专利名称：脂质体包封的浆果赤霉素iii衍生物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂质体包封的浆果赤霉素III衍生物及其用途，属于制药工业技术领域。
目前，植物细胞培养规模上已从摇瓶走向反应器，并采用了分批补料、半连续、连续、二步法、双液相和灌注培养等培养技术。随着研究的发展，植物细胞大规模培养技术成为一种成熟的工业化生产方式具有巨大的潜力。
本发明所采用的培养方法为两步法，即细胞株先在生长培养基中培养一段时间以累积生物量，再转入生产培养基促使细胞大量合成紫杉醇。
紫杉醇(Paclitaxel)的结构及其基本生物合成途径 式1.1紫杉醇的分子结构紫杉醇(分子结构见式1.1)以其独特的抗癌作用，高效、低毒的作用机制被认为是近几十年中最好的天然抗癌药。早在1969年，就被首次从太平洋短叶红豆杉(Pacific yew tree，Taxus brevifolia)的树皮和木部的粗提物中发现了这种四环、二萜酰胺类化合物。Schiff等发现了紫杉醇的抗癌机制在于，它与细胞微管蛋白结合，促进微管的聚合，稳定微管结构，并阻止其解聚，使细胞有丝分裂停止在G2/M期，抑制了癌细胞的快速分裂。临床结果表明，紫杉醇对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌和非小细胞肺癌等有明显疗效。1992年底，美国食品与药品管理局(FDA)已批准紫杉醇作为卵巢癌治疗药物上市。
高等植物次生代谢物的生物合成途径很复杂，牵涉到众多代谢支路和酶。从生源途径来看，通常可以把植物次生代谢物分成三个主要大类，即萜类、芳香化合物和生物碱。紫杉烷类属于萜类化合物。一般认为，萜类化合物是从乙酰辅酶A出发，经过甲羟戊酸、异戊烯基焦磷酸后再分支生成各类化合物，其中有一个化合物GGPPi(香叶基香叶醇焦磷酸)，据说这是紫杉醇母核生物合成的起始物。紫杉醇的生物合成途径大致可分为三个主要的生物合成阶段1、紫杉烷碳环系统即母核的生物合成；2、C13位侧链的生物合成；3、母核与侧链的酯化反应，经修饰形成紫杉醇(见式1.2)。
紫杉烷碳环系统的生物合成大致可分为两步紫杉烷碳环骨架的合成和其骨架上的官能化反应。目前已知其第一步重要反应是自然界广泛存在的双萜烯前体GGPPi在紫杉二烯合成酶(Taxadiene synthase)催化环化为4(5)，11(12)-紫杉二烯(taxadiene)。随着紫杉烷碳环骨架的建立，环上复杂的官能化反应亦随之发生。这些反应包括羟基化、羟基上的酰基化、酮基化、苯基化以及环氧系统的生成等，最终形成浆果赤霉素III(BaccatinIII、巴卡亭III)，它是紫杉醇合成的直接前体。这些反应的前后顺序尚未搞清。只知C5位的羟基化反应由细胞色素P450羟化酶催化，将紫杉二烯(Taxadiene)转变为4(20)，11(12)紫杉二烯(Taxadiene)-5α-醇(ol)。紫杉醇侧链的生物合成和酯化反应α-苯丙氨酸经转氨酶催化变为β-苯丙氨酸，再发生C2位羟化反应形成苯基异丝氨酸。此产物与浆果赤霉素III C13位羟基酯化形成N-去苯甲酰紫杉醇，再与同样来自苯丙氨酸的苯甲酰辅酶A酰化形成紫杉醇。如果N-去苯甲酰紫杉醇与N-甲基巴豆酰反应就形成Cephalomanine，一个常见的较难与紫杉醇分离的紫杉烷。 式1.2被推测的紫杉醇生物合成途径紫杉醇生物合成的代谢调控依据紫杉醇生物合成路径的理论，采用加入代谢前体分子、关键酶激活剂和旁路酶抑制剂，可以提高植物细胞培养合成紫杉醇的产量。
目前已知的紫杉醇合成关键酶有紫杉二烯合成酶Taxadiene synthase，此酶活性依赖Mg2+，但一般培养基中的Mg2+浓度远超过它需要的饱和浓度(1mM)，最适pH中性偏碱。由于此酶的惰性，因此加入代谢前体和各种诱导子，对紫杉醇的合成量的提高并不明显。另外，加入一些有机酸和芳香氨基酸，如乙酸、柠檬酸和苯丙氨酸，提供紫杉醇侧链侧基的前体，可明显提高紫杉醇的合成量。而加入C13侧链合成路径的酶激活剂茉莉酮酸甲酯可较专一地使浆果赤霉素III(BaccatinIII)转化为紫杉醇，抑制Cephalomanine的形成。
另外，还有许多诱导子如多糖类的壳聚糖、葡聚糖；重金属盐类的银、汞、镧、铈等都对细胞培养物中的紫杉醇含量的提高有作用。
植物细胞培养技术在生产紫杉醇上的应用在研究紫杉醇的过程中，科学家们分离提纯了一些紫杉醇的类似物、紫杉烷和代谢中间产物，已发现一些紫杉烷类具有和紫杉醇相似的治疗作用。而一些紫杉醇类似物和代谢中间产物可通过一些修饰和半合成转化为紫杉醇，但涉及多步手性合成，使成本居高不下。
目前用植物细胞培养技术生产紫杉醇类还存在一些问题(1)缺乏高产细胞株；(2)细胞株生产不稳定，大多细胞在经多次继代培养后产物含量下降甚至消失；(3)产物含量低，达不到商业化生产要求；(4)对目的产物的代谢途径还不是很清楚，无法采取相应的调控措施来大量积累产物；(5)由于植物细胞自有的一些特点，放大困难，大多数情况细胞从摇瓶转到反应器后，产物产量明显下降。
本发明详细考察了不含对人有害的合成植物激素的红豆杉细胞培养基，提供了一种通过植物细胞培养生产紫杉醇的工艺；特别是本发明提供了一种可以充分利用从天然植物提取紫杉醇后的副产物浆果赤霉素III(BaccatinIII)和/或10-脱乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)作为原料，利用植物细胞培养使之生物转化为紫杉醇的工艺。
红豆杉细胞生长较慢，其倍增时间远大于细菌等微生物；紫杉醇合成代谢途径较长且复杂，其水中溶解度甚低；红豆杉细胞种子遗传上也不稳定等等问题都限制了细胞培养在紫杉醇工业化生产上的应用。不仅国内植物细胞培养用于工业生产的例子没有，国外也只有屈指可数的几个产品，至于用红豆杉细胞培养生产紫杉醇更是未见公开报道。近年来紫杉醇类化学半合成的研究和灌木型红豆杉(T.media)的大规模快速培育进行得如火如荼，导致紫杉醇原料价格一降再降，纯以红豆杉细胞培养从碳源全合成紫杉醇已不具有竞争优势，为此本发明把细胞培养和化学半合成的优点结合起来，克服前者产率低和后者手性合成副产物分离困难的缺点。
本发明采用的中国红豆杉(T.chinesis)细胞是先从其野生植株(采自湖北房县)幼茎外植体诱导愈伤组织，再移入液体诱导培养基进行扩增培养若干代后，根据不同植株来源决定细胞株编号，共有四个HL、NA、YS、NS。所有细胞冷冻保藏作为种子细胞库，使用时取一瓶细胞复苏后移至半固体培养基上继代培养，继代二次后再用液体培养基(不加植物激素)继代三次后即可使用。细胞继代培养不超过十次。本发明采用的细胞株编号为HL-1，该细胞株样品已经提交给位于北京中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心予以保藏。保藏日期2002年1月24日，编号CGMCCNo.0701，分类命名Taxus Chinese愈伤组织细胞株。
向培养物中加入诱导物和前体分子促进紫杉醇合成早有报道。根据诱导子对红豆杉细胞的作用和其来源不同可分为三类一、是植物激素类，有乙烯、茉莉酮酸甲酯、脱落酸等；二、是大分子外源生物组分(主要是多糖)，如真菌提取物、壳聚糖、葡聚糖等；三、是一些重金属离子，如汞、镧、铈等。
前体分子主要是有机酸和芳香氨基酸以及紫杉醇生物合成中间体，它们的作用效果各不相同，有的对细胞有毒害作用，有的同时促进细胞生长。由于最终目的是以细胞培养生产作为药物的紫杉醇，因此凡是可能对人体有害的诱导子就不宜采用，同时避免增加后期纯化工作量和检验项目。
本发明采用Murashige-Skoog(MS)培养基，另添加0.5mg/l 6-苄基腺嘌呤(6-BA)，0.2mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5mg/l萘乙酸(NAA)，0.5g/l水解酪蛋白和30g/l(液体培养基)或25g/l(半固体培养基)蔗糖。培养基在灭菌前pH调节至5.8，半固体培养基需加1.5％的琼脂。
红豆杉细胞继代培养14天后，无菌过滤所得培养液即为红豆杉细胞条件培养基。培养条件摇瓶培养，将红豆杉细胞在25℃、120rpm的摇床上进行暗培养。250ml三角瓶中培养基装液量为100ml，接种量为100g鲜细胞/升培养基(10％指细胞鲜重与培养基体积比)，继代周期为14天，培养周期为21天。半固体培养装液量为100ml，接种量为5％，在25℃的培养箱中进行暗培养，继代周期为21天。分析方法细胞量的测定细胞悬浮液用布氏漏斗减压过滤，然后用蒸馏水淋洗细胞2-3次，称量得细胞湿重；将称量后的细胞置于50℃烘箱，烘干至恒重，称量得细胞干重。培养液用于测定培养基中的主要营养成分如糖、氮和磷及胞外紫杉醇等。主要培养基成份的测定总糖和果糖采用浓硫酸-苯酚法和钼酸铵比色法测定；硝酸根、铵根离子和磷酸根的定量分别采用水杨酸-浓硫酸法、苯酚-次氯酸盐反应和抗坏血酸还原法测定。紫杉醇(Paclitaxel)、浆果赤霉素III(Baccatin III)和Cephalomanine的测定分离和提取称取0.1g干细胞，磨成细粉，加入2ml甲醇超声提取，离心后取上清液，共三次，合并上清液挥干，加入二氯甲烷和蒸馏水各2ml，充分震荡混合后静置数分钟，离心取下层二氯甲烷相，挥干，加入1ml HPLC级甲醇溶解，用于高效液相色谱(HPLC)分析。取培养基滤液5ml也用乙酸乙酯抽提三次，有机相经洗涤干燥后减压浓缩至于，所得油状物也用1ml HPLC级甲醇溶解转移到磨口试管保存，供HPLC分析，两者换算相加即总的紫杉醇含量。
HPLC分析采用配有Waters 486紫外检测仪的Waters 510(英国)型高效液相色谱仪，检测波长为227nm。采用美国Whatman公司生产的五氟苯硅烷柱(PFP)。流动相为乙腈∶水＝42∶58，流速为1ml/min。每次进样量为20μl，进样前样品用10000rpm离心去除固体杂质。
浆果赤霉素III(Baccatin III)和/或10-脱乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)对紫杉醇合成的影响1988年法国Denis等用从法国浆果红豆杉(T.baccta)的叶中得到的10-脱乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)作为母核，进行半合成，得到紫杉醇。
根据对紫杉醇生物合成途径的研究，浆果赤霉素III是紫杉醇的前体，10-DAB可通过乙酰基转移酶转化为浆果赤霉素III，而此二者在红豆杉植物提取紫杉醇后的紫杉烷杂质中占较大比例，因此用红豆杉细胞把他们转化为紫杉醇，既可增加紫杉醇产量，又提高了稀少的红豆杉资源的利用率。
脂质体包封的浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)(见通式I)的制备 通式I R＝H 10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)R＝Ac 浆果赤霉素III(BaccatinIII)将浆果赤霉素III溶于丙酮，心磷脂、卵磷脂和胆酸钠溶于乙醇，以摩尔比为1∶1∶5∶5混合。混合溶液在真空薄膜浓缩器内40℃减压蒸发至干，形成磷脂和药物的薄膜。然后加入20mM Tris-HCl缓冲液(PH7.5，内含0.15MNaCl和0.01M NaNO3)溶解薄膜，溶液用超声波处理30分钟，然后对溶液透析除去有机溶剂。将透析液用葡聚糖凝胶层析。除去未被包封的浆果赤霉素III，脂质体部分超滤浓缩至含浆果赤霉素III 1mg/ml，低温保存。
包封率采用超离心和HPLC方法测定。浆果赤霉素III脂质体溶液经超离心取沉淀，用乙醇溶解，用HPLC测定浆果赤霉素III含量。HPLC测定条件见表1。
包封率(％)＝C脂/C总*100％式中C总＝浆果赤霉素III加入总量C脂＝脂质体中浆果赤霉素III的量10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体的制备方法同上。表1浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)和紫杉醇的HPLC定量分析条件
以中国红豆杉细胞株HL-1培养生产紫杉醇时，先在MS培养基中培养中国红豆杉细胞株HL-1约14天；细胞培养物以15％接种于100ml下表2所列培养基的250ml三角瓶中，并于24℃培养14天。
将浆果赤霉素III和/或10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)分别以普通形式和脂质体形式(平均直径124.5nm，多分散性指数0.45)加入到培养了14天的培养物中，投料量为30mg/l(终浓度)，对照组加入等体积的溶剂和空白脂质体，观察7天后紫杉醇含量细胞生长量的变化，见附
图1浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III及其脂质体对紫杉醇合成和细胞生长的影响。
结果表明与对照相比，浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III单体对细胞生长影响不大，对紫杉醇合成的促进作用也一般，但经脂质体包封后可明显促进紫杉醇合成。这是因为脂质体包封的原料克服了溶解度限制增加了投料量(最高可达100mg/l)并更易进入细胞，经相关酶催化转化为紫杉醇。
浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III脂质体投料量为10-100mg/l，40-70mg/l较好。
可以在9-18天时加入浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III脂质体，第15天时加入较好。
在15天和21天测量细胞干重和紫杉醇产量。表2红豆杉属植物细胞培养基
按照本发明提供的工艺过程，可以充分利用从天然植物提取紫杉醇后的副产物浆果赤霉素III(Baccatin III)和/或10-脱乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)作为原料，制备得到浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III的脂质体。按本发明工艺制得的脂质体，可以用于植物细胞培养生产紫杉醇。不仅提高了植物细胞培养生产紫杉醇的产量，并降低成本，对保护、节约有限的天然植物资源也有重要意义。
包封率采用超离心和HPLC方法测定。浆果赤霉素III脂质体溶液经超离心取沉淀，用乙醇溶解，用HPLC测定浆果赤霉素III含量。HPLC测定条件见表1。包封率(％)＝C脂/C总*100％式中C总＝浆果赤霉素III加入总量C脂＝脂质体中浆果赤霉素III的量10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体的制备方法同上。
测量细胞干重方法如下首先将一5.5cm滤纸(No.541，Whatman Co.U.S.A)置于一装配抽滤瓶的布氏漏斗中，在其上喷少量双蒸水并真空抽滤使滤纸完全贴于漏斗滤孔上，然后将5ml待测植物细胞培养液倾倒于滤纸上，并减压抽滤除水，并用少量双蒸水洗涤一、二次。将抽滤后的滤饼连用滤纸置于一铝箔盘中，并在烘箱中50℃干燥24小时，取出铝箔盘冷却至室温，称出总重再减区铝箔盘和滤纸重量的预先测量值，所得数字再乘以200即为每升培养液中的细胞干重。表3浆果赤霉素III脂质体对红豆杉属植物细胞生长和紫杉醇产量的影响
实施例3、脂质体包封的10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)对植物细胞生长及紫杉醇产量水平的影响在含0.5g/l水解酪蛋白的MS培养基中培养中国红豆杉HL-1 14天。将细胞培养物以15％接种于100ml表2所列培养基的250ml三角瓶中，并于24℃培养14天。在15天时分别加入10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)、10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体，投料量为30mg/l(终浓度)，对照组加入等体积乙醇和空白脂质体。在15天和21天测量细胞干重和紫杉醇产量，结果见表4。表4 10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体对细胞生长和紫杉醇产量的影响
实施例4、不同浓度的浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体对紫杉醇产量水平的影响将浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体分别以10、30、50、70、100mg/l的投料量进行实验，细胞株为HL-1，实验方法见实施例2。结果见表5表5不同浓度的浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体对紫杉醇产量的影响
注转化率是指所得紫杉醇产量减去对照的紫杉醇产量再除以投料量得出的重量收率。
由此可见，不同浓度的浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体对细胞培养物的紫杉醇产量都有一定的促进作用，但以50mg/l浓度的浆果赤霉素III脂质体的转化率最高。
由此看出，在细胞培养的第15天投下浆果赤霉素III脂质体，转化率最高，而在第12天投下10-去乙酰浆果赤霉素III(10-DAB)脂质体，转化率也较高，但低于浆果赤霉素III脂质体的转化率。
权利要求
1.一种以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体，其特征是这里的R可以是氢或乙酰基。
2.按权利要求1所述的以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体，其特征是脂质体的平均直径124.5nm，多分散性指数0.45。
3.按权利要求1、2所述的以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体的制备方法，包括将以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物溶于丙酮，心磷脂、卵磷脂和胆酸钠溶于乙醇，以摩尔比为1∶1∶5∶5混合；混合溶液真空减压蒸发至干，形成磷脂和药物的薄膜；用Tris-HCl缓冲液(PH7.5，内含0.15M NaCl和0.01M NaNO3)溶解薄膜，透析除去溶液中的有机溶剂；将透析液用葡聚糖凝胶层析，除去未被包封的以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物，即得以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体。
4.按权利要求1、2所述的以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体在植物细胞培养生产紫杉醇中的应用方法，包括在MS培养基中培养中国红豆杉细胞株HL-114天；细胞培养物24℃再培养14天；在9-18天时加入以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体，投料量为10-100mg/l。
5.按权利要求4所述的以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体在植物细胞培养生产紫杉醇中的应用方法，其特征在于在MS培养基中培养中国红豆杉细胞株HL-114天后，细胞培养物以15％接种于如下成分的培养基中MgSO4.7H2O 370(mg/l)；KH2PO4170(mg/l)；KNO31900(mg/l)；NH4NO31650(mg/l)；CaCl2.2H2O 440(mg/l)；H3BO36.2(mg/l)；MnSO4.H2O 15.6(mg/l)；ZnSO4.7H2O 8.6(mg/l)；NaMoO4.2H2O 0.25(mg/l)；CuSO4.5H2O 0.025(mg/l)；CoCL2.6H2O 0.025(mg/l)；KI0.83(mg/l)；Na2EDTA 37.3(mg/l)；FeSO4.7H2O 27.8(mg/l)；肌醇 100(mg/l)；盐酸硫胺 .05(mg/l)；盐酸吡哆醇0.5(mg/l)；烟酸 0.05(mg/l)；蔗糖 30000(mg/l)；水解酪蛋白500(mg/l)；萘乙酸1.0(mg/l)；6-苄基腺嘌呤 0.5(mg/l)24℃培养14天；在15天时加入以通式I表示的浆果赤霉素III衍生物脂质体，投料量为40-70mg/l。
全文摘要
利用从天然植物提取紫杉醇后的副产物浆果赤霉素III(Baccatin III)和/或10－脱乙酰浆果赤霉素III(10－DAB)作为原料,制备得到浆果赤霉素III、10－去乙酰浆果赤霉素III的脂质体。按本发明工艺制得的脂质体,可以用于植物细胞培养生产紫杉醇。不仅提高了植物细胞培养生产紫杉醇的产量,并降低成本,对保护、节约有限的天然植物资源也有重要意义。
文档编号A61K9/127GK1369556SQ0211071
公开日2002年9月18日 申请日期2002年1月31日 优先权日2002年1月31日
发明者杨凌风, 陈旭峰 申请人:上海华联制药有限公司