Phf20和jmjd3组合物及其在肿瘤免疫治疗中的使用方法
【专利说明】PHF20和JMJD3组合物及其在肿瘤免疫治疗中的使用方法
[0001] 优先权信息
[0002] 本申请要求申请日为2013年2月26日、专利申请序列号为61/769, 545的审查中 的美国专利申请的优先权，该专利申请内容通过参考并入本申请中。
[0003] 相关技术描述
[0004] 人及小鼠的体细胞均可通过四个关键转录因子：0ct4,Sox2,Klf4和c-Myc(Okita etal. , 2007；Takahashietal. , 2007b；TakahashiandYamanaka, 2006；Yuetal. , 2007) 被重编程为类似于多能胚胎干细胞（ESC)的状态，从而产生诱导多能干细胞（iPSCs)。基 于iPSCs与ESCs在基因表达谱、表观遗传/基因标记以及自我更新和分化成多种细胞的能 力方面的相似性，它在人类疾病模型的建立，药物筛选，甚至治疗应用方面拥有巨大的潜能 (PlathandLowry, 2011;RobintonandDaley, 2012)。
[0005] 尽管采用以下几种方法均可以实现体细胞的重编程，包括诱导四个转录因子 的表达，蛋白转导以及小RNA(miRNA)表达（RobintonandDaley，2012;Stadtfeldand Hochedlinger，2010)，不管是依赖或不依赖小分子化合物，其效率及iPSC产生的动力仍不 理想。这表明，在重编程过程有大量的遗传和表观遗传的的障碍存在（Hannaetal.，2009 ; Smithetal. , 2010)〇
[0006] 许多因素，包括细胞增殖和细胞周期，间充质细胞到上皮细胞的转化以及表观 遗传对组蛋白修饰和DNA甲基化的调节均可影响重编程效率（PappandPlath, 2011; StadtfeldandHochedlinger，2010)。瞬时强迫细胞表达重编程因子会产生可分离的 事件，开始是间质细胞到上皮细胞的转化引起的体细胞标记物YHYI的丢失，接着激活 胚胎标记物，例如碱性磷酸酶（AP)以及胚胎抗原l(SSEAl)(Lietal.，2010;Plathand Lowry, 2011)。诱导和维持内源性多能基因，例如Nanog和0ct4,需要在DNA甲基化和组蛋 白修饰方面进一步进行表观遗传修饰（StadtfeldandHochedlinger, 2010)。如果不能及 时达到这些表观遗传的变化，可能会导致部分重编程诱导多能干细胞。
[0007] 在重编程过程中，全面分析常染色质的动态变化可以揭示在组蛋白修饰水平精细 的表观遗传的改变（Gaspar-Maiaetal.，011;Hembergeretal.，2009;Hochedlinger andPlath，2009;Kocheetal.，2011)。异位表达染色质重塑蛋白，例如Brg-1和Brfl55可 以增强四个因子介导的重编程效率（Gaspar-Maiaetal.，2009;Singhaletal.，2010)。 ESCs和iPSCs都含有"二价结合域"，在这一区域核体标记为组氨酸3-赖氨酸27和组氨酸 3-赖氨酸 4 三甲基化（H3K27me3 和H3K4me3) (Gaspar-Mafiaetal.，2011;Hochedlinger andPlath, 2009)。而PcG复合体介导H3K27甲基化并且抑制基因阻遏（Caoetal.，2002 ; ]\^找1161'〇11&11(11?;[油6找，2011)，加」(13和1^1介导1131(27去甲基化（488616七&1.，2007; Hongetal.，2007;Jepsenetal.，2007 ;Kouzarides, 2007;Lanetal.，2007)。因此，根 据表观遗传因素在决定细胞谱系方面的重要性，可以合理推测在体细胞重编程过程中，一 些因子是体细胞重编程高效进行所必须的，而另外一些因子可能起负调控作用。如果要除 去这些重编程过程中路障，需要增加了解这些表观遗传分子的作用机制，即哪一种表观遗 传因子控制细胞系从而影响重编程的动态过程。 发明概要
[0008]Jmjd3被鉴定为是重编程过程中的重要负调控分子。Jmjd3缺陷的小鼠胚胎成纤 维细胞（MEFs)与野生型相比明显会产生更多的iPSC克隆，而Jmjd3异位表达可以显著抑 制重编程。Jmjd3的抑制作用通过组氨酸脱甲基酶依赖性及非依赖性两种途径实现，而后 者是完全新颖的并包括Jmjd3靶向PHF20并通过招募E3连接酶Trim26而进行泛素化和降 解。PHF20缺陷的MEFs即便在Jmjd3,Ink4a或p21敲低的条件下也不能转换为完全重编程 的iPSCs，说明PHF20这一蛋白在重编程过程中起主导作用。因此，本发明提供了诱导多能 干细胞形成的方法，包括在细胞中抑制或阻止Jmjd3基因的表达及抑制JMJD3蛋白的活性， 例如通过在细胞培养中添加JMJD3的拮抗剂。
[0009] 还发现PHF20在超过90%的乳腺癌组织中过表达，可作为一个新的乳腺癌抗原， 在介导强的抗肿瘤免疫反应中起重要作用。因此提供了靶向PHF20的乳腺癌免疫疗法。一 个实施方案中，提供了联合免疫疗法，该联合免疫疗法产生PHF20抗原特异性免疫反应，同 时抑制乳腺癌肿瘤生长。另一个实施方案中，给予有需求的患者负载有纳米脂质体的树突 状细胞（DC)与具有抗-PD-1 (程序性死亡-1)闭锁的siRNAs或抗人H)1 (抗-PD1)抗体联 合应用，所述纳米脂质体含有PHF20肽，其中PHF20/DC免疫接种增强抗原特异性T细胞的 前体，而抗-PD-1闭锁增加抗原特异性T细胞反应，（从而）抑制肿瘤生长并降低非特异性 免疫反应或副作用。
[0010] 另一个实施方案中，可以用包含抗PHF20抗体的合适制备物靶向肿瘤特异的 PHF20,所述抗PHF20抗体优选人源化、或人、单克隆抗体。
[0011] 本发明还提供了药物组合物，包括PHF20肽及药学上可接受的赋形剂，PHF20肽来 源于PHF20蛋白，是细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的表位。PHF20肽，优选人的PHF20肽，可 以激活T细胞，从而使T细胞能够识别负载有PHF20肽的T2细胞或PHF20阳性的乳腺癌细 胞。
[0012] 在一个实施方案中，本发明提供了一种疫苗或药物组合物，所述疫苗或药物组合 物包含PHF20肽、编码PHF20肽的核酸分子、或包含编码PHF20肽的核酸分子的表达载体。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，提供了PHF20肽特异性的分离的T细胞，优选CTL，或 者用PHF20肽刺激外周血单核细胞（PBMCs)产生的分离的T细胞。
[0014] 本发明还提供了治疗乳腺癌的方法，包括以下步骤（a)从对象分离细胞群，该细 胞群包含或能够产生CTLs和/或TH细胞；(b)用PHF20肽处理所述细胞群，任选与增生剂 联用；（c)筛选所述细胞群中对PHF20肽特异的CTLs或TH细胞或它们的混合；以及（d)给 予癌症患者所述细胞群。
[0015] 或者，上述方法可包括：（a)从对象分离细胞群，这个群体包含或能够产生CTLs、Th 细胞或它们的混合；(b)用PHF20肽处理所述细胞群，任选与增生剂联用；（c)筛选所述细 胞群中对PHF20特异的CTLs、TH细胞或它们的混合；⑷从筛选的CTLs、T"细胞或它们的混 合中克隆对本文描述的PHF20肽特异的T细胞受体（TCR)基因；（e)将在（c)克隆出的TCR 基因转导入：i.患者细胞；或ii.供体细胞；或iii真核或原核细胞以产生mTCRs用于乳腺 癌患者治疗。
[0016] 附图简要说明
[0017] 图1显示的是Jmjd3以及其它几个主要调节重编程的表观遗传因子的鉴定。异 位表达Jmjd3可以抑制重编程。图1H和图II中的数据显示的是三次独立实验的平均值+ 标准偏差。星号代表与对照有显著性差异（*P〈〇. 05, #p〈0. 01*#p〈0.001byStudent'st test)〇
[0018] 图2显示Jmjd3切除增加了重编程的效率和动力学。图2B和2C中的数 据显示的是三次独立实验的平均值+标准偏差。星号代表组与组之间有显著差异 (*p〈0. 05, **p〈0.OlbyStudent'sttest)。
[0019] 图3显示的是鉴定参与增强重编程的Jmjd3的靶基因。图3B、3D、3E、3F中 的数据是三次独立实验的平均值土标准偏差。星号代表组与组之间有显著差异 (*p〈0.05, **p〈0. 01***p〈0.OOlbyStudent'sttest)。
[0020] 图4显示的是PHF20对iPSCs的维持和重编程有关键作用。图4D、4F、4H、4I、4J、 4K和4L中使用的数据是三次独立实验的平均值土标准偏差。星号代表组与组之间有显著 差异（*p〈0. 05, **p〈0.OlbyStudent'sttest)。
[0021] 图5显示的是Jmjd3与PHF20相互作用并引起PHF20的降解。
[0022] 图6显示的是Jmjd3靶向PHF20,通过招募E3泛素连接酶Trim26泛素化PHF20。
[0023] 图7显示的是PHF20在重编程过程中通过与Wdr5相互作用是0ct4表达所必要的。 图7A、7C-7E、7I和7J中使用的数据是三次独立实验的平均值土标准偏差。星号代表组与 组之间有显著差异（*p〈〇. 05, **p〈0.OlbyStudent'sttest)。
[0024] 图8显示的是PHF20在乳腺癌中高表达。图8A显示PHF20mRNA在乳腺癌中的表 达通过实时定量PCR测定。图8B用蛋白免疫印迹的方法分析PHF20在乳腺癌细胞和正常 细胞系的表达情况。MCF-10A是一个正常乳腺细胞系。
[0025] 图9显示的是PHF20特异的T细胞的产生及表征。（图9A)PHF2093S946特异的CD8+T 细胞是通过对正常志愿者的PBMCs用PHF20肽体外刺激获得，并用于确定装载有不同浓度 的PHF2093S946肽及对照肽（阴性对照）的T2细胞的识别。（图9B)PHF20 938 946特异的T细 胞在培养基中单独或与1442+?册20+(]\07-7)或111^-42-?册20+(01]4475，]\0^-]\?-361)乳 腺癌细胞系共培养。一个正常的乳腺上皮细胞系MCF-10A作为对照。通过检测IFN-y的释 放来检测T细胞的活性。（图9C)PHF2093S946特异的⑶8+T细胞通过LDH测试检测对MCF-7 的细胞毒性。HLA-A2阴性的PHF20+PC3作为LDH测试的阴性对照。所用数据为平均值土 标准偏差。结果代表三次独立实验。*P〈〇. 05, #P〈0. 01，*#P〈0. 001与对照相比。
[0026] 图10显示的是在DCs中降低负调控因子的表达可增强抗原特异性免疫反应。抗 肿瘤免疫反应在基于纳米技术的传递系统下会有进一步提高。
[0027] 图11显示的是一个MSV传递系统以及利用它在肿瘤治疗模型中产生有效抗肿瘤 免疫。（A)脂质体存在及不存在两种条件下MSV示意图展示。（B)通过负载有MSV/脂质体 的DCs产生抗肿瘤免疫，MSV/脂质体包含TRP-2,CpG(TLR9的一个配体）以及MPLA(单脂酰 脂质A，TLR4的一个配体）。小鼠静脉注射B16肿瘤细胞（每只鼠注射0. 3*106个细胞，重悬 于200yLPBS中）。4天后这些荷瘤小鼠用负载有所指肽或纳米颗粒的DCs免疫（0. 3*106 个细胞）。接种疫苗14天后检查肺转移。（C)不同处理组中B16的肺转移灶数目。四个组 中的数据250代表数目太多无法统计。
[0028] 图12展示的是DC/PHF20疫苗与抗H)-l联合治疗。
[0029] 图13展示的是DC/肽抗原与抗H)-l联合治疗的两个时间表。
[0030] 图14HLA-A2转基因小鼠中PHF20特异的T细胞免疫应答。用DC/PHF20肽免疫 HLA-A2转基因小鼠。8天后，从脾脏中分离T细胞，检测它们识别PHF20或无关肽的能力。 用⑶8-FITC抗体染色，接着用IFN-g-PE抗体胞内染色。选通⑶8+T细胞群后进行FACS分 析。
[0031] 发明描述
[0032] Jmjd3负调控体细胞重编程
[0033] 在Tet-0_4FMEFs中用shRNA敲低技术鉴定出许多组蛋白修饰相关的蛋白是体细 胞向iPSCs重编程过程中所需要。只有Jmjd3 -个蛋白在这一过程中起到负调控作用。
[0034]Jmjd3可以通过上调启动子H3K27中三甲基化水平，从而在上调In4a/Arf中起重 要作用（Aggeretal.，2009;Barradasetal.，2009)。它通过H3K27的去三甲基化与其 他革巴基因相互作用以及通过与KIAA1718相互作用促进转录延长（Chenetal.，2012)。对 In4a/Arf表达造成的这些影响可以导致衰老和抑制重编程（Hongetal.，2009;Kawamura etal.，2009;Lietal.，2009;Marionetal.，2009;Utikaletal.，2009)。如上文所述， 切除Jmjd3可以降低细胞的衰老并且通过降低In4a和p21表达促进Jmjd3缺陷的MEFs重 编程。然而，一些证据表明Jmjd3负调控重编程过程是通过一个新途径实现的，即不依赖于 组蛋白甲基化酶的途径。首先，同时降低Jmjd3、Ink4a或p20的表达与单独降低它们中任 意一个的表达相比明显会产生更多的iPSC克隆，这表明，Jmjd3抑制重编程的功能不仅仅 是通过我们之前预测的上调Ink4a或p20实现的；其次，尽管在Jmjd3缺失的MEFs中异位 表达全长的Jmjd3可以恢复Ink4a/Arf的表达并明显抑制重编程，但是我们用Jmjd3的突 变体Jmjd3-AlmjC和Jmjd3-111390A也可以达到相同效果，而两个突变体都存在H3K27me3 去甲基化酶活性，并不能调控Ink4a/Arf表达。因此Jmjd3利用脱甲基化酶活性依赖性及非 依赖性两种机制调控体细胞重编程，并且后一种方式起主导作用。我们搜寻可能参与Jmjd3 介导的脱甲基化酶非依赖性介导的调控重编程过程的靶分子，经过广泛筛查我们找到了 PHF20。降低PHF20的表达会显著引起ESCs和iPSCs的分化，然而，如果ESCs或iPSCs用 RA处理或去除LIP会引起PHF20, 0ct4和Nanog表达下调，证明PHF20的表达对维持多能性 状态的重要作用。PHF20最初被认为是抗体反应性蛋白，在包括肝癌和髓母细胞瘤在内的 几种肿瘤中高表达（Fischeretal.，2001;Wangetal.，2002)。PHF20已被鉴定为"组蛋 白识别器"，因为它可以特异地识别H3K4，H3K9，H4K20和H4K79的二甲基化（Adams-Cioaba etal.，2012;Kimetal.，2006)。最近的研究表明PHF20可以识别p53的K370和K382而 甲基化，并且在对抗DNA受伤时可以在转录水平及转录后水平调控p53(Lietal.，2012b; Parketal.，2012)。PHF20敲除的小鼠出生不久就会死亡（Badeauxetal.，2012)。此外 PHF20缺失的小鼠不能产生ESC。与此相应，PHF20缺失的MEFs重编程过程会受到完全抑 制，这说明PHF20是iPSC重编程及产生ESCs的一个绝对必要因子。
[0035]Jmjd3在决定T细胞谱系的过程中有重要的作用，它通过一个去甲基化酶活性非 依赖性途径，与⑶4+T辅助细胞（Thl)主要调控分子T-bet及染色体塑造BAP复合体的主要 催化亚基Brg-1相互作用实现的（Milleretal.，2010)。在这个例子中，Jmjd3与PHF20相 互作用，引起PHF20泛素化，并通过蛋白酶体途径降解。虽然Jmjdl蛋白的C-端和N-端均可 以结合到PHF20的N-端，Jmjd3蛋白自身并不能引起PHF20的K48泛素化。相反，它会招募 一个E3泛素连接酶Trim26到PHF20上引起PHF20的K48泛素化。在敲低Trim26时PHF20 的泛素化和降解也随之消失，从而增强iPSC的重编程。进一步研究表明全长的Jmjd3,以 及某些突变体（Jmjd3-AJmjC和Jmjd3-H1390A)，但不包括Jmjd3-N，Jmjd3-M，Jmjd3-C突变 体，可以结合到PHF20介导PHF20的泛素化。这些结果强调了Jmjd3-Trim26介导的泛素化 在负调控重编程过程中所起的重要作用。
[0036]iPSCs的完全重编程伴随着不同的DNA甲基化模式改变以及内源性的0ct4 以及其他几种ESC标志基因的活性表达（PlathandLowry, 2011;Stadtfeldand Hochedlinger，2010)。然而，是否是因为PHF20缺失引起这些内源标志基因未能激活，因 此不能成功地重编程？ 一项最新的研究表明外源的0ct4与其他主要的重编程因子首先在 MEFs中引起Wdr5的表达，随后形成Wdr5-〇ct4复合体结合到0ct4启动子，引起内源的0ct4 活化（Angetal.，2011)。PHF20与0ct4表达的直接联系是，PHF20不仅可以结合到0ct4 的启动子区域，还会与Wdr5和M0F特异结合。最近的研究显示M0F参与ESC自我更新和功 能以及调控Nanog表达（Lietal.，2012a)。PHF20的缺失会降低Wdr5及M0F结合到0ct4 启动子的能力，暗示了这种蛋白在活化内源0ct4表达以及增强iPSCs完全重编程所起的关 键作用。与此观念相一致的是，这一实例中所显示的结果进一步证明PHF20缺失会引起许 多内源性的ESC标记基因在重编程过程中不能再活化。尽管内源性的Sox2和Nanog表达 缺失可以通过外源0ct4的表达得到弥补（在Dox存在的条件下）。这表明PHF20直接或 间接影响许多ESC的关键基因表达。ChIP-PCR和ChIP-seq分析表明PHF20和Wdr5结合 到0ct4的启动子，但并不会与Sox2,Nanog，Dnmt3i，Esgl，Eras，Rexl或Crinto的启动子 位置结合。此外，ChIP-seq分析显示PHF20和Wdr5均会结合重要的表观遗传因子基因，包 括Bafl55，Brg-l和Sal4。因此，这就可以解释为什么PHF20缺失的MEFs不能非完全重编 程的表现不能靠0ct4或4F(0SKM)的过表达来弥补，并且可以以此推断出PHF20是一个上 游调控分子，调控0ct4及其他许多重要的ESC标志基因，因此，本研究提供的一个机制联系 是Jmjd3介导PHF20降解导致重编程的缺陷。
[0037] 基于这些发现，我们提出一个Jmjd3-PHF20轴如何