生产l－天冬氨酸的方法

专利名称：生产l－天冬氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及用具有高天冬氨酸酶活性的微生物生产L-天冬氨酸的方法。
用具有天冬氨酸酶活性的微生物大肠杆菌从富马酸铵经酶促生产L-天冬氨酸的方法是已知的。日本专利公开55-35110(即JP-B-55-35110)描述了其中将大肠杆菌天冬氨酸酶固定于离子交换树脂Duolite A-7的方法。应用生物化学和生物技术(AppliedBiochemistry andBiotechnology)第13卷231-240页(1986)描述了连续生产L-天冬氨酸的方法，其中反应器中装有大肠杆菌，所述大肠杆菌通过凝胶包埋而被固定于κ角叉菜胶中。但是，从工业化生产的角度来看，这些方法是不令人满意的，因为被固定化的天冬氨酸酶活性低，或者因为凝胶包埋固定会引起扩散障碍或使扩散速率受到限制。
由于传统的固定化天冬氨酸酶没有足够高的活性，因此，需在30℃或更高的温度完成反应，在反应中需要冷却，因为天冬氨酸酶会因反应热而损失了其活性。具体地说，在超过40℃时，活性显著降低(AppliedMicrobiology vol.27,No.5,878-885页(1974)；Applied Microbioloyg vol.27,No.5,886-889页(1974))。为了防止因反应热而引起反应器中温度的升高，需要给反应器安装内部冷却管或冷却装置例如夹套，这样使反应器结构复杂。此外，由于现有技术中固定化天冬氨酸酶的活力低，因此，不能用所述天冬氨酸酶以高LHSV完成酶促反应。在使用通过凝胶包埋固定化的天冬氨酸酶的方法中，由于扩散障碍更大，也不可能以高LHSV(液体时空速)完成酶促反应。
需要以高LHSV完成反应以便提高利用固定化天冬氨酸酶的酶促反应生产L-天冬氨酸的生产率。利用在低温具有足够高的反应活性并且扩散障碍低和压力损失小的固定化天冬氨酸酶可完成所述反应。令人遗憾的是，本领域尚未制备出所述固定化天冬氨酸酶。在这种情况下，本发明人现已制备出具有上述优良特性的固定化天冬氨酸酶，并已发现通过将底物溶液导入反应器中，同时将底物溶液的温度控制在低于至少因反应热引起的温度升高而损害天冬氨酸酶稳定性的温度，确保固定化天冬氨酸酶的稳定活性，则无需除去热即可基本上以高LHSV完成反应。
本发明提供用于生产L-天冬氨酸的方法，该方法包括固定含天冬氨酸酶的微生物细胞以产生固定化天冬氨酸酶；将富马酸铵溶液加入装有固定化天冬氨酸酶的反应器中；从反应混合物中回收产生的L-天冬氨酸，其中固定化天冬氨酸酶的活力为250U或更高，其中以2-35 LHSV的进料速率将富马酸铵溶液加至反应器中。本文所用“1U”指每分钟每毫升固定化酶产生1μmol L-天冬氨酸，“LHSV”表示“液体时空速”并表示每体积催化剂(以毫升计)每小时的进料底物体积(以毫升计)。
本发明所用的固定化天冬氨酸酶例如是固定化的重组微生物细胞，所述微生物细胞含有利用重组DNA技术导入的天冬氨酸酶基因。用含天冬氨酸酶的上述微生物细胞和聚合物包被球形载体即可得到固定化天冬氨酸酶。具体地讲，用与下列通式代表的聚合物混合的含天冬氨酸酶的上述微生物细胞包被球形苯乙烯二乙烯基苯共聚物型离子交换树脂载体可得到固定化天冬氨酸酶
其中Y是直接键或由下列分子式代表的双功能基团
或
R1和R2各自独立地是氢原子或有机残基，X是阴离子，n是100-5000的整数。
举证性的有机残基包括含有10个碳原子以下的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基，优选甲基。有机残基可包括至少一个作为取代基的卤素或羟基，例如4-氯-2-二甲基戊基，3-乙基-2,5-二氯庚基和2-羟基-3,5-二甲基壬基，优选3-氯-2-羟基丙基。
X的实例包括卤素离子如F-、Cl-、Br-和I-，优选Cl-。也可用其他单价离子如NO3-作为X。
通过上述固定方法固定上述含天冬氨酸酶基因的重组微生物细胞而得到的本发明固定化天冬氨酸酶有极高的活性并且压力损失少以及扩散障碍小。结果，与传统固定化天冬氨酸酶不同，利用本发明的固定化天冬氨酸酶可以以高LHSV完成酶促反应。
由于可将低温富马酸铵溶液加至反应中，所以天冬氨酸酶的寿命得到延长。
在阅读和理解了下列详细描述后，本发明的这些和其他优点对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
本发明说明书包括在日本专利申请10-31809说明书中所公开的所有内容，该申请是本申请的优先权文件。发明详述本发明可使用的含天冬氨酸酶微生物优选是大肠杆菌、荧光假单胞菌、短杆菌属等，已知所述微生物具有高天冬氨酸酶活性。特别优选含有用重组DNA技术导入的天冬氨酸酶基因的重组细胞。
本发明所用的天冬氨酸酶基因优选得自大肠杆菌和含有天冬氨酸酶活性并且已知其基因与大肠杆菌基因天然杂交的微生物，例如荧光假单胞菌、肠杆菌属或柠檬酸杆菌属。但是，可以使用来自任何具有天冬氨酸酶活性之微生物的天冬氨酸酶基因。
例如，利用大肠杆菌K-12(IFO3301)或荧光假单胞菌(IFO3081)的染色体DNA为模板，利用以已知天冬氨酸酶基因序列为基础制备的引物，通过PCR扩增天冬氨酸酶基因。或者，通过其他常规方法，例如将得自染色体DNA的限制片段进行电泳以回收含天冬氨酸酶基因的片段，也可得到天冬氨酸酶基因。
用于掺入由此所得的天冬氨酸酶基因的质粒可以是任何能够在大肠杆菌细胞中复制的质粒。所述质粒的实例包括，但不限于pUC18(Nippon Gene Co.,Ltd.)和pKK223-3(Pharmacia)。
作为用于导入已掺入天冬氨酸酶基因之质粒的宿主微生物，可以使用大肠杆菌菌株K-12(Stratagene)等。
优选以具有下列特性的方法固定含天冬氨酸酶的微生物细胞，所述方法应使固定化产物有足够的强度，而且在加入底物溶液后不太可能引起压力损失或扩散障碍。
优选通过用细胞和聚合物包被球形载体表面来固定微生物细胞。更优选的是用细胞和聚丙烯基胺聚合物的混合物包被苯乙烯二乙烯苯共聚物型离子交换树脂的表面。作为苯乙烯二乙烯苯共聚物型离子交换树脂和聚丙烯基胺聚合物，分别优选Amberlite IRA96SB(Organo)和PAS-880(Nitto Boseki Co.,Ltd)。
根据上述方法，由于含天冬氨酸酶的微生物细胞本身即可被固定在载体上，因此，所述细胞中所含的天冬氨酸酶几乎全部被固定，由此得到具有很高活性的固定化天冬氨酸酶。
通过将与PAS-880(pH7.0)混合的细胞加至含Teflon球和AmberliteIRA-96SB的茄形烧瓶中，用旋转蒸发器减压旋转干燥混合物，由此用细胞和PAS-880包被Amberlite IRA-96SB的表面，从而固定微生物细胞。
根据上述方法，可得到球形固定化产物，当LHSV为20时，每米固定化天冬氨酸酶层的压力损失为2.0kg/cm2或更低(水中，20℃)。这样以高LHSV反应就成为可能。该方法的其他优点是扩散层足够薄，因此可表现出足够的酶活性。当LHSV为20时，每米固定化天冬氨酸酶层固定化酶的压力损失优选为2kg/cm2或更低，更优选1kg/cm2或更低。用于本发明的反应器形状通常，但不限于圆柱形反应器。反应器长度优选为10米或低于10米，因为反应器过长会引起压力损失。不需给反应器安装冷却装置。更优选，反应器是绝缘的。
需要在反应器前安装一温度可控储槽或热交换器以便使加至反应器中的富马酸铵溶液保持恒温。
通常，超过40℃时，嗜温菌酶是不稳定的，而且由于热其失活也会加速。在超过40℃时，大肠杆菌天冬氨酸酶极为不稳定，而且因热会使其活性受到损失(Applied Microbiology vol.27,No.5,878-885页(1974)；Applied Microbiology vol.27,No.5,886-889页(1974))。这种因热而引起的失活会导致固定化酶的寿命缩短。
为了防止因热引起的天冬氨酸酶失活，就需要控制加至反应器中的富马酸铵的温度，以便反应器出口处反应混合物的温度不超过40℃。
在所述温度范围内，可得到具有良好稳定性的天冬氨酸酶。在大肠杆菌的情况下，温度范围是40℃或低于40℃，在较低的温度，稳定性较高。为了用在40℃或高于40℃的最佳温度仍稳定的天冬氨酸酶得到相似的效果，将进料底物溶液的温度控制在低于损伤天冬氨酸酶稳定性的温度，所述对天冬氨酸酶稳定性的损伤至少是由于反应热引起的温度升高而导致的。用传统固定化酶在上述范围内不能完成反应，因为传统固定化酶的活力不够。“损伤天冬氨酸酶稳定性的温度”，在大肠杆菌天冬氨酸酶的情况下是40℃左右，在黄色短杆菌天冬氨酸酶的情况下是48℃左右(Journai of Japan Society for Bioscience,Biotechnology,andAgrochemistry,vol.59,No.1,31-37页，1985)，在产氨基酸芽孢杆菌天冬氨酸酶的情况下是50℃左右(日本专利申请3-48795)。
此外，当将富马酸铵溶液加至反应器并在平衡状态转变成L-天冬氨酸时，富马酸铵溶液的温度将升高。在这种情况下，通过将富马酸铵溶液温度控制在低于40℃，就可将反应混合物的温度保持在40℃或40℃以下。在上述范围内，温度应尽可能低以便提高稳定性。但是温度过低可能会引起晶体富马酸铵沉淀，因此在反应器入口的富马酸铵溶液温度优选最低为10℃至33℃，更优选15℃至28℃。
可将除大肠杆菌外的微生物天冬氨酸酶置于与上述条件相似的条件下。
具体地讲，当富马酸铵溶液的浓度为10％(按富马酸计算)时，由于反应热，温度升高约7℃。考虑固定化天冬氨酸酶的反应性，优选在10℃至33℃，更优选15℃至28℃，将富马酸铵溶液加至反应器中。
当富马酸铵溶液的浓度为20％(按富马酸计算)时，由于反应热，温度升高约14℃，因此，优选在10℃至26℃，更优选15℃至24℃，将富马酸铵溶液加至反应器中。用这种方法，反应器出口的反应混合物的温度将不超过40℃，天冬氨酸酶保持稳定。此外，在反应器内不需进行冷却，反应器本身的结构更加简单。
就生产率而言，优选加至反应器中的富马酸铵溶液的速度尽可能高，但所述速度可随富马酸铵溶液的浓度、固定化天冬氨酸酶的活力和固定化天冬氨酸酶层的长度而变化。LHSV范围优选为2-35，特别为6-30，最佳为7-25。
LHSV超出上述范围是不利的，因为富马酸铵溶液转变成L-天冬氨酸的转化率将降低。另一方面，LHSV低于上述范围也是不利的，因为会使生产率降低。
在反应器出口，富马酸铵溶液转变成L-天冬氨酸的转化率优选为90％或更高，最佳为95％或更高。异常低的转化率是不利的，因为这样会增加未反应富马酸的量并引起成本增加。
优选固定化天冬氨酸酶的活力为250U，最佳为500U。
当固定化天冬氨酸酶的活力为250U时，在以LHSV为2，将20％富马酸铵溶液加至反应器中并且其入口处温度为20℃的条件下，转化率为99％或更高。但是，当固定化天冬氨酸酶的活力为100U，其他条件与上述相同时，转化率降至80％。当固定化天冬氨酸酶的活力为1000U，在以LHSV为10，将20％富马酸铵溶液加至反应器中并且其入口处温度为23℃的条件下，转化率为99％或更高。
如上所述，具有较高活性的固定化天冬氨酸酶能够使反应以较高LHSV进行。
以下将描述用遗传工程技术制备大肠杆菌或荧光假单胞菌天冬氨酸酶的方法。
(1)制备重组大肠杆菌天冬氨酸酶将从发酵研究所(Institute for Fermentaton,Osaka,Japan(IFO))购买的大肠杆菌菌株IFO3301接种至表1所示的LB培养基中，在37℃培养8小时。从1毫升培养物中，收集大肠杆菌细胞并悬浮在1毫升蒸馏水中。用1微升细胞悬浮液作为模板DNA用于扩增天冬氨酸酶基因。
表1LB培养基的组成聚胨10g酵母提取物 5gNaCl10g蒸馏水 1升(用高压消毒锅在121℃灭菌15分钟)(2)用PCR扩增天冬氨酸酶基因并制备插入片段为了扩增大肠杆菌的天冬氨酸酶基因，以已知大肠杆菌菌株K-12的天冬氨酸酶基因(其核苷酸序列由SEQ ID NO:1表示，由其编码的氨基酸序列由SEQ ID NO:2表示)(Biochem.J.237(2),547-557)为基础，制备下列两个引物引物F1:GGATAATCGTCGGTCGAAAA (SEQ ID NO:3)引物R1:CGTCATCTGACGTGCCTTT (SEQ ID NO:4)用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制备含有下列组成的反应溶液以便在下列条件下通过PCR扩增天冬氨酸酶基因组成10x缓冲液 5μldNTPs混合物 5μlMgCl22μl模板DNA 1μlKOD DNA聚合酶 1μl引物F1(25pmol) 1μl引物R1(25pmol) 1μl蒸馏水 34μl总量50μlPCR条件(其中将ⅱ至ⅳ重复30个循环)ⅰ. 98℃,5分钟ⅱ. 98℃,30秒ⅲ. 53℃,30秒ⅳ. 68℃,1分钟在PCR反应结束时，在1％琼脂糖凝胶上电泳扩增的DNA片段并用溴化乙锭染色。预期的约1600bp片段被扩增。
从凝胶上切下片段以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(3)将插入片段与载体连接存在限制酶Srf和DNA连接酶的条件下，将回收的DNA片段连接至pCR-Script Amp SK(+)克隆载体中。
将含插入片段的转化体命名为PUaspE1菌株。将菌株PUaspE1接种至3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基中并在37℃振荡培养过夜。从1.5ml培养物收集细胞，再用碱SDS方法从细胞中回收质粒。将质粒命名为pUaspE1。
质粒中插入片段的定序表明以与载体启动子相反的方向插入了天冬氨酸酶基因。
为了相对于启动子以向前的方向正确地连接天冬氨酸酶基因，用限制酶SacⅠ和BamHⅠ从质粒pUaspE1中裂解出插入片段以导入pUC19(Nippon Gene Co.,Ltd.)。具体地讲，首先用BamHⅠ裂解质粒pUaspE1，然后在用SacⅠ裂解前，通过乙醇沉淀收集DNA。在1％琼脂糖凝胶上电泳分离裂解的DNA片段，然后从凝胶上切下以便用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA插入片段。
(4)制备载体将1μg质粒pUC19(Nippon Gene Co.,Ltd.)用限制酶BamHⅠ裂解，然后通过乙醇沉淀回收所得的DNA片段，再用SacⅠ裂解。在1％琼脂糖凝胶上电泳分离裂解的DNA片段，然后从凝胶上切下以便用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收靶DNA作为载体。
(5)将插入片段与载体相连在16℃，经30分钟，用Ligation high(Toyobo Co.,Ltd.)将均已用相同限制酶裂解过的插入片段和载体相连。
(6)转化大肠杆菌为了转化大肠杆菌，将2μl反应混合物加至200μl感受态大肠杆菌细胞(由Stratagene生产的XL2-Blue MRF’超感受态细胞)中，所述反应混合物含有带连接的插入片段的载体。将大肠杆菌转化体铺在含100ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基上并在37℃培养过夜。
作为对照，将用不含插入片段的质粒pUC18转化的大肠杆菌铺在含100ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基上并在37℃培养过夜。
捡出出现的20个菌落，接种至含100ppm氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃振荡培养。8小时后，将IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)加至培养基中达到1mM的浓度，然后在30 ℃振荡培养过夜。从1毫升培养物中回收细胞。
同样，培养不含插入片段的对照转化体以回收细胞。通过加入1毫升表2所示的富马酸铵底物溶液悬浮回收的细胞，然后使其在30℃反应1小时。
表220％富马酸铵底物溶液的组成富马酸 200g25％氨水200g硫酸镁 2.5g离子交换水 500g在用25％氨水将反应混合物的pH调整至8.3后，加入离子交换水达到1升的总体积。在分析反应混合物时，在含插入片段的大肠杆菌转化体中，转变成L-天冬氨酸的转变百分比为99.5％，而不含插入片段的对照转化体的转变百分比为5％。
将含插入片段的一个转化体命名为PUaspE2。将PUaspE2菌株接种至3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基中，然后在37℃培养8小时。从1.5ml培养物中，用碱SDS方法回收质粒，将其命名为pUaspE2。用限制酶SmaⅠ裂解质粒pUaspE2，然后用限制酶HindⅢ裂解，接着用1％琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段的大小。出现了大小分别为约2960bp和约1600bp的两个片段。
用PUaspE2菌株接种3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基，然后在37℃振荡培养。8小时后，将IPTG加至培养基中达到1mM的浓度，然后在30℃继续振荡培养。从1毫升培养物中回收细胞，其在OD660nm的密度为8.0。将细胞悬浮在10毫升20％富马酸铵底物溶液中，然后在30℃反应1小时。用HPLC分析反应混合物。以L-天冬氨酸产率和细胞密度为基础计算天冬氨酸酶活性，其活性为2,000,000μML-天冬氨酸/小时/OD660nm细胞密度。
同样，培养并回收不含插入片段的一个对照转化体。其在OD660nm的密度为8.5。将细胞悬浮在10毫升20％富马酸铵底物溶液中，然后在30℃反应1小时。用HPLC分析反应混合物。以L-天冬氨酸产率和细胞密度为基础计算天冬氨酸酶活性，其活性为10,000μM L-天冬氨酸/小时/OD660nm细胞密度。
PUaspE2菌株的天冬氨酸酶活性是不含天冬氨酸酶基因插入片段之菌株的200倍。
(7)培养重组大肠杆菌用能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组体大肠杆菌菌株PUaspE2接种10个试验试管，每个试管含有3毫升通过将100ppm氨苄青霉素加至表1所示培养基而制备的培养基，然后在37℃培养。8小时后，用试验试管中的培养物分别接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升与上述用1mMIPTG补充的培养基具有相同组成的培养基，然后在30℃振荡培养过夜。
从这些培养物中，离心收集细胞。测量的细胞的天冬氨酸酶活性为1.05mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。
(8)制备重组荧光假单胞菌天冬氨酸酶用从发酵研究所，Osaka(IFO)购买的荧光假单胞菌菌株IFO3081接种表1所示的LB培养基，然后在30℃培养8小时。从1毫升培养物收集细胞，然后悬浮在1毫升蒸馏水中。用1μl细胞悬浮液作为模板DNA用于扩增天冬氨酸酶基因。
(9)用PCR扩增天冬氨酸酶基因并制备插入片段为了扩增荧光假单胞菌的天冬氨酸酶基因，以已知荧光假单胞菌菌株IFO3081的天冬氨酸酶基因的核苷酸序列(J.Biochem.100,697-705(1986))为基础，制备下列两个引物引物F2GGGCATATGATCTCCGTCATGTCCTCTGCTGCATCTTTCCG(SEQ ID NO:5)引物R2CCCGGATCCTTAGGCCTTCAGCGGACCAAGCGTGGGG(SEQ ID NO:6)用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制备含有下列组成的反应溶液以便在下列条件下通过PCR扩增天冬氨酸酶基因组成10x缓冲液 5μldNTPs混合物 5μlMgCl22μl模板DNA 1μlKOD DNA聚合酶 1μl引物F2(25pmol) 1μl引物R2(25pmol) 1μl无菌水 34μl总量50μlPCR条件(其中将ⅱ至ⅳ重复30个循环)ⅰ.98℃,5分钟ⅱ． 98℃,30秒ⅲ． 55℃,30秒ⅳ.68℃,1分钟在PCR反应结束时，在1％琼脂糖凝胶上电泳扩增的DNA片段并用溴化乙锭染色。预期的约1500bp片段被扩增。
从凝胶上切下片段以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ同时裂解回收的DNA，通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离所得的NdeⅠ-BamHⅠ片段，然后从凝胶上切下以按上述用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(10)制备载体为了通过PCR制备在质粒pUC18的β-半乳糖苷酶结构基因的起始和终止密码子位置分别含有NdeⅠ和BamHⅠ限制酶位点的载体DNA片段，制备下列两个引物引物F3:CCCCATATGTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAATATACGAGCC(SEQ ID NO:7)引物R3CCCGGATCCTTAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACC(SEQ ID NO:8)用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制备含有下列组成的反应溶液以便在下列条件下通过PCR扩增天冬氨酸酶基因组成10x缓冲液 5μldNTPs混合物 5μlMgCl22μl模板DNA 1μlKOD DNA聚合酶 1μl引物F3(25pmol)1μl引物R3(25pmol)1μl无菌水34μl总量 50μlPCR条件(其中将ⅱ至ⅳ重复30个循环)ⅰ. 98℃,5分钟ⅱ98℃,30秒ⅲ． 55℃,30秒ⅳ. 68℃,1分钟在PCR反应结束时，在1％琼脂糖凝胶上电泳扩增的DNA片段并用溴化乙锭染色。预期的约2400bp片段被扩增。
从凝胶上切下片段以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ同时裂解回收的DNA，通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离所得的NdeⅠ-BamHⅠ片段，然后从凝胶上切下以按上述用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(11)将插入片段与载体相连在16℃，经30分钟，用Ligation high(Toyobo Co.,Ltd.)将均已用相同限制酶裂解过的插入片段和载体相连。
(12)转化大肠杆菌为了转化大肠杆菌，将2μl反应混合物加至200μl感受态大肠杆菌细胞(由Stratagene生产的XL2-Blue MRF’超感受态细胞)中，所述反应混合物含有带连接的插入片段的载体。将大肠杆菌转化体铺在含100ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基上并在37℃培养过夜。
作为对照，将用不含插入片段的质粒pUC18转化的大肠杆菌铺在含100ppm氨苄青霉素的LB琼脂培养基上并在37℃培养过夜。
捡出出现的20个菌落，接种至含100ppm氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃振荡培养。8小时后，将IPTG加至培养基中达到1mM的浓度，然后在30℃振荡培养过夜。从1毫升培养物中回收细胞。
同样，培养不含插入片段的一个对照转化体以回收细胞。
将回收的细胞悬浮在1毫升表2所示的富马酸铵底物溶液中并在30℃反应1小时。
分析反应混合物。结果在含插入片段的大肠杆菌转化体中，转变成L-天冬氨酸的转化％为99.5％，而不含插入片段的对照转化体的转化％为5％。
将含插入片段的转化体命名为PUaspP1。用菌株PUaspP1接种3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基，然后在37℃培养8小时。从1.5毫升培养物中用碱SDS法回收质粒，将该质粒命名为pUaspP1。用限制酶NdeⅠ和BamHⅠ裂解该质粒，然后用1％琼脂糖凝胶电泳以确定DNA片段的大小。出现了大小为约2400bp和约1500bp的两个片段。
用PUaspP1菌株接种3毫升含100ppm氨苄青霉素的LB培养基，然后在37℃振荡培养。8小时后，将IPTG加至培养基中达到1mM的浓度，然后在30℃继续振荡培养。从1毫升培养物中回收细胞，其在OD660nm的密度为8.0。将细胞悬浮在10毫升20％富马酸铵底物溶液中，然后在30℃反应1小时。通过HPLC分析反应混合物。以L-天冬氨酸产率和细胞密度为基础计算天冬氨酸酶活性，其活性为2,500,000μML-天冬氨酸/小时/OD660nm细胞密度。
同样，培养并回收不含插入片段的一个对照转化体。其在OD660nm的密度为7.0。将细胞悬浮在10毫升20％富马酸铵底物溶液中，然后在30℃反应1小时。通过HPLC分析反应混合物。以L-天冬氨酸产率和细胞密度为基础计算天冬氨酸酶活性，其活性为10,000μM L-天冬氨酸/小时/OD660nm细胞密度。
PUaspP1菌株的天冬氨酸酶活性是不含天冬氨酸酶基因插入片段之菌株的250倍。
(13)培养重组大肠杆菌用能够表达荧光假单胞天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌菌株PUaspP1接种10个试验试管，每个试管含有3毫升通过将100ppm氨苄青霉素加至表1所示培养基而制备的培养基，然后在37℃培养。8小时后，用试验试管中的培养物分别接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升与上述用1mM IPTG补充的培养基具有相同组成的培养基，然后在30℃振荡培养过夜。
从这些培养物中，离心收集细胞。测量的细胞的天冬氨酸酶活性为0.85mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。
下文将通过下列实施例更详细地描述本发明。但是本发明的技术范围不限于所述实施例。实施例1用能够表达荧光假单胞菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspP1接种10个试验试管，每个试管含有3毫升通过将100ppm氨苄青霉素加至表1所示培养基而制备的培养基，然后在37℃培养。8小时后，用试验试管中的培养物分别接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升通过将1mM IPTG和100ppm氨苄青霉素加入到表3所示的培养基中制得的培养基，然后在30℃振荡培养过夜。从这些培养物中，离心收集细胞。天冬氨酸酶的活力为0.19mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。
表3培养基组成富马酸 10g硫酸铵 5gKH2PO41gK2HPO43gMgSO4·7H2O 0.5gNaOH 6.5g,pH6.3酵母提取物 20g(用高压消毒锅在121℃灭菌15分钟)将70g PAS-880(Nitto Boseki Co.,Ltd.)(用碱将pH调至7.0左右)和230g去离子水彻底混合，在其中将收集的细胞分散均匀。将300毫升离子交换树脂(由Organo,Japan生产的AmberliteIRA-96SB型C1，平均颗粒大小为0.5mm)和200个Teflon球(每个0.5英寸)放在6L茄形烧瓶中，向其中加入1/6上述细胞分散液。在30℃用蒸发器将混合物旋转干燥1小时以便用细胞包被离子交换树脂。该步骤重复6次后，除去Teflon球得到珠样的固定化天冬氨酸酶。所述固定化天冬氨酸酶的活力为354U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的50毫升填充柱形反应器(1cm直径)。负载的固定化天冬氨酸酶层的长度为约64厘米。为了使反应器绝热，用热绝缘材料即聚苯乙烯泡沫包覆该柱。经用热绝缘材料包覆的Teflon管，以100毫升/小时(LHSV=2.0)的流速将底物溶液(每升含200g富马酸，200g25％氨水，0.25gMgSO4·7H2O；用氨水将pH调至8.3)加至柱中以完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为99.77％。流出物的温度为33℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到99.7％。
为了测量固定化天冬氨酸酶的压力损失，使水(20℃)流过该柱。结果，当LHSV为20(1L/小时)时，每米固定化天冬氨酸酶层的压力损失为0.8kg/cm2。实施例2用能够表达荧光假单胞菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspP1接种10个试验试管，每个试管含有3毫升通过将100ppm氨苄青霉素加至表1所示培养基而制备的培养基，然后在37℃培养。8小时后，用试验试管中的培养物分别接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升通过将1mM IPTG和100ppm氨苄青霉素加入到表3所示的培养基中制得的培养基，然后在30℃振荡培养过夜。从这些培养物中，离心收集细胞。天冬氨酸酶的活力为0.85mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。
按照与实施例1相同的方法固定细胞以得到固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为2800U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按照实施例1的描述进行连续反应。负载的固定化天冬氨酸酶层的长度为约13厘米。以100毫升/小时(LHSV=10.0)的流速将底物溶液(20℃)加至柱中以完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为99.6％。流出物的温度为33℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到99.5％。实施例3用能够表达荧光假单胞菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspP1接种10个试验试管，每个试管含有3毫升通过将100ppm氨苄青霉素加至表1所示培养基而制备的培养基，然后在37℃培养。8小时后，用试验试管中的培养物分别接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升通过将1mM IPTG和100ppm氨苄青霉素加入到表3所示的培养基中制得的培养基，然后在30℃振荡培养过夜。从这些培养物中，离心收集细胞。天冬氨酸酶的活力为0.85mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。
按照实施例1所述的方法固定细胞以得到固定化天冬氨酸酶，不同之处是仅将一半的细胞用于固定。固定化天冬氨酸酶的活力为560U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按实施例2所述完成连续反应，但用恒温器将底物溶液保持在23℃。以100毫升/小时(LHSV=10.0)的流速将底物溶液加至柱中以完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为99.6％。流出物的温度为36℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到99.5％。实施例4用能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspE2接种10个试验试管，每个试管含有3毫升通过将100ppm氨苄青霉素加至表1所示培养基而制备的培养基，然后在37℃培养。8小时后，用试验试管中的培养物分别接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升通过将1mM IPTG和100ppm氨苄青霉素加入到表3所示的培养基中制得的培养基，然后在30℃振荡培养过夜。从这些培养物中，离心收集细胞。天冬氨酸酶的活力为1.27mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。
按照与实施例1所述相同的方法固定细胞以得到固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为3200U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按实施例1所述完成连续反应。以100毫升/小时(LHSV=10.0)的流速将底物溶液(20℃)加至柱中以完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为99.6％。流出物的温度为33℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到99.6％。
为了测量固定化天冬氨酸酶的压力损失，使水(20℃)流过该柱。结果，当LHSV为20(1L/小时)时，每米固定化天冬氨酸酶层的压力损失为0.7kg/cm2。实施例5按实施例4所述培养能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspE2以收集细胞。天冬氨酸酶活性为1.00mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。除仅用1/10所得细胞外，按实施例1所述得到固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为265U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按实施例1所述完成连续反应。以20毫升/小时(LHSV=2.0)的流速将底物溶液(20℃)加至柱中。反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为99.2％。流出物的温度为31℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到99.2％。实施例6按实施例4所述培养能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspE2以收集细胞。天冬氨酸酶活性为1.20mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。按实施例1所述从细胞制备固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为3600U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按实施例1所述完成连续反应。以200毫升/小时(LHSV=20.0)的流速将底物溶液(20℃)加至柱中以完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为97.0％。流出物的温度为33℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到97.0％。实施例7按实施例4所述培养能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspE2以收集细胞。天冬氨酸酶活性为1.20mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。按实施例1所述从细胞制备固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为3600U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按实施例1所述完成连续反应。以250毫升/小时(LHSV=25.0)的流速将底物溶液(20℃)加至柱中。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为90.0％。流出物的温度为31℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到90.0％。实施例8按实施例4所述培养能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspE2并经两次固定过程以制备约600毫升固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为3000U。将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中一星期，用其中的500毫升填充柱形反应器(1英寸直径)以便按实施例1所述完成连续反应。固定化天冬氨酸酶层的长度为80厘米。
在底物溶液温度为24℃进料速率为5升/小时(LHSV=10)的条件下完成反应。反应开始后2小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为99.4％。
反应开始后3小时，将进料速率改为10L/小时(LHSV=20)。1小时后，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸的摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为98.2％。
反应开始后4小时，将进料速率改为12.5L/小时(LHSV=25)。1小时后，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸的摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为96.3％。
反应开始后7小时，将进料速率改为15L/小时(LHSV=30)。1小时后，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸的摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为93.8％。
反应开始后9小时，将进料速率改为17.5L/小时(LHSV=35)。1小时后，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为90.3％。
反应开始后11小时，将进料速率改为20L/小时(LHSV=40)。1小时后，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸的摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为85.8％。比较实施例1用大肠杆菌菌株K-12(IFO3301)接种10个试验试管，每个试管含3毫升表3所示培养基，然后在37℃培养。8小时后，分别用试验试管中的培养物接种10个Sakaguchi烧瓶，每个烧瓶含100毫升表3所示培养基，然后在30℃振荡培养过夜。从这些培养物中离心收集细胞。天冬氨酸酶活性为0.063mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。从所得细胞按实施例1所述制备固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为126U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按实施例1所述完成连续反应。以20毫升/小时(LHSV=2.0)的流速将底物溶液(20℃)加至柱中。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为86.4％。流出物的温度为31℃。反应开始后7天和1个月，转化率分别为86.8％和86.2％。比较实施例2按实施例5所述培养能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspE1以制备固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为263U。
按实施例1所述，经用绝热材料包覆的Teflon管，以20毫升/小时(LHSV=2.0)的流速将底物溶液(每升含200g富马酸，200g25％氨水，0.25gMgSO4·7H2O；用氨水将pH调至8.3)加至柱中以完成连续反应。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸的摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为99.7％。流出物的温度为43℃。反应开始后7天和1个月，转化率分别为94.5％和77.6％。比较实施例3按实施例4所述培养能够表达大肠杆菌天冬氨酸酶的重组大肠杆菌菌株PUaspE2以收集细胞。天冬氨酸酶活性为1.20mol L-天冬氨酸/小时/g细胞。从这些细胞按实施例1所述制备固定化天冬氨酸酶。固定化天冬氨酸酶的活力为3500U。
4℃，将上述制备的固定化天冬氨酸酶浸在20％富马酸铵溶液(pH8.3)中过夜，用其中的10毫升填充柱形反应器(1cm直径)以便按实施例1所述完成连续反应。以300毫升/小时(LHSV=30.0)的流速将底物溶液(20℃)加至柱中。
反应开始后3小时，分析反应混合物。所得的反应产物即L-天冬氨酸的摩尔数基本上等于消耗的富马酸的摩尔数。反应转化率为75.0％。流出物的温度为31℃。反应开始后7天，甚至1个月，转化率仍达到75.0％。
根据本发明的方法，利用具有高天冬氨酸酶活性的微生物可以以高产率得到L-天冬氨酸。
不偏离本发明范围和精神的各种其他修饰对于本领域技术人员是显而易见并很容易完成的。因此，不能认为本文权利要求的反应仅限于本文所描述的范围，而应给权利要求以更宽的解释。
本文引用的所有文献包括专利和专利申请均全文引入本文作为参考。
下列是本文描述的序列资料序列表SEQ ID NO:1:序列长度1573序列类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型cDNA到mRNA来源大肠杆菌序列描述SEQ ID NO:1ggggataatc gtcggtcgaa aaacattcga aaccacatat attctgtgtg ttaaagcaa 60atcattggca gcttgaaaaa gaaggttcac atg tca aac aac att cgt atc gaa 114Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu1 5gaa gat ctg ttg ggt acc agg gaa gtt cca gct gat gcc tac tat ggt 162Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly10 15 20gtt cac act ctg aga gcg att gta aac ttc tat atc agc aac aac aaa 210Val His Thr Leu Arg Ala Ile Val Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys25 30 35 40atc agt gat att cct gaa ttt gtt cgc ggt atg gta atg gtt aaa aaa 258Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys45 50 55gcc gca gct atg gca aac aaa gag ctg caa acc att cct aaa agt gta 306Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val60 65 70gcg aat gcc atc att gcc gca tgt gat gaa gtc ctg aac aac gga aaa 354Ala Asn Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys75 80 85tgc atg gat cag ttc ccg gta gac gtc tac cag ggc ggc 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序列长度62序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:7ccccatatgt gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aatatacgac 60cc 62SEQ ID NO:8:
序列长度42序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其他核酸，人工序列序列描述SEQ ID NO:8cccggatcct tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cc 4权利要求
1．用于生产L-天冬氨酸的方法，该方法包括固定含天冬氨酸酶的微生物细胞以产生固定化天冬氨酸酶；将富马酸铵溶液加至装有固定化天冬氨酸酶的反应器中；和从反应混合物中回收生产的L-天冬氨酸，其中固定化天冬氨酸酶的活力为250U或更高，其中以LHSV为2-35的进料速率将富马酸铵溶液加至反应器中。
2．根据权利要求1的方法，其中将要被加入反应器的富马酸铵溶液的温度控制在低于损害天冬氨酸酶稳定性的温度，所述损害至少是因天冬氨酸酶与富马酸铵反应过程中产生的热而引起的富马酸铵溶液温度升高而导致的。
3．根据权利要求1的方法，其中要被加入反应器的富马酸铵溶液的温度为10-33℃。
4．根据权利要求1的方法，其中含天冬氨酸酶的微生物是含有通过重组DNA技术导入的天冬氨酸酶基因的重组微生物细胞。
5．根据权利要求1-4任意一项的方法，其中通过用含天冬氨酸酶的微生物细胞和聚合物的混合物包被球形载体而得到固定化天冬氨酸酶。
6．根据权利要求1-5任意一项的方法，其中所述固定化天冬氨酸酶是通过与下列通式代表的聚合物混合的含天冬氨酸酶的微生物细胞包被球形苯乙烯二乙烯基苯共聚物型离子交换树脂载体而制得的
其中Y是直接键或由下列分子式代表的双功能基团
或
R1和R2各自独立地是氢原子或有机残基，X是阴离子，n是100-5000的整数。
7．根据权利要求1-6任意一项的方法，其中当LHSV为20时，所述固定化天冬氨酸酶的压力损失为每米固定化天冬氨酸酶层2.0kg/cm2或更低(用水，20℃)。
全文摘要
本发明涉及用于生产L－天冬氨酸的方法,该方法包括:固定含天冬氨酸酶的微生物细胞以产生固定化天冬氨酸酶;将富马酸铵溶液加至装有固定化天冬氨酸酶的反应器中;从反应混合物中回收生产的L－天冬氨酸,其中固定化天冬氨酸酶的活力为250U或更高,其中以LHSV为2—35的进料速率将富马酸铵溶液加至反应器中。
文档编号C12N11/08GK1229142SQ9910074
公开日1999年9月22日 申请日期1999年2月12日 优先权日1998年2月13日
发明者向山正治, 小松崎聡美 申请人:株式会社日本触媒