专利名称：：海藻硫酸多糖的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种海藻硫酸多糖的新医药用途，即作为治疗乙型肝炎药物的用途。许多病毒性疾病仍严重威胁着人类的生命安全，其中乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型肝炎(HB)是一种传染性强且危害性极大的传染病，目前尚无有效的治疗药物。中国是乙型肝炎(以后简称乙肝)病发大国，乙肝携带者达1．2亿，其中相当一部分患者将转化为肝硬化以及肝细胞癌，它严重影响人们的身体健康。乙肝的诊断和预防措施已基本成熟，但有效的药物治疗不尽人意。目前治疗中最常用的干扰素对适应症患者有效率仅达40％。鉴于现在所使用的抗乙肝药物存在治疗效果不完全，有毒副作用及停药反弹等现象，需要寻求有效、低毒的治疗药物。现代药用海藻多达百余种，具有清热解毒、利水消肿、补肾养心、活血化淤和消食驱虫等功效。海藻中含有多种有效成分，其中，硫酸酯多糖是研究较为深入，同时也是最赋有实用价值的成分。海藻多糖是一种具有特殊结构的复合糖，含有硫酸酯基团的蛋白多糖。以糖类为基础的药物研究有巨大的潜力，糖类分子在细胞识别、信号传递、细胞间相互作用等方面起重要作用，糖部分决定了整个分子的功能。糖类药物在抗感染，抗癌，抗病毒及抗类风湿关节炎等方面均有不同程度的开发与应用。多糖中的结合蛋白组分发挥抑制病毒繁殖和杀灭病毒作用，是多位点抗病毒的分子基础。对海藻硫酸多糖的抗病毒作用，国内外已有报道(郑永唐，贲昆龙，金善炜，17种植物中蛋白质提取物的抗HIV活性，中国病毒学，1998；13312-24；WitvrouwMandDeClercqE．Sulfatedpolysaccharidesextractedfromseaalgaeaspotentialantiviraldrugs．GenPharmacol，1997；29497-511；WitvrouwM，EsteJA，MateuMQ，etal．Activityofasulfatedpolysaccharidesextractedfromtheredseaweedaghardhiellateneraagainsthumanimmunodeficiencyvirusandenvelopedviruses．Antiviralchemistry＆chemotherapy，1994；5297-303)。但是，未见有其抗乙型肝炎病毒作用的研究报道。本发明的发明人在研究中发现海藻硫酸多糖具有意想不到的显著的抗乙型肝炎病毒的作用。本发明的目的在于提供一种治疗乙型肝炎的新的药物。本发明的海藻硫酸多糖(Sulfatedpolysaccharidesfromseaweeds，SPS)是从褐藻中提取的一种含硫酸酯基团的蛋白质多糖，主要理化特征为易溶于水，溶解度≥30％，白色或黄色多晶粉末，具特有的香味；SO42-含量为20±5％，岩藻糖含量为20±5％，蛋白质含量10-18％。本发明的海藻硫酸多糖提取工艺是由本发明的发明人独立研究开发的，它包括以下步骤1．选料可选国产优质淡干海藻(也可使用巨藻)，主要产地，我国北方海域；2．浸泡和清洗常温下浸泡并清洗，严格控制浸泡和清洗的时间；3．粉碎；4．水提；5．低浓度醇沉；6．高浓度醇沉，获得粗产品；7．纯化，获得精制产品。该制备方法条件温和，不破坏海藻藻体所含的各种天然营养成份，操作简单，提高了海藻综合利用程度，产率较高(2％)，成本较低，适合于工业化生产。本发明的药物组合物可制成片剂、丸剂、针剂和胶囊(软、硬)，每剂含海藻硫酸多糖250mg，遵医嘱口服。每日用量750mg～1500mg，可分三次给予，每次250mg～500mg。参照中华人民共和国国家标准GB15193．3-94、GB15193．5-94、GB15193．8-94、GB15193．7-94、GB15193．4-94、GB15193．14-94和GB15193．13-94，进行大鼠急性毒性试验、小鼠急性毒性试验、小鼠骨髓微核试验(雄性)、小鼠骨髓微核试验(雌性)、小鼠精子畸形试验、小鼠睾丸染色体畸变试验、Ames试验、大鼠系统致畸试验和大鼠30天喂养试验，结果显示大、小鼠LD50＞21．50g／kg；胶囊实验组与溶剂组比较，小鼠骨髓细胞微核率无显著差异；胶囊实验组与溶剂组比较，小鼠精子畸形率无显著性差异；胶囊实验组与溶剂组比较，小鼠初级精母细胞染色体畸变率，无显著差异；Ames试验，实验组回变菌落数小于或等于自然回变菌落数2倍；大鼠致畸试验中，实验组与溶剂组比较，孕鼠孕期体重增重和生殖胚胎检查、胎鼠生长发育和骨骼畸形检查等指标差异不显著；大鼠30天喂养，与基础饲料对照组比较，临床检查脏器称量、血液生化学检查、血液学检查、病理组织学检查，均无显著性差异。该结果表明海藻硫酸多糖属无毒，无遗传毒性和无致畸作用物质。大鼠口服海藻硫酸多糖胶囊(4000mg／kg)，一天2次，连服10天，在清醒状态下观察其精神神经系统、心血管系统和呼吸系统，结果均无异常表现。经本实验室科技人员和志愿受试者工30人试服，海藻硫酸多糖对消化系统、神经系统、呼吸系统及循环系统均不引起不良变化，多数人反映精力旺盛，食欲增加。5例身体虚弱、易患感冒的受试者反映感冒次数明显减少下面用实施例来详细描述本发明，但这些实施例不得理解为任何意义上的对本发明的限制。实施例1海藻硫酸多糖的制备100kg海藻，经浸泡、清洗、粉碎，加水800kg，90-100℃萃取3次，3．5h。取上清液减压浓缩到25L，在30％的乙醇条件下沉淀，再取上清液，减压蒸发至10L，加入85L95％的乙醇中，过滤，得粗产品。60℃干燥，纯化，100目粉碎。实施例2海藻硫酸多糖抗HBV病毒作用SPS在体内、外有较好的抗HBV效果。一、SPS体外抗HBV作用研究1．SPS在2．2．15细胞培养内对HBeAg和HBsAg的抑制作用(1)细胞培养长满2．2．15细胞的培养瓶内加0．25％胰酶(Hanks液配制)，37℃消化3分钟，加MEM培养液(含胎牛血清10％，3％谷氨酰胺1％，G418380g／ml，卡那霉素50U／ml)吹打，1∶3传代，10天长满，加入细胞计数板计数，配制成每毫升10万个细胞接种细胞培养板，96孔板每孔0．2ml，24孔板每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。(2)药物对细胞毒性试验SPS用培养液配制成20mg／ml溶液，用2倍稀释至1．25mg／ml加入96孔细胞培养板，每浓度4孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞对照组。以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制率(％)。按ReedMuench法计算半数有毒浓度(TC50)，最大无毒浓度(TC0)。(3)药物对HBeAg、HBsAg抑制试验2．2．15细胞104／ml接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下2倍稀释试验药液，5个稀释度分别为10、5、2．5、1．25和0．625mg／ml，每浓度3孔，37℃5％CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存。固相放射免疫测定盒测定HBsAg和HBeAg。药物效果计算计算细胞对照及每浓度cpm均值及标准差，P／N值和抑制百分率(％)，半数有效浓度(IC50)及选择指数(SI)。2．SPS对乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBVDNAp)的抑制作用超速离心制备HBV颗粒，加入病毒裂解液(0．02MTris-HClpH7．6，0．05MNaCl，0．001MEDTA，0．1％-巯基乙醇[-ME]，0．01％TritonX-100)。冰浴加入60ul掺入液(0．2MTris-HClpH7．6，0．2MNH4Cl，0．06MMgCl2，2％NP-40，0．6％-ME，0．1mMdNTP)，201SPS(浓度分别为20、4、0．8、0．16、0．032mg／ml)，30ul裂解病毒，1．5Ci3H-dTTP，4℃充分混匀，移至45℃反应2．5小时，反应结束后，加入3ml冰冷的10％三氯乙酸沉淀DNA，沉淀的DNA收于玻璃纤维素膜上，然后以5％的三氯乙酸及70％的乙醇洗膜，将膜烘干，加入8ml闪烁液(含0．5％PPO，0．015％POPOP的二甲苯溶液)液闪计数仪测定cpm，计算抑制率。3．SPS对HBsAg与抗-HBs结合的抑制实验将浓度分别为20、4、0．8、0．16、0．032mg／ml的SPS与等体积的纯化HBsAg混合作为待测样品，设阴性(无纯化HBsAg)和阳性(无SPS)对照，用固相放免试剂盒测定样品中HBsAg含量，计算药物对HBsAg与抗-HBs结合的抑制率。4．实验结果(1)SPS在2215细胞培养中对HBV有抑制作用<tablesid="table1"num="001"><table>细胞毒性(mg／ml)HbeAgHBsAgIC50TC016．32±0．6510±0IC50(mg／ml)SI4．88±0．423．37±0．321IC50(mg／ml)SI4．26±1．044．0±1．01</table></tables>(2)SPS对HBVDNA聚合酶有抑制作用((IC50=225μg／ml)(3)SPS抑制HBsAg与抗HBs结合(IC50=200μg／ml)二、SPS体内抗HBV作用研究1．鸭乙型肝炎病毒感染1日龄北京鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0．2ml，在感染后7天取血，分离血清，-70℃保存待检。2．药物治疗试验DHBV感染雏鸭7天后随机分组进行药物治疗试验，每组6只雏鸭，给药组分3个剂量组，硫酸海藻多糖分别为25、50和100mg／kg组，腹腔注射1天2次，10天，设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物。阳性药用阿昔洛韦100mg／kg组，作阳性对照。在感染后第7天即用药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。3．检测方法取上述待检鸭血清点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。计算每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药第3天(P3)血清DHBV-DNA与给药前(T0)的抑制％，并作图，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态。4．实验结果鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染鸭肝炎动物模型腹腔注射SPS(50，100μg／kg)，Bid×10，以生理盐水组为病毒对照，以阿昔洛韦(ACV)作阳性药物对照，SPS组(100μg／kg)与病毒对照组比较，能显著降低DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平。尤其值得注意的是，停药后不出现反弹。权利要求1．海藻硫酸多糖在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。2．根据权利要求1所述的用途，其特征在于所说的海藻硫酸多糖为褐藻硫酸多糖。3．根据权利要求2所述的用途，其特征在于所说的海藻硫酸多糖水溶解度大于或等于30％，为白色或黄色多晶，有芳香味，SO42-含量为20±5％，岩藻糖含量为20±5％，蛋白质含量为10-18％。4．根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所说的海藻硫酸多糖以片剂形式给予。5．根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所说的海藻硫酸多糖以胶囊形式给予。6．根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所说的海藻硫酸多糖以丸剂形式给予。7．根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所说的海藻硫酸多糖以针剂形式给予。8．根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于海藻硫酸多糖每日用量为750mg～1500mg。全文摘要本发明公开了海藻硫酸多糖治疗乙型肝炎的新医药用途。海藻硫酸多糖每日用量750mg～1500mg,分三次给予,每次250mg～500mg对乙型肝炎有显著疗效。文档编号A61K31/734GK1279953SQ0012087公开日2001年1月17日申请日期2000年8月4日优先权日2000年8月4日发明者孙存普,魏文青,丛建波,吴可,先宏,张建中申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所