scientific 1986年出版的“应用分子遗传学”中所述，沙雷氏菌在不同的(ISBN4-06-139659-5)和学会中心1986出版的“氨基酸发酵”(ISBN4-7622-9454-3)中所述，沙雷氏菌在不同的方面有着杰出的特性。用属于沙雷代菌属的细菌生产不同的氨基酸已有报道。根据一个报导(特公昭51-9393(1976))，其报导了一种L-赖氨酸多产菌，其产率(用产生的L-赖氨酸盐酸盐的浓度除以初始的碳源浓度而得到的值)经计算为5.4％。
粘质沙雷氏菌，沙雷氏菌属的一个代表菌株，其在基因结构及基因表达和调控机制上同埃希氏杆菌属的细菌相似，并且适用于埃希氏杆菌属细菌的重组DNA克隆载体可用于沙雷氏菌属细菌(特开平2-27980(1990)和5-10076(1993))。
另外，二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)是一种用于脱水并缩合天冬氨酸半醛和丙酮酸以合成二氢吡啶二羧酸的酶。该反应位于进入分枝反应的入口处，该分枝继续天冬氨酸家族氨基酸的生物合成中L-赖氨酸生物合成系统。已知该酶与天冬氨酸激酶在埃希氏杆菌属细菌中一样，是负责L-赖氨酸生物合成中的一个重要调控位点的酶。
在大肠杆菌(Escherichia coli)中，编码DDPS的基因是名为dapA的基因。dapA已被克隆，且其碱基序列已被测定(Richaud，F.et al.，细菌学杂志，297(1986))。
另一方面，天冬氨酸激酶(此后有时缩写为“AK”)是催化天冬氨酸转化为β-磷酸天冬氨酸反应的酶，该酶是作为天冬氨酸家族氨基酸生物合成系统中的主要的调节酶。大肠杆菌的AK有三种(AKI，AKII，AKIII)，其中的二种是复合酶，有高丝氨酸脱氢酶(以后有时缩写为“HD”)。复合酶中的一个为由thrA基团编码的AKI-HDI，另一个为由metLM基因编码的AKII-HDII。AKI受苏氨酸和异亮氨酸协同抑制并被苏氨酸所抑制，而AKII则受甲硫氨酸阻遏抑制。
相反，已知仅有AKIII是一单功能酶，该酶是各为LysC基因的产物，该酶可受L-赖氨酸的阻遏及反馈抑制。细胞中它们的活性比是AKI∶AKII∶AKIII＝约5∶1∶4。
如上所述，DDPS和AKIII受L-赖氨酸的反馈抑制，这阻遏了有效生产L-赖氨酸。如果期望得到一种不受L-赖氨酸反馈抑制的突变体酶DDPS或AKIII，通过使用属于沙雷氏菌属的细菌就可以通过发酵有效地生产L-赖氨酸。然而，虽然只有1篇关于AKIII酶的突变体酶的报导，此前没有文献记述DDPS的突变体酶，(Boy，E.，等，细菌学杂志，112，84(1972))，但已知没有实例表明这样的突变体酶可以提高L-赖氨酸的产率。此外，就沙雷氏菌属菌的L-赖氨酸生物合成系统的基因方面而言也是未知的。

发明内容
考虑到前述的观点，完成了本发明，其中的一个目的就是从沙雷氏菌属细菌中得到对于L-赖氨酸的反馈抑制有效脱敏的DDPS和AK，特别是，DDPS和AKIII，并且提供了用沙雷氏菌属的细菌生产L-赖氨酸的方法，该法较以前领域的方法更为有效。
为了达到上述的目的，作为勤奋和反复研究的结果，本发明人成功地从埃希氏菌属的一种细菌中得到了编码DDPS的DNA，该菌中L-赖氨酸的反馈抑制被有效脱敏。这种从对L-赖氨酸反馈抑制被有效脱敏的大肠杆菌中得到的编码DDPS的DNA在这里有时称为突变体dapA或dapA*。
本申请的发明人进一步创造了一种属于沙雷氏菌属的细菌，其中带有对于L-赖氨酸的反馈抑制被脱敏的天冬氨酸激酶以及带有对于L-赖氨酸反馈抑制被有效脱敏的DDPS。来自对于L-赖氨酸反馈抑制有效脱敏的大肠杆菌的编码天冬氨酸激酶的DNA在这里有时称为突变体LysC或Lys*。
本发明人进一步创造了一种属于沙雷氏菌属的细菌，其中带有突变体dapA和突变体LysC。并且已发现通过将前述的属于沙雷氏菌属的细菌培养于适当的培养基中，培养物中可产生和集累相当大量的L-赖氨酸。
即，本发明提供了一种属于沙雷氏菌属的细菌，该菌通过将编码含有突变的二氢吡啶二羧酸合酶的DNA导入到菌中而被转化，突变使得该酶对于L-赖氨酸的反馈抑制剂脱敏。用来自埃希氏菌属细菌的二氢吡啶二羧酸合酶举例说明。关于来自属于埃希氏菌属细菌的二氢吡啶二羧酸合酶，对于L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变用以下的突变加以举例说明，即从序列表中SEQ ID NO4中定义的二氢吡啶二羧酸合酶氨基酸序列中的N-末端计数，以缬氨酸残基代替81位的丙氨酸残基的突变，用酪氨酸残基代替118位组氨酸残基的突变，以及用缬氨酸和酪氨酸残基分别代替81位丙氨酸残基和118位组氨酸残基的突变。该二氢吡啶二羧酸合酶如果含有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变，对于属于沙雷氏菌属的细菌而言，它可能是一天然的类型。
本发明进一步提供了前述的属于沙雷氏菌属的细菌，该菌带有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶。允许属于沙雷氏菌属的细菌带有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶的方法以下面的方法为例加以说明，该方法用于将来自埃希氏菌属细菌的具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的编码天冬氨酸激酶III的DNA导入到细菌细胞中。
来自埃希氏杆菌属细菌的对于L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III的突变通过以下突变加以举例说明，即将323位的甘氨酸残基用天冬氨酸残基替换的突变，将323位的甘氨酸残基用天冬氨酸残基替换并且将408位的甘氨酸残基也用天冬氨酸残基替换的突变，将34位的精氨酸残基用半胱氨酸残基替换并且将323位的甘氨酸残基用天冬氨酸残基替换的突变，将325位的亮氨酸残基用苯丙氨酸残基替换的突变，将318位甲硫氨酸残基用异亮氨酸残基代替的突变，将318位甲硫氨酸残基用异亮氨酸残基代替并且将349位缬氨酸残基用甲硫氨酸残基代替的突变，将345位丝氨酸残基用亮氨酸残基代替的突变，将347位缬氨酸残基用甲硫氨酸残基代替的突变，将352位苏氨酸残基用异亮氨酸残基代替的突变，将352位苏氨酸残基用异亮氨酸残基代替并且将369位丝氨酸残基用苯丙氨酸残基代替的突变，将164位谷氨酸残基用赖氨酸残基代替的突变，以及将417位甲硫氨酸残基用异亮氨酸残基代替并且将419位半胱氨酸残基用酪氨酸残基代替的突变，氨基酸的计数是从序列表中SEQ ID NO8中定义的天冬氨酸激酶III氨基酸序列的N末端开始计数。
不必说，对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶对于属于沙雷氏菌属的细菌而言，可能是一天然的类型。
编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏突变的二氢吡啶二羧酸合酶的DNA，和编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏突变的天冬氨酸激酶的DNA可能均存在于一种属于沙雷氏菌属的细菌中，二种DNA可以在同一质粒上或者在不同的质粒上。
属于沙雷氏菌属的细菌，其中有编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏突变的二氢吡啶二羧酸合酶的DNA，通过一种赖氨酸脱羧酶缺陷的细菌加以举例说明。
本发明进一步提供了生产L-赖氨酸的方法，该方法包括在合适的培养基中培养任一种前述的属于沙雷氏菌属的细菌，在其培养物中产生并积累L-赖氨酸，以及从培养物中收集L-赖氨酸。
在此说明书中，编码DDPS或AKIII的DNA，或者是其中再含有启动子的DNA，有时称为“DDPS基因”或“AKIII基因”。进一步，突变体酶是指对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的酶，而且编码其DNA或再含有启动子的DNA有时分别简称为“突变体酶”和“突变体基因”。进而，词组“对L-赖氨酸反馈抑制脱敏”意思是对抑制基本上脱敏是充分的，并不需要完全脱敏。
下面将详细解释本发明。<1>用于本发明的方法中的编码突变体二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)的DNA。
用于本发明方法中的编码突变体DDPS的DNA具有突变，突变使得编码野生型DDPS的DNA编码的DDPS对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏。DDPS通过那些来自属于埃希氏菌属细菌的DDPS，特别是来自大肠杆菌的DDPS加以举例说明。进而，也可使用沙雷氏菌属的细菌的DDPS。如果其含有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变。来源于埃希氏菌属的细菌的对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的DDPS突变通过以下实例加以说明(1)将81位丙氨酸残基用缬氨酸残基代替的突变；(2)用酪氨酸残基代替118位组氨酸残基的突变；和(3)用缬氨酸残基代替81位丙氨酸残基并且用酪氨酸残基代替118位的组氨酸残基的突变；氨基酸的计数是从序列表中的SEQ ID NO4中定义的DDPS的氨基酸序列的N末端开始的。
编码野生型DDPS的DNA并不特别地受到限制，如果DNA是编码来自属于埃希氏菌属或沙雷氏菌属的细菌的DDPS。编码来自属于埃希氏杆菌属细菌的DDPS的DNA具体地通过编码SEQ ID NO4中定义的氨基酸序列的DNA加以举例说明，并且进一步具体地通过由SEQID NO3中所定义的碱基序列中272～1147碱基所代表的DNA序列加以具体说明。在这些序列中，那些含有碱基突变进而导致上述氨基酸替换的序列为用于本发明中的编码突变体DDPS的DNA的实例。如果它是编码同一个氨基酸残基，相应于被替换氨基酸残基的任何密码子都是可用的，特别是同其种类无关时。进一步，假设已有的DDPS根据细菌种类和细菌菌株的不同在序列上具有轻微差异，然而，那些在同酶活性无关的位置上有氨基酸残基的替换、缺失或插入的DDPS也包括在本发明中的突变体DDPS基因中。
得到这种突变体基因的方法如下。首先，含有野生型DDPS基因的DNA或含有对DDPS的酶活性基本上无影响的突变的DDPS基因的DNA进行体外突变处理，并且突变处理后将DNA同适于宿主的载体DNA连接以得到重组体DNA。将重组体DNA导入一宿主微生物以得到转化子。当在前述的转化子中筛选到表达突变体DDPS的转化子时，该转化子带有突变体基因。另一种方法是，将含有野生型DDPS基因的DNA或将含有别的突变的DDPS基因的DNA同适合于宿主的载体DNA连接的获得重组体DNA。然后将此重组DNA在体外进行突变处理，并且在突变处理后将重组体DNA导入到宿主微生物中以得到转化子。当在前述的转化子中筛选到一表达突变体DDPS的转化子时，这一转化子也将带有突变体基因。
这样也是可以接受的，即将产生野生型酶的微生物经突变处理后产生突变体菌株，该菌株生产突变体酶，且然后从突变体菌株中得到突变体基因。另一种方法是，将同野生型基因相连接的重组体DNA导入其中的转化子进行突变处理以产生一突变菌株，该突变株可产生突变体酶。当之后从突变体菌株中回收重组DNA时，在前述DNA中产生突变体基因。
用于体外DNA突变处理的试剂通过羟胺等加以举例说明。羟胺是一种化学的突变处理试剂，它通过使胞嘧啶转化为N4-羟基胞嘧啶而导致胞嘧啶变为胸腺嘧啶的突变。另一种方法是，当将微生物自身受突变处理时，处理可用紫外光辐射来进行，或用常用于人工突变的突变剂进行，比如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸。
作为含有野生型DDPS基因或含有上述的其它突变的DDPS基因的DNA的供体微生物，可以用包括属于埃希氏杆菌属或沙雷氏菌属的细菌在内的任一种微生物。具体地说，对于属于埃希氏菌属的微生物，使用那些Neidhardt等写的书中描述的微生物是可能的(Neidhardt，F.C.等，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，美国微生物学会，华盛顿特区，1208，表1)。例如，提到大肠杆菌JM 109株和MC 1061菌株。当用一野生型菌株作为含有DDPS基因的DNA的供体微生物时，能得到含有野生型DDPS基因的DNA。
另一方面，属于沙雷氏菌属的微生物通过粘质沙雷氏菌，例如，粘质沙雷氏菌AJ 13125菌株(FERM BP-5441)加以举例说明。(1)野生型DDPS基因的制备一个制备含有DDPS基因的DNA的实例将叙述如下。描述于此的制备是就大肠杆菌而言，并且对其它的属于埃希氏菌属和属于沙雷氏菌属的细菌而言，DDPS基因可以同样制得。
首先，含野生型dapA的大肠杆菌，例如MC 1061菌株，经培养以得到培养物，当培养上述的微生物时，可按照常规的固体培养方法进行，但是，考虑到菌体收集的效率，优选的培养是用液体培养方法进行。可用一种培养基，其中加入一种或多种氮源，例如酵母提取物，胰蛋白胨，肌肉提取物，玉米浸液和大豆或小麦的浸出液，培养基中应含一种或多种无机盐例如磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠，氯化镁，氯化亚铁，硫酸亚铁或硫酸锰，而且另外应任选和足够含有糖类物质、维生素等。将培养基的起始pH值调为6到8是合适的。培养可在30℃到42℃下进行4到24小时，优选通过于37℃，在通气和搅拌的条件下进行深层培养，厌菌培养或静置培养等方法培养。
得到的培养物离心，例如，3,000转/分离心5分钟以得到大肠杆菌MC 1061株的细胞沉淀。可用，例如Saito和Miura的方法(生物化学和生物物理学报，72，619(1963))，或用K.S.Kirby的方法(生物化学杂志，64，405(1956))从细胞沉淀中得到染色体DNA。
为了从这样得到的染色体DNA中分离DDPS基因，制备染色体DNA文库。首先，染色体DNA用适当的限制性酶进行部分消化以得到不同片段的混合物。如果切割的程度可用切割时间等来控制，可以用很多种的限性酶。例如，Sau3AI在不低于30℃的条件下可作用于染色体DNA，优选的是在37℃下，酶浓度为1到10单位/毫升，消化不同的时间(1分钟到2小时)。
其次，将得到的DNA片段同能在属于埃希氏菌属的细菌中自主复制的载体DNA连接以制得重组DNA。具体地说，一种可以在切割后产生同所用的切割染色体DNA的限性酶Sau3AI产生的末端碱基序列互补的限性酶，例如，BamHI，允许在不低于30℃的温度，酶浓度为1到100单位/ml的条件下与载体DNA作用不少于1小时，优选是作用1到3小时以完全消化载体DNA，并且切割之。继而，上述得到的染色体DNA片段混合物同切割后的载体DNA相混合，其中DNA连接酶，优选的是T4 DNA连接酶，在4到16℃，酶浓度为1到100单位/ml的条件下作用不少于1小时，优选作用6到24小时以获得重组体DNA。
得到的重组DNA用于转化属于埃希氏菌属的微生物，例如，DDPS缺陷型突变菌株如大肠杆菌K-12株，优选的是JE7627株(ponB704dacB12 pfv+tonA2 dapA lysA str malA38 metB1 ilvH611leuA371 proA3 lac-3 tsx-76)，以制备染色体DNA文库。转化可按D.M，Morrison方法(酶学方法，68，326(1979))的方法进行，或者是用将受体菌细胞用氯化钙处理以增加DNA的通透性的方法(Mandel，M，and Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))完成。JE 7627株可从国立遗传研究所得到(日本静岗县三岛市)。
含有DDPS基因重组体DNA的细菌株可从以下菌株中获得在获得的染色体DNA文库中那些有DDPS活性增高的菌株或是由于DDPS基因缺陷而得到的营养缺陷被补充的菌株，例如，DDPS缺陷型突变株需要二氨基庚二酸。这样，当DDPS缺陷型突变株用作宿主时，含有DDPS基因的DNA片段可以通过分离能在不含有二氨基庚二酸的培养基上生长的细菌而得到，并且从该细菌菌株中回收重组体DNA。
证明一个含有DDPS基因的重组体DNA的候选菌株中是否真正带着其中DDPS基因被克隆的重组体DNA，可以先从候选菌株中制备细胞提取物，并从其中制备粗酶溶液以证明DDPS的活性是否有增加来完成。DDPS酶活性的测定方法可按照Yugari等(Yugari，Y，和Gilvarg，C.生物化学杂志，240，4710(1962))的方法进行。
其中的含有DDPS基因的DNA插入到载体DNA中的重组体DNA可以从前述的细菌菌株中通过以下分离。例如可按P.Guerry等的方法(细菌学杂志，116，1064(1973))或D.B.Clewell的方法(细菌学杂志，110，667(1972))进行。
用Sioto和Miura等的方法，也可以从染色体上含有DDPS基因的菌株中制备染色体DNA而完成野生型的DDPS基因的制备，并且可用聚合酶链式反应(PCR)(见White，T.J.等，遗传学方向，5，185(1989))来扩增DDPS基因。扩增反应用到的引物是那些同含有DDPS基因整个区域或部分区域的双链DNA的3′末端互补的引物。当只扩增DDPS基因的部分区域时，必需用这些DNA片段作为引物来进行从染色体DNA文库中筛选含有全序列区的DNA片段。当DDPS基因的全序列区被扩增时，含有DNA片段的PCR反应液做琼脂糖凝胶电泳，这些DNA片段含有扩增的DDPS基因，且然后提取目的DNA片段。这样，含有DDPS基因的DNA片段就可以被回收。
DNA引物可以根据例如，已知的大肠杆菌的序列充足地制备(Richand，F.等，细菌学杂志，297(1986))。具体地说，能够扩增DDPS基因包括编码DDPS的1150个碱基的区域的引物是优选的，且SEQ ID NO1和NO2中定义的二种引物是合适的。引物的合成可按照常规方法如亚磷酰胺法(见四面体通讯，22，1859(1981))，用一商业上提供的DNA合成仪(例如，DNA合成仪380B型，由应用生物系统公司生产)进行。进而，PCR反应可用商业上提供的PCR仪(例如，DNA热循环仪，PJ2000型，由Takara Shuzo公司生产)，用TaqDNA聚合酶(由Takara Shuzo公司提供)，按照供应商指定的方法进行。
就PCR方法扩增的DDPS基因而言，当这些DDPS基因同能在属于埃希氏菌属的细菌中进行自主复制的载体DNA相连接，并将之导入到属于埃希氏菌属的细菌细胞时，一些操作，如向DDPS基因中引入突变，变得简单化。所用的载体DNA，转化方法及证明DDPS基因存在的方法都同前述方法一样。
照上述的方法，也可以得到来自属于沙雷氏菌属细菌的DDPS基因，且用来自大肠杆菌的DDPS基因或其一部分作为探针，通过杂交，可以从属于沙雷氏菌属的细菌的染色体DNA文库中分离得到DDPS基因。同样，源于属于沙雷氏菌属的细菌的DDPS基因也可用PCR方法得到。PCR中用属于沙雷氏菌属的细菌的染色体DNA作为模板，并且用根据来自大肠杆菌的DDPS基因的碱基序列而制备的寡聚核苷酸作引物，例如，用具有SEQ ID NO1和NO2中所示的二种序列的寡核苷酸作引物。
属于沙雷氏菌属的细菌和属于埃希氏菌属的细菌密切相关，并且已知细胞中蛋白的氨基酸序列和基因的碱基序列的同源性在此二类菌间是高的。对于这些基因，例如，已知的有thrA，thrB和thrC，它们的同源性分别是83％，73％和84％(K.Omori等，细菌学杂志，175，785～794(1993))。进而，作为用来自属于埃希氏杆菌属的细菌的基因序列分离属于沙雷氏菌属的细菌的基因的实例，dnaA就是已知的一个这样的例子(O.Skovgaard和F.G.Hansen，细菌学杂志，169，3976-3981(1987))。因而，这一点是肯定的，即可用基于属于埃希氏杆菌属细菌中的DDPS基因的碱基序列通过杂交或PCR的方法，来分离属于沙雷氏菌属的细菌中的DDPS基因。(2)向DDPS基因中导入突变进行例如氨基酸残基的替换，插入或缺失的突变的方法，通过以下例子加以说明，即重组PCR法(Higuchi.R.，61，PCR技术(Erlich，H.A.编，Stockton出版社(1989))，以及定点诱变法(Kramer，W和Frits，H.J.，酶学方法，154.，350(1987))；Kunkel T.A.等，酶学方法，154，367，(1987))。通过运用这些方法，可在目的位点产生目的突变。
进而，根据目的基因的化学合成，向目的位点引入突变或随机突变均是可能的。
此外，这样的方法是可得到的，即，用羟胺直接处理含有DDPS基因的染色体或质粒(Hashimwto，T.和Sekiguchi，M.细菌学杂志，159，1039(1984))。另一种方法是，用紫外线辐射的方法对含有DDPS基因的属于埃希氏菌属的细菌进行照射，或者用如N-甲基-N′-亚硝基胍或亚硝酸的化学试剂处理细菌，这些方法均是可接受的。运用这些方法，可以随机地引入突变。
就突变基因的筛选而言，包含带有DDPS基因的DNA片段和载体DNA的重组DNA首先用羟胺等直接进行突变处理，然后用于转化例如，大肠杆菌菌株W3110。继之，将转化的菌株培养于基本培养基上，例如M9，它含有作为L-赖氨酸类似物的S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)。带有含有野生型DDPS基因的重组DNA的菌株不能合成L-赖氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，这样其生长受到抑制，因为AEC可抑制由重组DNA表达的DDPS。相反，带有含有对L-赖氨酸的抑制脱敏的DDPS基因的重组DNA的菌株含有由前述重组DNA中该基因编码的突变体酶，它是不受AEC抑制的。这样，这种菌就能在添加有AEC的基本培养基上生长。这一现象可用来筛选菌株，这些菌可以在生长中对作为L-赖氨酸类似物的AEC具有抗性，就是说，带有含有突变DDPS基因的重组DNA的菌株，其对抑制是不敏感的。
这样得到的突变基因可作为重组DNA导入到属于沙雷氏菌属的细菌中并表达。由此可获得含有对反馈抑制脱敏的DDPS的细菌。另一种选择是，可从重组DNA中取出突变的DDPS基因片段，并将之插入到另一载体中来运用。能用于本发明中的载体DNA优选的是质粒载体DNA，实例有pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。此外，也可用噬菌体DNA载体。
此外，为了有效地表达突变的DDPS基因，其它的可在属于沙雷氏菌属的细菌细胞中作用的启动子，例如lac，trp和PL启动子，可以连接于编码突变的DDPS的DNA序列的上游，或者可以用DDPS基因带有的启动子，或在扩增启动子后用。<2>用于本发明的编码突变的天冬氨酸激酶的DNA用于本发明的编码突变的AK的DNA上在编码野生型AK的DNA中具有突变，突变使编码AK对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏。AK的例子是那些属于埃希氏菌属的细菌中的AK，特别是来自大肠杆菌中的AKIII。进而的例子是属于沙雷氏菌属细菌中的任一种天冬氨酸激酶，只要它具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变。
对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的AKIII的突变的实例有(a)用天冬氨酸残基替换323位甘氨酸残基的突变；(b)用天冬氨酸残基替换323位甘氨酸残基并用天冬氨酸残基替换408位甘氨酸残基的突变；(c)用半胱氨酸残基替换34位精氨酸残基并用天冬氨酸残基替换323位甘氨酸残基的突变；(d)用苯丙氨酸残基替换325位亮氨酸残基的突变；(e)用异亮氨酸残基替换318位甲硫氨酸残基的突变；(f)用异亮氨酸残基替换318位甲硫氨酸残基并用甲硫氨酸残基替换349位缬氨酸残基的突变；(g)用亮氨酸残基替换345位丝氨酸残基的突变；
(h)用甲硫氨酸残基替换347位缬氨酸残基的突变；(i)用异亮氨酸残基替换352位苏氨酸残基的突变；(j)用异亮氨酸残基替换352位苏氨酸残基并用苯丙氨酸残基替换369位丝氨酸残基的突变；(k)用赖氨酸残基替换164位谷氨酸残基的突变；和(1)用异亮氨酸残基替换417位甲硫氨酸残基并用酪氨酸残基替换419位半胱氨酸残基的突变；氨基酸计数是从序列列表中的SEQ ID NO8所定义的AKIII的氨基酸序列N末端开始。
就编码野生型AKIII的DNA而言，所提及的例子是来自属于埃希氏菌属的细菌如大肠杆菌的编码AKIII的DNA。具体地说，实例是编码SEQID NO8中定义氨基酸序列的DNA，以及由SEQ ID NO7中定义的碱基序列中584～1930个碱基所代表的序列。偶尔，大肠杆菌的AKIII是由lysC基因编码的。
在这些序列中，那些碱基序列由于具有突变导致产生上述氨基酸残基替换的序列，在本发明中是作为编码突变的AKIII的DNA的例子。任何同被替换的氨基酸残基相对应的密码子，特别在不考虑其种类时，均可得到，假若密码子是编码同一氨基酸残基。此外，由于细菌菌种及菌株的不同，得到的野生型AKIII的氨基酸序列有些轻微不同。那些在同酶活性无关的位置有这种方式氨基酸残基替换、缺失或插入的基因，也包括在用于本发明中的突变AKIII基因中。例如，下述实例2中得到的野生型lysC基因的碱基序列(SEQ ID NO7)同已发表的，大肠杆菌K-12 JC411株的lysC的序列在6个位点有所不同。(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化学杂志，261，1052(1986))。其中编码的氨基酸残基在2个位点有差别(在JC411株的lysC中，58位甘氨酸残基被半胱氨酸残基代替，并且401位的甘氨酸残基被丙氨酸残基代替，氨基酸计数是从SEQ ID NO8中定义的lysC氨基酸序列的N-末端开始的)。如果前述的(a)到(1)中的任何的突变被引入，甚至期望得到含有与大肠杆菌K-12 JC411菌株相同序列的lysC，该菌株具有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变。
得到的编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变AK的DNA的方法见下。首先，含有野生型AK基因或含有其它突变的AK基因的DNA进行体外突变处理，且将突变处理后的DNA同适于宿主的载体DNA连接以得到重组DNA。重组DNA导入宿主微生物中以得到转化子。当从前述转化子中筛选到一个表达突变AK的转化子时，则其中含有突变的基因。另一方法是，将含野生型AK基因或将含有有其它突变的AK基因的DNA同适合于宿主的载体DNA连接以得到重组DNA。然后将重组DNA进行体外突变处理，且随后将之导入到宿主微生物中以得到转化子。当从此处提到的转化子中筛选到表达突变AK的转化子时，则此转化子中也含有突变的基因。
或者，将产生野生型酶的微生物进行突变处理以制备产生突变酶的突变株也是可接受的，且然后从突变株中可得突变的基因。进行直接突变处理DNA的试剂的例子有羟胺等。羟胺是一种化学突变处理试剂，可通过将胞嘧啶转化为N4-羟基胞嘧啶而导致从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。另外的选择是，对微生物本身进行突变处理，处理可用紫外线照射，或用通常用于人工突变的如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等突变试剂进行处理。
只要微生物属于埃希氏菌属或沙雷氏菌属，则任一种均可用作供体微生物以提供前面所述的含有野生型AK基因或含有含其它突变的AK基因的DNA。具体地说，可用那些在Neidhardt等人所著的书中描述的微生物(Neidhardt，F.C.等，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，美国微生物学会，华盛顿特区，1208，表1)。例如，大肠杆菌JM 109株和MC1061株即为此例。同样，属于沙雷氏菌属的微生物的例子是粘质沙雷氏菌，如，粘质沙雷氏菌AJ 13125菌株(FERM BP-5441)。
当从这些菌株中得到AK基因后，染色体DNA的制备，染色体DNA文库的制备等均可按照前述与DDPS基因的制备相同方法进行。作为待用于制备文库的宿主，优选的是用AKI，II和III的完全缺陷株，例如大肠杆菌GT3株(可从大肠杆菌遗传储备中心得到(康涅狄格，美国))。
从得到的染色体DNA文库中，可得到含有AK基因的重组DNA的细菌株，在这些株中，AK活性增加，或是营养缺陷得到补充。从候选菌株中制备细胞提取物，然后从中制备粗酶溶液来确定AK的活性。AK酶活的测定方法可按照Stadtman等的方法进行(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajstcr，H.，生物化学杂志，236，2033(1961))。
例如，当AK完全缺陷的突变株用作宿主时，带有AK基因的DNA片段可通过分离能在这含L-赖氨酸，L-苏氨酸，L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸的培养基上生长的转化菌株而得到，或是经分离能在不含高丝氨酸和二氨基庚二酸的培养基上生长的菌株而得到，然后就可从该细菌菌株中回收重组DNA。
当用PCR的方法从染色体DNA扩增AK基因时，用于PCR反应的DNA引物可根据已知的序列，而适当地制备(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，生物化学杂志，261，1052(1986))。然而，能够扩增编码lysC基因的含有1347个碱基区域的引物也是合适的，并且例如，具有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中所定义的序列的二种引物也是合适的。
此外，来源于属于沙雷氏菌属的细菌的AK基因可按上述方法得到，并且，通过用来自大肠杆菌的AK基因或其部分作为探针，经过杂交，可从属于沙雷氏菌属的细菌的染色体DNA文库中分离该基因。同样，以属于沙雷氏菌属的细菌的染色体DNA为模板且用基于大肠杆菌的AK基因的碱基序列而制备的寡聚核苷酸，可用PCR方法得到属于沙雷氏菌属的细菌的AK基因。
对于前述得到的AK基因进行诸如氨基酸残基的替换、插入和缺失突变的方法是以重组PCR方法及定点诱变方法等同前述DDPS基因的突变处理方式一样为例加以说明。
此外，根据目的基因的化学合成，向目的位点引入突变或引入随机突变是可能的。
此外，有一种方法是可得到的，该法中可用羟胺直接对染色体或染色体外的重组DNA上的AK基因的DNA进行处理(Hashimoto，T和Sekiyuchi，M.细菌学杂志，159，1039(1984))。另一种选择是，用紫外线照射染色体上含有或染色体外重组DNA上含有AK基因的属于埃希氏菌属的细菌也是可接受的，或者用诸如N-甲基-N′-亚硝基胍或亚硝酸这类化学试剂处理的方法均是可接受的。
就筛选突变AK基因的方法而言，首先用已经过突变处理的含AK基因的重组DNA转化一种AK完全缺陷的菌株，如大肠杆菌GT3株。然后，转化菌株培养于基本培养基中，如含有大量L-赖氨酸的M9培养基中。带有含野生型AK基因的重组DNA的菌株不能合成L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)且生长受抑制，这是因为一种AK被L-赖氨酸所抑制。相反，带有含突变AK基因的重组DNA的菌株，由于突变使AK对L-赖氨酸的抑制脱敏，而能在添加有大量的L-赖氨酸的基本培养基中生长。这一现象可用来筛选能够抗L-赖氨酸或作为类似物的AEC而生长的菌株，也就是说，该菌株中带有含突变的AK基因的重组DNA，其对抑制脱敏。
如此得到的突变基因可作为重组DNA导入到属于沙雷氏菌属的细菌中，并表达。这样就得到了含有对反馈抑制脱敏的AK的细菌。另一种方法是从重组DNA中取出突变AK基因片段，并将之插到另一载体上来用。用于本发明中的载体DNA优选的是质粒载体DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219和pMW218。此外，也可用噬菌体DNA载体。
此外，为了有效地表达突变的AK基因，可将能在属于沙雷氏菌属细菌中起作用的别的启动子，如lac，trp和PL，连接于编码突变的AK的DNA序列的上游，或者是用包含于AK基因中的启动子，或是在扩增其之后用该启动子。<3>依据本发明生产L-赖氨酸通过在合适的培养基中培养其中导入了按上述获得的并且带有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的AK的突变的DDPS基因而转化的属于沙雷氏菌属的细菌、在培养物中产生并集累L-赖氨酸，并且从培养物中收集L-赖氨酸可有效地制备L-赖氨酸。特别地，通过使属于沙雷氏菌属的细菌既带有突变的DDPS又带有突变的AK，可有效地生产L-赖氨酸。
带有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的AK的属于沙雷氏菌属的细菌的例子如下，将编码带有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的AK的DNA同可在属于沙雷氏菌属的细菌细胞中自主复制的载体DNA相连以构建重组DNA，然后将此重组DNA导入到其细胞中而转化的属于沙雷氏菌属的细菌。
此外，其中的对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的AK可以是不受L-赖氨酸反馈抑制的野生型AK，或者是以同样的方式向属于沙雷氏菌属的细菌中导入了这样一种野生型AK基因。此外，通过对属于沙雷氏菌属的细菌细胞进行突变处理而使之成为产生突变AK的属于沙雷氏菌属的突变株，这也是可接受的。
另一方面，为了使向属于沙雷氏菌属的细菌中导入突变的DDPS基因而完成转化，其可以是通过向细胞中导入一重组DNA来完成，该重组DNA是通过将突变的DDPS基因和能在属于沙雷氏菌属的细菌细胞中自主复制的载体DNA相连接而构建的。
当将突变的DDPS基因和突变的AK基因同时导入一属于沙雷氏菌属的细菌时，这二个突变基因可在细胞中的同一质粒上也可在各自的质粒上。当用不同的质粒时，优选的是用具有稳定的分布机制以使它们中每个均稳定地存在于菌体细胞中的质粒。当用不同的质粒将突变的DDPS基因和突变的AK基因导入到一属于沙雷氏菌属的细菌中时，二种基因的任何一种导入顺序均是可行的。
通过增强属于沙雷氏菌属的细菌中的二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB，该菌中已经导入了突变的DDPS基因和突变的AK基因，L-赖氨酸的产率可进一步增加。通过向属于沙雷氏菌属的细菌中导入来自棒状菌的二氨基庚二酸脱氢酶基因(DDH)，前者已带有突变的AK基因及突变的DDPS基因并且其中的二氢吡啶二羧酸还原酶基因已被增强，可进一步增加L-赖氨酸的产率。这种二氨基庚二酸脱氢酶基因应被增强。另一选择是，通过增强琥珀酰基二氨基庚二酸转氨酶基因(dapD)和琥珀酰基二氨基庚二酸脱酰基酶(dapE)而不是通过导入二氨基庚二酸脱氢酶，也可使L-赖氨酸的产率有相同程度的提高。
此处的基因增强指的是每个细胞中作为基因的表达产物的酶活性的增强。具体地说，例如细胞中基因拷贝数的增加。通过运用有高表达效率的启动子而使每个基因的表达量增加，以及向该基因中引入突变以增强酶活性。为了增加一个细胞中基因的拷贝数，可将基因插入到一能在属于沙雷氏菌属的细菌中自主复制的载体上，并用此载体转化属于沙雷氏菌属的细菌。该载体优选的是一多拷贝型质粒。另一方法是，通过扩增用Mu噬菌体等使得整合到染色体DNA上的DNA可增加拷贝数。
就所用的质粒而言，当质粒是用于突变的DDPS基因和突变的AK基因的导入时，那些有稳定分布机制的质粒是优选使用的，因其可稳定共存在于细胞中。任意的基因导入顺序都是可以接受的。
得到大肠杆菌的L-赖氨酸生物合成系统的基因的方法及得到棒杆状菌的DDH基因的方法将在下面的例子中给出。
以二种按已知的谷氨酸棒杆菌的DDH基因的DNA序列(Ishino，S，等，核酸研究，15，3917(1987))为基础而制备的寡核苷酸引物(例如，SEQ ID NO9，NO10)，用PCR来扩增棒状菌的染色体DNA，如乳酸发酵短杆菌的染色体DNA，而得到DDH基因。
以二种按已知的dapD基因的核酸序列(Richauel，C.等，生物化学杂志，259，14824(1984))为基础而制备的寡聚核苷酸引物，(如，SEQ ID NO11，NO12)用PCR来扩增大肠杆菌W3110菌株的染色体DNA而得到dapD基因。
以二种按已知的dapE的核酸序列为基础(Bouvier，J.等细菌学杂志，175，5265(1992))而制备的寡核苷酸引物(SEQ ID NO13，NO14)，用PCR来扩增大肠杆菌DNA而得到dapE基因。
在本发明中，假若突变的DDPS基因，突变的AK基因或其它的L-赖氨酸生物合成系统中的基因的启动子，或者是用于表达这些基因的其它启动子在细胞中有功能，并且当突变的DDPS基因，突变的AK基因或其它的L-赖氨酸生物合成系统中的基因作为染色体外DNA被引入质粒后，该载体DNA的复制起点在细菌细胞中仍有功能并能进行复制，则满足以上条件的任一种属于沙雷氏菌属的细菌均可用作宿主。
例如，属于沙雷氏菌属的细菌是以产L-苏氨酸的微生物为例说明，这是因为在产L-苏氨酸的微生物中，由L-赖氨酸引起的天冬氨酸激酶的抑制通常也会脱敏。有一种属于粘质沙雷氏菌的产L-苏氨酸细菌，其可以抗AHV(α-氨基-β-羟戊酸)，AHV是一种苏氨酸类似物(S.Komatsubara，M，Kisumi和I.Chiba，应用环境微生物学，35，834(1978))。粘质沙雷氏菌AJB 125菌株就是这样的菌株。该菌株已于1995年6月12日根据布达佩斯条约以许可号FERM P-14983保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)并于1996年3月4日转为国际保藏，并得到许可号FERM BP-5441。
此外，作为可用于本发明中用到的属于沙雷氏菌属的细菌，例子是赖氨酸脱羧酶缺陷型粘质沙雷氏菌(特开昭50-53589(1975))。赖氨酸脱羧酶是通过L-赖氨酸脱羧催化产生尸胺反应的一种降解L-赖氨酸的酶，该酶的缺陷株在L-赖氨酸的降解上受到抑制。
产L-苏氨酸且是赖氨酸脱羧酶缺陷的属于沙雷氏菌属的细菌可通过紫外辐射或用诸如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍和亚硝酸等常用于人工突变的突变剂处理而得到。
用于培养本发明中的带有突变基因的转化子的培养基是含有碳源、氮源、无机离子和任选其它有机成分的常规培养基。
作为碳源，可用糖，如蔗糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、或淀粉水解产物，醇如甘油或山梨醇；或有机酸如延胡索酸、柠檬酸或琥珀酸。
作为氮源，可用无机铵盐如尿素、硫酸铵、氯化铵或磷酸铵；有机氮如大豆水解物、氨气，或水溶性氨。
优选的是允许在培养基中含适当量的必需的物质，如维生素B1和L-异亮氨酸或酵母提取物作为痕量有机营养成分。除此之外，如果必要，加入少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
优选的培养是在需氧条件下培养16到96小时。培养温度控制在25℃到45℃，且培养时的pH值控制在5～8。无机或有机，酸性或碱性物质以及氨气等可用于调节pH值。
从发酵液中收集L-赖氨酸通常是将离子交换树脂法，沉淀法及其它已知方法相结合进行。
附图简述

图1示pdapA1和pdapA2的制备步骤。
图2示野生型和突变的DDPS被L-赖氨酸的抑制。
图3示含有双突变型dapA*基因的质粒pdapAS824的制备步骤。
图4示pLYSC1和pLYSC2的制备步骤。
图5示羟胺处理后，转化子的出现率和突变率。
图6示野生型和突变的AKIII被L-赖氨酸的抑制剂。
图7示源于RSF1010的含dapA*24的质粒RSF24P的制备步骤。
图8示质粒pLLC*80的制备步骤。
图9示源于RSF1010的含dapA*24和lysC*80的质粒RSFD80的制备步骤。
实施本发明的最佳方式下面将用实施例来对本发明作更具体地解释。
实例1突变的DDPS基因的制备<1>野生型dapA基因的克隆大肠杆菌dapA基因的碱基序列已经报导过(Richavd，F.等，细菌学杂志，297(1986))，并已知其开放阅读框(ORF)有876个碱基对，并编码一含292个氨基酸残基的蛋白。因为不知该dapA基因是怎样被调控的，所以用PCR法扩增出仅含有SD序列及ORF的区域并将之克隆，而没有扩增启动子区域。
按Saito和Miura的方法(生物化学和生物物理学报，72，619(1963))提取大肠杆菌K-12MC1061株的总基因组DNA。制备具有SEQ ID NO1和NO2中所示序列的二种引物，将之用于PCR反应。PCR按Erlich等的方法进行(PCR技术，Stockton出版社(1989))，对靶DNA进行扩增。将得到的DNA插入到市售的PCR片段克隆载体pCR1000上(购自Invitroyen公司(加州，美国))。pCR1000含有lacZ启动子(Placz)，并且在出售时在lacZ启动子的下游位点已为切割状态。当将连接PCR片段和二个pCR1000的切割末端而得到重组DNA导入到大肠杆菌时，PCR片段在lacZ启动子控制下转录。连接PCR片段和pCR100时，得到二种质粒，pdapA1是以正向连入的质粒而pdapA2是以反向连入的质粒，dapA的转录方向是相对于lacZ启动子所转录的方向。
当将这些质粒导入到一种DDPS缺陷的大肠杆菌JE7627株时，带有导入质粒的菌株将导致宿主JE7627株的二氨基庚二酸营养缺陷得到补充。这样，可证明插入到二种质粒中的DNA片段带有编码活性DDPS的dapA基因。
通过将pdapA1导入野生型大肠杆菌W3110菌株(可从国家遗传所(日本静岗县三岛市)得到)而得到的转化菌株命名为W3110/pdapA1，并将通过导入pdapA2到大肠杆菌W3110株中而得到的转化菌株命名为W3110/pdapA2。将此二种转化菌分别培养于基本培养基M9中，M9中含下列成分，其中AEC作为赖氨酸的类似物而被加入。作为对照，没有导入质粒的W3110株也培养于同样的培养基中。二种转化菌及不含质粒的W3110株的生长受AEC抑制，然而，加入L-赖氨酸后，生长抑制得到恢复。(基本培养基M9)A(20×M9)Na2HPO4·12H2O 303g/LKH2PO460g/LNaCl 10g/LNH4Cl 20g/LB1M MgSO4C50％葡萄糖D1g/L维生素B1上述A、B、C、D分别灭菌，并以A∶B∶C∶D∶水＝5∶0.1∶1∶0.1∶95的比例混合。<2>突变的DDPS基因(dapA*)的制备据认为带有含有dapA*的质粒的菌株可以在加入了大量AEC的基本培养基M9上生长，dapA*编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的DDPS。带有含dapA*的质粒的菌株可以通过其对AEC的生长抑制的抗性而得到筛选。
为了有效地得到dapA*，将在<1>中所制备的pdapA1和pdapA2上的dapA接受突变处理。(1-2-1)带有含dapA*的质粒的菌株在筛选条件的研究上述得到的W3110/pdapA1和W3110/pdapA2菌株分别培养于含有不同浓度的AEC的M9培养基琼脂板上。测量AEC的生长抑制浓度，并且研究带有含dapA*的质粒的菌株的筛选条件。
各转化子在含不同浓度的AEC的M9培养基上的生长见表1。在此表中，+代表转化子生长，-代表没有生长。
表1

dapA基因在pdapA1中的转录方向同由lacZ启动子引起的转录方向一致。因而发现甚至当dapA仍是野生型时，pdapA1上的dapA基因也能提供对相当高浓度的AEC的抗性，因为其表达量可被lacZ启动子所增强，而在pdapA2上的dapA基因具有较小的表达量并在低浓度AEC下生长就被抑制，因其转录方向同lacZ启动子相反，且dapA本身启动子也是缺陷型的(对于W3110/pdapA1菌株，生长抑制是在30mM下发生，而对于W3110/pdapA2则是在15mM下发生)。通过同时加入L-赖氨酸证实生长抑制得到消除。
因此，pdapA2用作引入突变的对象。加入了60mM的AEC到基本培养基M9中而制备的培养基用作筛选带有含dapA*的质粒的菌株。这种培养基在下面的实施例1中称作“选择培养基”。(1-2-2)用羟胺对pdapA2作体外突变处理用一种其中质粒直接用羟胺处理的体外突变处理方法向pdapA2质粒中引入突变。
2μg的DNA在75℃下，以0.4M羟胺中处理1到4个小时(0.1MKH2PO4-1mM EDTA(pH6.0)100μl，1M羟胺-1mM EDTA(pH6.0)80μl，DNA2μg，总共用水补足至200μl)。处理后的DNA用玻璃粉纯化，并导入到大肠杆菌W3110菌株中，且然后将菌铺于完全培养基(L-培养基1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％琼脂)上以形成菌落。将它们复制到(1-2-1)中所述的选择培养基上，挑取那些可在选择培养基上形成菌落的细菌。二次实验后，总共在36株得到突变质粒的候选菌株。
将得到的总共36株候选菌再一次点于选择培养基上，并证明AEC的抗性。(1-2-3)分离dapA基因及对dapA*产物的研究从上述36个菌株中回收突变的pdapA2。用突变的pdapA2及野生型pdapA2分别转化dapA缺陷型JE7627菌株。从每个转化菌株中制备无细胞提取物，并且测量DDPS的酶活性。
无细胞提取物(粗酶溶液)按下列方法制备。转化菌培养于2×TY培养基中(1.6％Bacto胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，在660nm下的光密度值(OD660)约为0.8时收集细菌。用0.85％NaCl在0℃下洗涤细胞沉淀，并用含400mM KCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)重悬菌体。用超声破碎细胞(0℃，200瓦，10分钟)。破碎的细胞溶液在0℃下于33千转/分钟离心1小时得到上清，向其中加入硫酸铵至80％饱和度，于0℃放置过夜，然后离心。沉淀溶于20mM磷酸钾缓冲液400mM KCl中(pH7.5)。
DDPS酶活性的测定按Yugari等的方法进行(Yugari，Y.和Gilvarg，C.生物化学杂志，240，4710(1962))。即，含以下组分的反应液37℃下270nm的光吸收在以时间-进程方式用分光光度计测定，并且测定生成的二氢吡啶二羧酸。除去丙酮酸钠的反应系统作为空白。(反应液组分)50mM盐酸咪唑pH7.420mM L-天冬氨酸半醛20mM丙酮酸钠酶溶液水(平衡)总计1.0ml
在测DDPS的酶活性时，向酶反应液中加入不同浓度的L-赖氨酸并检测L-赖氨酸引起的抑制程度。如图2中所示，野生型DDPS受L-赖氨酸抑制。同野生型相比，在36种候选质粒中，有3种来自转化菌株具有DDPS的突变质粒，其DDPS不容易受到L-赖氨酸抑制。将之分别命名为pdapAS8、pdapAS9和pdapAS24。根据此后的对碱基序列的测定，发现pdapAS8和pdapAS9具有相同的突变。
由pdapAS8，pdapAS9和pdapAS24的dapA*编码的三种突变的DDPS中，对由L-赖氨酸引起的抑制的脱敏程度是不同的，然而，在所有三种DDPS中，对L-赖氨酸的抑制均脱敏。尽管特定的酶的活性可能受到细胞的生长状况及样品制备的影响。但发现同野生型相比，突变体在任何情况下均低一些。然而，可以断定它们作为一种繁殖物质不会产生实质的问题。(1-2-4)突变的da3A基因碱基序列的测定用ABI373A型DNA测序仪(由应用生物系统公司制造)用一种常规方法测定突变的dapA基因的碱基序列。结果是显示在pdapAS8和pdapAS9中，487位的C变为T，并且在pdapAS24中第597位的C变为T，比较的对象是SEQ ID NO3中所示的野生型dapA基因的序列。因此，结果显示在由pdapAS8和pdapAS9编码的DDPS中，81位的丙氨酸残基变为缬氨酸残基，并且在pdapAS24编码的DDPS中，第118位组氨酸残基变为酪氨酸残基，DDPS的氨基酸序列在SEQ IDNO4中给出。(1-2-5)制备有双突变的dapA二种突变的dapA基因如前述而得到。为了验证对抑制的脱敏是否也对这些突变奏效，制备带有含二种突变的突变的dapA质粒。制备方法示于图3中。所得到的具有双突变的质粒命名为pdapAS824。
实施例2突变的AKIII基因的制备<1>野生型lysC基因的克隆大肠杆菌的AKIII基因(lvsC)的碱基序列已有报导(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化学杂志，261，1052(1986))，并且已知其开放阅读框(ORF)含1347个碱基对，并编码一含449个氨基酸残基的蛋白。该基因中存在一操纵子，且其可受到L-赖氨酸的抑制。因此，为了去除此操纵子区域，用PCR法扩增了只含有SD序列和ORF的一段区域，并将之克隆。
按Saito和Miura(生物化学和生物物理学报，72，619(1963))的方法制备大肠杆菌K-12 MC1061菌株的总基因组DNA。制备含有SEQ ID NO5和NO6中所示的序列的二种引物，并用它按Erlich等的方法(PCR技术，Stockton出版社(1989))进行PCR反应，继而扩增lysC基因。得到的DNA用BamHI和AseI消化，然后使之末端变平，并插入到多拷贝载体pUC18的SmaI位点上。该SmaI位点位于存在于载体上的lacZ启动子的下游一侧，且当将通过将DNA片段插入pUC18的SmaI位点而得到的重组DNA导入到大肠杆菌中时，插入的DNA片段在lacZ启动子控制下通过连读转录而被转录。当将PCR片段插入到pUC18的SmaI位点时，得到二种质粒，pLYSC1是以反向插入的质粒，而pLYSC2是以正向插入的质粒，lysC转录的方向相对于由lacZ启动子所引起的转录方向而言(图4)。
当用这些质粒转化AKI、II、III完全缺陷的大肠杆菌GT3菌株(thrA1016b metLM1005 lysC1004)时，GT3对高丝氨酸和二氨基庚二酸的营养缺陷得到补充。这样可以确证插入到二个质粒上的DNA片段含有编码活性AKIII的lysC基因。
通过向AK完全缺陷的大肠杆菌GT3菌株中导入pLYSC1而得到的转化菌命名为GT3/pLYSC1，并将pLYSC2导入到大肠杆菌GT3而得到的转化菌命名为GT3/pLYSC2。向基本培养基M9中加入相当多量的L-赖氨酸，并将GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2菌株分别培养。GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2两种菌株中均带有含野生型lysC基因的质粒，其中的质粒上lysC编码的AKIII是唯一的AK。在存在有相当多量的L-赖氨酸时，作为唯一的AK的野生型AKIII受到L-赖氨酸的抑制。这样，二种菌株都不能合成L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，并且生长受到抑制。<2>突变的AKIII基因(lysC*)的制备据认为带有含编码对L-赖氨酸的抑制脱敏的AK的lysC*的质粒的菌株能在加入了相当多量的L-赖氨酸的M9基本培养基上生长。通过筛选能抗L-赖氨酸尤其类似物AEC而生长的菌株，可以得到带有含lysC*的质粒的菌株。
为了有效地得到lysC*，对<1>中制备的pLYSC1和pLYSC2上的lysC进行突变处理。(2-2-1)带有含lysC*的质粒的菌株的筛选条件的研究将GT3/pLYSC1和GT3/pLYSC2菌株分别培养于含有不同浓度的L-赖氨酸或AEC的M9琼脂板培养基上。检测L-赖氨酸和AEC引起的生长抑制浓度，并研究带有含lysC*的质粒的菌株的筛选条件。
含有不同浓度的L-赖氨酸或AEC的M9培养基上转化子的生长见表2。此表中，+代表转化子生长，±代表有一点生长，而-代表没有生长。
表2生长及L-赖氨酸的浓度

生长及AEC的浓度

<p>pLYSC2上的lysC基因的转录方向同由lacZ启动子引起的转录的方向相一致(图4)。这样，发现pLYSC2上的lysC基因，甚至当其是野生型的，也可提供对相当高浓度的L-赖氨酸和AEC的抗性，这是因为其表达量被lacZ启动子增强，而pLYSC1上的lysC基因表达量较小且在L-赖氨酸和AEC的浓度较低时生长就受到抑制，这是因为其转录方向同lacZ启动子的方向相反，且其自身的启动子也是缺陷型的(就GT3/pLYSC2菌株而言，在加入了100mM的L-赖氨酸，以及在加了3mM的AEC的情况下，生长不受抑制，而对于GT3/pLYSC1菌株，加入0.2mM的L-赖氨酸及AEC就使得生长完全受到抑制)。在同时加入高丝氨酸和二氨基庚二酸时，证明生长抑制被消除。
因而，pLYSC1用于引入突变的实验。加入了10mM L-赖氨酸或0.2mM AEC的基本培养基M9而制备的培养基被用来筛选带有含lysC*的质粒的菌株。该培养基在下面的实施例2中被称为“选择培养基”。(2-2-2)用羟胺对pLYSC1进行体外突变处理二种方法被用于向pLYSC1质粒中引入突变，一种是体外突变处理法，其中的质粒用羟胺直接处理，且另一种是体内突变处理法，即将带有质粒的细菌细胞用亚硝基胍(NTG)处理，之后提取质粒以得到广泛的突变，就是说预期得到的突变是除是用羟胺处理时得到从胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变的其它突变。(用羟胺进行体外突变处理)2μg的DNA于75℃在0.4M羟胺中(0.1M KH2PO4-1mMEDTA(pH6.0)100μl，1M羟胺-1mM EDTA(pH6.0)80μl，DNA2μg，总共用水补充至200μl)处理到4小时。处理后的DNA用玻璃粉纯化，导入到AK完全缺陷的大肠杆菌GT3菌株中，并将菌铺于完全培养基上(L-培养基1％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，1.5％琼脂)以形成菌落。将之复制到(2-2-1)中所描述的选择培养基上，并筛选能在选择培养基上生长的菌株作为候选菌株。发现转化子的出现率和突变率是如图5中所示变化的。处理4小时，在相当高的比率下，0.5～0.8％，得到突变菌株。(用NTG进行体内突变处理)将pLYSCl导入大肠杆菌MC1061菌株，并对完整的细胞进行NTG处理。处理后的细胞培养过夜以巩固突变，且然后，提取质粒并导入大肠杆菌GT3中。就是说，转化菌株培养于2×TY培养基(1.6％Bacto胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，在OD660约为0.3时收集菌体，用下述的TM缓冲液洗，然后重悬于NTG溶液中(将NTG以0.2mg/ml浓度溶于TM缓冲液中而制得)，且在37℃下处理0到90分钟。用TM缓冲液和2×TY培养基洗涤菌体细胞，且然后将之在2×TY培养基中培养过夜以巩固突变。之后，从该细胞中提取质粒DNA，并将之导入到大肠杆菌GT3菌株中。按照体外突变中相同的方法筛选候选菌株，并且得到赖氨酸抗性(LysR)和AEC抗性(AECR)的突变株。(TM缓冲液)Tris50mM马来酸 50mM(NH4)2SO41g/LMgSO4·7H2O 0.1g/LCa(NO3)25mg/LFeSO4·7H2O 0.25mg/L用NaOH将pH调至6.0依上述方法处理后(羟胺处理；48株，NTG处理，132株)，共得到180个候选菌株，将这些菌株重新点在选择培养基上，并确证得到153株AEC和L-赖氨酸的抗性株。考虑到培养基中氨基酸集聚形式的差异，将此153株分为14个组，挑取每个组的代表菌株并对之进行4K活性的测定。由羟胺处理得到的突变株和由NTG处理得到的突变株的AK活性无大的差异。这样，进行的下列实验中未能区分它们。(2-2-3)lysC*基因的分离及lysC*产物的研究24号、43号、48号、60号、80号、117号、126号、149号、150号、156号、158号、167号、169号和172号被选作前述14个组的代表菌株。从这些菌株中回收来自pLYSC1的突变的质粒，并分别命名为pLYSC1*24、pLYSC1*43、pLYSC1*48、pLYSC1*60、pLYSC1*80、pLYSC1*117、pLYSC1*126、pLYSC1*149、pLYSC1*150、pLYSC1*156、pLYSC1*158、pLYSC1*167、pLYSC1*169和pLYSC1*172。将这些质粒及野生型pLYSC1转化AK完全缺陷的GT3菌株。从每个转化菌株中制备无细胞提取物，并测定AKIII的酶活性。
无细胞提取物(粗酶溶液)按下法制备。转化菌株培养于2×TY培养基，并在OD660约为0.8时收集菌体。用0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03Mβ-巯基乙醇在0℃下洗涤细胞，并用超声(0℃，100瓦，30分钟4次)破碎菌体细胞。经破碎的细胞溶液于0℃下以33krpm/分钟离心1小时，向得到的上清液中加入硫酸铵至80％饱和度。离心后，沉淀用0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03Mβ-巯基乙醇溶解并于4℃贮存过夜。
根据Stadtman等的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.，和Robichon-Szulmajster，H.，生物化学杂志，236，2033(1961))测定AKIII的酶活性。就是说，含有下列组分的反应液于27℃保温45分钟，加入FeCl3溶液(2.8N HCl 0.4ml+12％TCA 0.4ml+5％FeCl3·6H2O/0.1N HCl 0.7ml)以形成颜色，且离心后，于540nm测上清液的吸收值。活性由每分钟产生的氧\异羟肟酸的量来表示(1U＝1μmol/分钟)。摩尔吸收系数为600。不含天冬氨酸钾的反应液作为空白。(反应液的组成)反应混合物*1 0.3ml羟胺溶液*2 0.2ml0.1M天冬氨酸钾(pH7.0) 0.1ml酶溶液水 (平衡)总体积1.0ml*11M Tris-HCl(pH8.1)9ml+0.3M MgSO40.5ml+0.2M ATP(pH7.0)5ml*2在使用前用KOH将8M羟胺溶液中和。
在测AK的酶活中，向酶反应液中加入了不同浓度的L-赖氨酸并检测L-赖氨酸的抑制程度。结果在图6和表3中给出。野生型和24，43，48，60，80，117和126号的结果显示在图6A中。149，150，156，158，167，169和172号的结果显示在图6B中。
正如这些结果所示，野生型AKIII受到L-赖氨酸的强烈抑制，在约0.45mM L-赖氨酸存在时，50％活性被抑制，并且在5mM L-赖氨酸存在时，约100％活性被抑制。相反，尽管这次得到的突变的AKIII具有不同程度的脱敏，然而所有14种菌株对L-赖氨酸的抑制均脱敏。特别是24，80，117，169和172号，甚至L-赖氨酸达100mM时，也很少能观测到抑制，并且同野生型相比，它们的50％抑制浓度要高200倍以上。在几乎所有情况中，基于总蛋白的特异酶活性，尽管其可受到细胞的生长状况和样品制备的影响，但同野生型的相同或高于野生型，并且几乎没有由于引入突变而导致酶活性下降的问题(表3)。依据该事实，可以预测AKIII的活性中心独立于L-赖氨酸的调控位点。在表3中，抑制脱敏程度(％)是指反应液中存在有100mM的L-赖氨酸时AK的活性同没有L-赖氨酸时AK活性的比较。热稳定性(％)是指55℃下处理1.5小时后酶活性的保持率。
表3

*1存在100mM的L-赖氨酸时AK的活性同没有L-赖氨酸时AK活性的比较*255℃处理1.5小时后酶活性的保持率随后，测定了突变酶的热稳定性。当有意于改善一种酶以提高其活性时，所产生的酶在细胞中保持稳定是重要的。体外检测存在一些问题，这是因为细胞内和细胞外蛋白酶活性差别以及用于体外酶的储存的缓冲的影响。然而，为了方便，测量了体外突变的AKIII的热稳定性作为一个参数。
根据不同条件下AKIII的失活温度的研究结果，测量了于55℃下处理90分钟后酶活性的保持率。如表3中所示，半数的酶较野生型酶更好。一般来说，突变酶通常较野生型更不稳定。然而，这次得到的一些突变的AKIII在稳定性上超过野生型，并且其中的多种酶看来可以很好地实际应用于L-赖氨酸的生产中。(2-2-4)野生型lysC知突变的lysC碱基序列的测定本次所得到的野生型lysC基因碱基序列用一ABI373型测序仪按常规方法进行测序(由应用生物系统公司制造)(SEQ ID NO7)。结果是发现在6个位点(2个是氨基酸水平)与已发表的大肠杆菌K-12 JC411菌株的lysC的序列不同(Cassan，M.，Karsot，C.，Cohen，G.N.，和Patte，J.C.，生物化学杂志，261，1052(1986))。推测此6个位点的不同是由于所用菌株不同所致。
以相同的方法，测定了存在于14种突变的pLYSC1中lysC*的每个碱基序列，确定了突变位点。结果在表4中给出。在此表中，括号中示由于核苷酸突变而引起的氨基酸残基的突变。突变的类型为12种，因为在14种突变菌株中，有二对(48号和167号，24号和80号)实际上是相同的突变类型。就突变类型而言，149、150、156、158、167、169和172号是通过羟胺处理而得到，且24、43、48、60、80、117和126号是通过NTG处理而得到。然而，就突变的方式而言，由于非编码链上的胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变其中的任何一种都在于编码链上的从胞嘧啶到胸腺嘧啶，或由鸟嘌呤到腺嘌呤的突变。
表4lysC*的突变点的确定

*H；羟胺处理，N；NTG处理实施例3用导入了dapA*的菌株发酵生产L-赖氨酸为了用属于埃希氏菌属的细菌来生产L-赖氨酸，正如特开昭56-18596，美国专利No.4,346,170和应用微生物学和生物技术，15，227-231(1982)中所说，应考虑到在DDPS增强的宿主菌中具有一个被改变了的不受L-赖氨酸抑制的天冬氨酸激酶是至关重要的。预计属于沙雷氏菌属的细菌与属于埃希氏菌属的细菌相似。这样的菌株的例子是产L-苏氨酸的细菌。对于产L-苏氨酸的粘质沙雷氏菌，已知一种抗苏氨酸的类似物AHV(α-氨基-β-羟基戊酸)的菌株(S.Komatsubara，M.Kisumi和I.Chiba.应用环境微生物学，35，834(1978))。特别值得一提的是该菌株中的粘质沙雷氏菌AJ 13125菌株。该菌株已于1995年6月12日根据布达佩斯条约以许可号FERM P-14983保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮政编码305日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，并于1996年3月4日转为国际保藏且得到许可号FERM BP-5441。
另一方面，含于pdapAS24中的dapA*(其118位组氨酸残基被酪氨酸残基所替换)被选作导入到粘质沙雷氏菌中的dapA*，这是考虑了该酶对抑制的脱敏程度和其特异活性后决定的。首先，为了增加dapA*的表达量并增强质粒的稳定性，将存在于pdapAS24上的突变dapA*(此后称作“dapA*24”)连接到pVIC40的四环素抗性基因的启动子下游且RSF24P按照图7中所示获得。
通过将质粒RSF24P导入到大肠杆菌JM109菌株而得到的菌株命名为AJ12395，该菌株于1993年10月28日根据布达佩斯条件以许可号FERM P-13935保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，并于1994年11月1日转为国际保藏，得到许可号FERM BP-4858。含有pdapAS8和pdapS9的菌株未被保藏。然而，每个质粒上的dapA*的所有突变点均已在前文中确定。这样，对于本领域的技术人员来说，容易用Maniatis等的方法(Sambrook，J.，Fritsch.，E.F，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港实验室出版社，1.21(1989))从前述保藏菌中回收质粒，以及用定点诱变法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港实验室出版社，15.63(1989))得到目的基因。
用一种常规的方法将质粒RSF24P导入到AJ13125株中并得到AJ13125/RSF24P。测定AJ13125/RSF24P的L-赖氨酸的产率。
另一方面，构建作为对照质粒的KSFP。即，按照图7中所示从用BamHI和DraI双酶消化pVIC40消化产物中的筛选出一大片段，并用DNA聚合酶Klenow片段将之末端变平。平末端的大片段经自连得到质粒RSFP。用常规方法将RSFP导入AJ13125菌株。且得到AJ13125/RSFP。也测AJ13125/RSFP的L-赖氨酸的产率。
用下述培养基，将菌于30℃，以114～116转/分钟振荡培养72小时进行培养。结果列于表5。(用于L-赖氨酸生产的培养基)A(NH4)2SO416g/LKH2PO41g/LMgSO4·7H2O 1g/LFeSO4·7H2O 0.01g/LMnSO4·5H2O 0.01g/L酵母提取物(Difco公司)2g/LL-甲硫氨酸 0.5g/LL-苏氨酸 0.1g/LL-异亮氨酸 0.05g/L用KOH将pH调至7，以115℃高压灭菌10分钟(16/20体积)B20％葡萄糖(115℃高压灭菌10分钟)(4/20体积)C药用CaCO3(180℃，2天，干热灭菌)(30g/L)A和B以A∶B＝4∶1的比例混合，向混合物中以30克每升的量加入C并使之溶解，并加入一种抗生素(链霉素200μg/毫升)。
表5

实施例4用导入了dapA*和lysC*的菌株发酵生产L-赖氨酸在实施例3中已揭示了突变的DDPS对于L-赖氨酸产量的影响。为了获得进一步的提高，让实施例2中获得的突变型AKIII基因同突变的DDPS基因共存于菌中。同突变的DDPS基因共存的突变的AKIII基因选自80号菌株(lysC*80)，这是从酶活，热稳定性等考虑。
通过将已存在于pLYSC1*80上的lysC*连接(此后称为“lysC*80)到载体pHSG399(由Takara Shuzo公司生产)的lacZ启动子的下游而制得质粒pLLC*80(图8)，pHSG399相对于pUC18而言含有一反向插入位点，将lysC*80从质粒pLLC*80切下使用以增加lysC*的表达量。为了提高L-赖氨酸产率，制得质粒pLLC*80以使lysC*80的转录方向相对于lacZ启动子而言是正向的，因为pLYSC1*80上的lysC*80相对于lacZ启动子而言其转录方向是反向的。
如图9中所示，从实施例3中获得的pLLC*80和RSF24P中制备含有dapA*和lysC*的质粒RSFD80。RSFD80包括以此顺序安排的dapA*24和lysC*80以使得其转录方向在tetP的下游相对于四环素抗性基因的启动子(tetP)而言是正向的。
将RSFD80质粒导入到大肠杆菌JM109菌株中，命名为AJ12396。AJ12396于1993年10月28日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，许可号为FERM P-13936，并且根据布达佩斯条约，于1994年11月1日由转国际保藏，且其保藏许可号为FERM BP-4859储藏。带有pLYSC1*24、pLYSC1*43、pLYSC1*48、pLYSC1*60、pLYSC1*117、pLYSC1*126、pLYSC1*149、pLYSC1*150、pLYSC1*156、pLYSC1*158、pLYSC1*167、pLYSC1*169和pLYSC1*172的菌株未被保藏。然而，每个质粒中的lysC*上的所有突变位点均在上文中确定。这样，对于本领域的技术人员而言，容易用Maniatis等的方法(Sambrook，J.，Fritsch.E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港实验室出版社，1.21(1989))从前述保藏菌中回收质粒，以及用定点诱变的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港实验室出版社，15.63(1989))得到目的基因。以常规方法将RSFD80导入到AJ13125菌株且得到AJ13125/RSFD80。测定AJ13125/RSFD80的L-赖氨酸的产率。作为对照的AJ13125/RSFP的L-赖氨酸的产率也被测定。
用实施例3中的用于生产L-赖氨酸的相同培养基在30℃下， 114到116转/分钟振荡培养72小时进行培养。结果见表6。
表6

工业适用性根据本发明，得到一种来自属于埃希氏菌属的细菌的DDPS突变基因，其对L-赖氨酸的反馈抑制足够地脱敏。一种属于沙雷氏菌属的细菌，带有产生相当多量的L-赖氨酸的基因。L-赖氨酸的产量可按下述方法得到提高，即向属于沙雷氏菌属的细菌中导入突变的DDPS基因，这种菌中带有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶。
序列表(1)一般信息(i)申请者味之素公司(ii)发明题目发酵生产L-赖氨酸的方法(iii)序列数14(iv)通讯地址(A)地址味之素公司(B)街道京桥1丁目15-1(C)市中央区(D)州东京都(E)国家日本(F)邮编104(v)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日期(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号(B)提交日期(viii)代理人/事务所信息(A)人名(B)注册号(C)文献/目录号(ix)电讯信息(A)电话(B)电传(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CCGCAACTAC TGACATGACG 20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1197(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)最初来源(A)有机体大肠杆菌(B)菌株MC1061(ix)特性
(A)名称/关键词原始转录本(B)位置248(C)鉴定方法E(ix)特性(A)名称/关键词CDS(B)位置272..1150(C)鉴定方法E(ix)特性(A)名称/关键词引物结合(B)位置27..46(C)鉴定方法E(ix)特性(A)名称/关键词引物结合(B)位置1156..1175(C)鉴定方法E(ix)特性(A)名称/关键词RBS(B)位置261..265(C)鉴定方法S(xi)序列描述SEQ ID NO3CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG120TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA180TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA240TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292Met Phe Thr Gly Ser Ile Val1 5GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser10 15 20TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile25 30 35GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu40 45 50 55CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile60 65 70CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser75 80 85CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val90 95 100ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe105 110 115AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val120 125 130 135CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu140 145 150GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA 772Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu155 160 165ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu170 175 180CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly185 190 195CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala200 205 210 215CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val220 225 230ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012Ile Asa Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro235 240 245AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TFT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala250 255 260ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg265 270 275GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG1158Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu280 285 290GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度292(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys1 5 10 15Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val20 25 30Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser35 40 45Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu50 55 60Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn65 70 75 80Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly85 90 95Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln100 105 110Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu115 120 125Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu130 135 140Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile145 150 155 160Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu165 170 175Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu180 185 190Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn195 200 205Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu210 215 220His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His225 230 235 240Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys245 250 255Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr260 265 270Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His275 280 285Ala Gly Leu Leu290(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度18(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO6GAATTCCTTT GCGAGCAG 18(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征
(A)长度2147(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型基因组DNA(vi)最初来源(A)有机体大肠杆菌(B)菌株MC1061(ix)特性(A)名称/关键词-35信号(B)位置242..249(C)鉴定方法S(ix)特性(A)名称/关键词-10信号(B)位置265..273(C)鉴定方法S(ix)特性(A)名称/关键词引物结合(B)位置536..555(C)鉴定方法E(ix)特性(A)名称/关键词引物结合(B)位置2128..2147(C)鉴定方法E(ix)特性(A)名称/关键词RBS(B)位置575..578(C)鉴定方法S(ix)特性(A)名称/关键词CDS(B)位置584..1933
(C)鉴定方法S(ix)特性(A)名称/关键词终止子(B)位置1941..1968(C)鉴定方法S(xi)序列描述SEQ ID NO7TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA120AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA180AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT240CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC300CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG360AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC420TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC480ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC540CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595Met Ser Glu Ile1GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met5 10 15 20AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val25 30 35GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala40 45 50GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg55 60 65AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile70 75 80CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu85 90 95 100GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser105 110 115CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu120 125 130CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr135 140 145AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu150 155 160CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile165 170 175 180ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu185 190 195GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu200 205 210CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr215 220 225ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala230 235 240TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His245 250 255 260CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val265 270 275GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys280 285 290ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln295 300 305ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe310 315 320CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp325 330 335 340TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr345 350 355GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met360 365 370GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu375 380 385GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys390 395 400GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr405 410 415 420GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala425 430 435GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu440 445ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA2000ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT2060ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA2120TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC2147(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度449(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp1 5 10 15Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn20 25 30Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu35 40 45Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu50 55 60Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr65 70 75 80Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr85 90 95Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp100 105 110Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu115 120 125Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys130 135 140Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala145 150 155 160Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu165 170 175Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg180 185 190Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu195 200 205Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro210 215 220Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile225 230 235 240Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala245 250 255Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile260 265 270Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu275 280 285Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu290 295 300Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His305 310 315 320Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn325 330 335Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr340 345 350Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln355 360 365Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu370 375 380Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys385 390 395 400Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg405 410 415Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro420 425 430Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe435 440 445Glu(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO9CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO10TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO11TTTATTCATA ATTGCCACCG 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO12CACGGTAATA CATATAACCG 20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO13CCTGCAATTG TCAAACGTCC20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度20(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它..合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO14GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20
权利要求
1.一种属于沙雷氏菌属的细菌，该菌通过向其中导入了编码带有突变的二氢吡啶二羧酸合酶的DNA而被转化，突变使L-赖氨酸的反馈抑制脱敏。
2.根据权利要求1的DNA，其中的二氢吡啶二羧酸合酶来源于沙雷氏菌属的细菌。
3.根据权利要求2的属于沙雷氏菌属的细菌，其特征在于使对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变选自如下即用缬氨酸残基代替81位的丙氨酸残基，用酪氨酸残基代替118位的组氨酸残基，以及用缬氨酸残基代替81位的丙氨酸残基并用酪氨酸残基代替118位的组氨酸残基的突变，氨基酸的计数是从序列表中SEQ ID NO4中所定义的二氢吡啶二羧酸合酶的氨基酸序列的N-末端开始的。
4.根据权利要求1的属于沙雷氏菌属的细菌，还带有天冬氨酸激酶，该酶对L-赖氨酸的反馈抑制被脱敏。
5.根据权利要求4的属于沙雷氏菌属的细菌，带有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶，该菌是通过向细菌菌体中导入编码含有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变的天冬氨酸激酶的DNA而获得。
6.根据权利要求5的属于沙雷氏菌属的细菌，其中的天冬氨酸激酶是来源于埃希氏菌属细菌的天冬氨酸激酶III。
7.根据权利要求6的属于沙雷氏菌属的细菌，其中的使天冬氨酸激酶III对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变选如下用天冬氨酸残基替代323位甘氨酸残基，用天冬氨酸残基替代323位甘氨酸残基并用天冬氨酸残基替代408位的甘氨酸残基，用半胱氨酸残基替代34位的精氨酸残基并用天冬氨酸残基替代323位的甘氨酸残基，用苯丙氨酸残基替代325位的亮氨酸残基，用异亮氨酸残基替代318位甲硫氨酸残基，用异亮氨酸残基替代318位甲硫氨酸残基并用甲硫氨酸残基替换349位缬氨酸残基，用亮氨酸残基替换345位丝氨酸残基，用甲硫氨酸残基替代347位缬氨酸残基，用异亮氨酸残基替换352位苏氨酸残基，用异亮氨酸残基替换352位苏氨酸残基并用苯丙氨酸残基替代369位丝氨酸残基，用赖氨酸残基替换164位谷氨酸残基，以及用异亮氨酸残基替换417位甲硫氨酸残基并用酪氨酸残基替换419位半胱氨酸残基的突变，氨基酸计数是从序列表内的SEQ ID NO8中所定义的天冬氨酸激酶III的氨基酸序列的N-末端开始的。
8.根据权利要求1的属于沙雷氏菌属的细菌，该菌是赖氨酸脱羧酶缺陷型菌。
9.一种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤在合适的培养基中培养权利要求1到8中任一项中所定义的属于沙雷氏菌属的细菌，在其培养物中产生并积累L-赖氨酸并且从培养物中收集L-赖氨酸。
全文摘要
一种用于制备L－赖氨酸的方法,其中包括在适当的培养基中培养属于沙雷氏菌属的细菌,该菌通过导入以下的DNA于细胞中而被转化,其一为编码来自属于埃希氏菌属或沙雷氏菌属的细菌并具有消除L－赖氨酸反馈抑制突变的二氢吡啶二羧酸合酶的DNA且另一种为编码来自属于埃希氏菌属或沙雷氏菌属的细菌并具有消除L－赖氨酸反馈抑制突变的天冬氨酸激酶的DNA,并且收获这样积累于培养物中的L－赖氨酸。
文档编号C12N9/12GK1203629SQ96196197
公开日1998年12月30日 申请日期1996年3月14日 优先权日1995年6月13日
发明者児岛宏之, 尾川由理, 川村和枝, 佐野孝之辅 申请人:味之素株式会社