专利名称：生物活性络合物于脂质体中囊封工艺的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及将聚阳离子缩合的核酸之类的络合物于脂质体中囊封的方法，利用通过两亲性脂类稳定化的乳液作为中间体，在其间形成络合物。本发明还涉及由此所产生的囊封络合物的脂质体。本发明的方法可用于提供装载各种化合物的脂质体。到目前为止，一直难于使这些化合物以相对脂类的高比例装载入脂质体中。
本发明背景为了被用作药用制剂，生物活性剂必须能够以适当的治疗有效量到达治疗部位。尽管很多生物活性剂和药物在活体内是稳定的，但还有一些生物活性剂通常会被降解。当所述降解发生在药物或生物活性剂到达其目标部位之前时，便只有不足治疗量的药物能到达所述目标部位。若有一些药物或生物活性剂被非目标系统所吸收，这更加导致不可能有治疗量的药物或生物活性剂能以治疗有效量到达所述目标部位。某些极性药物根本就不能进入细胞，因为它不能够穿过靶细胞膜。这种极性药物能够进入细胞的唯一途径是通过胞吞过程被吸收，使其接触细胞内的降解性溶菌酶。治疗性输送药物或生物活性剂的另一个问题是，不能够施用用于治疗的足够高浓度药物或生物活性剂的同时，而又能避免与某些药物或生物活性剂相关的毒性。上述问题业已通过多种不同方法得到解决。如果一种药物或生物活性剂没有与它相关的毒性的话，就可以足够高的剂量施用，以便抵消降解、被非目标器官清除和对需要所述治疗药物或生物活性剂的部位定向不准等。不过，很多药物或生物活性剂要么太昂贵不允许如此浪费，要么具有毒性，不可能服用如此大的剂量。业已有多种方法用于克服以治疗剂量的药物或生物活性剂给药所遇到的诸多问题。
所述方法之一是将药物或生物活性剂囊封于脂质体中。当某些药物或生物活性剂能够通过被动装载或梯度装载方式以治疗有效剂量囊封于脂质体中时，这类方法要么局限于具有特殊化学特性的药物或生物活性剂，要么局限于能够以较低浓度服用的药物或生物活性剂。弱碱或弱酸之类的某些生物活性化合物可以间接地装入预先成型的脂质体中，以便形成高度浓缩的络合物。这种类型的装载，被称作间接或梯度装载，要求药物或生物活性剂能临时通过脂质体的脂双层。不过，并不是所有生物活性分子都能这样，有许多生物活性分子不能穿透脂质体双层。
试图以治疗有效量施用药物或生物活性剂仅取得部分成功的一个领域是基因治疗领域。基因治疗包括将外源基因导入合适类型的细胞中，然后让该基因能够在所述细胞内以治疗相关水平表达。所述疗法在较短时间内就已经从基础研究达到将多种基因导入细胞中的成果，包括用于治疗癌症的基因(Duque等，《病理组织学》，13231-242，1998；Runnebaum等，《抗癌研究》，12889-2890，1997)。尽管裸DNA在某些场合下能被摄入细胞(Wolff等，《科学》，2471465-1468，1990)，但一般来说不能被细胞摄入，因为它体积大和负电荷高；而且，不能够设计针对特定细胞的裸DNA。因此，成功的基因治疗通常取决于能否获得将DNA和其他核酸导入细胞的“载体”。
目前，存在两大类DNA输送系统，病毒系统和非病毒系统。病毒载体包括复制-缺陷型病毒，如逆转录病毒，腺病毒，和腺缔合病毒。到目前为止，它们是介绍过的最全面的基因输送载体(Robbins等，《生物技术发展趋势》，1635-40，1998)。不过，其应用受到了以下因素的限制其病毒成分的免疫原性，逆转到复制-感受态状态的潜在危险，导入致瘤突变的潜在可能，缺乏定向机制，DNA能力的限制，难于大规模生产和其他因素(例如，参见Lee和Huang，《生物学化学杂志》，2718481-8487，1996)。
业已开发了两种主要类型的非病毒载体用于代替病毒载体。到目前为止，由阳离子脂类和DNA组成的阳离子脂质体DNA络合物(Felgner等，《美国科学院院报》，847413-7417，1987)是最全面介绍的用于基因输送的病毒载体的替代物。不过，所述脂质络合物在用于基因治疗时存在若干重大缺陷，包括稳定性低、细胞毒性高、不能生物降解、对DNA的缩合和保护较差、血清过敏性、体积大和缺乏组织特异性。另外，由于所述脂质络合物带正电荷，它通常会与大多数细胞的带负电荷的表面发生非特异性相互作用。因此，通常不可能将所述脂质络合物定向到活体内的特定部位。
脂质络合物和DNA的另一种变体包括结合于阴离子脂质体上的聚赖氨酸缩合的DNA(例如，参见Lee和Huang，《生物学化学杂志》，2718481-8487，1996)，它需要某些阴离子脂类形成活性结构。所形成的脂质络合物要么不能将所述DNA完全囊封，要么必须在缩合的DNA周围形成两个或两个以上的双层。在后一种情况下，在向细胞质中输送时需要DNA穿过至少三层膜。预计这样会抑制转染效率。在前一种情况下，由于所述DNA暴露在生理盐溶液中有可能破坏其稳定性。
脂质体是非病毒载体的另一种类型，并且在使用时与所述脂质络合物相比具有若干优点。例如，在囊封的核酸周围形成了脂质体双层，因此保护核酸不被环境中的核酸酶降解；相反，脂质络合物不能将核酸囊封，因此不能使其与环境中的核酸酶完全隔离。另外，脂质体除了囊封核酸以外，还可将其他生物活性剂囊封成其含水区室。相反，脂质络合物不能，因为它不能将含水空间囊封。另外，脂质体可以制成带中性电荷或呈阴离子性，相反，上述脂质络合物具有有限的离子特性。因此，可以对脂质体进行设计，以避免由输送载体本身所引起的细胞毒性，并增加其在感兴趣的特定部位积累。
尽管将生物活性剂囊封于脂质体中的构思并不是新的，但人们一直难于将许多药剂以任意用量囊封于脂质体中，而且某些其他药剂也被证实难于以治疗有效量囊封于脂质体中。许多小分子能囊封于脂质体中，但会渗漏。因此，一直难于将某些生物活性剂囊封，并以治疗有效剂量在脂质体中保持治疗有效的时间。例如，一直难于将特别大的分子囊封于脂质体内形成络合物。难于将很多水溶性分子用作治疗剂，因为它们不能穿透细胞膜。如果能将其稳定地囊封于能够与细胞膜融合的脂质体中，就有可能将所述药物以治疗有效剂量输送到靶细胞中。本发明的方法能够生产包含治疗有效形式的所述药物或生物活性剂的脂质体。
业已进行了将核酸囊封于脂质体中的若干尝试，其中包括使用反相蒸发(Fraley等，《生物学化学杂志》，255；10431-10435，1980)，脱水-再水化(Alizo等，《微胶囊杂志》，7497-503，1990)和冻融(Monnard等，《生物化学生物物理学学报》，132949-50，1997)等方法形成脂质体。不过，上述每一种方法都具有若干局限，包括需要低的核酸起始浓度，导致在产物脂质体中有大百分比的空小泡，不能可再现地将足够量的DNA囊封于脂质体中，以便能在预期的目标部位进行有效治疗，以及难于优化所述载体，以便保护其所囊封的核酸不受核酸酶介导的降解作用。
业已尝试过用络合剂对DNA进行配位，然后将所述配位DNA囊封于脂质体中。络合剂是能与其他分子起反应，导致所述分子沉淀或缩合的试剂。可用于实施本发明的络合剂选自其所带电荷与生物活性剂上的电荷相反的带电分子。所述络合剂可选自下列一组带电荷的分子精胺、亚精胺、六氨合钴、钙离子、镁离子、聚赖氨酸、聚组氨酸、鱼精蛋白、聚阴离子物，如肝素和葡聚糖硫酸酯、柠檬酸根离子、或硫酸根离子。例如，已知电荷为+3或更高的聚阳离子，如聚胺、聚赖氨酸和六氨合钴(III)，可通过与DNA上的多种负电荷相互作用缩合DNA分子(参见Chattoraj等，《分子生物学杂志》，121327-337，1978；Gosule LC和Schellman JA.《自然》，259333-335，1976；Vitello等，《基因治疗》，3396-404，1996；Widom等，《分子生物学杂志》，144431-453，1980；Arscott等，《生物聚集物》，30619-630，1990；Wilson等，《生物化学》，182192-2196，1979)。业已发现聚胺，如亚精胺(3+)和精胺(4+)与其他类型的聚阳离子不同，它天然存在于所有活细胞中(例如，参见Ames和Dubin，《生物学化学杂志》，253769-775，1960；Tabor和Tabro，《生物化学年度综述》，53749-790，1984)。已知在活跃增殖的动物细胞中存在高水平的聚胺，并且被认为是保持正常细胞生长所必需的(例如，参见Ames和Dubin，《生物学化学杂志》，253769-775，1960；Tabor和Tabro，《生物化学年度综述》，53749-790，1984；Hafner等，《生物学化学杂志》，25412419-12426，1979；Pegg，《生物化学杂志》，234249-262，1986)。
Tikchonenko等(《基因》，63321-330，1988)业已尝试了将精胺缩合的线型DNA囊封于脂质体中。不过，其中的起始DNA浓度较低，其结果是，所得到的脂质体其囊封DNA与脂质体脂类比例仍较低(每微摩尔脂类0.02-0.2微克DNA)。而且，在缺乏分子间DNA聚集的情况下，所述线型DNA分子的缩合要求将精胺的浓度控制到无法实现的精确程度。另外，Baeza等(原始生活环境生物圈，21225-252，1992)和Ibanez等(《生物化学细胞生物学》，74633-643，1996)都报导了在脂质体中，以每微摩尔精胺缩合1-4微克SV40质粒DNA的囊封结果。不过，它们在脂质体形成之后都没有用高盐缓冲液对制剂进行透析，所报导的囊封DNA的量，实际上可能包括较大百分比未囊封的DNA。由于所述脂质体制剂没有受到DNAase的降解作用而确定实际包埋在脂质体内的DNA的百分比的，因此所报导的高剂量可能并不反映实际囊封的DNA。
脂质体囊封核酸的有效制备和利用，需要使用核酸的高浓度悬浮液，以便降低由该工艺所产生的空脂质体的百分比，并提高DNA脂质体脂类的比例。不过，在已知的脂质体形成方法中，高浓度DNA的缩合会导致分子间聚集，导致不适合基因输送的以核酸为基础的结构形成。由DNA直接与络合剂缩合所产生的大聚集体不容易被囊封于脂质体中，并且所述大聚集体结构(其大小与细胞相似)不能将材料有效输送到靶细胞。例如，如果所述聚集体大于500纳米，在静脉用药之后由于其大体积，它们会被从循环系统中迅速清除。另一方面，可以在体外将较大聚集体用于细胞。不过，有时候所述聚集体太大，以至于不能被细胞吸收。
因此，为了将多种药物以治疗有效量输送到靶细胞，必须提供一种制备含有络合生物活性剂的脂质体的方法，以便降低其穿过脂双层的渗透性，同时，提供一种同样能限制被囊封于脂质体中的络合物尺寸的方法，以便所得到的治疗产物在符合治疗的大小范围内。
本发明概述本发明提供了一种将生物活性络合物囊封于脂质体中的方法，该方法包括以下步骤(a)将至少一种两亲性脂类溶解在一种或多种有机溶剂中；(b)将包括含有选自生物活性剂和络合剂的第一种分子的溶液的至少一种含水悬浮液与步骤(a)的含有脂类的有机溶液混合，以便形成含有所述第一种分子和脂类的反相胶束形式的乳液；(c)向步骤(b)的乳液中添加含有选自生物活性剂和络合剂的第二种分子的第二种含水悬浮液，其中，如果所述第一种分子是生物活性剂的话，第二种分子就是络合剂，反之亦然。
(d)将步骤(c)的乳液保温培养，让所述络合剂接触所述生物活性剂，从而在脂类稳定化水滴中形成所述生物活性剂和络合剂的络合物；其中，所述络合物的直径不大于所述水滴的直径，和(e)除去步骤(d)的悬浮液中的有机溶剂，由此形成含有所述络合生物活性剂和脂类的脂质体。
本发明的方法可用于制备具有治疗作用的脂质体，在所述脂质体中含有与络合剂络合的多种生物活性分子。所述脂质体优选融合型脂质体，通过本发明的方法它可以将各种分子囊封。所述融合脂质体能够与细胞膜融合，并能够将治疗有效量的生物活性剂输送到细胞和器官中。另外，本发明的方法还可将一种以上的生物活性剂囊封于脂质体中。可以通过本发明的方法，同时将一种或多种生物活性剂囊封于相同的脂质体中。如果要用本发明的方法将一种以上的生物活性剂囊封于脂质体中的话，不一定使每一种生物活性剂都为络合物形式。
某些生物活性剂容易穿透脂双层，因此不能稳定隔离在脂质体中。通过让该生物活性剂与一种络合剂形成络合物，该生物活性剂就能留在脂质体中。主要障碍是将络合的生物活性剂囊封于脂质体中有某些问题。在囊封于脂质体中之前，当所述生物活性剂和络合剂在溶液中混合时，于有效装载脂质体所必需的浓度下，会形成许多大得无法控制的络合物。所谓生物活性络合物是指结合于络合剂上的任何生物活性剂，由此所形成的络合物会发生物理特性的改变，如降低所述生物活性分子的大小，降低所述生物活性剂的溶解度，使所述生物活性剂沉淀，使所述生物活性剂缩合，或增加络合物的大小。与细胞膜融合的脂质体能够将大量分子输送到细胞内部。本发明的一个优点是，通过在反相胶束中形成所述生物活性剂的络合物，避免了大到不能够被囊封于治疗用脂质体中的不宜络合物形成。
含有生物活性化合物的络合物在脂质体内的形成其优点是，所述络合物在输送到希望的靶细胞之前不大可能从脂质体中泄露。另外，络合物的形成能够在所述脂质体中浓缩大量的生物活性剂，以使生物活性剂与脂类的比例较高，而进行有效输送。所披露的方法能够使生物活性材料与络合剂在一种乳液中络合，然后，以能避免形成超过几个微米的生物活性剂和络合剂的极大有害聚集体的方式，将其囊封于脂质体中。
在一种实施方案中，本发明的方法提供了一种囊封核酸络合物的方法。例如，让DNA之类的核酸在反相胶束中与缩合剂络合，然后由所述胶束形成脂质体。如上文所述，尽管以前业已尝试过将DNA囊封于脂质体中，但这些方法没有一种能够成功有效地制备具有治疗作用的脂质体DNA。
本发明提供了一种制备含有缩合核酸的脂质体的方法，其量为每微摩尔脂质体脂类至少囊封大约0.5微克核酸。
所述脂质体脂类成分优选包含衍生磷脂和其他脂类，通常其比例为大约20-80摩尔％衍生磷脂大约80-20摩尔％其他脂类。优选的衍生磷脂包括磷脂酰乙醇胺(PE)-生物素共轭物；N-酰化磷脂酰乙醇胺(NAPEs)，如N-C12DOPE；和肽磷脂酰乙醇胺共轭物，如Ala-Ala-Pro-Val DOPE。所述其他脂类可以是常被掺入脂质体中的各种脂类中的任一种；不过，当衍生磷脂是NAPE时，所述其他脂类优选为磷脂酰胆碱(例如DOPC)。所述核酸优选为DNA。
本发明还提供制备含有脂质体和可药用载体的药用组合物的方法；所述组合物可用于将所述核酸输送给动物细胞。
通过结合下面的附图而提供的对本发明优选实施方案的以下说明，可以理解本发明的其他的和进一步的目的、特征和优点。
附图的简要说明
图1.精胺介导的质粒DNA聚集作用的显微照片(将存在于125微升LSB中的200微克质粒DNA与存在于125微升LSB中的7mM精胺轻轻混合)(A)在室温下培养15分钟之后进行的光学显微镜观察(横线表示10微米)(B)Cryo TEM观察(竖线表示100纳米)。
图2.DNA囊封法的示意图。在磷脂稳定化的水滴中进行DNA缩合(I)，所述水滴是在大量有机溶剂中，在DNA周围形成的。通过瞬时(III)接触和交换由各独立的含有精胺的水滴将精胺转移(II)到含有DNA的水滴中。在乳液中缩合之后(IV)，通过溶剂蒸发形成小囊，并进一步挤压成较小的体积(V)。
图3.脂质体N-C12 DOPE对精胺介导的质粒DNA聚集体的影响。在三个腔室的透析装置中进行平衡透析(参见实施例4)。左边的曲线来自没有脂质体的透析，而右移的曲线来自包括带脂质体腔室透析的曲线。X-轴精胺浓度(mM)；y-轴浊度(O.D.400纳米)。
图4.在N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)制剂中保护的质粒DNA的琼脂糖凝胶分析，在挤压和透析之后从每一种制剂中分出等份试样，并用DNaseI对一部分进行消化(参见例9)。泳道1，不含精胺的制剂。泳道2，与泳道1相同，但用DNaseI消化过。泳道3，含有精胺的制剂。泳道4，与泳道3相同，但用DNaseI消化过。
图5.按例3所述方法用pZeoLacZ质粒和精胺制备的存在于N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)样品中的颗粒的光学显微照片(A)与平均直径为269±7纳米的聚苯乙烯珠(B)(线条表示10纳米)。
图6.按例3所述方法同质粒和精胺一起制备的N-C12DOPE/DOPC(70∶30)样品的冷冻破碎PEM显微照片(参见例7)。箭头指明显已囊封的材料颗粒(线条表示400纳米)。
图7.不含精胺(a)或含有精胺(b)的脂质体与C12 DOPE/DOPC和pZeoLacZ质粒的冻结TEM显微照片(参见例8)，所述脂质体是按例3所述方法制备的。在(a)中，在脂质体外面(星号)和里面(箭头)观察到纤维样结构。在(b)中，箭头指向类似于聚阳离子缩合的质粒DNA的环形(在(a)和(b)中的线条表示100纳米)。光学显微照片(c)表示用精胺制备的EPC样品。圆形(箭头)和弯曲的棒形(星号)结构与多层脂质体(英磅号)的比较[线条表示50纳米]。
图8.用N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)制剂转染之后融合的OVCAR3细胞的荧光光学显微照片(参见例11)。用pEGFP-C1质粒DNA制备(a)含有精胺或(b)不含精胺的脂质体样品；还检测了空的不含精胺的脂质体N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)+添加在所形成的脂质体外面的游离的pEGFP-C1质粒DNA的样品(c)。添加到样品(c)空脂质体中的质粒DNA的量等于每一种其他制剂中的总量。在上述实验中使用相同的脂质体浓度。
图9.通过EGFP荧光水平定量测定EGFP在用pEGFP-C1转染过的OVCAR3细胞中的表达。转染实验(a、b和c，参见例11)与前面的图例相同。另外，测试过的制剂为d)用精胺和pEGFP-C1质粒制备的卵PC脂质体(参见例3)和e)不加合。洗涤所述细胞，并用CBAM标记，然后溶解在洗涤剂中，以便测定EGFP的荧光和钙黄绿素蓝(参见例10线段误差为±S.D.)。
图10.用精胺和pEGFP-C1质粒DNA制备的N-C12DOPE/DOPC(70∶30)的脂类沉淀的转染活性(参见例3)；原始质粒DNA和精胺溶液含有200mM蔗糖。在挤压和透析之后，将所述样品的一半用于转染，不进行进一步的处理(a)，通过离心使所述样品的其余部分的脂类颗粒沉淀，并用HBSS洗涤1次，然后用于转染(b)。同样制备仅含有200mM蔗糖的N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)样品，在即将透析之前，以与其他样品中所用相等量从外部添加质粒DNA和精胺。用相同方法制备该空白样品的沉淀(c)，然后将上述每一种样品的相等量脂类用于前面图中所披露的条件下转染。在培养过夜之后，用CBAM标记所述细胞，以便测定EGFP和钙黄绿素蓝的荧光(线段误差为±S.D.)。
图11.由小鼠腹水中的N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)脂质体进行的转染和用缓冲液进行的转染相比较。腹水是按例13所述方法从长有肿瘤的SCID小鼠灌洗液中获得的。让细胞与存在于HBSS或含有腹水的HBSS中、终浓度为10mM总脂类的含有质粒DNA的脂质体(不是沉淀)一起培养，最终蛋白浓度为大约3.5毫克/毫升(参见例11)。在培养3小时之后，用含有血清和丁酸的培养基取代所述转染溶液培养大约20小时。通过其荧光测定EGFP的表达(线段误差为±S.D.)。
图12.用存在于缓冲液或小鼠腹水中的N-C12DOPE/DOPC(70∶30)脂质体转染的OVCAR-3细胞的荧光显微照片(参见例11)。照片A表示在没有腹膜腹水的条件下进行的转染，而照片B表示用腹膜腹水进行的转染；在这些照片中细胞是融合的。
图13.脂质体层的荧光探针检测。
图14.在活体内用含有pEGFP-C1的N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)脂质体转染过的OVCAR-3肿瘤的荧光显微照片。照片A表示EGFP的表达，照片B表示由罗丹明标记的脂质体发出的红色荧光。
图15.在活体内用含有pEGFP-C1的N-C12 DOPE/DOPC(70∶30)脂质体转染过的OVCAR-3肿瘤的荧光显微照片，拍摄的是与图14不同的部位。照片A表示EGFP的表达，照片B表示由罗丹明标记的脂质体发出的红色荧光。
图16.对照用的肿瘤组织的荧光显微照片。照片A表示扩散的绿色荧光。照片B表示由罗丹明标记的脂质体无发出的红色荧光。
图17.表示在活体内转染之后，肌肉组织中β-半乳糖苷酶活性表达的曲线图。
本发明的详细说明下面是本申请所使用的缩略语和相应的术语PE，磷脂酰乙醇胺；PC，磷脂酰胆碱；EPC，卵磷脂酰胆碱；DO-，二油酰-；DOPC，二油酰磷脂酰胆碱；DOPE，二油酰磷脂酰乙醇胺；NAPE，N-酰化磷脂酰乙醇胺；N-C12 DOPE，N-十二酰二油酰磷脂酰乙醇胺；AAPV-DOPE，Ala-Ala-Pro-Val-二油酰磷脂酰乙醇胺；CBAM，钙黄绿素蓝乙酰氧基甲基酯；PBS，磷酸缓冲的盐溶液；LSB，低盐缓冲液；HBSS，Hank’s平衡盐溶液；EGFP，强化绿色荧光蛋白；SPLV，稳定的多层脂质体；MLVs，多层脂质体；ULVs，单层脂质体；LUVs，大型单层脂质体；SUVs，小型单层脂质体；dsDNA，双链DNA；TEM，透射电子显维术。
本发明提供了一种将生物活性配合体囊封于脂质体中的方法，该方法包括以下步骤(a)将至少一种两亲性脂类溶解在一种或多种有机溶剂中；(b)将包括含有选自生物活性剂和络合剂的第一种分子的溶液的至少一种含水悬浮液与步骤(a)的含有脂类的有机溶液混合，形成含有所述第一种分子和脂类的反相胶束形式的乳液；(c)向步骤(b)的乳液中添加含有选自生物活性剂和络合剂的第二种分子的第二种含水悬浮液，其中，如果所述第一种分子是生物活性剂的话，第二种分子就是络合剂，反之亦然。
(d)将步骤(c)的乳液保温培养，让所述络合剂接触所述生物活性剂，从而在脂类稳定化水滴中形成所述生物活性剂和络合剂的络合物；其中，所述络合物的直径不大于所述水滴的直径，和(e)除去步骤(d)的悬浮液中的有机溶剂，形成含有所述络合生物活性剂和脂类的脂质体。
本发明的方法可用于制备具有治疗作用的脂质体，在所述脂质体中含有与络合剂络合的各种生物活性分子。所述脂质体优选为融合型脂质体，通过本发明的方法它可以将多种分子囊封。所述融合脂质体能够与细胞膜融合，并能够将治疗有效量的生物活性剂输送到细胞和器官中。另外，本发明的方法还可将一种以上的生物活性剂囊封于脂质体中。可以通过本发明的方法，同时将一种或多种生物活性剂囊封于相同的脂质体中。如果要用本发明的方法将一种以上的生物活性剂囊封于脂质体中的话，不一定使每一种生物活性剂都为配合体形式。
术语“生物活性剂”表示能够给动物，优选人类施用，以达到治疗和诊断目的的任何化合物或物质的组合物。本发明的方法可用于将生物活性剂囊封，所述生物活性剂包括(但不限于)水溶性膜不可渗透的制剂，如核酸，核苷酸或核苷类似物，如胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷5’-三磷酸(araCTP)，蛋白，如细胞色素c，极性抗癌剂，如顺式铂氨，N-膦-乙酰基-L-天冬氨酸或5-氟乳清酸，抗癌剂的极性衍生物或带电荷的衍生物，极性肽，组蛋白脱乙酰酶抑制剂，如丁酸等。生物活性剂还包括(但不限于)选自下列一组的制剂核酸，如DNA和RNA，抗病毒剂，如无环鸟苷、叠氮胸苷和干扰素，抗菌剂，如氨基糖苷，头孢菌素和四环素；抗真菌剂，如多烯抗生素，咪唑和三唑；抗代谢剂，如叶酸，和嘌呤及嘧啶类似物；抗肿瘤剂，如蒽环(anthracycline)抗生物和植物碱；碳水化合物，如糖和淀粉；氨基酸，肽，蛋白，如细胞受体蛋白，免疫球蛋白，酶，激素，神经递质和糖蛋白；染料；放射性标记，如放射性同位素和放射性同位素标记过的化合物；硫酸钡化合物；荧光化合物；散瞳化合物；支气管扩张剂；和局部麻醉剂等。
术语“生物活性配合体”是与络合剂结合的任何生物活性剂，由此所产生的配合体会发生物理特性的改变，如降低生物活性分子的大小，降低生物活性剂的溶解度，使生物活性剂沉淀，使生物活性剂缩合，或增加络合物的大小。
含有反相胶束的油包水型乳液以前已被用于研究酶动力学(例如Bru等，《生物化学杂志》，310721-739，1995)并用于生产脂质体(例如Szoka等，《美国科学院院报》，754194-4198，1978；Gruner等，《生物化学》，242833-2842，1984)，但以前未曾报导过出于装载脂质体的目的而将所述乳液用于调节两种化合物的络合。
乳液可以用本领域技术人员所熟知的各种方法制成。可以用超声处理、涡旋搅拌、机械搅拌、静态混合、匀浆、注射、微流化法、胶体磨、压力乳化器，和/或Kady磨制备各种类型的乳液，包括各种级别的添加材料。本发明的乳液是用两个步骤制成的，以便在添加其他制剂的水分散液之前将生物活性剂或络合剂中的至少一种成分预先隔离在脂类稳定化乳液的水滴中。
在从脂类稳定的乳液中除去溶剂之后，形成了“脂质体”。溶剂可以用多种方法中的任一种除去，包括(但不限于)旋转蒸发和氮气流。
“脂质体”是包括一个或多个脂双层的自我组装的结构。每一个脂双层包括两个方向相反的含有两亲性脂类分子的单层。两亲性脂类包括与一个或两个非极性(疏水性)酰基链共价连接的极性(亲水性)端基区。疏水性酰基链和周围水介质之间的非常不适宜接触会诱导所述两亲性脂类分子自动排列，以便使其极性端基朝向双层的表面，而酰基链朝向双层的内部，由此形成能量稳定的结构，其中，所述酰基链受到了有效屏蔽，不会接触到含水的环境。
脂质体可以具有单一脂双层(单层脂质体，ULVs)，或多重脂双层(多层脂质体，MLVs或SPLVs)(例如，参见Cullis等，《生物化学生物物理学学报》，559399-420，1987；New，1995)。每一个双层包围或囊封一个含水的区室。使所述含水空间囊封于脂类分子的保护性屏障之内，脂质体能够隔离囊封的分子，例如核酸，使其不受存在于外部环境中的核酸酶之类因素的降解作用。例如，通过例9所提供的琼脂糖凝胶分析，证实了对囊封的内含物(在这里是核酸分子)的保护作用，该分析的结果在图4中示出。
脂质体可以具有各种大小，例如，平均直径可以低到25纳米或高到10000纳米或更高。其大小受多种因素的影响，例如，脂类组成和制备方法，这些为本领域技术人员所熟知，其大小可以通过准弹性光学散射的多种方法确定，这些也为本领域技术人员所公知。
可以使用同样为本领域技术人员所公知的诸如超声波、匀浆、French Press应用和研磨之类的各种方法，由较大的脂质体制备具有较小体积的脂质体。可以用挤压法降低脂质体的体积(例如，参见US5008050)，就是说，通过加压强制所述脂质体通过具有特定大小尺寸的过滤器孔，产生具有预定平均大小的脂质体。还可以用切向流动过滤法(WO89/008846)规范脂质体的大小，就是说，生产一群具有较低粒度不均一性和更均质性的、并限定粒度分布的脂质体；以上文献的内容被收作本文参考。
本发明的脂质体可以是单层的或寡叠层的，其大小可以等于上文所披露的任何方法所生产的脂质体的大小。不过，在本发明的优选实施方案中，脂质体是平均大小为50-300纳米的单层脂质体。
脂质体是由包括天然和合成来源在内的多种来源的，包括两亲性和非两亲性在内的多种脂类构成的。合适的脂质体脂类包括(但不限于)磷脂，如磷脂酰胆碱(PC’s)、磷脂酰乙醇胺(PE’s)、磷脂酰丝氨酸(PS’s)、磷脂酰甘油(PG’s)、磷脂酰肌醇(PI’s)和磷脂酸(PA’s)。所述磷脂通常具有两个酰基链，要么都是饱和的要么都是不饱和的，或者是一个饱和而另一个不饱和；所述酰基链包括(但不限于)肉桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、花生四烯酸、二十二酸和二十四酸链。
还可以通过在磷脂上连接合适的反应基团将其衍生化。所述基团通常是氨基，因此，衍生化的磷脂通常是磷脂酰乙醇胺。适于连接在PE’s上的不同的部分包括(但不限于)酰基链(WO98/16199)，用于增强脂质体与生物学膜的融合能力；肽(WO98/16240)，用于在靶细胞附近使脂质体变得不稳定；生物素和马来酰亚胺部分(US5059421和5399331)，用于将抗体之类的定向部分连接在脂质体上；和各种分子，如神经节苷脂，聚烷基醚、聚乙二醇和有机二羧酸(例如参见US5013556，4920016和4837028)。以上所引用的文献的内容被收作本文参考。
因此，在本发明的最佳实施方案中，用本发明方法制备的脂质体包括衍生化的磷脂，适用于增强对其内含物的输送。所述脂质体还可以(但不是必须)包括其他脂类，所述其它脂类由于脂质体学领域普通技术人员所知的多种原因而被掺入所述脂质体中。所述原因包括(但不限于)稳定或定向所述脂质体，以及进一步改变该脂质体的药物动力学表现。合适的其他脂类包括被公认为适于掺入脂质体中的脂类的任一种，包括(但不限于)磷脂、糖脂和甾醇。
本发明的脂质体优选包括衍生化的磷脂和其他脂类的脂类成分。所述衍生化的磷脂的结构式为 其中Z选自生物素、马来酰亚胺部分，被称为R3的基团和结构式为X-Y的基团，X选自单键和R4基团，而Y是酶可裂解的肽，它所包括的氨基酸序列是一种细胞分泌的肽酶的底物，R1、R2、R3和R4中的每一个是具有以下结构式的基团OC(O)(CH2)n1(CH＝CH)n2(CH2)n3(CH＝CH)n4(CH2)n5(CH＝CH)n6(CH2)n7(CH＝CH)n8(CH2)n9CH3，其中n1是0或1-22的整数；n3是0或1-19的整数；n5是0或1-16的整数；n7是0或1-13的整数；n9是0或1-10的整数；而n2、n4、n6和n8中的每一个是0或1。n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8和n9中的每一个在每一次出现时是相同的或不同的。
对于R1和R2来说，n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的总和分别为12-22的整数，而对于R3和R4来说，n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9的总和分别为2-22的整数。所述衍生化的磷脂优选包括大约20-80摩尔％的脂质体脂类。
其中，R3是-C(O)(CH2)n1(CH＝CH)n2(CH2)n3(CH＝CH)n4(CH2)n5(CH＝CH)n6(CH2)n7(CH＝CH)n8(CH2)n9CH3，该衍生化的磷脂是N-酰化磷脂酰乙醇胺(NAPE，参见WO98/16199)。R3优选为OC(O)(CH2)n1CH3，更优选为OC(O)(CH2)10CH3。
所述衍生化的磷脂优选为N-酰化PE，所述NAPEs可用于制备融合脂质体，并且被优选用于制备本发明的含有药物或生物活性剂络合物的脂质体。
NAPE-诱导的双层去稳定作用，能诱导该双层与它附近的生物学膜融合，并因此增强该双层的融合能力(Shangguan等，《生物化学生物物理学学报》，1368171-183，1998)，增强了的融合能力，反过来又被用于将不能通过细胞膜的核酸等或其他制剂的囊封生物活性剂输送到细胞中，通过让所述细胞在存在合适浓度的钙离子和镁离子等条件下与所述脂质体结合而实现。脂质体-细胞接触会导致脂质体囊封的生物活性剂释放到所述细胞中，和/或由于脂质体和细胞膜的融合而直接进入细胞质。所述输送是在体内或体外进行的。
当R3是酰基链或肽，而衍生化的磷脂是NAPE或肽-脂类共轭物时，R1和R2中的至少一个优选为不饱和酰基链，而n2、n4、n6和n8中的至少一个等于1。不饱和酰基链包括(但不限于)棕榈油酸根、油酸根、亚油酸根、亚麻酸根和花生四烯酸根链。所述不饱和酰基链优选为油酸根链(-OC(O)(CH2)7CH＝CH(CH2)7CH3)。更优选R1和R2均为油酸根链，即衍生化的磷脂 其中，Z是R3或X-Y。最优选所述衍生化磷脂为 即“N-C12 DOPE”。
当所述衍生化磷脂是N-C12 DOPE时，所述脂质体脂类优选还包括一种磷脂酰胆碱，优选具有至少一个不饱和酰基链的PC，最优选二油酰磷脂酰胆碱。所述脂质体脂类优选包括大约70摩尔％N-C12DOPE，和大约30摩尔％DOPC(即N-C12 DOPE和DOPC的70∶30的制剂，其中，脂质体脂类的浓度在这里以比例形式表示，并且，其中所述比例是所涉及到的特定脂类在脂质体脂类中的相对百分比指标)。
所述脂质体脂类还可以包括“端基修饰过的脂类”，即通过在它上面连接一个能够抑制血清蛋白与掺入了所述脂类的脂质体结合的部分而衍生化的极性基团的脂类。因此，将端基修饰的脂类结合到脂质体中改变了它的药物动力学表现，从而使所述脂质体能够在动物的循环体系中比其他形式的脂质体保留更长的时间(例如参见Blume等，《生物化学生物物理学报》，1149180，1993；Gabizon等，《药理学研究》，10(5)703，1993；Park等，《生物化学生物物理学报》，2571108，1992；Woodle等，US5013556；Allen等，US4837028和4920016；以上文献被收作本文的参考)。端基修饰的脂类通常为磷脂酰乙醇胺(PE’s)，例如，其中包括二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。所述脂类的端基通常用聚乙二醇或用诸如琥珀酸或谷氨酸(GA)等有机二羧酸或其他相应的酸酐衍生化。掺入所述脂类载体中的端基修饰过的脂类的量，通常取决于本领域技术人员所熟知的多种因素，或者本领域技术人员不用进行太多的实验就可以确定这些因素。其中包括(但不限于)脂类的类型和端基修饰的类型；载体的类型和大小；以及预期的该制剂的治疗用途。通常，在含有端基修饰过的脂类的脂类载体中，有大约5-大约20摩尔％的脂类是端基修饰过的脂类。
络合剂通常包括(但不限于)带有与生物活性剂相反电荷的基团，包括精胺、亚精胺、六氨合钴、钙离子、镁离子、聚赖氨酸、聚组氨酸、鱼精蛋白、聚阴离子、如肝素和葡聚糖硫酸酯，柠檬酸根离子和硫酸根离子。本领域技术人员还公知可用于本发明方法的其他有用的络合剂。
囊封于所述脂质体中的缩合的核酸为DNA，包括基因组DNA、质粒DNA或cDNA，或RNA；所述囊封的核酸优选为DNA，更优选为环状质粒DNA。以每微摩尔脂质体至少大约0.5微克的用量，或者每微摩尔至少大约0.75、1.0、1.25、1.5、1.75或2微克的用量将缩合的核酸囊封于所述脂质体中。更优选的是，所述脂质体每微摩尔脂类含有大约2-大约20微克核酸。在本文中，与核酸一起使用的“缩合的”是指与一种或多种聚阳离子结合的核酸，使得所述核酸链能比在没有所述聚阳离子的条件下更紧密的堆积。所述堆积使得核酸能够囊封于脂质体中，且仍然保持所述核酸处于可转染的、可随时转录的形式。
因此，在本发明的优选实施方案中，所述方法制备含有缩合DNA和脂质体脂类的脂质体，它包括大约70摩尔％N-C12 DOPE和大约30摩尔％DOPC。所述脂质体每微摩尔脂类含有大约0.5微克缩合的DNA。
由本发明的方法所提供的脂质体除了所述络合生物活性剂之外，还可以含有一种或多种生物活性剂。可以与脂质体结合的生物活性剂包括(但不限于)，抗病毒剂，如无环鸟苷、叠氮胸苷和干扰素，杀菌剂，如氨基糖苷，头孢菌素和四环素；抗真菌剂，如多烯抗生素，咪唑和三唑；抗代谢剂，如叶酸，和嘌呤及嘧啶类似物；抗肿瘤剂，如蒽环(anthracycline)抗生物和植物生物碱；甾醇，如胆甾醇；碳水化合物，如糖和淀粉；氨基酸，肽，蛋白，如细胞受体蛋白，免疫球蛋白，酶，激素，神经递质和糖蛋白；染料；放射性标记，如放射性同位素和放射性同位素标记过的化合物；硫酸钡化合物；荧光化合物；散瞳化合物；支气管扩张剂；和局部麻醉剂等。
脂质体生物活性剂制剂可以提高该生物活性剂的治疗指标，例如，通过缓和该生物活性剂的毒性而实现。脂质体还可以降低生物活性剂被从动物循环系统中清除的速度。因此，生物活性剂的脂质体制剂可能意味着为了达到希望的效果需要较少的制剂。
可以将本发明的脂质体脱水、保存，然后再重建，以便保留其内含物的大部分。脂质体脱水通常需要使用亲水性干燥保护剂，如存在于脂质体双层内表面和外表面上的二糖(参见US4880635，该专利的内容被收作本文参考)。据信，这种亲水性化合物通常能抑制脂质体中的脂类重新排列，从而在干燥过程中，以及在随后的再水合过程中保持其大小和内含物。所述干燥保护剂的合适品质应为强氢键受体，并具有能保留脂质体双层成分的分子间间隙的立体化学特征。另外，如果在脱水之前不对所述脂质体进行冷冻，并且在脱水之后有足够的水留在该制剂中的话，可以不用所述干燥保护剂。
本发明还提供了一种可以药用的载体和本发明脂质体的药用组合物。例如，所述组合物可用于将核酸输送到动物细胞中。本文所使用的“可以药用的载体”总的来说是指给包括人在内的动物施用脂类和脂质体(包括脂质体生物活性制剂)时可结合使用的介质。可以药用的载体通常是根据多种因素制备的，这些因素为本领域技术人员所公知，包括(但不限于)所使用的具体脂质体生物活性剂，其浓度，稳定性和预期的生物可利用性；接受该脂质体组合物治疗的疾病或症状；受治对象、其年龄、体形和一般状况，以及该组合物的预期给药途径，利如鼻腔、口腔、眼睛、局部、经皮、阴道、皮下、乳房内、腹膜内、静脉内、或肌内(例如参见Nairn，1985，该文献的内容被收作本文参考)。例如，用于肠胃外给药的生物活性剂的典型药用载体包括D5W等，一种含有重量体积百分比为5％葡萄糖的水溶液和生理盐水。可以药用的载体可以含有其他成分，例如包括能增强所述活性成分的稳定性成分，如防腐剂和抗氧化剂。
本发明还提供了一种将DNA之类的核酸囊封于脂质体中的方法，该方法包括以下步骤(a)将所述核酸的水悬浮液与含有诸如衍生化磷脂之类和其他脂类的有机溶液混合，形成含有所述核酸和脂类的反相胶束的悬浮液；(b)将一种聚阳离子添加到所述胶束悬浮液中，以便缩合所述反相胶束内的核酸；和(c)从步骤(b)的悬浮液中除去有机溶剂，由所述反相胶束形成所述核酸和脂类的脂质体。通过囊封法所达到的核酸和脂质体脂类的比例为每微摩尔脂类至少大约0.5微克核酸。
如上文所述，可用于实施本发明的脂类是那些被认为适合单独或与其他脂类结合掺入脂质体中的脂类；其中包括磷脂、糖脂、甾醇及其衍生物。用于本方法的有机溶剂是可用于制备脂质体过程中溶解脂类的各种溶剂中的任一种；其中包括(但不限于)甲醇、乙醇、二甲基亚砜、氯仿、及其混合物。优选的有机溶剂是氯仿。
在本发明方法中可用于缩合核酸的聚阳离子是具有三个或三个以上可离解基团的任何化合物，所述基团可用于缩合核酸，其他生物活性剂或药物；其中包括(但不限于)聚赖氨酸、聚胺(例如，精胺和亚精胺)、六氨合钴(III)、聚组氨酸、和聚乙烯胺等，优选聚阳离子是精胺。可用于实施本发明的核酸包括DNA，例如基因组DNA、cDNA和线型或环状质粒DNA，以及RNA。通过普遍了解的、并且容易实施的方法将核酸悬浮在含水介质中，例如以涡旋搅拌法将大分子悬浮。合适的含水介质是缓冲剂之类的各种添加剂水溶液，并且基本上不含某些成分，如盐和核酸酶；所述介质包括(但不限于)低盐缓冲物(LSB，参见下面的例3)。
通过磷脂稳定的油包水型乳液包括反相胶束。反相胶束(参见Bru等，《生物化学杂志》，310721-739，1995)是两亲性脂基结构，其中，所述脂类的亲水性功能域被隔离在所述胶束表面的内侧，而所述脂类的疏水性功能域排列在其外部。
按上文所述以及下面的图2所示的方法制备含有反相胶束的乳液，加以屏蔽的包括核酸的生物活性剂，使其隔离在其中，不发生分子间接触，否则存在络合剂的条件下，会导致其聚集，而不适合结合到脂质体中。所述工艺的实施，要使所得含有所需络合物的脂质体的百分比达最大。
在所述乳液中，络合物是通过该乳液中反相胶束的含水区室之间所添加的络合剂，如聚阳离子，或生物活性剂进行交换而形成的。例如，参见Bru等，FEBS，282170-174，1991；Fletcher等，《Farady化学会志论文集I》，83985-1006，1987)。对于DNA络合物的囊封来说，合适的聚阳离子是可用于缩合核酸的聚阳离子中任一种。例如，精胺和亚精胺都被用于(例如，参见Chattoraj等，《分子生物学杂志》，121327-337，1978和Gosule等，《自然》，259333-335，1976，以上文献的内容被收作本文参考)体外缩合个体质粒，不过只能在低DNA浓度下进行，以避免缩合质粒的聚集。所述DNA的浓度足够低，是为在脂质体将缩合的核酸囊封时，有大量的空的、即不含DNA的脂质体。聚赖氨酸和六氨合钴(III)也可用于核酸缩合。
适合缩合核酸的聚阳离子的浓度为可导致有足够数量的核酸负电荷被中和的浓度，例如，对于DNA来说有大约50％或更高的负电荷被中和(Wilson等，《生物化学》，182192-2196，1979)。本领域技术人员可以根据要被缩合的核酸、所使用的聚阳离子、核酸浓度和聚阳离子的化学价，适当地确定合适的或最佳的聚阳离子浓度。
另外，本领域技术人员可以确定并了解能够影响适于缩合核酸等生物活性剂的聚阳离子浓度的其他因素。例如，NAPEs，如N-C12DOPE通过额外的酰基链形式而负载净负电荷，因此，所述脂类能够与带正电荷的分子相互作用，从而减少可用于核酸缩合的聚阳离子汇集。
因此，在上述情况下，可能需要添加超过核酸缩合需要量的聚阳离子。所述聚阳离子的足够的额外量可以通过多种方法确定，例如，包括在例4中所披露的分配实验的类型。所述实验提供了表示核酸缩合所需要的额外聚阳离子的数据(参见图3)。例如，针对例3中所使用的核酸和脂类的浓度来说，对于质粒DNA的缩合，0.6毫摩尔的精胺就足够了，但在存在所示浓度的NAPE N-C12 DOPE的情况下，该用量要增加到0.85毫摩尔。不过，可以使用高于所述浓度的聚阳离子浓度，即高于最低要求例如，同样可以参考例3的条件，发现乳液中8-20毫摩尔最终精胺浓度对于核酸和脂类电荷的中和来说是最佳的。
本领域技术人员可以确定适于实施本发明的脂类和核酸浓度。例如(参见下面的例3)，为了将缩合的质粒DNA囊封于200纳米的球形脂质体中，将溶解在125微升LSB中的200微克pZeoLacZ质粒DNA与30微摩尔N-C12 DOPE和DOPC的70∶30摩尔比的组合物混合。
因此，本发明的优选实施方案是用缩合核酸(它是质粒DNA)，含有衍生磷脂的脂类，例如N-C12 DOPE，氯仿和精胺，例如在大约1毫摩尔或更高浓度下进行的。
本发明还提供了一种用核酸之类的生物活性剂转染动物细胞的方法，所述方法包括让所述细胞与本发明的含有所述络合核酸的脂质体接触的步骤。所述接触可以在体外进行，在这种情况下，将含有所述脂质体的组合物添加到所述细胞周围的培养基中，或者在体内进行，在这种情况下，以另外含有一种可药用载体的药用组合物形式施用所述脂质体，并且是通过给动物施用所述组合物的标准方法的任一种给所述动物施用。
体内接触，特别是需要专一性或定向的体内接触，是通过在脂质体中结合一种能引导脂质体到特定部位的工具而实现的，例如，通过抗生蛋白链菌素在所述脂质体上结合一种抗体，导致脂质体的内含物能在特定部位优选释放，例如，通过将NAPEs或肽-脂类共轭物结合到所述脂质体中，和/或通过在其中结合一种端基修饰过的脂类，导致所述脂质体可积累在肿瘤之类的部位而实现其目的。
转染效率，即实际将脂质体囊封的核酸分子导入细胞的效率，是通过在所述脂质体中掺入能诱导脂质体双层与细胞膜融合的物质而在体外或体内得到提高的。所述方式包括(但不限于)掺入NAPEs，肽-脂共轭物和可离解的脂类(参见WO87/07530和WO95/27478，以上专利内容被收作本文参考)。体外或体内转染的目的是为了将核酸导入细胞，以便它能在细胞内转录并翻译。所述通过外源核酸导入所进行的蛋白表达，可用于解决由于其中基因缺乏表达或超量表达所导致的各种细胞缺陷，或改变细胞蛋白及其表达。因此用本发明所提供的脂质体囊封的核酸转染细胞，可被用于治疗患有疾病的动物。所述疾病的特征是蛋白表达的缺乏、异常低、异常高或不合适。例如，所述疾病包括(但不限于)各种癌症和基因缺陷疾病。与治疗相关的转染还能导致以前不能在靶细胞中表达的蛋白表达。
可以用多种方法检测转染的成功和转染核酸在细胞中的表达，这些方法通常根据要检测的所述核酸在细胞中的物理存在，例如，通过在所述核酸上整合放射性核苷酸，或者检测由所述核酸编码的蛋白表达，这一目的可以通过多种方法实现，包括(但不限于)其中所述蛋白是可检测的，例如荧光，标记物等，或者其中所述蛋白是选择性的，例如抗细胞毒性剂，标记物等。
例如，质粒pEGFP-1含有编码强化绿色荧光蛋白的DNA序列，其存在是通过荧光显微术检测到的。因此，通过估算由所述细胞所表现出的荧光量，可以方便地确定用该质粒已成功转染的细胞(参见例10-12)。以上实验的结果表明(参见图8-12)，用pEGFP-1质粒成功地转染了OVCAR-3细胞，并且在很大百分比的转染细胞中所述转染质粒能以高水平表达。
所述成功表达只出现在转染DNA被聚阳离子缩合的情况下；未用精胺处理过的样品表现出没有或几乎没有荧光(参见图8)。荧光蛋白表达的定量测定(图9)表明，用聚阳离子缩合的DNA转染会导致较高水平的表达，而未用精胺处理过的样品转染不会产生可定量测定的荧光。另外，用游离的，即未囊封的DNA转染也只有观察不到的或无法定量的荧光(图8c和9c)。
通过以下实施例可以更好地理解本发明，这些实施例仅仅不过是随后的权利要求书中所限定的本发明的典型例。
用几分钟时间将所得到的乳液放入位于Rotovap(BuchiLaboratoriums-Technik AG，瑞士)上的烧瓶中。在以最大速度转动所述烧瓶时除去有机溶剂，而真空是通过一个针阀调节的。首先建立大约600-650毫米的真空，然后在不产生过多气泡的前提下尽可能快地提高该真空度，直到达到最大真空度(大约730mm)；然后再对所述烧瓶进行25分钟的抽真空。将留在烧瓶上的薄膜重新悬浮在1毫升用LSB制备的300毫摩尔蔗糖中，通过0.4微米聚碳酸酯膜过滤器(Poretics，Livemore，CA)挤出所述样品5次。然后在4℃下用不含钙离子/镁离子的Hank氏平衡盐缓冲液(HBSS)透析所述样品过夜。
用其他脂类组合物将本发明的缩合DNA囊封。按本实施例上面所披露的方法缩合质粒并将其囊封于脂质体中，然后按例12所述方法沉淀。所述脂质体的脂类组合物是比例为12.5∶2.5∶50∶12∶10.5∶10.5的胆甾醇半琥珀酸∶胆甾醇∶1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺∶1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺∶二油酰二甲铵丙烷∶油酰乙酸酯。在沉淀并洗涤之后，按例10所述方法测定该脂质体的DNA/脂类比例。典型的DNA/脂类比例为每微摩尔脂类1.4-2.1微克DNA。例4-精胺分配N-C12 DOPE带有净负电荷，它可能与带正电荷的精胺相互作用，并影响缩合过程。因此，有必要通过低盐缓冲透析实验测定精胺在该组合物的DNA和脂质体之间分配。被设计用于测定精胺在带负电荷的磷脂和DNA之间分配的实验是用具有三个腔室的透析装置(Sialomed，MD)进行的，每一个腔室装有250微升液体。将需要量的精胺稀释到LSB中，并放入中间的腔室中，该腔室两侧是两个截断100,000分子量的透析膜。位于所述精胺腔室一侧的腔室装有存在于总体积为250微升LSB中的400微克pZeoLacZ质粒DNA。另一侧的腔室装有250微升LSB，或者按照例3所述方法制备的空的N-C12DOPE/DOPC(70∶30)脂质体，在250微升LSB中的总脂类浓度为30毫摩尔，该设计方案中只有精胺进入所有三个腔室。由于已知由精胺中和质粒DNA会导致聚集(图1)，在含有DNA的腔室中溶液的浊度被用作监测精胺分配的指标。如果脂质体将精胺与DNA完全隔离的话，DNA就不会聚集。在所述实验中，可利用的带负电荷脂类的量大约为所述DNA上负电荷量的两倍。每一台透析装置在12英寸的马达驱动转轮上转动过夜(大约20小时)。然后取出含有DNA的腔室，通过移液管反复移液以便混合样品，并将其放入体积为250微升的样品池中。以400纳米的吸收度监测相对于缓冲物液本底的浊度。
建立有和没有脂质体的透析DNA浊度精胺滴定曲线(图3)。在所述曲线上由于脂质体的存在而导致的近似偏移程度被用于计算脂类和DNA的相对结合常数，假设每一个精胺分子能结合4个核苷酸磷酸基团或4个磷脂，在简单的平衡中，结合常数分别为KDNA和K酯。已知在低盐条件下，精胺从DNA上解离的解离常数在微摩尔范围内(Wilson等，《生物化学》，182192-2196，1979；Gosule等，《分子生物学杂志》，121327-337，1978)。因此，在所述实验中，在DNA聚集所必需的毫摩尔精胺浓度下，精胺的所述游离浓度是可以忽略不计的。
为DNA聚集所需的精胺对DNA磷酸基团进行的分级中和，根据在无脂质体的条件下获得的数据γ，被设定为0.9。这一数据与报导过的DNA缩合所需要的值相同，并且与以前的观察吻合，即在高DNA浓度下聚集伴随着缩合(Wilson等，《生物化学》，182192-2196，1979；Gosule等，《分子生物学杂志》，121327-337，1978)。假设在聚集点时[DNA-spm]＝γ[DNA]总合，而[脂-spm]＝在所述曲线上的偏移，便可以使用以下公式KDNA/K酯＝[γ/(1-γ)]×[(脂总合-偏移)/(偏移)]其中，当脂总合是暴露在脂质体外面的带负电荷的总浓度除4时，表观平衡常数为178，即精胺与DNA结合的倾向大于与脂类结合的倾向。结合常数与右侧的第一因素的比例是常数。因此，右侧的最后一个因素可用于计算DNA浓度和任何总合脂类浓度在所述精胺滴定曲线上的偏移，包括用于所述乳液中的较高的有效浓度。
图3所提供的数据表明，脂质体的存在只会使DNA聚集的曲线发生小的偏移。因此，在最初的250微升乳液中，大约0.6毫摩尔的精胺就足于缩合质粒DNA，而在存在使用量N-C12-DOPE的条件下，总共0.85毫摩尔的精胺便足于缩合所述DNA。因此，在所述制剂中，在不用中和有可能使脂质体去稳定化的带负电荷脂类的复杂工艺下，预计质粒DNA确实可以缩合。例5-脂质体样品的光学显微术测试了有可能囊封于脂质体中的DNA的预先缩合。通过溶液浊度的很大变化，判断有大量聚集现象发生。这种情况并不意外，因为已经有人报导过类似问题。对质粒聚集体进行光学显微镜检查(图1)，用存在于125微升LSB中的200微克pZeoLacZ质粒，与存在于125微升LSB中的7毫摩尔精胺轻轻混合，并在室温下培养15分钟。
显微镜观察(图1A)发现，聚集体通常大于1微米，即通常为5-10微米。通过低温电子显微镜术进一步证实所述聚集体的大体积(图1B)。在该放大倍数下特别注意到了纤维的规则排列，有可能是由于精胺诱导的缩合形成了部分有序的结构。也有某些弯曲的棒状暗示有环形结构开始形成，但没有完整的环。以这种方式形成的聚集体太大，以至不能用于输送系统。
为了估算含有DNA的N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体的大小，用水将平均粒径为269±7纳米的聚苯乙烯珠(Duke科学公司，Palo Alto，CA)稀释到适合显微检测的浓度，并使用挤压和透析之后没有做进一步稀释的含有DNA的N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体样品(大约20毫摩尔脂)。在Olympus BH-2荧光显微镜(Olympus，Lake Succss，NY)以千倍的放大倍数检查所述样品。
结果示于图5中。在这种放大倍数下，含有DNA的脂质体颗粒在大小和性状上看上去比较均匀，而样品颗粒的大致体积与通过动态光学散射研究所获得的结果看来非常相似。将含有DNA的脂质体颗粒样品和图1A中所示精胺聚集的DNA进行比较，证实在形成脂质体之前，在本发明的反相胶束中使DNA缩合确实具有优点，当没有出现精胺与水溶液中的DNA直接相互作用所观察到有极大聚集体的迹象时，表明所述乳液缩合法能大大抑制所述聚集体的形成。例6-通过光散射分析颗粒通过拟弹性光散射鉴定N-C12-DOPE/DOPC制剂。粒度分析是用Nicomp370粒度分析仪(粒度分析系统，Santa Barbara，CA)进行的。在分析时将样品稀释大约10倍。在泡囊模型中进行高斯分析，并记下数均加权平均值。对于按例3方法制备的精胺缩合的pZeoLacZ质粒DNA数据，可以用数均粒度为222.6纳米的高斯粒度分布拟合。例7-冷冻破碎TEM通过冷冻破碎TEM进一步鉴定带有囊封DNA的融合N-C12-DOPE/DOPC制剂。将2微升样品沉积在2个Balzers铜制双折弯夹持器之间，并在液态丙烷中冷冻。在Balzers BAF400冷冻破碎装置中，在-100℃和10-6和10-7barr下破碎所述样品，用白金(低于45℃)和碳进行遮盖。用5％的漂白剂将几份复制样品消化过夜，用蒸馏水洗涤，并置于300目网格上。用菲利浦300TEM获得图象。
结果示于图6中。大多数颗粒的体积均小(小于400纳米)，与NICOMP结果吻合。由于大多数碎片通过脂双层，用该方法观察到内含物的情况是罕见的。不过，有少量颗粒看起来有代表缩合DNA的某种囊封结构。例8-低温透射电子显微术用Cryo-EM证实所述制剂的脂质体性质，并有可能观察到所有囊封材料。对于EPC样品和精胺聚集的DNA来说，使用由多孔碳载体涂覆的铜格栅不做进一步处理。对于含有N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)DNA的脂质体样品来说，通过在格栅表面上放1滴0.1毫摩尔聚赖氨酸溶液，并让其在上面保持1分钟，使得具有多孔碳薄膜的EM格栅带正电荷。将所述聚赖氨酸吸走，并用几滴蒸馏水漂洗所述格栅，然后用几滴样品缓冲液洗涤。再将5微升1份的等分样品放在该格栅上，吸印到薄膜上，并马上放入液态乙烷中。在液氮中保存所述格栅待用。在一台菲利浦CM12透射电子显微镜(Mahwah，NJ)上观察所述格栅，以120kV的加速电压操纵。在成像期间，用626低温保持器(Warrendale，PA)将样品温度保持在-177至175℃之间。在低电子剂量条件下，记录孔上方部位的电子显微图象。使用35,000×或60,000×放大倍数和1.8-2.5微米的弱焦点。
结果示于图7中。当制备N-C12-DOPE/DOPC脂质体的过程中省略精胺时，观察到了主要为单层、较小的，但结构不均匀的脂质体(图7a)，与Nicomp分析吻合。有很多脂质体看上去呈管状，这可能是由于在制备过程中所产生的渗透压梯度所致。某些脂质体表现出内部纤维样结构，有可能代表未缩合的DNA(左侧箭头)。还可以观察到未囊封的游离纤维(右侧箭头)。
用精胺制备的含有DNA的N-C12-DOPE/DOPC脂质体样品(图7b，c)在大小、性状和层状结构方面也是不均匀的。某些颗粒是带有不可见囊封材料的正常外观脂质体。不过，其他含有电子密集的、明确的环形结构的颗粒(图7b)，在不含精胺的样品中观察不到。所述结构与所使用的具体脂类没有关系，因为环形(图7c，右侧箭头)和弯曲的棒状结构(图7c，左侧箭头)在卵PC制剂中也出现，该结构在cryo-EM样品制备条件下更稳定。所述棒和环内部的细线之间的间隙是均匀的，并且比多层脂质体(星号)中两层膜之间的间隙明显更小。上述环形结构与在稀释溶液中通过精胺(Chattoraj等，《分子生物学杂志》，121327-337，1978)或其他缩合剂(Arscott等，《生物聚集物》，30619-630，1990；Gosule和Schellman，《分子生物学杂志》，121327-337，1978)缩合游离DNA时所观察到的环和棒十分相似。所述棒和环内部所观察到的平行且同心的细线与在质粒聚集体内所观察到的线也很相似(图7b)。
在某些环形结构周围可以清楚看到膜(例如图7b)。看来所有观察到的环都囊封于离子不可渗透的屏障中，因为缩合的DNA环不能存在于高盐缓冲液中，在这种缓冲液中，脂质体最终会被悬浮。因此，看来所述制剂的大部分是由脂质体囊封的质粒DNA构成。例9-琼脂糖凝胶分析通过对用精胺制备的脂质体囊封的质粒DNA和不用精胺制备的对照样品进行琼脂糖凝胶电泳分析，评估使质粒DNA不受DNase消化的保护作用。将50微升等分样所需制剂稀释到不含钙离子/镁离子的135微升HBSS中，并添加1微升0.2M氯化镁和2微升DNaseI(20单位)，并搅拌。在室温下培养6小时，然后添加2微升0.5MEDTA终止该反应。对于未消化过的对照样品来说，将各样品的50微升等份试样与150微升HBSS(w/o钙离子/镁离子)混合。然后按照公开方法用苯酚/氯仿/异戊醇提取样品，并用乙醇沉淀(Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，NY，B4-B5液，1989)。将沉淀溶解在20微升TE(pH8.0)中，将5微升样品加样到0.8％琼脂糖凝胶上。用SYBR Green I核酸凝胶染料(MolecularProbes)母液的1∶10000的稀释液，将所述凝胶染色30分钟，并在FotoSpectrum紫外线透光装置(灯箱)上观察。在所述灯箱上用Polaroid MP4+照相系统拍摄照片，然后以ScanJet IIC(惠普，PaloAlto，CA)对所述照片进行扫描，并用Aldus Photostyle(U-Lead系统，Torrance，CA)将其数字化。图4中的结果表明，这两种制剂都能产生显著的DNA保护或明显的被囊封。例10-定量分析为了对DNA保护进行定量分析，从每一份样品中提取DNA，并通过荧光分析测定。用PicoGreen荧光分析(Haugland，《荧光探针和研究化合物手册》，第6版，分子探针公司，161-162页，1996)通过例9所述苯酚/氯仿法提取DNA进行定量测定。通过将100微升PicoGreen母液(分子探针)添加到20毫升TE(pH7.5)中制备工作溶液。首先用TE(pH7.5)将提取的样品稀释100倍。然后将14微升1份的稀释过的样品与986微升TE(pH7.5)和1毫升PicoGreen工作溶液混合。在室温下将所述混合物遮光培养4分钟。在室温下，在PTIAlphascan荧光计(South Brunswick，NJ)上记录PicoGreen荧光，激发波长为480纳米，发射为520纳米，采用大于500纳米的高通滤片(Schott Glass Technologies，Duryea，PA)。用1毫升TE(pH7.5)和1毫升PicoGreen工作液混合物的荧光做空白对照样。以未消化过的样品作为100％，通过减去所述空白样品值，计算出受到保护未被DnaseI消化的DNA的百分比。在我们的实验条件下，来自消化过的DNA的荧光信号是不明显的。
具有精胺的样品表现出10.1±5.6％质粒保护率，而在不含精胺的样品中有19.0±4.5％受到保护。例11-转染实验然后测定所述脂质体制剂囊封的pEGFP-C1质粒DNA的转染活性。以每毫升11×105细胞的密度将OVCAR3细胞铺板于24孔平板上，或以每毫升2×105细胞的密度将其铺板于96孔平板上，每孔分别接种1毫升或0.1毫升的含有10％加热失活的胎牛血清的RPMI1640。在进行转染之前让细胞生长2天(大约40-48小时)；在该时间点上细胞处于铺满状态。将合适的脂质体或DNA样品稀释到无血清介质中制备转染溶液。抽吸所述平板以便除去介质，并在抽吸之后用Dulbecco’s磷酸盐缓冲溶液洗涤1次。
通过将含有pEGFP-C1质粒的透析过的样品在无血清介质中稀释10倍(大约2mM总脂浓度，除非另有说明)制备转染溶液(对于24孔平板来说每孔0.5毫升，对于96孔平板来说每孔0.1毫升)，然后添加到孔中，并在37℃下培养3小时。将所述孔抽空，并将含有10％加热失活的胎牛血清的介质加入每一个孔中。由于以前已经证实了转基因在CMV启动子的控制下是沉默的(Tang等，《人类基因治疗》，82117-2124，1997；Dion等，《病毒学》，231201-209，1997)，将5mM组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A添加到每一个孔中，以便增强表达。在最后两幅图中所示的实验中，用另一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂5mM的丁酸钠作为替代。
在37℃下，在细胞培养箱中培养18-22小时之后，吸出所述介质，并用0.5毫升1份的Dulbecco’s PBS洗涤。用一台Olympus IMT-2倒置显微镜，用10倍的目镜对还保存在所述组织培养平板上的样品进行拍照。吸出PBS，并将0.5毫升(96孔板为0.1毫升)存在于PBS中的5微摩尔的CBAM添加到每一个孔中，并在室温下培养40分钟。再次用PBS洗涤细胞，吸干，并向每一个孔中添加0.5毫升(对于96孔平板来说为0.1毫升)溶解在TE缓冲液(pH8.0)中的1％C12E8。将该样品溶解在洗涤剂中，获得校正的总EGFP荧光读数，以活细胞总数计。在Cytofluor II荧光平板读数仪(PerSeptive生物系统，Framingham，MA)上测定所述平板的荧光。在360纳米的激发波长和460纳米的发射波长下获得加入到活细胞中的钙黄绿素蓝的读数，其增量为80。这些读数被证实与原始铺板的细胞数量直至出现铺满时的数量呈线性关系。对于图10所示数据来说，使用从外部DNA中分离的脂质体沉淀(例12)。由于RPMI 1640中的钙离子和镁离子的含量明显低于血清中的含量，图11和12的数据是转染期间向无血清介质中添加钙离子和镁离子使其分别达到1.2和0.8mM之后获得的。
通过测定用1％Triton-100洗涤剂提取的24孔和96孔实验中的OVCAR-3细胞48小时培养物的平均蛋白浓度，估算每单位细胞蛋白转变为EGFP荧光的大致转化率。采用bicinchoninic酸测定(Pierce化学品公司，Rockford，IL)，以牛血清白蛋白为标准物。对图9来说，方框“a”表示每一个孔总平均本底校正荧光读数，为670单位。在另一个平板上，转染时(48小时)每一个孔的平均总细胞蛋白大约为88.4微克/孔，对于24孔平板实验来说，在0.5毫升的体积中每微克总细胞蛋白能产生7.6荧光单位。在图10中，方框“a”的数据(96孔实验)，表示每一个孔的平均本底校正EGFP荧光，大约为420单位，每一个孔的平均总细胞蛋白浓度为27微克，在0.1毫升的总体积中每微克总细胞蛋白能产生15.5荧光单位。在图11中(96孔实验)，方框“a”表示荧光读数为每微克细胞蛋白103荧光单位。
为了模拟腹膜内输送(图11和12中的数据)，通过首先将50微升来自长有肿瘤的SCID小鼠腹腔的浓缩无细胞灌洗液(实施例13)添加到按上述方法长有OVCAR-3细胞的96孔平板的每一个抽吸过的孔中进行转染。向每一个孔中添加50微升按例3所述方法制备的N-C12-DOPE/DOPC脂质体-DNA制剂，所得到的最终脂浓度为大约10mM，而最终囊封的DNA浓度为大约7-14微克/毫升(总DNA为67微克/毫升)。按上述方法进行培养。在这种情况下，通过添加浓缩母液，将所述腹膜灌洗液调整到与血清相当的钙离子和镁离子浓度(分别为1.2mM和0.8mM)。在向细胞中添加脂质体之前，同样通过添加所述浓缩母液将脂质体-DNA溶液调整到相同的钙离子和镁离子浓度。
图8和9中的数据表明，N-C12-DOPE/DOPC((70/30)脂质体囊封的精胺缩合质粒DNA在转染OVCAR-3细胞时具有活性。以上数据表明，其活性取决于精胺缩合剂的存在，并取决于质粒DNA在所述脂质体中的囊封。图10的数据同样表明，转染活性与脂类囊封的DNA相关，而不是与游离的外部DNA相关。图11和12的数据表明，在OVCAR-3肿瘤的腹膜内部位存在潜在干扰物质(例如血清蛋白)的情况下，也可以出现转染。例12-质粒DNA和脂颗粒的沉淀为了证实囊封的质粒DNA的转染活性，有必要从脂质体囊封的DNA中分离游离的质粒DNA。采用了以下制备方法。将通过沉淀除去了外部DNA的脂质体用于该实验中。该实验的结果示于图10中。对于沉淀实验来说，通过例3的方法用精胺制备N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体样品，所不同的是，在LSB中含有200mM蔗糖。同样添加10微克/毫升的端基标记的丽丝胺罗丹明B-磷脂酰乙醇胺(Rh-PE)作为脂类探针。将500微升所述制剂等分样以16000×g的速度离心3小时。除去上清液，然后将沉淀重新悬浮在不含钙离子/镁离子的HBSS中。以16000×g的速度离心该悬浮液3小时。将沉淀重新悬浮在500微升不含钙离子/镁离子的HBSS中。取每一种级份的50微升的等分试样进行Dnase I消化(例9)。在苯酚/氯仿和乙醇沉淀之后，通过PicoGreen分析(例10)测定每一份样品中的质粒DNA，并用于计算每一种级份中受到保护的质粒的百分比和总质粒DNA的百分比。
为了测定脂类的分布，将每一种级份的40微升等分样品溶解在0.2％的C12E8中，总体积为2毫升，并用560纳米的激发波长，用550±20纳米的带通滤片(Melles Griot，Irving，CA)监测荧光，发射波长为590纳米。作为对照，按上述方法制备空心N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体。在透析之后，将100微克EGFP质粒添加到500微升样品中。然后对所述样品进行离心，并对脂类和质粒DNA进行定量分析。
在上述条件下，大约80％的脂类会沉淀，而仅有全部DNA的大约14％沉淀。所述沉淀材料的转染活性示于图10中。转染活性明显与脂类沉淀有关，即与囊封DNA的脂质体相关。例13-灌洗液为了测定所述腹膜内蛋白对本文所披露的制剂的转染活性的影响，按以下方法制备灌洗液。在注射OVCAR-3细胞之后7周，从SCID小鼠体内获取无细胞的6毫升HBSS灌洗液，并用截留分子量为10000的旋转浓缩器将其浓缩到1毫升。蛋白回收率为大约60％。向存在于HBSS中的含有大约10毫克/毫升蛋白的该灌洗液中添加钙离子和镁离子，使其达到正常血清范围。将其添加到培养的OVCAR-3细胞中，并与等体积的、有相同钙离子和镁离子浓度的HBSS中的脂质体轻轻混合，使最终脂浓度为10mM。
上述转染实验的结果示于图11和12中。尽管已知血清蛋白对转染效率有抑制作用，而在使用本发明制备的制剂的条件下，却保存了明显的活性。例14-脂质体装载效率用预先缩合的DNA装载脂质体方法和本文所披露方法二者效率进行比较。按Ibanez等所述方法制备脂质体(《生物化学细胞生物学》，74633-643，1996)。以66微克/毫升的浓度将pEGFP质粒DNA溶解在TS缓冲液(10mM Tris，1mM氯化钠，pH7.0)中。将2毫升的该溶液与2毫升存在于TS缓冲液中的23mM精胺混合，使DNA预先缩合，得到一种非常浑浊的溶液。在4℃下保存过夜。次日，将总共9微摩尔的脂类溶解在1毫升乙醚中。向该溶液添加330微升的所述DNA和精胺溶液，同时涡旋搅拌。然后马上对该混合物进行3次超声处理，每次5秒(Laboratory Supply超声处理器#G112SOI)，然后用旋转蒸发器在37℃下除去乙醚，以便形成脂质体。每一种脂类组合物制备四个这样的样品。以200,000×g的速度离心30分钟使脂质体沉淀。除去上清液，添加500微升TS缓冲液，并重复离心。在总共进行3次循环之后，通过具有0.45微米孔的FF膜挤压脂质体。此时的脂质体用于测定囊封作用，或用不含钙离子或镁离子的HBSS对其进行透析。为了进行比较，同样按例3所述方法制备脂质体。按例9和10所述方法测定DNA的囊封。所有消化都进行6小时。通过HPLC测定脂类浓度。除胆甾醇之外的所有成分都使用WatersSherisorb二氧化硅柱(3微米)定量测定，所使用的移动相为乙腈∶甲醇∶硫酸，100∶3∶0.05，以紫外线吸收检测。胆甾醇是在Phenomenex LunaC18柱(5微米)上测定的，所使用的移动相为96；4的甲醇∶水，并通过弹性光散射检测器检测。测定的脂类组成在下面的表中给出。
表1DNA/脂类比例(微克DNA/微摩尔总脂量)*
*通过HPLC估算的脂类回收。通过提取和PicoGreen测定定量测定的DNA。**Ibanez，M.，Gariglio，P.，Chavez，Santiago，C.W.和Baeza，I.(1996)的“精胺缩合的DNA和锥形的脂类能改善脂质体对外源DNA的输送和表达”(《生物化学细胞生物学》，74633-643，1996)。
通过本文中所披露的方法在乳液中缩合DNA所制备的脂质体中DNA脂类比例高于用预先缩合的DNA制备的脂质体的比例。例15-测定脂质体的成层性按照例3所述方法制备由7030N-C12-DOPE/DOPC和囊封的质粒DNA组成的脂质体，并按例12的方法沉淀并洗涤。所述脂质体还含有占总脂量0.5摩尔％的NBD探针。在搅动的荧光计样品池中用磷酸盐缓冲溶液将脂质体稀释到80微摩尔总脂浓度。以450纳米的激发波长和530纳米的发射波长测定NBD荧光。将终浓度为20mM的连二亚硫酸钠注入装有脂质体的样品池中，以便还原所接触到的NBD探针。图13表示，大约50-55％的NBD信号消失了，这表明所述制剂中的脂质体主要是单层的，即大约有一半的脂类探针接触到了不可透过膜的还原剂连二亚硫酸钠。例16-通过肿瘤内注射SCID小鼠体内皮下人肿瘤的转染将人OVCAR-3细胞(2×106)皮下注射到SCID小鼠体内，并让其生长数周，直到平均直径达到大约4-7毫米。
按例3的方法制备含有精胺、pEGFP-C1质粒和70摩尔％N-C12-DOPE和30摩尔％的DOPC的脂质体。所述脂质体膜还含有0.5％摩尔的罗丹明PE作为荧光脂质体标记。
在将钙离子和镁离子的含量分别调整到1.2和0.8mM之后，将0.11毫升溶解在不含钙或镁的HBSS中的、总脂浓度为大约40mM的脂质体溶液直接注射到所述肿瘤中央。一天以后，将0.11毫升溶解在HBSS中的20mM丁酸注射在同一部位。24小时之后切除肿瘤并冷冻。然后在-20℃的低温恒温器上获得14-30微米厚的切片，并在冷冻状态下载于玻璃盖玻片上，并用盖玻片固定。将冷冻的肿瘤样品固定于O.C.T.包埋介质中。
通过对所述固定的冷冻组织的20微米低温切片进行共焦显微研究，评估pEGFP-C1质粒的转基因表达。用Olympus BX50/BioradMRC1000共焦显微镜，通过Argon/Krypton激光检查所述冷冻切片(对于EGFP来说激发波长为488纳米，发射波长为515纳米；对于罗丹明来说激发波长为568纳米，发射波长为585纳米)。以20倍的放大倍数将组织切片部位成像。不使用图象增强法，但在制备图象时采用了色标。图14表示来自用pEGFP-C1质粒处理过的肿瘤组织切片的一对荧光图象。下面一幅图表示由罗丹明标记的脂质体发出的红色荧光。很强的脂类信号(黄色)表明，该切片靠近脂质体注射部位。上面的图表示由于转基因表达而产生的绿色荧光。来自表达质粒的信号靠近所述脂类信号，但与它不同圆心，并且看来代表了所述质粒在肿瘤中的实际表达。图15表示来自带表达EGFP的不同肿瘤切片的另外一对荧光图象。图16中示出来自对照肿瘤组织的低温切片的一对荧光图象。上面的图片中可以看到该组织所固有的弱的、漫射绿色荧光，而在所有对照组织切片中都没有发现强荧光部位。在任何对照肿瘤切片中都没有红色荧光。例17-体内小鼠肌肉转染在小鼠腿肌肉中体内测试N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体囊封的pZeoSVLacZ质粒的转染活性。所述脂质体是按例3所述方法制备的。该实验中使用标准条件下圈养的雌性DBA小鼠。在第一天，将50微升含有pZeoSVLacZ质粒的脂质体直接注射到一条后腿的肌肉中。注射部位靠近这条腿的前股。相对的另一条腿要么注射50微升pEGFP-C1质粒的脂质体要么不做处理。在第二天，将50微升溶解在HBSS中的丁酸钠注射到脂质体处理过的腿中。在第三天宰杀小鼠，并将其腿肌肉切成四段前腿、后腿、前股、后股。将来自每一段的一半组织立即冷冻在液态丙烷中，而另一半在4％的多聚甲醛中固定，用30％的蔗糖低温保护，然后在丙烷中快速冷冻。
用Clontech发光β-gal试剂盒分析通过N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体输送的pZeoSVLacZ质粒的转基因表达。将未固定的肌肉解冻，切成切片，并按以下方法匀浆。向每1毫克湿组织中添加15毫升溶胞缓冲液(9.15毫升磷酸氢二钾，0.85毫升磷酸二氢钾，20微升Triton×100，10微升DTT)，并手工匀浆5分钟。然后在室温下培养20分钟。接着以14,000rpm的速度离心所述样品2分钟，使组织碎片沉淀。按Clontech介绍的方法测定上清液试样的β-半乳糖苷酶活性。60分钟之后，用Berthold平板发光计测定光线读数。对同一类型的不同肌肉切片的读数加以平均，结果示于图17中。在前股的肌肉切片中发现了β-半乳糖苷酶活性相对对照的明显提高。在后腿和后股组织中也观察到有稍微增加。
以上结果证实了在用N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体载体输送到小鼠肌肉中时，pZeoSVLacZ质粒的体内转染和转基因表达。例18-用脂质体缩合的DNA和阳离子脂质络合物进行转染的比较阳离子脂质络合物制剂的制备在临使用之前制备阳离子脂类和辅助脂类与质粒DNA的络合物。脂转染蛋白是从Gibu BRL(Grand Island，N.Y.)购买的。对于脂转染蛋白来说，按照生产商的说明(Invitrogen)在与DNA络合之前，将所述脂类本身与无血清介质一起培养大约45分钟。混合等体积的均存在于无血清RPMI 1640介质中的4微克/毫升DNA和40微克/毫升脂类和等体积的20微克/毫升和200微克/毫升脂类，并培养大约10-15分钟，然后添加到组织培养平板的孔中。在将要把脂质络合物添加到所述细胞中之前，通过添加浓缩母液将钙离子和镁离子分别调整到1.2mM和0.8mM的终浓度。用于脂转染的脂类/DNA比例根据比较若干比例取其最佳者。
大体按以前所披露的方法(Muldoon等，《生物技术》22，162-167，1997)制备DC-胆甾醇/DOPE(4/6)络合物，并在15分钟内使用。在所有实验中都使用优化的DNA/脂类比例，即4微克/毫升DNA与等体积的20微克/毫升脂类混合，或20微克/毫升DNA与等体积的100微克/毫升脂类混合。
所有其他的络合物都是用购自同一厂商(Invitrogen)的一套阳离子脂类或脂类混合物制备的。所述络合物是按照厂商的说明以1×浓度和所推荐的脂类/DNA比例制备的。
按例11所述方法进行转染测定。与阳离子脂络合物的比较将不含外部DNA的沉淀脂质体直接用于与相同DNA浓度的阳离子脂质络合物进行转染比较。以上结果列于有关脂质体处理的表2中(所有数据都是在丁酸钠，转基因表达的无毒激活剂中培养之后(Tang等，《人类基因治疗》，82117-2124，1997；Wheeler等，《生物化学生物物理学学报》，180，1996；Gruner等，《生物化学》242833-2842，1984)、并且在生理钙离子和镁离子浓度下测得；所有数据均就细胞内酯酶总活性规范化处理)。在表2中，将N-C12-DOPE/DOPC脂质体的细胞活性和转染定为1.0，即大于1.0的数字表示该测试系统中比任何参数之一高出的因子。N-C12-DOPE/DOPC(70∶30)脂质体的转染活性大体上处于相同条件下的阳离子脂质体络合物转染活性的范围内。某些脂质体络合物能产生明显较低而某些能产生明显较高的活性。含有3β[N-(二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆甾醇和二油酰磷脂酰乙醇胺(DC-chol/DOPE)的脂质络合物活性特别高。不过，与所有阳离子脂质络合物一样，它对用于该实验中的特定细胞的毒性明显高于脂质体的毒性，特别是在较高浓度下。这种现象可以在用脂质络合物处理之后有较低钙黄绿素蓝荧光观察到(表2的数据)，以及在处理之后显微镜观察到有圆形和破碎的细胞看出(数据未列出)。在某些情况下，阳离子脂质络合物的转染效率在较高浓度下相对脂质体而言实际上是降低了，这可能是由于其毒性所致。没有观察到脂质体囊封的DNA的毒性。有趣的是，用所述脂质体处理，通常会导致最终的钙黄绿素蓝荧光增加10％-30％，这可能是由于在无血清介质中培养时得到保护而没有受到影响。
在所述组织培养系统中，这种脂质体质粒DNA输送系统的较低毒性的重要性并没有充分显现，这是因为转染效率在用于上述实验中的较低DNA含量下就已经到达了饱和。不过，预计体内的情况与此有很大不同。体内大量的非专一性结合部位使得必须使用高水平的DNA和/或多次注射，以便在靶细胞中有效表达。在这种情况下，对阳离子脂质络合物的使用便有所限制，因为它具有毒性。
在无血清介质中将Ovcar-3细胞与洗涤过的脂质体沉淀一起培养(如图10所示)，或脂质络合物与等量的pEGFP-C1质粒DNA一起培养3小时。所有转染方法如例11所述，并且包括将钙离子和镁离子的浓度分别调整到1.2和0.8mM。
表2
a用下面的脂类制备阳离子脂类络合物#1-三((2-戊二酰基-4-氨基-N-双十八烷基胺)-4’-(2，5-二氨基戊酰基-(2”，5”-二氨基丙基乙基)胺三氟乙酸酯和2-氨基-(2’，2’-二甲基)乙基-甲基膦酸-O-十八烷基-(1’-十七烷基)三氟乙酸酯的1∶1混合物(Pfx-1)；#2-2，5-二氨基戊酰基-甘氨酰-甘氨酰-N-十八烷基-(1’-十七烷基)酰胺三氟乙酸酯(Pfx-2)；#3-2，5-二氨基戊酰基-(2’，3’-二-3-氨丙基)-2-氨乙酰基-2-氨乙酰基-N-十八烷基-(1’-十七烷基)酰胺三氟乙酸酯和DOPE的1∶1混合物；#4-2-氨基-(2’，2’-二甲基)乙基-甲基膦酸-O-十八烷基-(1’-十七烷基)三氟乙酸酯和2，5-二氨基戊酰基-2-氨基乙酰基-N-双十八烷基酰胺三氟化物的1∶1混合物(Pfx-4)；#5-2，5-二氨基戊酰基-(2，5-二-3-氨丙基)-戊二酰基-N-十八烷基-(1’-十七烷基)酰胺三氟乙酸酯和2，5-二氨基戊酰基-(2，2，5，5，-四-3-氨基丙基)-甘氨酰-N-双十八烷基胺三氟乙酸酯的1∶1混合物(Pfx-5)；#6-2，5-二氨基戊酰基-(2，5-二-3-氨丙基)-1，2-二氨乙基-O-十八烷基-(1’-十七烷基)氨基甲酰三氟化物和DOPE的1∶1混合物(Pfx-7)；#7-双(2，5-二氨基戊酰基-(2，5-二-3-氨丙基)-胱氨酰-N-双十八烷基胺)二硫化物三氟乙酸酯(Pfx-8)；#8-脂转染蛋白(lipofectin)；#9-DC-胆甾醇/DOPE 4/6。b数据是相对定为1.0的含N-酰基-PE的脂质体而言，即所列数字表示每一种脂质络合物相对其毒性或活性更高或更低的因子。用脂类#2作为标准比较来自一个以上系列的实验数据。c转染效率是通过图11所示的EGFP荧光测定的，并对总细胞酯酶活性进行校正，体现在钙黄绿素蓝的总荧光度(参见例11)。
本领域技术人员可以理解，本发明非常适于实现上述目的，并获得所提到的结果和优点，以及其固有优点。本文所披露的化合物、组合物、方法、过程和技术是所述优选实施方案的代表，或者用于作为典型例，而不是要限定本发明的范围。本领域技术人员所能想到的变化和其他用途也包括在所附权利要求书的构思之内。
权利要求
1.一种将生物活性络合物囊封于脂质体中的方法，该方法包括以下步骤(a)将至少一种两亲性脂类溶解在一种或多种有机溶剂中；(b)将含有生物活性剂的第一种水悬浮液与步骤(a)的含有脂类的有机溶液混合，形成含有所述生物活性剂和脂类的乳液；(c)向步骤(b)的乳液中添加含有络合剂的第二种含水悬浮液，(d)将步骤(c)的乳液保温培养，让所述络合剂与所述生物活性剂接触，从而在脂类稳定化水滴中形成所述生物活性剂和络合剂的络合物；其中，所述络合物的直径不大于所述水滴的直径，和(e)除去步骤(d)悬浮液中的有机溶剂，形成含有所述络合的生物活性剂和脂类的脂质体。
2.一种将生物活性络合物囊封于脂质体中的方法，该方法包括以下步骤(a)将至少一种两亲性脂类溶解在一种或多种有机溶剂中；(b)将含有络合剂的第一种水悬浮液与步骤(a)的含有脂类的有机溶液混合，形成含有所述络合剂和脂类的乳液；(c)向步骤(b)的乳液中添加含有生物活性剂的第二种含水悬浮液，(d)将步骤(c)的乳液保温培养，让所述络合剂与所述生物活性剂接触，从而在脂类稳定化水滴中形成所述生物活性剂和络合剂的络合物；其中，所述络合物的直径不大于所述水滴的直径，和(e)除去步骤(d)悬浮液中的有机溶剂，形成含有所述络合生物活性剂和脂类的脂质体。
3.如权利要求1的方法，其中，所述生物活性剂是核酸。
4.如权利要求1的方法，其中，所述核酸是DNA。
全文摘要
本发明提供了一种制备脂质体囊封核酸等生物活性剂的方法,包括在形成脂质体之前,将所述生物活性剂络合于反相胶束中;本发明还涉及以由此产生的脂质体和制剂将核酸输送到细胞中的方法。
文档编号A61K9/133GK1349402SQ00807027
公开日2002年5月15日 申请日期2000年3月1日 优先权日1999年3月2日
发明者P·梅尔斯, T·上官, D·卡布拉尔－利利, A·雅诺夫, P·阿尔 申请人:利普索姆公司