硫酸氢盐转化用EpitectBisulfiteKit(QIAGEN)进行。分子克隆根据产品说 明书采用TopoTA克隆试剂盒（Invitrogen)。
[0126]Jmjd3脱甲基酶活性测定
[0127] 293T细胞转导HA-Jmjd3或各种HA-Jmjd3突变体。转导48h后收集核裂解物。 Utx/Jmjd3H3K27me3去甲基化酶活性检测试剂盒（Epigentek)被用来确定Jmjd3H3K27me3 去甲基化酶活性。
[0128] 免疫荧光染色
[0129] 细胞在预先处理的盖玻片上培养，用4%PFA固定和用0. 5%TritonX-100透明。 细胞用一抗染色 0ct4(SantaCruz)，SSEA-1 (Abeam)orHA，然后分别用共辄TexasRed的二 抗染色。细胞核用DAPI(Invitrogen)复染。细胞用配备C350FX摄像头的LeicaDMI4000B 倒置荧光显微镜拍照。
[0130] 碱性磷酸酶染色（AP染色）
[0131] 按照碱性磷酸酶检测试剂盒（Vectorlab)的说明书来确定碱性磷酸酶活性。
[0132]免疫沉淀（IP)，免疫印迹和泛素化分析
[0133] 细胞在低盐裂解缓冲液或含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。按照先前描 述的（Cuietal.，2010)，样品于10000g离心lOmin，上清液加入40-yL抗HA凝胶或抗 FlagM2亲和力凝胶。样品用特异性抗体在4°C免疫沉淀过夜。珠子清洗5遍，用3XSDS/ PAGE加样缓冲液洗脱。用3XSDS/PAGE样缓冲液，并煮沸用于免疫印迹。按照描述使用抗 PHF20的特异性抗体（CellSignalingTechnology)，然后用固定化蛋白A/G(Sigma)孵育 进行内源性免疫共沉淀试验。化学发光的HRP底物（Millipore)用于蛋白质检测。为了分 析PHF20泛素化，HEK293T细胞转导PHF20,JMJD3,Trim26有或没有WT泛素或仅含一个在 48位点（K48)或63位点（K63)赖氨酸的泛素突变体。转导后36h，细胞裂解物用指示抗体 进行免疫沉淀，包括抗PHF20和抗Flag抗体（Sigma)中，然后用抗泛素或抗K48泛素抗体 做免疫印迹分析来检测PHF20的泛素化。
[0134] 染色质免疫沉淀（ChIP) -PCR和ChIP-序列分析
[0135] 根据印超染色质免疫沉淀反应手册（Sigma)进行ChIP的测定。简言之，ESCs和 iPSCs最终生长至大约1-5X107个细胞用于每个反应。细胞用1 %甲醛溶液在室温下交联 l〇min，并用0. 125M甘氨酸淬灭。细胞用1XPBS清洗两次。细胞重悬，裂解并超声溶解，和 剪切交联的DNA。将所得的染色质提取物与10g抗体在4°C孵育过夜。第二天，每个样品加 入15L封闭的珠子，然后在4°C孵育lh。珠子用RIPA缓冲液洗涤5次。复合物通过在洗 脱液中加热至65°C，从珠子上洗脱下来。输入DNA(从超声保留）同时交联逆转处理。DNA 用RNaseA、蛋白酶K处理并纯化。用于IP的一抗：PHF20(CellSignalingTechnology)， Wdr5 (Bethyl)，鼠/兔IgG和RNA核糖核酸聚合酶II(Sigma)。相对倍富集通过测定免疫沉 淀效率（免疫沉淀的DNA量/输入样本量）进行计算。对于ChIP-Seq分析，总共30ng的 免疫沉淀DNA片段用于ChIP-Seq文库构建。应用Illumina测序。序列从PHF20，Wdr5和 聚合酶II拉升下来的ChIP-Seq文库读取与使用ELAND软件读取的鼠_8基因组一致。统 计数据的倍数变化用基于MA图的方法进行评估（Wangetal.，2010)。
[0136]ChIP-Seq文库用标准方法建立（详阅：www.illumina.com)。生成的文库在I lluminaMiseq设备上连续测序两次，对每个样品获得数据放在一起进行分析。生成的 序列结果（碱基2_42个）用130￥1：16〇.12.7软件与鼠基因组1111119比对。（]^11^11163(16七 al.，2009)。结合峰使用QuEST2. 4软件（Valouevetal.，2008)结合标准参数和n倍的特定 富集进行分析。由此产生的全基因组结合数据在Cistrome网站用实用工具进行分析（Liu etal.，2011)。全基因组结合模式用CEAS分析（Shinetal.，2009)。过表达的转录因子 结合基序用序列位点注释，在转录因子数据库中查询鼠或人的基序（Matysetal.，2006)。 转录起始位点（TSS)邻近结合位点采用Genomatix软件集分析(http://www.genomatix. _)。结合和未结合基因意义丰富。基因本体论分析临近结合位点采用基于网络的生物信 息学数据库进行分析(http: //david.abcc.ncifcrf.rov/)。
[0137]实时定量PCR(real-timePCR)
[0138] 互补DNA由293T、MEF和iPS细胞的总RNA和SuperscriptII逆转录酶 (Invitrogen)，用寡核苷酸（dT)作为引物合成得到。基因转录通过实时PCR技术用专门用 于ABIPRISM荧光定量PCR仪（Invitrogen)的SYBR绿色荧光实时定量PCRSuperMix在 ABIPRISM7000荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems)上检测。所有目标基因表达水平 数值用肌动蛋白标定。用于实时定量PCR的引物列在表1中。
[0139] 在重编程过程中敲除PHF20基因
[0140] 为了确定PHF20在不同重编程阶段的作用，PHF20在不同时间点敲除。在前一天， 将Tet-0-4FM2-11MEFS接种于饲养层细胞上，然后在第0天用基于组成型表达shRNA的 PHF20特异性慢病毒转导这些细胞。培养基（包含这些病毒）用含强力霉素的新鲜ES培养 基换液。为了在其他时间段敲除，细胞在第4、8或12天如文所述用PHF20特异性的或对照 慢病毒的shRNA在含强力霉素的ES培养基中感染。感染的细胞在含强力霉素的ES培养基 培养，并在第14天计数AP+克隆。
[0141]从MEFs和Tet-0-4FMEFs生产iPSCs
[0142] 鼠源iPSCs按先前描述的方法做一些小的改动后进行生产（Takahashiet al.，2007a)。简单的说，MEFs(1-8X104/孔）接种在6孔细胞培养板里辐照过的MEFs上。 第二天，细胞用等量的表达4种逆转录酶的慢病毒和逆转录酶进行转导。第三天，转导的 MEFs用含2yg/mL强力霉素的mESC培养基培养14天。通过用含强力霉素的mESC培养基 处理MEFs，Tet-0-4F转基因MEFs用于生产iPSCs。iPSCs形成效率基于AP阳性的iPSC克 隆和播种的MEFs起始细胞数量进行计算。如前描述生产人的iPSC(Parketal.，2008)。
[0143] 用Tet-0_4FMEFs和shRNA敲除筛查鉴定调制重编程的表观遗传因子
[0144]Tet-0_4F转基因MEF细胞用15个表观遗传因子特异性的慢病毒shRNA转导，然 后重新播种于所需密度的辐照过的饲养层细胞上。第二天，加入包含2yg/mL强力霉素的 mESC培养基并且每天补液。克隆在第12-14天染色检测AP活性，如前描述生产慢病毒质粒 并浓缩（Pengetal.，2005)。
[0145] 实时定量PCR和免疫印迹
[0146]如前所述，总RNA用Trizol(Invitrogen)提取，层析纯化和用SuperScriptOII 逆转录酶试剂盒（Invitrogen)逆转录（Cuietal.，2010)。对于ChIP-qPCR分析，lng ChlP-DNA用于每个PCR。所有qPCR用SYBRGreen(AppliedBiosystems)进行分析。为了 获得全细胞蛋白提取物用于免疫印迹分析，细胞用低盐裂解缓冲液或RIPA缓冲液裂解。引 物序列和抗体如表1所示。
[0147]Co-IP和ChIP分析
[0148] 如前所述，细胞用低盐裂解缓冲液裂解，与抗体孵育过夜，蛋白A/G磁珠捕获（Cui etal.，2010)。煮沸加样缓冲液洗脱免疫沉淀物。取10yL和2%全细胞裂解物用于每个 免疫印迹。293T细胞附加表位免疫共沉淀用Flag、HA或Myc抗体在低盐裂解缓冲液中进 行。ChIP用印超染色质免疫沉淀试剂盒（Sigma)检测。引物序列和抗体如表1所示。
[0149] 结果
[0150] 鉴定Jmjd3为重编程抑制剂
[0151] 体细胞中转录因子（4个转录因子）的异位表达可以诱导iPSCs产生（Okitaet al.，2007;Takahashietal.，2007b;TakahashiandYamanaka, 2006)，但是重编程方案需 要病毒转导必需因子，导致不同的结果。为了建立一个更简单的基于诱导4个转录因子的 方法来生产iPSCs，我们建立了表达四环素（Tet) -0-诱导的Sox2和K1f4的转基因小鼠，然 后用这些小鼠与携带rtTA-M2反向四环素反式激活因子的Tet-0-诱导的0ct4和Myc转基 因小鼠杂交（图1A)。鼠胚胎成纤维细胞（MEFs)由表达Tet-0-0ct4, -Sox2, -Klf4和-Myc 基因和携带rtTA-M2的转基因小鼠产生，一旦他们用多西环素（Dox)处理就检测它们表达 4种转录因子的能力。正如图1B所示，当用2yg/mL的Dox处理24h时，0ct4,Sox2,Klf4, 和Myc蛋白易于通过免疫印迹分析检测。结果表明这些表达MEFs(Tet-0-4FMEFs)的4种 转录因子在Dox存在时可有效产生iPSCs(图1C)。除去Dox在第8天之前或当天可显著 减少AP+克隆产生，但在第10天除去Dox或在在第10天以后采用3个不同（WT,Tet-0-4F and0ct4-GFP)的类型的MEFs，AP+iPSC克隆数量没有明显不同。这些完全编程的iPSCs 的AP，SSEA-1和Nanog染色为阳性（图ID-图1G)。这些结果与其他研究团队（Careyet al.，2010;Stadtfeldetal.，2010;Wernigetal.，2008)的报道一致，表明基于Tet-〇_4F MEF重编程可以提供一个可靠的系统来筛查增强或减弱重编程效率的表观遗传因子。
[0152] 发明人预测当敲除细胞系特异性分化基因的表达时，涉及组蛋白修饰的表观遗传 因子在复活包括0ct4,Sox2和Nanog的富含干细胞的基因表达起关键作用，从而显著增加4 种转录因子介导的重编程效率。为了检验这个假设，一组高敲除效率的shRNAs(>70%)用 于筛选编码组蛋白甲基转移酶或脱甲基酶的基因，然后转导入Tet-0-4FMEFs。经过3轮筛 选，结果表明敲除H3K27甲基转移酶Ezh2和许多包括FbxllO,Taridlb，Jaridld，Jarid2,J mjdla，Jmjd2c和Utx的组蛋白去甲基转移酶基因，可显著降低重编程效率（图1H)。这与 先前的结果一致，表明FbxllO,Ezh2,Jmjdla，Jmjd2c和Utx在ESC恢复和iPSC重编程起至 关重要的作用（Ezhkovaetal.，2009;Lohetal.，2007;Mansouretal.，2012 ;0nderet al.，2012;Wangetal.，2011)。相比之下，敲除Jmjd3显著增加4个转录因子介导的重编 程效率，当它的异位表达导致重编程效率降低（图10)。虽然此过程无疑需要许多组蛋白甲 基转移酶和脱甲基酶，这些发现表明Jmjd3是体细胞产生iPSC的一个障碍。Jmjd3的这个 独特特征导致将其选择作进一步研究。
[0153] Jmjd3敲除提高重编程效率和动力学
[0154] 为了进一步明确Jmjd3在重编程中的作用，用Cre-LoxP系统有针对性的敲除外显 子15-21来构建Jmjd3敲除的小鼠（图2A)。来自通过用JenjdS1小鼠和由次黄嘌呤鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶启动子（Hpri-Cre)驱动表达Cre重编程基因的小鼠杂交来完全敲除Jmjd3 的小鼠出生后存在肺部和骨骼形成的缺陷，很快死亡。RT-PCR和蛋白质印迹分析Jmjd3缺 陷MEFs显示，对比WT对照组，在Jmjd3缺陷型MEFs中没有Jmjd3表达（图2A)。与Jmjd3 敲除获得的结果一致，结果表明4个转录因子重编程的Jmjd3缺陷型MEFs比起WTMEFs产 生更多的iPSC克隆（图2B)。对比WTMEFs的结果，通过Jmjd3缺陷型3个转录因子诱导的 MEFs(0ct4,Sox2andKlf4)也获得了强大的重编程（图2B)。相比之下，Ezh2缺陷型MEFs 通过用三苯氧胺处理Ezh2n'4°7:Cre-ESRMEFs产生，显著抑制4个转录因子介导的MEFs重 编程效率（图2C)，进一步证实Ezh2是重编程所必需的。更重要的是，结果表明重编程是由 3个转录因子或4个转录因子介导，AP4iPSC克隆在Jmjd3缺陷型MEFs比在WTMEFs中出 现的更早，表明Jmjd3敲除显著增加重编程的动力学和重编程效率。
[0155] 由Jmjd3缺陷型MEFs产生的iPSCs显示ESC特有的形态学和标记，如AP，磷酸酶， SSEA-1和Nanog免疫染色阳性（图2E-图2G)。他们还形成畸胎瘤包含所有3个胚胎胚芽 层（外胚层、中胚层和内胚层）（图2H-图21)，注入BALB/C宿主囊胚后形成嵌合体（图 2J)。因此，由Jmjd3缺陷型MEFs产生的iPSCs和衍生自WTMEFs的iPSCs-样拥有同样 的全能性特征，表明缺失Jmjd3增强Jmjd3重编程的效率和动力学，支持了这种蛋白负调控 的角色。
[0156]Jmjd3负调控Ink4a/Arf基因座的重编程
[0157] 发明者接着研究了Jmjd3敲除如何增强重编程。尽管Jmjd3表达被认为通过C端 Jumonji域脱甲基Jumonji域修饰启动子区域H3K27甲基化，增加MEFs中Ink4a/Arf基因 座的表达（Aggeretal.，2009;Barradasetal.，2009)。此外，包括Ink4a,Arf和p21 在 内几个关键分子的表达，在细胞生长停滞和老化起着关键作用，并且在显著增加重编程效 率的同时，它们的缺陷可以延缓细胞老化（Hongetal.，2009;Kawamuraetal.，2009;Li etal.，2009;Marionetal.，2009;Utikaletal.，2009)。为了评估这些分子在Jmjd3 缺 陷型MEFs中的表达水平，我们做了RT-PCR和蛋白质印迹分析。观察到对比WT细胞的结果， Jmjd3缺陷显著降低InklalibilfmRNA和蛋白质的表达（图3A)。尽管WTMEFs和Jmjd3 缺陷型MEFs的p21mRNA没有明显差异（图3A)，Jmjd3缺陷型MEFs细胞的p21蛋白表达也 降低。因此，Jmjd3缺陷显著减低Ink4a和Arf蛋白的表达，降低p21蛋白的程度较小。这 些作用反过来可以降低细胞衰老和增加细胞增殖。的确，结果表明Jmjd3缺陷型MEF细胞 比WT细胞生长更快（图3B)。细胞衰老是根据Jmjd3缺陷型MEFs半乳糖苷酶03-gal染色 也减少，对比WTMEFs的结果（图3C)。尽管Jmjd3缺陷型MEFs繁殖5-7代后会经历衰老 危机，因Jmjd3缺陷造成的衰老短期内减少和细胞增殖增加可能形成一个短暂的提高这些 MEFs重编程的效率和动力学的方法。
[0158] 为了确定Ink4alArf和p21下调对Jmjd3缺陷型MEFs高效重编程的影响程度， 通过特异性的shRNAs敲除这些基因的表达，并评估其在Tet-0-4FMEFs中的作用。虽然 通过shRNAs单独敲除Jmjd3,Ink4a/Arf或p21增加重编程效率（对比对照组shRNA转 导MEFs)，但是同时敲除Jmjd3和Ink4a/Arf或p21的重编程效率几乎翻了一倍（图3D) 表明Jmjd3对重编程可能有附加效应，这些效应与Ink4a，Arf?和p21介导的效应不重叠。 构建Jmjd3-N(包含N端450个氨基酸），Jmjd3-AJmjC(包含催化Jumonji域敲除）和 Jinkl3-111390A(包含一个催化域的点突变），所有这些缺少H3K27三甲基的脱甲基活性。 实验测试Jmjd3介导的重编程抑制是否依赖Ink4a/Arf和p21的表达，全长Jmjd3的异 位表达而不是Jmjd3-N，Jrnjd3-4JnajC或Jmjd3-H1390A，在Jmjd3缺陷型MEFs仍然保留 Ink4a/Arf的表达（图3E)并几乎完全抑制重编程（图3F)。出人意料的，2个Jmjd3突变 (Jmjd3-AlmjC和Jmjd3-H1390A)缺乏H3K27去甲基活性，不能上调Ink4a/Arf表达仍然能 够抑制在Jmjd3缺陷型MEFs里的重编程。这些结果明确Jmjd3可以通过依赖脱甲基反应 和不依赖脱甲基反应的方法调节重编程。
[0159] PHF20是Jmjd3蛋白质的一个关键靶标
[0160] 为了寻找Jmjd3的靶标，我们在WTMEFs和Jmjd3缺陷型MEFs中对比分析miRNA和 mRNA基因表达，但是该研究没有找到任何基因，导致Jmjd3缺陷型MEF细胞中重编程效率 提高。因此，我们将注意力转移到组蛋白表观遗传因子的表达水平上，因为他们是重编程体 细胞为ESC样状态的关键（PlathandLowry, 2011;StadtfeldandHochedlinger, 2010)。 比较59个基因的表达编码组蛋白修饰蛋白，对比MEFs在iPSCs/ESCs中的18个基因在RNA 水平显著，并且在iPSCs/ESCs之间与人纤维母细胞的11个基因被上调。对比纤维母细胞 和iPSCs/ESCs的表达模式确定7个基因在鼠和人的iPSCs/ESCs高表达。这些基因，只有 PHF20 (编码PHD指蛋白20,也叫GLEA2)在Jmjd3缺陷型MEFs，iPSCs和ESCs表达明显增 加对比其在WTMEFs(图3G);然而，WTMEFs和Jmjd3缺陷型MEFs在PHF20mRNA表达上没 有明显差异。
[0161]H3K27三甲基在WTMEFs和Jmjd3缺陷型MEFs或iPSCs也没有明显差异。此外， PHF20在睾丸，卵巢和ES细胞中强表达；在胎盘，肺，肝和肌肉中弱表达；在其他组织中仅仅 轻微或根本不表达。在时间进程实验中为了确定PHF20在重编程过程的表达模式，发现其 在WTMEFs中的表达平缓增加，其在Jmjd3缺陷型MEFs中表达加快（图3H)。这些结果表 明PHF20蛋白是Jmjd3的一个关键靶标，从而可能在更新和维持ESCs，iPSCs或两者的过程 中起重要作用。
[0162]ESCs和i