ysosporium queenslandicum)、 热带金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、带纹金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、 杆孢状镰孢（Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢（Fusarium cerealis)、库威镰孢 (Fusarium crookwellense)、黄色镜抱菌（Fusarium culmorum)、禾谷镜抱菌（Fusarium graminearum)、禾赤镜抱（Fusarium graminum)、异抱镜抱（Fusarium heterosporum)、合 欢木镜抱（Fusarium negundi)、尖抱镜抱菌（Fusarium oxysporum)、多枝镜抱（Fusarium reticulatum)、粉红镜抱菌（Fusarium roseum)、接骨木镜抱（Fusarium sambucinum)、 肤色镜抱（Fusarium sarcochroum)、拟枝抱镜抱菌（Fusarium sporotrichioides)、 硫色镜抱菌（Fusarium sulphureum)、圆镜抱（Fusarium torulosum)、拟丝抱镜抱 菌（Fusarium trichothecioides)、镶片镜抱菌（Fusarium venenatum)、灰腐质霉 (Humicola grisea)、特异腐质霉（Humicola insolens)、疏棉状腐质霉（Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌（Irpex lacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、嗜热毁丝 霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖脉抱菌（Neurospora crassa)、绳状青霉菌 (PeniciIlium funiculosum)、产紫青霉（Penicillium purpurogenum)、黄抱原毛平革 菌（Phanerochaete chrysosporium)、无色梭抱壳（Thielavia achromatica)、成层梭 抱壳菌（Thielavia albomyces)、白毛梭抱壳（Thielavia albopilosa)、澳洲梭抱壳 (Thielavia australeinsis)、奠梭抱壳（Thielavia fimeti)、小抱梭抱壳（Thielavia microspora)、卵抱梭抱壳（Thielavia ovispora)、秘鲁梭抱壳（Thielavia peruviana)、 毛梭孢壳（Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳（Thielavia spededonium)、耐热梭孢 壳(Thielavia subthermophila)、土生梭抱壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)、康宁木霉（Trichoderma koningii)、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride) 天冬酰胺酶。
[0083] 将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态 (perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们 已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
[0084] 这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国 典型培养物保藏中心（ATCC)、德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心（NRRL)。
[0085] 可以从其他来源，包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水等等）分离的微生物或直接 从自然材料（例如，土壤、堆肥、水等等）获得的DNA样品鉴定和获得该天冬酰胺酶。用于 从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地 筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该天冬酰胺酶的 多核苷酸。一旦已检测出编码天冬酰胺酶的多核苷酸，可以通过利用本领域的普通技术人 员已知的技术来分离或克隆该多核苷酸（例如，参见，萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989， 分子克隆（Molecular Cloning)，实验手册（A Laboratory Manual)，第 2 版，冷泉港（Cold Spring Harbor)，纽约）。
[0086] 在一个优选实施例中，该天冬酰胺酶或其亲本（优选该天冬酰胺酶）可从曲霉属 获得，例如，从棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭 曲霉（Aspergillus foetidus)、烟曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、构巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)或土曲霉（Aspergillus terreus) 〇
[0087] 在另一个优选实施例中，该天冬酰胺酶或其亲本（优选该天冬酰胺酶）可从米曲 霉（Aspergillus oryzae)获得，例如，SEQ ID NO: 1的天冬酰胺酶或其成熟多肽。在另一 个优选实施例中，该天冬酰胺酶或其亲本（优选该天冬酰胺酶）可从黑曲霉（Aspergillus niger)获得，例如，SEQ ID NO:2的天冬酰胺酶或其成熟多肽。
[0088] 在另一个优选实施例中，该天冬酰胺酶与SEQ ID NO: 1或2中的任一个的成熟多 肽具有至少50%的序列一致性，例如与SEQ ID N0:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少 60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。
[0089] SEQ ID NO: 1是来自米曲霉（Aspergillus oryzae)的天冬酰胺酶的氨基酸序列。
[0090] 在本发明的背景中，术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰之后处于其最 终形式的多肽，这些翻译后修饰为例如N-末端加工、C-末端平截、糖基化、磷酸化、等等。本 领域已知宿主细胞可以产生由相同的多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽（即，具 有不同的c-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0091] 基于N-末端测序和质谱（MS)分析，显现SEQ ID NO: 1的天冬酰胺酶的N-末端加 工是相当多样的。在一个实施例中，基于预测SEQ ID NO: 1的氨基酸1至19是信号肽的 SignalP(尼耳森（Nielsen)等人，1997,蛋白质工程（Protein Engineering)10:l_6)，该成 熟多肽是SEQ ID NO: 1的氨基酸20至378。
[0092] SEQ ID N0:2是来自黑曲霉（Aspergillus niger)的天冬酰胺酶的氨基酸序列。 在一个实施例中，基于预测信号肽是氨基酸1_17，SEQ ID N0:2的成熟多肽是SEQ ID N0:2 的氨基酸18至378。
[0093] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件 套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人， 2000,遗传学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔 (Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德尔 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)来确定两个氨 基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0094] (一致的残基X 100)八比对长度-比对中的空位总数）
[0095] 在另一个优选实施例中，该天冬酰胺酶是一种亲本天冬酰胺酶的变体，该变体与 SEQ ID N0:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少50%的序列一致性，例如与SEQ ID N0:1 或2中的任一个的成熟多肽具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至 少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至 少99 %的序列一致性。
[0096] 在更优选实施例中，该天冬酰胺酶是一种亲本天冬酰胺酶的变体，该变体与SEQ ID NO: 1的成熟多肽具有至少50%的序列一致性，例如与SEQ ID NO: 1的成熟多肽具有至 少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。
[0097] 在另一个优选实施例中，相比于SEQ ID N0:1或2中的任一种的成熟多肽，该天冬 酰胺酶包括至多100,优选至多80或至多50,更优选至多25、至多20、至多15、至多10或至 多5个氨基酸差异。
[0098] 在另一个实施例中，该天冬酰胺酶是一种热稳定天冬酰胺酶，例如，来自披露于W0 2008/151807中披露的强烈火球菌（Pyrococcus furiosus)的天冬酰胺酶。
[0099] 实例
[0100] 材料与方法
[0101] 天冬酰胺酶活性（ASNU)测定
[0102] 天冬酰胺酶的活性能以ASNU测量。将一个天冬酰胺酶单位（ASNU)定义为在37°C 和pH 7. 0下于具有9. 2mg/ml天冬酰胺的0. 1M MOPS缓冲液中在1分钟内产生1. 0微摩尔 的氨所需的酶量。
[0103] 天冬酰胺酶将天冬酰胺水解为天冬氨酸和铵。产生的铵与a-酮戊二酸组合，以 形成谷氨酸，由此NAD