治疗代谢紊乱的方法
【专利说明】治疗代谢紊乱的方法
[0001] 政府资助
[0002] 本发明是在由国立卫生研究院授予的批准号HL097738和DK077086下借助政府资 助完成。政府对本发明具有一定的权利。
[0003] 以引用的方式并入电子提交材料
[0004] 本申请含有呈计算机可读形式的序列表（文件名：46768S_SeqListing.txt;2014 年3月18日创建；3, 026字节-ASCII文本文件），所述序列表作为本公开内容的单独部分， 以引用的方式整体并入。 发明领域
[0005] 本发明涉及治疗以神经调节蛋白4(Nrg4)缺陷为特征的病状（如代谢紊乱）的方 法。
[0006] 背景
[0007] 代谢综合征已经成为全球流行病，其显著增加了患2型糖尿病、心血管疾病和非 酒精性脂肪肝病（NAFLD)的风险。在胰岛素抵抗中，升高的肝葡萄糖产生和脂蛋白分泌促 成高血糖症和高脂血症的发病机理。肥胖症也与过量脂肪在肝脏中的累积相关，过量脂肪 在肝脏中的累积是影响成年人和孩子的NAFLD的最典型特征。虽然肝脂肪变性通常作为对 肝功能没有明显的不良效应的良性病状出现，但是在20% -30%的患有非酒精性脂肪性肝 炎（NASH)的NAFLD患者中观察到进行性肝损伤、炎症和纤维化。NASH正在成为终末期肝 病的主要危险因素。控制肝葡萄糖和脂质代谢的调节网络已经成为过去二十年中的研究焦 点。这些研究为促成葡萄糖和脂质稳态的分子和生理机制提供了关键性的认识。然而，介 导不同组织间（尤其是在脂肪组织和肝脏之间）的串扰的激素线索仍然难以确定。
[0008] 神经调节蛋白（NRG)为含有保守的表皮生长因子（EGF)样结构域的生长因子的家 族。至今，已经在哺乳动物中鉴定了 4种神经调节蛋白基因（Nrgl-4)，所述基因通过广泛 的选择性剪接产生一系列多样化的信号传导配体。NRG通常被合成为经受蛋白水解裂解以 释放含有EGF样结构域的细胞外片段的跨膜蛋白。基因和生物化学的研究证明了NRG通过 酪氨酸激酶受体的ErbB家族发出信号并且以旁分泌、自分泌和内分泌的方式发挥它们的 生物效应。在神经肌肉系统的发育中Nrgl已经被广泛地表征，尤其是在神经肌肉突触和外 周神经中。此外，在维持心脏的稳态和中枢神经系统发育中Nrgl起着重要的作用。Nrgl 和Nrg3的遗传多态性已分别与精神分裂症和先天性巨结肠疾病（HirschsprungDisease) 的风险相关。NRG令人惊奇地引发靶细胞中的特异性生物应答。Nrg4基于它的序列与其它 NRG成员具有同源性而被发现并且预测其编码115个氨基酸的前体蛋白。介导Nrg4对尤其 是葡萄糖和脂质代谢和NAFLD的生物效应的相关细胞受体还未确定。
[0009] 前述观察结果提供了仍然需要在治疗疾病如2型糖尿病、心血管疾病和非酒精性 脂肪肝疾病（NAFLD)中有用的组合物和制剂的证据。
[0010] 概述
[0011] Nrg4被鉴定为靶向肝脏中的肝细胞的脂肪细胞源性因子。在肥胖症的小鼠模型 中，Nrg4在脂肪组织中的表达明显减少。使用Nrg4敲除的小鼠，确定了Nrg4缺陷使饮食 诱导的高血糖症、高血脂症和肝脂肪变性加剧。相反，Nrg4的脂肪-特异性转基因表达使 在高脂食物喂养之后这些代谢参数显著提高。合起来，这些研究鉴定Nrg4为用于生物治疗 剂的开发的新型靶标，从而用于治疗2型糖尿病、高血脂症和NAFLD。
[0012] 在本公开的一个方面中，提供了治疗代谢紊乱的方法，所述方法包括向有需要的 患者施用治疗有效量的Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段。
[0013] 在一些实施方案中，代谢紊乱选自由以下各项组成的组：非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖症、高血脂症、血脂异常、肥胖症、高胰岛素血症、 胰岛素抵抗、高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、杂合型家族性 高胆固醇血症、纯合型家族性高胆固醇血症、混合型血脂异常、动脉粥样硬化、早发型?冠心 病、血脂异常、高甘油三酯血症、高脂肪酸血症和肝硬化。
[0014] 在一些实施方案中，生物学活性片段包括SEQIDN0:1的残基5-46、5-55、5-62、 1-46、1-55、1-52、1-53、4-52、4-53 或 1-62。
[0015]在一些实施方案中，Nrg4 变体与SEQIDN0:1 至少 70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95%或99%相同。
[0016] 在一些实施方案中，Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段由病毒载体编码。
[0017] 在一些实施方案中，Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段是经化学合成的或从重 组来源中纯化得到的。
[0018] 在本公开的另一个方面中，提供了治疗以神经调节蛋白4(Nrg4)缺陷为特征的疾 病或病状的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的Nrg4(SEQIDNO: 1)、Nrg4 变体或其生物学活性片段。
[0019] 在一些实施方案中，所述疾病或病状为与来自健康患者的脂肪组织中的NRG4的 表达相比，脂肪组织中的NRG4的表达减少。在一些实施方案中，脂肪组织为褐色脂肪组织 或白色脂肪组织。
[0020] 在一些实施方案中，所述疾病或病状为脂肪细胞和人体组织之间的异常交流。
[0021] 在一些实施方案中，所述疾病或病状为代谢紊乱。在一些实施方案中，代谢紊乱选 自由以下各项组成的组：非酒精性脂肪肝病（NAFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖症、 尚血脂症、血脂异常、肥胖症、尚膜岛素血症、膜岛素抵抗、尚胆固醇血症、非家族性尚胆固 醇血症、家族性高胆固醇血症、杂合型家族性高胆固醇血症、纯合型家族性高胆固醇血症、 混合型血脂异常、动脉粥样硬化、早发型冠心病、血脂异常、高甘油三酯血症、高脂肪酸血症 和肝硬化。
[0022] 在一些实施方案中，生物学活性片段包括SEQIDN0:1的残基5-46、5-55、5-62、 1-46、1-55、1-52、1-53、4-52、4-53 或 1-62。
[0023]在一些实施方案中，Nrg4 变体与SEQIDN0:1至少70%、75%、80%、85%、90%、 95%或99%相同。
[0024] 在一些或任何实施方案中，Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段由病毒载体编码。
[0025] 在一些实施方案中，Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段是经化学合成的或从重 组来源中纯化得到的。
[0026]在本公开的另一个方面中，提供了治疗选自由以下各项组成的组的病状的方法： 非酒精性脂肪肝病（NAFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖症、高血脂症、血脂异常、肥 胖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、家族性高胆固醇 血症、杂合型家族性高胆固醇血症、纯合型家族性高胆固醇血症、混合型血脂异常、动脉粥 样硬化、早发型冠心病、血脂异常、高甘油三酯血症、高脂肪酸血症和肝硬化，该方法包括 向有需要的患者施用治疗有效量的Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段。在一些实施方 案中，生物学活性片段包括SEQIDN0:1的残基5-46、5-55、5-62、1-46、1-55、1-52、1-53、 4-52、4-53或1-62。在一些实施方案中，Nrg4变体与SEQIDNO: 1至少70%、75%、80%、 85%、90%、95%或99%相同。
[0027] 在本公开的又一个方面中，提供了减少肝脏中脂肪累积的方法，该方法包括向有 需要的患者施用治疗有效量的Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段。在一些实施方案中， Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段与治疗有效量的降脂剂共同施用。在一些实施方案中， 降脂剂选自由以下各项组成的组：阿托伐他汀（atorvastatin)、辛伐他汀（simvastatin)、 罗素伐他汀（rosuvastatin)、氟伐他汀（fluvastatin)、依泽替米贝（ezetimibe)、苯扎贝 特（bezafibrate)、环丙贝特（ciprofibrate)、安妥明（clofibrate)、烟酸（niacin)、吉非 罗齐（gemfibrozil)和非诺贝特（fenofibrate)。
[0028] 而在本公开的又一个方面中，提供了降低血糖水平的方法，该方法包括向有需要 的患者施用治疗有效量的Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段。在一些实施方案中，Nrg4、 Nrg4变体或其生物学活性片段与治疗有效量的胰岛素、GLP-1、二甲双胍或DPP4抑制剂共 同施用。
[0029] 而在本公开的又一个方面中，提供了药物组合物，该药物组合物包含Nrg4、Nrg4 变体或其生物学活性片段以及药学可接受的载体。在一些实施方案中，生物学活性片段包 括SEQIDN0:1 的残基 5-46、5-55、5-62、1-46、1-55、1-52、1-53、4-52、4-53或1-62。在一 些实施方案中，Nrg4 变体与SEQIDN0:1 至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相 同。
[0030] 而在另一个本公开的方面中，提供了诊断测试个体中的代谢紊乱的方法，该方法 包括测定来自测试个体的样品中的Nrg4水平的步骤，其中与正常个体中的Nrg4水平相比， 测试个体中降低的Nrg4水平是病状的提示，并且其中已知正常个体没有罹患代谢紊乱。
[0031] 在另一个本公开的方面中，提供了用于诊断个体中代谢紊乱的方法，该方法包括 检测来自个体的样品中的Nrg4水平的步骤，其中与同一个体中之前的Nrg4水平相比，降低 的Nrg4水平是代谢紊乱的提示。
[0032] 在另一个本公开的方面中，提供了用于测定测试个体中对代谢紊乱的易感性的方 法，该方法包括测定来自测试个体的样品中的Nrg4水平的步骤，其中与来自正常个体的样 品中的Nrg4水平相比，测试个体中降低的Nrg4水平指示对病状的易感性，并且其中已知正 常个体没有罹患代谢紊乱。
[0033] 在另一个本公开的方面中，提供了用于测定个体中对代谢紊乱的易感性的方法， 该方法包括检测来自个体的样品中的Nrg4水平的步骤，其中与同一个体中之前的Nrg4水 平相比，个体中降低的Nrg4水平是对代谢紊乱的易感性的提示。
[0034] 在另一个本公开的方面中，提供了用于测定个体中代谢紊乱的进展的方法，该方 法包括测定来自个体的样品中的随着时间的Nrg4水平的步骤，其中Nrg4水平随着时间的 减少是代谢紊乱的进展的提示。
[0035] 在另一个本公开的方面中，提供了用于监测个体中代谢紊乱的治疗有效性的方 法，该方法包括测定来自个体的样品中的随着时间的Nrg4水平的步骤，其中Nrg4水平随着 时间的增加是有效治疗的提示。
[0036] 在段落[0018]_[0023]的方法的一些实施方案中，代谢紊乱选自由以下各项组成 的组：非酒精性脂肪肝病（NAFLD)、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖症、高血脂症、血脂异 常、肥胖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、家族性高 胆固醇血症、杂合型家族性高胆固醇血症、纯合型家族性高胆固醇血症、混合型血脂异常、 动脉粥样硬化、早发型冠心病、血脂异常、高甘油三酯血症、高脂肪酸血症和肝硬化。
[0037] 在以上方法的一些实施方案中，Nrg4水平是Nrg4的血清蛋白浓度的量度。
[0038] 在一些实施方案中，Nrg4水平是NRG4mRNA水平的量度。
[0039] 在一些实施方案中，Nrg4水平是Nrg4活性的量度。
[0040] 在一些实施方案中，Nrg4活性是特异性结合活性。
[0041] 在另一个方面中，本公开包括使用Nrg4来制备药剂。在另一个方面中，本公开包 括使用Nrg4和包含Nrg4的组合物来治疗NAFLD、脂肪性肝炎、II型糖尿病、高血糖症、高血 脂症、血脂异常、肥胖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血 症、家族性高胆固醇血症、杂合型家族性高胆固醇血症、纯合型家族性高胆固醇血症、混合 型血脂异常、动脉粥样硬化、早发型冠心病、血脂异常、高甘油三酯血症、高脂肪酸血症和肝 硬化。在本公开中还提供其它相关方面。
[0042] 从以下的详细描述中将会明了本公开的其它特点和优点。然而，应理解的是，虽然 详细描述和具体实施例示出本公开的优选实施方案，但它们仅通过说明的方式给出，这是 因为本领域技术人员从这一详细描述中将会明了在本公开的精神和范围内的各种变化和 修改。
[0043] 附图简述
[0044]图1:人和小鼠的Nrg4蛋白质序列的比对。EGF样结构域的特征为存在三个保守 的二硫键（细线连接半胱氨酸残基）。推定的N-连接糖基化位点（N39YT)、蛋白水解裂解位 点（箭头）和预测的跨膜结构域（TM)被指出。应注意到人和小鼠的Nrg4的EGF样结构域 (氨基酸1至大约氨基酸52)是高度保守的。
[0045] 图2 :Nrg4在脂肪组织和培养的脂肪细胞中的表达。⑷在不同组织中的Nrg4 mRNA的Taqman定量PCR分析。Nrg4在褐色脂肪组织（BAT)和白色脂肪组织（WAT)中被大 量地表达。分析来自三只C57BL/6J雄性小鼠的混合的RNA样本。（B)在褐色（顶部）和白 色（3T3-L1，底部）脂肪细胞的分化过程中诱导Nrg4mRNA表达。包括了作为分化标记的 UCP1和PPARy。示出了来自一个代表性研究的三个复孔的平均值土标准差。
[0046] 图3 :Nrg4缺陷的小鼠具有低温耐受性并且具有正常的低温诱导的生热作用。（A) 野生型和Nrg4K0小鼠在低温暴露之后的直肠温度。在自由获取食物和水的情况下将小鼠 从环境温度转移至4°C持续共4小时。（B)肩胛间的褐色脂肪组织的组织学（H&E)(比例尺 =100ym)。（C)对暴露在环境温度（室温，WT= 5,K0 = 6)或低温温度（低温，WT= 5， K0 = 7)的小鼠中的BAT基因表达的qPCR分析。（D)在低温暴露之后的WT和Nrg4K0小 鼠中的血浆甘油三酯（TG)、酮（0-羟基丁酸）和非酯化脂肪酸（NEFA)的浓度。
[0047] 图4 :Nrg4的EGF样结构域与肝细胞结合。⑷分泌的碱性磷酸酶（SEAP)对照或 SEAP-Nrg4融合蛋白（氨基酸1-62)的示意图。（B)SEAP-Nrg4N62特异性地与肝细胞结合， 但并不与BAT、心脏、肌肉和脾脏中的细胞结合。（C)过量的GST-Nrg4N62融合蛋白竞争存在 肝细胞上的Nrg4结合位点。在3.Og/mLGST或GST-Nrg4重组蛋白存在下将SEAP-Nrg4N62 与肝切片一起孵育。
[0048] 图5 :通过肥胖调节脂肪Nrg4表达。（A)来自瘦的或饮食诱导的肥胖小鼠的WAT 和BAT中的Nrg4mRNA水平的qPCR分析。野生型C57BL/6J雄性小鼠保持进食标准食物（n =5)或高脂食物（n= 6)3个月。将总RNA从脂肪组织分离以用于qPCR分析。（B)来自 WT(n= 5)或瘦素受体缺陷db/db(n= 6)小鼠的脂肪组织中的Nrg4mRNA水平的qPCR分 析。A-B中的数据为平均值土SEM。\〈0.05。（C)从来自被喂养标准食物（n= 3)或高脂 食物（n= 3)的小鼠的附睾的WAT分离的基质血管成分（SVF)和脂肪细胞成分中的Nrg4 mRNA水平的qPCR分析。*p〈0. 01标准食物对比HFD。（D)在用媒介物（_)或TNFa(l〇ng/ mL)处理所指示的时间的成熟3T3-L1脂肪细胞中的Nrg4表达。示出了来自一个代表性研 究的三个复孔的平均值土标准差。"^〈O.OITNFa对比媒介物。
[0049] 图6 :Nrg4表达水平和代谢参数之间的相关性。具有54只野生型C57BL/6J雄 性小鼠的组被喂养高脂食物2个月。检测附睾的WAT中的相对Nrg4mRNA表达和代谢参 数。（A-B)Nrg4mRNA表达与体重负相关（A)并且与附睾的白色脂肪重量负相关（B)。（C) 高Nrg4 (下框）和低Nrg4 (上框）表达水平分别与低血糖水平和高血糖水平相关。（D)高 Nrg4(下框）和低Nrg4(上框）表达水平分别与低肝脂肪含量和高肝脂肪含量相关。
[0050] 图7 :Nrg4缺陷使饮食诱导的胰岛素抵抗和高血脂症加剧。⑷被喂养标准食物或 高脂食物（HFD)的野生型（填充的，n= 8)和Nrg4K0(灰白的，n= 9)小鼠的体重。在HFD 喂养之后的8周检测血浆瘦素水平。（B)在喂养和禁食条件下检测血浆葡萄糖和胰岛素水 平。（C)甘油三酯、总胆固醇和0 -羟基丁酸的血浆浓度。数据代表平均值土SEM。\〈0. 05。
[0051] 图8:Nrg4缺陷使饮食诱导的肝脂肪变性加剧。（A)在被喂养HFD7周的野生型 (填充的，n= 9)和Nrg4K0(灰白的，n= 8)小鼠中的肝甘油三酯含量。数据代表平均值 土SEM。*p〈0. 05。⑶来自HFD之后的7周的WT和Nrg4K0小鼠的附睾的WAT和肝切片的 H&E染色。比例尺=100yM。
[0052] 图9:脂肪组织中Nrg4的转基因表达使小鼠免受饮食诱导的代谢紊乱。（A)脂肪 特异性Nrg4转基因小鼠（TG)免受饮食诱导的肥胖症。（B)在8周的高脂喂