专利名称：具有蛋白代谢功能的体内型人工肾及其构建方法
技术领域：
本发明涉及具有蛋白代谢功能的体内型人工肾，其包含作为组成部分的海绵片，其中注射进入含促进血管生成生长因子的水凝胶，以及表面表达有megalin的细胞，以及其构建的方法。
背景技术：
在日本，由于肾移植供体较少，终末期肾机能不全(terminal renalinsufficiency)治疗主要采用血液透析。但是，血液透析，并不能完全补偿原来的肾功能，因为各种引起的并发症损害了生活质量(QOL)以及患者的重要愈后。
血液透析的不足在于其不能补偿近端曲小管细胞(proximal tubularcells)具有的肾小管滤过的蛋白的代谢功能。因此，原先由这些细胞代谢的低分子量蛋白积累在患者体内，成为尿毒症毒蛋白(uremic toxinprotein)，引起各种疾病。典型例子是透析相关的淀粉样变性病，其是由于β2微球蛋白(β2-m)的积累，其引起骨关节病和器官衰竭。而且，在血液透析患者中，AGE，由于glycation的修饰蛋白也会积累，导致动脉硬化和/或器官损伤。近些年来，血液透析膜和血液过滤技术得到不断改进，β2-m吸收柱已经投入实际使用。但是，这些都具有局限性，因此需要能持续和有效地补偿代谢蛋白的人工肾。
为满足需要，开发了利用细胞的系统以补偿近端。例如，Humes，HDet al.(Nature Biotech.17，451-453(1999))报道人工肾，其含有结合中空纤维组件的血液滤器，具有永生近端曲小管上皮细胞，引起粘接到中空纤维内表面，其中滤过的血液循环通过含有培养的近端曲小管细胞的内腔，以及Saito，Akira et al.(44thMeeting of the JapaneseSociety for Dialysis Therapy(1999))报道了类似的人工肾(小管)，其中使用了远端曲小管细胞(distal tubular cell)。但是，这些都是体外装置，因此无法克服间断血液治疗的缺点。
发明内容
本发明提供了体内人工肾，其具有代谢蛋白的功能，以及其方法，以解决上述问题。本发明还提供了具有代谢蛋白的功能的人工肾，其具有利用了整合低分子量蛋白，激素等进入细胞的megalin的功能。
因此，本发明涉及具有代谢蛋白的功能的体内人工肾，其包含，作为组成部分的，具有含注射进入的促血管生成生长因子的水凝胶(hydrogel)的海绵片(sponge sheet)，以及具有megalin的细胞，其是内吞作用受体(endocytosisreceptor)，在近端曲小管细胞代谢蛋白的功能中具有关键作用，megalin表达在细胞表面。
本发明还涉及具有代谢蛋白的功能的体内人工肾的构建方法，其包含使用其中注射了含有促血管生成生长因子的水凝胶，以及表面表达有megalin的细胞的海绵片。
此外，本发明还涉及构建体内人工肾的方法，其包含将含有促血管生成生长因子的水凝胶注射进入海绵片的步骤，皮下移植海绵片的步骤，以及将表面表达有megalin的细胞注射到移植的海绵片中。
此外，本发明还涉及上述的人工肾和其构建方法，其中促血管生成生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；bFGF是基因工程技术生产的人bFGF；所述水凝胶是明胶凝胶(gelatin gel)；所述明胶凝胶主要由具有4.5-5.5的等电点的明胶种类(species)组成；海绵片由胶原质(collagen)制备；表面表达有megalin的细胞是人近端曲小管上皮细胞(humanproximal tubular epithelial cell)和/或通过基因传递(gene transfer)方式高水平表达megalin人近端曲小管上皮细胞；和/或megalin的表达是基因操纵的结果。
发明详述本发明具有代谢蛋白的功能的体内人工肾包含，作为组成部分的，具有含注射进入的促血管生成生长因子的水凝胶以及表面表达有megalin的细胞的海绵片。
作为本发明所用的促血管生成生长因子，还可以有，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGF-α)，血管上皮生长因子(VEGF)，血小板来源生长因子-BB(PDGF-BB)，和肝细胞生长因子(HGF)。
本发明中，上述促血管生成生长因子可包含一种或多种的结合。此外，也可结合另一生物活性因子。
为具有更强大的生长活性，优选bFGF，PDGF-BB。此外，bFGF作为被广泛认知的促血管生成生长因子，是最优选的。
本发明中所用bFGF包括提取自器官或组织，如脑下垂体，脑，肾，肾上腺，胎盘，骨基质，软骨，上皮细胞，成纤维细胞的种类，以及采用基因重组，修饰等基因工程技术产生的种类，以及其它具有成纤维细胞生长因子作用的种类。其中，基因工程技术产生的人bFGF种类由于质量和供应稳定性特别优选。上述的修饰包括其它，得自通过提取或添加一或多个氨基酸残基到bFGF的氨基酸序列中，此序列中一或多个氨基酸残基的取代，或此序列中一或多个氨基酸残基的缺失而得的基因工程技术的bFGF种类的衍生。本发明中，可以单独或者混合使用这些bFGF种类。
本发明方法中的水凝胶的其它原料包括，多糖如纤维素，葡聚糖，琼脂糖，pullulan，淀粉，透明质酸，褐藻酸，几丁质，脱乙酰壳多糖，以及多糖衍生物如羟乙基纤维素；聚氨基酸(polyamino acid)如聚天冬氨酸，聚谷氨酸和聚赖氨酸；多肽如明胶，纤维蛋白，谷蛋白(gluten)；具有亲水性侧链基团的合成聚合物，如聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，聚乙烯吡咯烷酮，聚(2-羟乙基丙烯酸脂)，聚乙烯甲基醚(polyvinyl methyl ether)，聚(N-乙烯乙酰胺)(poly(N-vinylacetamide))，聚丙烯酸，聚(异丁烯-顺丁烯二酸)(poly(isobutylene-maleic acid))，聚(2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸)，聚丙烯氧丙烷磺酸，聚乙烯磺酸，聚(异丁烯酰基氧乙基-季胺盐酸盐)，聚乙烯吡啶，聚(N，N-二甲基-N-(2-异丁烯酰基氧乙基)-N-(3-硫代丙基)内胺盐)(poly(N，N-dimethyl-N-(2-methacryloyloxyethyl)-N-(3-sulfopropyl)ammonium internal salt)，以及主链本身是亲水性的合成聚合物，如聚乙二醇，二氧戊环(polydioxolane)和聚乙烯亚胺。
本发明中，这些材料可以单独使用，或适当地多种组合使用，或者经过另一化合物的进一步地修饰后使用。
在上述的水凝胶的原料中，多糖如纤维素，透明质酸，褐藻酸，几丁质，脱乙酰壳多糖；聚氨基酸如聚天冬氨酸，聚谷氨酸和聚赖氨酸；多肽如明胶，纤维蛋白，谷蛋白的其它这些原料是可生物吸收的，因此是优选的。具体地，从易加工性能，所包含生长因子的生物活性的保持，以及体内的分解速度(生长因子的逐步释放)考虑优选明胶。
通过使得自活生物体的胶原质采用例如酸或碱进行适当地预处理，然后用温水热提取，可以得到明胶。本发明中，但是，可以使用通常可得的任何级别的明胶，没有特别的限制。因此，例如可以有碱处理的具有4.5-5.5的等电点的明胶，酸处理的具有8-9的等电点的明胶。在bFGF用作促血管生长因子的情况下，考虑bFGF截留优选具有4.5-5.5的等电点的碱处理明胶，这是因为bFGF等电点为约9，在中性水溶液中带正电。此外，在来源或物理性质，如溶解度，分子量，等电点方面不同的不但单一种类的明胶，而且二或多种类都可混合使用。此外，明胶可以包含添加剂；例如可以加入阴离子化合物以使bFGF逐渐释放，如Japanese Kokai Publication Hei-08-325160所公开的。当bFGF用作促血管生长因子时，可以使用除明胶外的其它水凝胶，如上所述，从bFGF截留考虑，优选的水凝胶具有低等电点。
促血管生长效果的持续可能因生物降解度以及所用水凝胶的水含量不同而不同。
从促血管生成生长因子逐渐释放的角度考虑，水凝胶的水含量优选在水中溶胀后不低于80％，更优选85％到99％，更优选90％到98％。
水凝胶的水含量可如下计算。
当水凝胶是颗粒形式时，水含量计算为w[％]＝100×(VW-VD)/VW
当VD是冻干和叩打(tapping)(将水凝胶放置于量筒中并给量筒以物理刺激使水凝胶堆积紧密)后水凝胶体积，VW是叩打后37℃下水中溶胀24小时后水凝胶体积。测量VD和VW例如，从高度5厘米重复叩打量筒直至读取体积不再发生变化。对于VW，上述叩打的方法重复10次，在体积保持30分钟后无变化时，读取刻度上的体积，这是因为水凝胶在水中稳定需要一些时间。
当水凝胶不是颗粒时，水含量如下计算w[％]＝100×(WW-WD)/WW当WW是水凝胶在37℃下水中溶胀(swelling)24小时，然后除去水凝胶粘连的那部分水，通过吸滤，离心等在水凝胶微粒间出现的那部分水后的重量(湿重)，WD是随后对水凝胶进行干燥直到重量不再改变的重量(干重)。
作为测定湿重的具体方法，此方法可例如包括将水凝胶放置在玻璃滤器上，采用吸气器(aspirator)吸入水凝胶，绘制重量减少曲线表示吸入时间和重量之间的关系，当曲线斜率改变较小时测定吸入时间(suctiontime)间隔后的重量。干燥方法没有限制，只要可以达到恒重，但是采用不低于105℃常压下干燥，不需要任何特别的装置，可以简单容易地进行。如果在此温度下会引发分解或其它现象，可以在减压低温下进行干燥，如冻干。
当上述原料溶于水时，本发明水凝胶是使上述原料通过交联而不溶得到的。根据材料的来源，性质和/或类似方法，交联的方法可以是热处理，紫外或gamma射线照射，或与固化剂反应。
固化剂没有特别的限制，但当水凝胶材料是明胶时，其包含含有多价金属离子如铝或铁离子的盐的无机化合物；醛如戊二醛和福尔马林，碳二酰亚胺(carbodiimide)如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐和1-环己基-3-(2-morpholinoethyl)碳二酰亚胺甲基-p-甲苯磺酸盐，环氧树脂化合物如表氯醇和丁二醇二缩水甘油基醚，异氰酸盐，典型的如环己烷二异氰酸盐，酸酐，和其它有机化合物。
本发明所用水凝胶的形式例如可以是柱状，片状，盘状，球形，颗粒或无定形的。考虑容易注射进入海棉片，优选球形，颗粒或无定形的形式。
水凝胶的大小，其平均微粒大小优选10到200μm，更优选20到150μm。
本发明所用海绵片是用于固定化含促血管生成生长因子水凝胶，以及容纳表面表达有megalin的细胞的多孔片。
海绵片的原料包括上述的水凝胶原料以及聚酯如聚乙醇酸，聚乳酸，聚己内酯，polydioxanone，聚羟基乙酸，聚羟基戊酸，聚环丙烷碳酸(polytrimethylene carbonate)，聚(α-氰基丙烯酸酯)以及类似的生物可吸收材料，以及聚氨脂。本发明中，这些原料可以单独或几种混合使用，也可用其它化合物修饰后使用。
上述海绵片材料中，考虑本领域应用中的生物相容性，优选胶原质，聚乙醇酸，聚乳酸等。具体地，由于活细胞粘连较好特别优选胶原质海绵片。
本发明所用海绵片具有多孔结构。考虑新血管的穿透，以及对注射的细胞的氧气和营养物的供应，其优选具有完全开放的孔结构，其中孔之间是相互连通的。
其平均孔大小优选是60到4000μm，更优选70到150μm。
megalin是内吞作用受体，其在近端曲小管细胞的蛋白代谢中起到关键作用，其cDNA克隆在大鼠上成功制得，Saito等，其为发明人，分析了全长初级结构(Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 91，pp9725-9729(1994))。此后，HjalmG等克隆了人megalin/gp330(Eur.J.Biochem.239，pp.132-137(1996))。人megalin估计包含4655aa(分子量519636)。已知，其由N末端(25aa)，胞外区(4398aa)，跨膜区(23aa)和C末端胞外区(209aa)组成。所述胞外区具有三种类型的富半胱氨酸(cystein)区，megalin基因属于LDL受体基因家族。
Megalin是多功能内吞作用受体，据报道其结合的酶和酶抑制剂有PAI-1，PAI-1尿激酶，PAI-1-tPA，prourokinase，脂蛋白脂肪酶和抑肽酶，这样的结合维生素蛋白如维生素D结合蛋白，维生素A结合蛋白，阿朴脂蛋白(apolipoprotein)如阿朴脂蛋白B和阿朴脂蛋白E，碱性多肽如氨基葡糖苷和多粘菌素B，低分子量蛋白和激素如甲状旁腺激素，胰岛素，β2-m，内皮生长因子，催乳激素，溶菌酶和细胞色素C。
已经有，在人体，如megalin不仅表达在近端曲小管上皮细胞而且表达在甲状旁腺细胞表面，胎盘绒毛间隙(placental intervillous spaces)，epididymal上皮细胞，II型肺泡(alveolar)上皮细胞，乳腺上皮细胞，甲状腺小泡细胞，眼睛睫毛体上皮细胞等。因此这些细胞可以成为megalin表达细胞。在上述细胞中，最优选来自患者自己残余肾的近端曲小管上皮细胞作为megalin表达细胞。
由于megalin表达在细胞表面，其可用于本发明中，除上述来自患者或其它人的megalin表达细胞外，还有能通过基因传递作为衍生自megalin表达细胞来自患者或其它人高水平表达megalin的细胞，作为衍生自来自患者或其它人的非megalin表达细胞通过基因传递能表达megalin的细胞，此外，衍生自胚细胞，干细胞或通过诱导分化的细胞。本发明所用的基因传递方法，可以是本领域已知的物理，化学或生物方法。分化诱导方法，例如有包括添加分化诱导物质的方法，包含改变各种环境因素如温度，压力，pH或/和渗透压的方法。
在上述表面表达有megalin的细胞中，考虑移植细胞的排异性优选来自患者自己的细胞。此外，优选人近端曲小管上皮细胞和/或由于基因传递高水平表达megalin的人近端曲小管上皮细胞。
对于非megalin表达细胞，考虑技术技能的易行性优选衍生自患者自体的高吞噬性巨噬细胞样细胞。
优选由基因操纵引起megalin表达。
现在描述构建本发明的具有蛋白代谢功能的体内人工肾的方法。本发明的体内人工肾采用海绵片构建，其中注射了包含促血管生成生长因子的水凝胶，以及表面表达有megalin的细胞。优选地，构建人工肾的方法包含注射包含促血管生成生长因子的水凝胶进入海绵片的步骤，皮下移植海绵片的步骤，注射表面表达有megalin的细胞进入移植的海绵片的步骤。
水凝胶可通过本领域已知的方法制备，没有特别的限制。例如，利用通过氢键，离子键，配位键等产生分子间聚集的物理现象，采用交联试剂引起化学交联的方法，通过光或照射引发的化学交联。水凝胶模化(molding)(成型)方法没有特别限制，例如乳状液方法，模化方法，喷雾干燥方法可用于制备颗粒水凝胶。
为使促血管生成生长因子包含在水凝胶中，只要促血管生成生长因子生物活性不受到大的损害，所述方法没有特别限制。例如，包含制备后干燥水凝胶以及采用含生长因子的溶液将其注入的方法，或包含将没有干燥水凝胶制备的具有生长因子溶液的水凝胶的方法，此外包含引起生长因子存在于用于制备水凝胶的起始溶液的方法。
例如，含促血管生成生长因子的水凝胶可以通过注射器注射进入海绵片。
为固定化含促血管生成生长因子的水凝胶以及保持表面表达有megalin的细胞，将海绵片皮下移植进入活体或可以利用的其它部位。可在注射进入含促血管生成生长因子的海绵片后进行海绵片的移植，或者可在水凝胶注射进入后移植。
本发明的体内人工肾可通过将表面表达有megalin的细胞注射进入海绵片来构建，所述海绵片注射了含促血管生成生长因子的凝胶，移植进入活体。
表面表达有megalin的细胞可采用，例如注射器或微毛细管注射进入海绵片。
注射表面表达有megalin的细胞的计时没有特别限制，为了保证表面表达有megalin的细胞的附着和增殖，需要在必须的移植具有含促血管生成生长因子的水凝胶注射其中的海绵片后血管生成天数间隔后移植细胞，或者在先注射含生长因子的水凝胶进入海绵片后。必须的血管生成天数取决于所用的促血管生成生长因子以及水凝胶性质。当使用含bFGF碱处理明胶凝胶时，例如，天数是3到8天。
图1是有关在实施例和对比例中125I标记的β2-m在几个组织中的摄取。图中，下列符号为transpl.实施例；cont.对比例；T移植的细胞肿块(phyma)；L肝；P肺；H心脏；S骨骼肌。
图2是125I标记的β2-m整合进入移植细胞的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图中，泳道分别表示下列实施例泳道1用于腹膜内给药的125I标记的β2-m；泳道2实验后恢复的移植细胞肿块匀浆；泳道3实验后从移植细胞小鼠采集的血液。
图3表示了实施例和对比例中三氯乙酸(TCA)引起的血液沉积的放射性同位素计数结果。图中，下列术语为对照组为对比例；移植组为实施例。
具体实施例方式
下面的例子用于具体说明本发明。这些实施例并不构成对本发明的限制。
(实施例)(1)含bFGF的明胶凝胶微粒的制备含bFGF的明胶凝胶微粒由Tabata等方法准备(Tabata，Y，等，J.Biomaterri.Sci.Polymer Edn.，10957-968，1999)。因此，10ml 10％wt的碱处理明胶(等电点5.0，Nitta Gelatin产品)水溶液先预热到40℃，与25μl 25％wt的戊二醛混合，混合物在425rpm搅拌下滴加到40℃375ml橄榄油中，形成w/o乳状液。25℃下持续搅拌24小时，化学交联明胶。加入100ml丙酮，离心收集所得微粒(4℃，3000rpm，5分钟)，丙酮中离心冲洗5次。冲洗后微粒保持在100ml 100mM水性明胶溶液中，其中含有0.1％wt Tween80，37℃下一小时，以阻断残余的来自戊二醛的未反应醛基。将如此得到的交联明胶微粒蒸馏水中冲洗2次，然后冻干，环氧乙烷气体消毒。37℃下水中溶胀24小时后，明胶凝胶微粒水含量95％。光学显微镜下测定微粒大小(直径)，60-130μm。具有等电点9.6的重组bFGF(Kaken Pharmaceutical Co.产品)的10mg/ml水溶液(10μl)滴加到上述所得的干明胶凝胶微粒2mg部分上，25℃下保持1小时得到含bFGF的明胶凝胶微粒。
(2)凝胶海绵片的制备采用冷冻均浆器1800-2000rpm下搅拌60分钟0.3％脂肪变性胶原质盐酸(atherocollagen hydrochloric acid)溶液(pH3.0)。起泡的溶液灌注到模中，-40℃下快速冷冻，冻干48小时，105℃下减压干燥24小时。然后4℃下0.05M乙酸的0.2％戊二醛溶液中进行交联24小时，用磷酸盐缓冲的生理盐(PBS)(pH7.4)冲洗模具(molding)，浸没在15％乙醇水溶液中.模具-135℃下快速冷冻，然后冻干(48小时)，环氧乙烷气体消毒得到胶原质海绵片。
(3)表达megalin细胞的皮下移植如上(1)中得到的含bFGF的明胶凝胶微粒悬浮在0.15mlPBS中，采用1ml注射器(具有23G针头)将悬浮液注射入如上所得胶原质海绵片(1×1×0.5cm)。将海绵片移植到5周龄雌性裸小鼠(BALB/cA Jcl-nu；CLEA日本)皮下背侧(dorsal side)，二乙基醚吸入麻醉.
一周后，病理确认海绵片中血管生成，0.15ml细胞悬浮液采用1ml注射器(具有23G针头)注射进入麻醉的小鼠，悬浮液如下制备，将得自培养在补充有10％(vol/vol)新生牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle培养基(LIFE TECHNOLOGIES，GIBCO BRL，Rockville，MD，USA)中的大鼠卵黄囊上皮癌细胞(L2细胞)，现在带有表面表达有megalin的细胞(1×107细胞/ml)悬浮。细胞注射两周后，当细胞肿块最长直径不短于2cm时，麻醉下从背侧手术切除小鼠双肾，产生小鼠肾不足状态.没有观察到移植的L2细胞转移。
(对比例)如上进行同样的步骤，只是不注射细胞悬浮液，在步骤(3)中只有PBS注射进入海绵片。
(实验例)将如上实施例和对比例中所得的肾不足状态的小鼠进行如下实验.
(1)使用IODOGEN(Pierce产品)125I标记的β2微球蛋白(Microglobulin，Oriental Yeast Co.产品)。碘化作用产生6×103cpm/ng蛋白的比活。125I标记的β2-m用含0.5％牛血清(BSA)的PBS稀释到11ng/μl浓度。125I标记的β2-m(2.8μg/250μl)腹膜内给药到上述肾不足状态的15只小鼠的每一只，评价小鼠的下述各项。125I标记的β2-m给药后3，6或14小时用生理盐水全身灌注(general perfusion)杀死5只小鼠。
(2)采集处死后的每只小鼠的移植的细胞肿块，心，肺，肝脏，和骨骼肌，称重，在Eppendorf管中进行gamma射线计数(counting)。所得结果表示于图1中。
图1表示了有关实施例和对比例中组织中125I标记的β2-m摄入的数据。纵座标表示每单位重量组织的125I数(count)，移植细胞中125I数总是显著(*p＜0.05)高于心，肺，肝脏，和骨骼肌中的，不论测定时间。另一方面，心，肺，肝脏，和骨骼肌中的125I数在实施例和对比例间没有表现出任何显著的不同。这些结果显示125I标记的β2-m已经被有效的整合进入移植细胞。
(3)此外，采用UITRA TURRAX(IKA LAB ORTECHNIK，Staufen，Germany)在补充有2％β巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中允浆移植的细胞肿块，将所得进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。所得结果表示于图2中.
图2表示了整合进入移植细胞125I标记的β2-m的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。与腹膜内给药的125I标记的β2-m结果相比揭示移植细胞含有125I标记的β2m单体以及其分解产物。另一方面，在细胞移植受体小鼠的血液样品中，除分解产物，观察到比移植细胞中更大数量的β2-m的concatemer。这些结果指示移植细胞中放射性同位素数量不是由于血液中的杂质，而是由于整合进入移植细胞的β2-m的分解。
(4)此外，处死小鼠后采集的每一只的血液，10μl血液样品部分与415μl含1％BSA的PBS混合，混合物然后与75μl 1 00％三氯乙酸(以下称TCA)混合以沉淀未分解蛋白。离心收集沉淀蛋白，gamma计数器计数，从而评价血液中未分解125I标记的β2-m水平。所得结果显示于图3中。
图3表示了实施例和对比例中TCA引起的血液沉淀的放射性同位素计数。125I标记的β2-m给药后6和14小时，与对比例相比，实施例血液的TCA沉淀中放射性同位素计数显著减少(*p＜0.05)。这指示与对比例相比，实施例中125I标记的β2-m分解数量更大，即移植细胞正在产生代谢蛋白的功能。
工业应用性本发明的具有代谢蛋白功能的人工肾可以在体内发挥作用，在改善肾不足患者的QOL方面有用。
权利要求
1.一种具有代谢蛋白功能的体内人工肾，其含有，作为组件的海绵片，所述海绵片具有其中注射有含促血管生成生长因子水凝胶和表面表达有megalin的细胞。
2.权利要求1的人工肾，其中所述促血管生成生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
3.权利要求2的人工肾，其中bFGF是基因工程技术产生的人bFGF。
4.权利要求1的人工肾，其中水凝胶是明胶凝胶。
5.权利要求4的人工肾，其中明胶凝胶主要由等电点4.5-5.5的明胶种类组成。
6.权利要求1的人工肾，其中海绵片由胶原质制成。
7.权利要求1的人工肾，其中表面表达有megalin的细胞是人近端曲小管上皮细胞和/或通过基因传递方法在表面高水平表达megalin的人近端曲小管上皮细胞。
8.权利要求1的人工肾，其中megalin的表达是基因操纵的结果。
9.构建具有蛋白代谢功能的体内型人工肾的方法，其包含使用其中注射有含促血管生成生长因子水凝胶和表面表达有megalin的细胞的海绵片。
10.权利要求9的构建人工肾的方法，其包含将含有促血管生成生长因子水凝胶注射进入海绵片的步骤，皮下移植海绵片的步骤，将表面表达有megalin的细胞注射进入移植的海绵片的步骤。
11.权利要求9的构建人工肾的方法，其中所述促血管生成生长因子是bFGF。
12.权利要求11的构建人工肾的方法，其中bFGF是基因工程技术产生的人bFGF。
13.权利要求9的构建人工肾的方法，其中水凝胶是明胶凝胶。
14.权利要求13构建的人工肾的方法，其中明胶凝胶主要由等电点4.5-5.5的明胶种类组成。
15.权利要求9的构建人工肾的方法，其中海绵片由胶原质制成。
16.权利要求9的构建人工肾的方法，其中表面表达有megalin的细胞是人近端曲小管上皮细胞和/或通过基因传递方法在表面高水平表达megalin的人近端曲小管上皮细胞。
17.权利要求9的构建人工肾的方法，其中megalin的表达是基因操纵的结果。
全文摘要
本发明涉及提供体内型人工肾，其具有蛋白代谢功能。即一种具有代谢蛋白功能的体内型人工肾，其特征为具有作为组成成员的海绵片，所述海绵片具有含生长因子的水凝胶，其可促进血管生成，注射进入以及具有表达在表面的megalin的细胞，其是内吞作用受体，在近端曲小管细胞中的蛋白代谢中发挥主要作用；构建体内型人工肾的方法，所述肾具有蛋白代谢的功能，其特征在于采用了注射进入具有含生长因子的水凝胶的海绵片，其可促进血管生成，以及具有在表面表达megalin的细胞。
文档编号A61L27/38GK1509155SQ0281005
公开日2004年6月30日 申请日期2002年5月17日 优先权日2001年5月17日
发明者田畑泰彦, 斋藤亮彦, 下条文武, 古吉重雄, 山下宪司, 司, 彦, 武, 田 泰彦, 雄 申请人:钟渊化学工业株式会社, 田畑泰彦, 斋藤亮彦