H被氧化为NAD+。由剩余的谷氨酸脱氢酶催化该反应。通过340nm下 的光度测定法测量NADH的消耗。NADH在340nm处具有吸光度，然而NAD+没有吸光度。因 此对颜色的下降进行测量，并且可以将其与天冬酰胺酶活性相互关联。
[0104] 相对于具有已知活性的天冬酰胺酶标准品确定活性。可以将一种具有公告活性的 商用产品（像Acrylaway?)用作标准品。
[0105] 使用HPLC量化天冬酰胺和天冬氨酸
[0106] 样品的天冬酰胺和天冬氨酸含量可以在赛默飞世尔（ThermoFisher)WPS3000高 压液相层析系统上进行分析，该系统包括四元栗、具有温度控制的自动进样器、柱温箱和可 调荧光检测器。
[0107] 在自动柱前衍生化之后，分析样品。将30 y L的milli-Q水、10 y L的0. 4M硼酸 盐缓冲液pH 10.2、2yL的样品、和在0.4M硼酸盐缓冲液（pH 10.2)中的2yL邻苯二甲醛 l〇g/L进行收集，并且在混合瓶中通过上下吸移来混合；添加100 y L的milli-Q水，并且最 后在具有相应保护柱的安捷伦zorbax eclipse AAA柱（4.61111]1乘15〇111111，3.5111]1粒径）上 注射2 yL用于层析分析。
[0108] 将栗设定为2ml/分钟的恒定流速，初始用20mM磷酸盐缓冲液pH 7. 5平衡柱，并 且将天冬酰胺用从4分钟至12分钟、45 %甲醇45 %乙腈10 %水的混合物从0 %至100 %的 线性梯度进行洗脱。天冬酰胺衍生物的荧光在340nm的光下激发，并且在450nm处对发射 值量化。通过与在从0. 05g/l至0. 75g/L的浓度范围内的标准天冬氨酸和天冬酰胺比较来 分析样品。
[0109] 实例 1
[0110] 采用或不采用汽蒸时对罗布斯塔咖啡豆的天冬酰胺酶处理
[0111] 针对处理走戌.南罗布其斤塔豆（Vietnam Robusta bean)的天冬酉先胺酉每试骑设詈
[0112] 汽蒸程序
[0113] 在所使用的高压釜中，只能获得20 % w/w的在豆中的最终含水量，因为水/蒸汽入 口不能被调整高于此水平。因此，在高压釜中进行汽蒸程序之前，引入预浸泡步骤。然而， 出于既定的目的，更灵活的汽蒸设备是可商购的，在这种情况下，因为咖啡豆的含水量可以 通过蒸汽处理增加至所希望的水平，所以预浸泡可以是不必要的。
[0114] 预浔泡：轻轻混合5. 0kg越南罗布斯塔豆+高达2. 25L的自来水。进行混合，直至 所有的水被豆吸收，约20-30min。
[0115] 汽蒸：通过寨斯太克（Systec) XV 65高压釜进行汽蒸，3号程序，汽蒸在 110°C -120°c下发生持续 15min。
[0116] 酶处理和干燥
[0117] 向5. 0kg豆（初始量）添加4. 5L自来水和0或3000ASNU/kg的Aery丨awayK CB, L 豆，伴随在60°C下轻轻混合持续60-120分钟。缓慢添加水和酶。
[0118] 在酶处理之后，在流化床中将生咖啡豆干燥至约10% w/w水，该流化床其入口温 度60°C以及300m3/h的空气流量持续第一个1. 5h，并且其入口温度50°C以及250m3/h的空 气流量持续另一个2. 5h。
[0119] 烤制和丙烯酰胺分析
[0120] 将来自酶影响试验的125g的干燥咖啡豆烤制至80的LRU色值。之后使用LC-MS/ MS针对丙烯酰胺来分析豆。
[0121] MM
[0122] 起初，在35% w/w的总含水量下（在如以上所描述的预浸泡和汽蒸期间所 获得的），在110 °C下对5kg的生的越南罗布斯塔豆进行汽蒸。添加0或3000ASNU/ kg Acrylaway? CB, L咖啡豆，并且允许在轻轻混合下反应120min。在干燥和烤制之后，当 对照产生了 3%的丙烯酰胺减少，针对于酶处理过的测量到丙烯酰胺减少达38%。在两种 情况下，该减少已与相对应的没有酶的过程对照进行了比较。
[0123] 然后将酶处理的时间从120min减少至60min;其他参数保持恒定。后者产生了 33%的丙烯酰胺含量减少。随后，测试了将汽蒸温度从110°C增加至120°C的测验。出人意 料地，目前所获得的丙烯酰胺减少只有4%。
[0124]
[0125]
[0126] 3号和4号显示出了没有前面的汽蒸步骤时天冬酰胺酶处理几乎不能导致任何丙 烯酰胺的减少。将5号和6号与7号和8号相比显示出了汽蒸温度对于丙烯酰胺减少很重 要。将针对具有35%含水量的5号和6号的生的（未经烤制的）豆的丙烯酰胺水平与10 号（其中在照原样具有8%含水量的生豆上进行汽蒸）相比显示出了含水量是重要的。当 将具有低含水量的生豆进行蒸汽处理时，在烤制之前测量到了 140ppb的丙烯酰胺。在蒸汽 处理期间所获得的丙烯酰胺将不能通过后续天冬酰胺酶处理来减少。
[0127] 实例 2
[0128] 采用或不采用汽蒸时对阿拉比卡咖啡豆的天冬酰胺酶处理
[0129] 在酶处理之前在采用或不采用汽蒸时，对5g规模的、经天冬酰胺酶处理的阿拉比 卡豆进行测试。在这种情况下，只有天冬酰胺减少被监测到；然而众所周知用于丙烯酰胺减 少的主要前体是天冬酰胺。
[0130] 在 2010 年，从 CR3 (CR3_KafTeeveredelung M. Hermsen GmbH，不莱梅（Bremen)， 德国）获得了未洗的生的阿拉比卡咖啡豆。以实验室规模在采用或不采用天冬酰胺酶 Acrylaway? 5cb，l以及采用或不采用汽蒸时，对它们进行测试。
[0131] 在被嵌入蒸汽锅炉（该蒸汽锅炉含有1L的沸腾的去离子水）中的小线篓中，在 100°C下，将具有6. 5%含水量的5. 0g未洗的生的阿拉比卡咖啡豆的部分汽蒸45分钟。在 汽蒸之后，对被吸收的水的量进行定量确定。然后将豆添加至4.2ml的加热的去离子水 (60°C)，该去离子水包含 0ASNU 的Acrylaway@ CB, L/kg 或 3000ASNU/kg 的Aerylaway? CB, L。仅将豆的其他5g部分添加至4. 2ml的加热的去离子水（60°C)，该去离子水包含 0ASNU 的Acrylaway? CB, L/kg 或 3〇〇〇ASNU/kg 的Acrylaway? CB, L。以四个重复对所有 的剂量进行测试。将这些样品在60°C下孵育45分钟，伴随20rpm的搅拌速度。在45-60分 钟之后，水完全由豆吸收。
[0132] 研磨相应于5g的初始干的生豆的量；添加盐酸以使酶失活并且用于萃取天冬酰 胺。在萃取之后，过滤这些豆，并且保持在-18 °C直至进一步分析。
[0133] 使用高压液相层析系统分析天冬酰胺含量，通过柱前衍生化分析氨基酸，并且将 荧光量化。
[0134]
[0136] 当使用阿拉比卡咖啡豆时，在不采用前面的汽蒸步骤时，观察到了显著的酶诱导 的天冬酰胺减少。
【主权项】
1. 一种用于生产烤制的咖啡豆的方法，该方法包括： (a) 用蒸气处理原罗布斯塔咖啡豆； (b) 使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触；并且 (c) 烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。2. 如权利要求1所述的方法，其中将这些原罗布斯塔咖啡豆用温度为约100°C -120°C， 优选约105°C _115°C的蒸汽处理。3. -种用于生产烤制的咖啡豆的方法，该方法包括： (a) 用温度为约105°C _115°C的蒸汽处理原咖啡豆； (b) 使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触；并且 (c) 烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。4. 如权利要求3所述的方法，其中这些咖啡豆是罗布斯塔咖啡豆。5. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤（a)之前或期间，将这些咖啡豆 的含水量增加至从约30% w/w至约45% w/w范围的水平，例如约35% w/w。6. 如权利要求5所述的方法，其中这些咖啡豆的含水量是通过蒸汽处理来增加的。7. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（a)进行约5-60分钟，优选约 10-30分钟，例如约15分钟。8. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤（b)中的接触是持续约10-240分 钟，优选地持续约30-180分钟，更优选地持续约45-180分钟。9. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（b)是通过与浓度为约 100-30, OOOASNU/kg 咖啡豆，优选约 500-20, OOOASNU/kg 咖啡豆例如约 3, OOOASNU/kg 咖啡 豆的天冬酰胺酶接触来进行的。10. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤（b)之后且在步骤（c)之前，将 这些原咖啡豆干燥至含水量为约5% -15% w/w，优选7% -12% w/w。11. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤（c)之后，研磨这些咖啡豆。12. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该天冬酰胺酶是获得自曲霉属，优选米 曲霉或黑曲霉，或是从曲霉属优选米曲霉或黑曲霉中获得的亲本天冬酰胺酶的变体。13. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中相比于SEQ ID NO: 1或2中的任一个的 成熟多肽，该天冬酰胺酶包括至多100,优选至多80或至多50,更优选至多25、至多20、至 多15、至多10或至多5个氨基酸差异。14. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该天冬酰胺酶与SEQ ID N0:1或2中的 任一个的成熟多肽具有至少50%的序列一致性，例如与SEQ ID N0:1或2中的任一个的成 熟多肽具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。15. 如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该天冬酰胺酶是一种热稳定天冬酰胺 酶。
【专利摘要】本发明涉及一种用于生产烤制的咖啡豆的方法，该方法包括用蒸汽处理原咖啡豆，随后与天冬酰胺酶进行接触。
【IPC分类】A23F5/16, A23F5/24
【公开号】CN105072919
【申请号】CN201480016836
【发明人】G·B·林格雷夫, S·舍斯勒
【申请人】诺维信公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年3月20日
【公告号】CA2903352A1, WO2014147189A1