养之后的WT(n =10)和TG(n= 9)小鼠中的血浆瘦素浓度。（C)在WT和TG小鼠中的血浆葡萄糖（喂养 和禁食）、总胆固醇（喂养）和羟基丁酸（禁食）的浓度。A-C中的数据代表平均值 土SEM。*p〈0. 05。
[0053]图10 :Nrg4转基因小鼠具有更大的葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性并且免受饮食诱 导的脂肪肝。（A)在10周的高脂喂养之后的WT和TG小鼠中的葡萄糖耐受性测试。（B)在 12周的高脂喂养之后的WT和TG小鼠中的胰岛素耐受性测试。A-B中的数据代表平均值 ±3已1(11 = 8-10)。>^〈0.05。（〇在被喂养册0 11周的町（灰白的，11 = 9)和16(填充的， n= 9)小鼠中的肝甘油三酯含量。数据代表平均值土SEM。V〇. 〇5。⑶附睾的WAT和肝 切片的H&E染色。
[0054] 图11:在11周的HFD喂养之后的WT和TG小鼠中的肝基因表达的qPCR分析。数 据代表平均值土SEM。*p〈0. 05。
[0055] 图12:重组Nrg4使饮食诱导的肥胖小鼠中的血糖降低。HFD喂养的肥胖小鼠腹腔 内注射GST或GST-Nrg4N62两次（每克体重4yg)，持续共6小时。应注意到Nrg4使血糖水 平降低，而并非通过促进胰岛素分泌。
[0056] 图13:对Nrg4作为用于治疗2型糖尿病和非酒精性脂肪肝病的潜在生物治疗剂 的模型描绘。Nrg4为脂肪细胞源性激素，该激素作用于肝脏以降低血糖和脂质，并且减少肝 脂肪含量。
[0057] 图14:对释放Nrg4的细胞外片段重要的氨基酸的绘制。SEAP-Nrg4融合载体在 SEAPcDNA和全长Nrg4即氨基酸1-115之间被构建并且瞬时被转染至HEK293细胞中。在 免疫印迹上指出丙氨酸突变体的位置。收获条件培养基和总细胞裂解物并且用抗-SEAP抗 体通过免疫印迹法分析。应注意到氨基酸53-54或53的突变显著地减少了融合蛋白向培 养基中的分泌。
[0058] 图15 :在肥胖症的小鼠模型中褐色和白色脂肪组织中的Nrg4的表达减少。㈧来 自瘦的（空白柱）或肥胖（黑柱）小鼠的附睾的白色脂肪（eWAT)和BAT中的Nrg4mRNA表 达的qPCR分析。对于DIO,WT雄性小鼠被喂养标准食物（n= 5)或HFD(n= 6) 3个月。对 于遗传型的肥胖症，分析一组中的WT(n= 3)和ob/ob(n= 4)小鼠和一个单独组中的WT(n =5)和db/db(n= 6)小鼠。（B)从来自瘦的（n= 3)或DI0(n= 3)小鼠的eWAT分离的 基质血管成分（SVF)和脂肪细胞成分（Ad)中的Nrg4mRNA表达的qPCR分析。a-b中的数 据代表平均值土s.e.m。*p〈0. 05。（C)在用媒介物（Veh)、TNFa(l〇ng/ml)或IL1 0 (40ng/ ml)处理6小时之后的已分化的褐色或3T3-L1脂肪细胞中的Nrg4mRNA表达的qPCR分析。 数据代表来自一个进行三次重复的代表性研究的平均值土标准差。\〈〇.05对比Veh。
[0059] 图16:Nrg4缺陷使饮食诱导的肥胖症加剧并且升高血浆甘油三酯水平。（A)被喂 养标准食物或HFD的野生型（填充的，n= 8)和Nrg4K0(灰白的，n= 9)小鼠的体重、肥 胖和瘦体重的百分比。（B)在喂养和禁食条件下的WT和Nrg4K0小鼠中的血浆TAG水平。 (C)0-羟基丁酸的血浆浓度。数据代表平均值土SEM。*p〈0.05。
[0060] 图17:Nrg4缺陷使饮食诱导的肝脂肪变性加剧。㈧在被喂养HFD7周的野生型 (填充的，n= 9)和Nrg4K0(灰白的，n= 8)小鼠中的肝甘油三酯含量。数据代表平均值 土SEM。*p〈0.05。（B)来自HFD之后7周的WT和Nrg4K0小鼠的BAT、附睾的WAT和肝切 片的H&E染色。比例尺=100yM。
[0061] 图18:Nrg4缺失小鼠患有更严重的高脂食物诱导的葡萄糖的不耐受性和胰岛素 抵抗。（A)在HFD喂养的WT和K0小鼠中的喂养和禁食的血糖以及禁食的血浆胰岛素水平。 (B)在喂养HFD13周之后的WT(n= 7,填充的菱形，黑线）和Nrg4K0(n= 7,空白方块，红 线）小鼠中葡萄糖耐受性测试。（C)在喂养HFD15周之后的WT(n= 7)和Nrg4K0(n= 9)小鼠中的胰岛素耐受性测试。数据代表平均值土s.e.m。\〈0. 05,K0对比WT。
[0062] 图19:Nrg4缺陷促进肝脂肪生成基因程序的异常激活。（A)自由进食的WT和Nrg4 K0小鼠中的肝基因表达的qPCR分析。数据代表平均值土s.e.m。*p〈〇.〇5,K0对比WT。（B) 将肝组织从HFD喂养的WT和Nrg4K0小鼠切下并且被处理用于qPCR和免疫印迹法分析。 使用所指出的抗体的总肝裂解物的免疫印迹（顶部）；pSREBPl表示前体蛋白。使用肝细胞 核提取物的核SREBPl(nSREBPl)的免疫印迹（底部）。核纤层蛋白A/C免疫印迹作为上样 对照被包括。
[0063] 图20 :在原代肝细胞中，Nrg4通过LXR激活来减弱对脂肪生成基因表达的诱导。 在含有SEAP或SEAP-Nrg4N62的条件培养基存在下，用媒介物或T0901317处理的原代肝细 胞中的基因表达的qPCR分析。数据代表平均值土标准差。\〈0. 05。
[0064] 图21 :脂肪组织中Nrg4的转基因表达使小鼠免受饮食诱导的肥胖症。㈧在12 周的HFD喂养之前和之后的WT(实心柱，n= 10)和aP2-Nrg4转基因（Tg，空心柱，n= 9) 小鼠的生长曲线。⑶身体组成。（C)在6周的HFD喂养之后的WT和aP2-Nrg4Tg小鼠中 的食物摄取和V02。V02值被标准化为体重（中间图）和瘦体重（右图）。
[0065] 图22:Nrg4转基因小鼠免受HFD诱导的代谢紊乱。㈧在10周的高脂喂养之后 的WT(空心柱，n= 9)和Tg(实心柱，n= 8)小鼠中的血浆代谢物浓度。⑶在HFD喂养 的WT(空心柱，n= 9)和Tg(实心柱，n= 8)小鼠中的喂养的和禁食的血糖以及禁食的血 浆胰岛素水平。数据代表平均值土s.e.m。\〈0.05,WT对比Tg。
[0066] 图23 :Nrg4转基因小鼠免受HFD诱导的葡萄糖不耐受性和胰岛素抵抗。（A)HFD 喂养的WT(空心，n= 9)和Tg(实心，n= 8)小鼠中的葡萄糖耐受性测试。⑶HFD喂养 的WT(空心，n= 9)和Tg(实心，n= 8)小鼠中的胰岛素耐受性测试。数据代表平均值 土s.e.m。*p〈0.05，WT对比Tg〇
[0067] 图24:通过减弱肝脂肪生成使Nrg4转基因小鼠免受HFD诱导的脂肪肝。（A)HFD 喂养的小鼠中的脂肪组织和肝切片的H&E染色。比例尺=100ym。（B)肝TAG含量。（C) 使用总肝裂解物（顶部）和肝细胞核提取物（底部）的免疫印迹。应注意到在来自Tg小 鼠的肝脏中，前体和核SREBP1的水平减少。（D)自由进食的WT(空心）和Tg(实心）小鼠 中的肝基因表达的qPCR分析。数据代表平均值土s.e.m。*p〈0. 05,WT对比Tg。
[0068] 图25:重组Nrg4使饮食诱导的肥胖小鼠中的血糖和胰岛素降低。HFD喂养的肥 胖小鼠腹腔内注射GST或GST-Nrg4N62每天两次（每克体重4yg)，持续共5天。应注意到 Nrg4使血糖水平降低，而并非通过促进胰岛素分泌。
[0069] 详述
[0070] 定义
[0071] 如本文所使用，术语"Nrg4"（SEQIDN0:1)是指由人NRG4基因编码的蛋白质。 Nrg4基于它的序列与其它NRG成员具有同源性而被发现并且被预测编码115个氨基酸的前 体蛋白。Nrg4在小鼠和人之间是高度保守的，在EGF样结构域中具有超过90%的氨基酸序 列同一性（大约AA1-52,图1)。因此，在一些实施方案中，术语"Nrg4"是指SEQIDN0:2， 即由小鼠NRG4基因编码的蛋白质。
[0072] 如本文所使用，术语"治疗的"或"治疗"是指如本文所描述的向有需要的患者施 用治疗有效量的Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段以达到疾病或病状的改变或改善的 目的。在某些方面的治疗需要以定期间隔施用单剂量或多剂量以改变病状的过程。
[0073] 如本文所使用，"施用"意指将药剂提供给动物（包括人类患者），并且包括但不限 于通过医学专业人员施用或自我施用。
[0074] 如本文所使用，术语"共同施用"是指两种或更多种药剂向动物（包括人类患者） 的施用。在某些方面中，药剂为单一药物组合物或分开的药物组合物。共同施用包括通过 相同或不同施用路径施用每种药剂。共同施用还涵盖并行或依序施用。
[0075] 如本文所使用，术语"治疗有效量"是指向动物（包括人类患者）提供治疗益处的 药剂的量。
[0076] 如文中所使用，"药学可接受载体"包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表 面活性剂、抗氧化剂、防腐剂（例如抗菌剂、抗真菌剂）、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药 物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等、类似物质 和其组合，如本领域的普通技术人员所知的（Remington's, 1990)。
[0077] 如本文所使用，术语"代谢紊乱"是指以代谢功能的改变或扰乱为特征的病状。"代 谢的"和"代谢"是本领域中熟知的术语并且通常包括发生在活有机体内的整个范围的生物 化学过程。
[0078] 本发明的Nrg4变体可包括天然氨基酸在特定的残基处的保守性替代。享有共同 的侧链性质并且适合用于产生保守性替代的氨基酸残基被如下分组。
[0079] (1)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；
[0080] (2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
[0081] (3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；
[0082] (4)碱性：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；
[0083] (5)影响链定向的残基：甘氨酸、脯氨酸；以及
[0084] (6)芳族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
[0085] Nrg4
[0086] 本文发现神经调节蛋白4(Nrg4)(信号传导配体的神经调节蛋白家族的成员）为 调节血浆葡萄糖和脂质水平以及NAFLD发展的新型脂肪源性激素。Nrg4表达在脂肪组织中 是高度富集的并且在褐色和白色脂肪细胞的分化过程中被诱导。使用结合测定，发现Nrg4 通过推定的受体（或多个受体）以可饱和方式仅仅与肝细胞结合。在饮食诱导的和遗传的 小鼠肥胖症模型中脂肪细胞中的Nrg4表达水平明显减少，表明了Nrg4不足可促成肥胖症 相关联的代谢素乱的发展。对这一点的支持，在尚脂食物喂养之后Nrg4缺失小鼠患有更严 重的高血糖症、高血脂症和肝脂肪变性。相反，Nrg4的脂肪-特异性转基因表达使血糖和 脂质降低，并且减少肝脂肪含量。本文所描述的研究将Nrg4确定为在维持代谢稳态中起有 益作用的新型脂肪源性激素。因此，Nrg4的治疗靶向为治疗例如2型糖尿病、高血脂症和 NAFLD提供了新途径。
[0087] 本文所提供的方法包括那些其中待施用的Nrg4为Nrg4变体，该Nrg4变体与SEQ IDN0:1至少45 %相同、至少50 %相同、至少55 %相同、至少60 %相同、至少65 %相同、至少 70%相同、至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至 少96 %相同、至少97 %相同、至少98 %相同、或至少99 %相同。
[0088] 本发明的Nrg4变体可包括天然氨基酸在特定的残基处的保守性替代。享有共同 的侧链性质并且适合用于产生保守性替代的氨基酸残基被如下分组。
[0089] ⑴疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；
[0090] (2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
[0091] (3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；
[0092] (4)碱性：天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；
[0093] (5)影响链定向的残基：甘氨酸、脯氨酸；以及
[0094] (6)芳族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
[0095] 本公开也设想了包括施用一种或多种Nrg4的生理活性片段以治疗以Nrg4的不足 水平或活性为特征的病状的方法。Nrg4片段包括但不限于缺乏SEQIDNO: 1的前4个残 基的Nrg4片段、包括SEQIDN0:1的氨基酸残基5至46、5至55、5至62、1至46、1至55、 1至52、1至53、4至52、4至53或1至62或者由其组成的片段。本领域中的技术人员可 通过在相关的生物测定中针对活性进行筛选而容易地筛选活性片段。在各种实施方案中， Nrg4片段包括x至y的氨基酸残基或由其组成，其中x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、或55，并且7为26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、或 115〇
[0096] 在所提供的方法中使用的Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段来源于本领域中 所已知的任何方法。例如，在一个方面中，Nrg4来源于表达内源性的Nrg4的细胞。或者， Nrg4、其变体或生物学活性片段的来源来自于用编码Nrg4或其前体的核酸载体转化的细 胞，并且在各种方面中所述细胞为哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、整个有机 体或其它有用的重组蛋白来源的细胞。
[0097] Nrg4的N-端片段（Nrg4的氨基酸1至大约氨基酸52)含有EGF样结构域并且能 够与肝细胞上的它的受体结合。合成肽或从哺乳动物细胞（例如，中国仓鼠卵巢CH0)产生 和纯化的重组Nrg4可用于降低血糖水平。用Nrg4慢性治疗可降低肝脂肪含量，类似于由 转基因Nrg4表达引起的作用。合成的肽可用N-端乙酰化、C-端酰胺化、酰化、糖基化和聚 乙二醇化以及其它来修饰以进一步改善药代动力学特征。此外，可使用保留Nrg4的生物活 性的更小肽。
[0098] 对于Nrg4蛋白的重组产生，提供了编码重组Nrg4蛋白和控制指导细菌、哺乳动物 或昆虫细胞中的蛋白质表达的序列的分离的DNA和/或重组载体。在一些情况下，希望重 组Nrg4编码序列与可（但不限于）促进重组蛋白纯化的另外的氨基酸序列融合。例如，在 一个方面中，所表达的Nrg4蛋白被表达为融合蛋白，该融合蛋白包括一个或多个组氨酸标 记、谷胱甘肽S转移酶（GST)序列、麦芽糖结合蛋白（MBP)序列、标志序列（Flagsequence) 和/或myc标记的RGT序列。这些帮助重组蛋白的纯化的另外的序列任选地通过蛋白酶裂 解来移除。
[0099] 能够调节Nrg4活件或表汰的化合物
[0100] 也设想调节Nrg4表达的化合物（即Nrg4调节剂）在本公开的范围内。因为在肥 胖症中Nrg4表达被严重抑制，可能恢复脂肪细胞中的Nrg4表达的化合物或治疗可用于产 生治疗益处。本文证明了Nrg4表达被炎症信号如TNFa抑制。因此，恢复脂肪细胞中的 Nrg4水平的抗炎化合物被认为在本公开的范围内。
[0101] 也设想调节Nrg4脱落/激活的化合物（即Nrg4调节剂）在本公开的范围内。Nrg4 被合成为前体跨膜蛋白，该前体跨膜蛋白经受蛋白水解裂解和脱落或者Nrg4可溶的细胞 外结构域从膜结合蛋白的释放。可溶的Nrg4释放到组织中并且循环对激活Nrg4是重要 的。裂解Nrg4的确切蛋白酶的身份仍未知。尽管这个不确定，但是为了并用于实现与施用 的Nrg4具有类似的代谢益处可筛选出激活脱落事件并且增加活性Nrg4的释放的化合物。
[0102] 也设想调节Nrg4更新的化合物（即Nrg4调节剂）在本公开的范围内。许多激素 在循环中经受快速更新。阻止Nrg4的蛋白水解降解的化合物可增加Nrg4在血浆中的浓度， 并且实现代谢益处。
[0103] 也设想调节Nrg4受体结合和信号传导的化合物（即Nrg4调节剂）在本公开的范 围内。改善Nrg4与其受体结合并且增加下游信号传导事件的另外的化合物可用于延长和 /或增强靶细胞中的Nrg4作用。
[0104]通过施用Nrg4而治疗的病状
[0105] 所提供方法被利用用于治疗可通过施用Nrg4、Nrg4变体或其生物学活性片段而 减轻的任何病状。在所提供方法的一些方面中，病状为代谢紊乱。示例性代谢紊乱包括但 不限于2型糖尿病、高血糖症、高胰岛素血