用于炎性疾病治疗的联合形式的制作方法

专利名称：用于炎性疾病治疗的联合形式的制作方法
背景技术：
本发明涉及炎性疾病的治疗。
当组织被病毒、细菌、创伤、化学品、热、冷或任何有害刺激损伤时会出现炎症。化学品包括舒缓激肽，组胺，5-羟色胺和其他物质被释放，吸引组织巨噬细胞和白细胞定位在一定区域内来吞噬和破坏外来物质。在此过程中，释放化学介质例如TNFα，导致炎症。炎性疾病是其中炎症持续或慢性的那些。炎性疾病的一个实例是骨关节炎。
免疫炎性疾病(例如，类风湿性关节炎，牛皮癣，溃疡性结肠炎，克罗恩氏病，中风诱发的脑细胞死亡，关节僵直性脊椎炎，纤维肌痛，和自身免疫性疾病例如哮喘，多发性硬化，I型糖尿病，系统性红斑狼疮，硬皮病，系统性硬化，和斯耶格伦氏疾病综合征)是特征为免疫系统调控障碍且机体防御对其自身健康组织的不适当动员的炎性疾病。
全球百分之一的人患有类风湿性关节炎，一种使关节炎症肿胀、疼痛和最后变形的不间断的、进行性疾病。根据关节炎基金会所说，类风湿性关节炎当前影响着2百万以上的美国人，其中妇女患该疾病的人可能高三倍。类风湿性关节炎特征在于关节内层和/或其他内部器官的炎症，并且存在升高数量的淋巴细胞和高水平的促炎细胞因子。
类风湿性关节炎的治疗通常包括给予(i)非甾类抗炎药物(NSAID类；例如，detoprofen，双氯酚酸钠，二氟尼柳，依托度酸，非诺洛芬，氟比洛芬，布洛芬，消炎痛，酮洛芬，甲氯灭酸盐，甲氯灭酸，meloxicam，nabumeone，萘普生钠，噁丙嗪，吡罗昔康，舒林酸，托美丁，celecoxib，rofecoxib，阿斯匹林，水杨酸胆碱，双水杨酸酯，和水杨酸钠和水杨酸镁)；(ii)甾类化合物(例如，可的松，地塞米松，氢化可的松，甲泼尼龙，强的松龙，强的松，去炎松)；(iii)DMARD类，即，疾病修饰的抗风湿药物(例如，环孢菌素，硫唑嘌呤，氨甲蝶呤，leflunomide，环磷酰胺，羟氯喹，柳氮磺胺吡啶，D-青霉胺，米诺环素，和金)；或(iv)重组蛋白质(例如，ENBREL)(etanercept，一种可溶性TNF受体)和REMICADE(infliximab)一种嵌合单克隆抗-TNF抗体)。
需要开发出治疗类风湿性关节炎和其他炎性疾病的新方案。
发明概述我们发现阿莫沙平(2-氯-11(1-哌嗪基)二苯并[b，f][1，4]氧杂)和强的松龙(也称作1-脱氢皮质醇；1-脱氢氢化可的松；1，4-孕二烯-11β，17α，21-三醇-3，20-二酮；和11β，17α，21-三羟基-1，4-孕二烯-3，20-二酮)的联合形式能够对外周血单核细胞(PBMCs)中引起的TNFα水平产生巨大抑制作用。
阿莫沙平是三环类抗抑郁药(TCA)。基于阿莫沙平与强的松龙一致抑制TNFα水平的能力，所属领域技术人员应懂得其他TCAs也可以用于本发明中。也可以使用不是三环类抗抑郁药的阿莫沙平的结构类似物。示例结构类似物包括，例如，氯噻平，哌拉平，氟哌拉平，和二苯并(b，f)(1，4)氧杂氮杂，2-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-，一氢氯化物。
强的松龙是一种皮质甾类。基于皮质甾类族的共同结构特征和明确作用机理，所属领域技术人员应理解其他皮质甾类可以与阿莫沙平或其他TCA类联合用于治疗炎性疾病。
所以，本发明特征在于一种治疗患有炎性疾病的患者的方法，该方法通过同时或各自在14天内给予该患者足以抑制TNFα水平足够给该患者带来治疗益处量的(i)TCA(例如，阿莫沙平)；和(ii)皮质甾类(例如，强的松龙)。在一个实施方式中，两种化合物是阿莫沙平和强的松龙。
本发明特征还在于一种治疗患有炎性疾病的患者的方法，该方法通过同时或各自在14天内给予该患者足以抑制TNFα水平足够给该患者带来治疗益处量的(i)氯噻平，哌拉平，氟哌拉平，或二苯并(b，f)(1，4)氧杂氮杂，2-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-，一氢氯化物；和(ii)皮质甾类(例如，强的松龙)。
优选地，本发明的两种化合物各自在10天内给药，更优选各自在5天内给药，和首选各自在24小时内给药或同时给药。
按照本发明被治疗的疾病可以是，例如，类风湿性关节炎，牛皮癣，溃疡性结肠炎，克罗恩氏病，中风诱发的脑细胞死亡，关节僵直性脊椎炎，和纤维肌痛，哮喘，多发性硬化，I型糖尿病，系统性红斑狼疮，硬皮病，系统性硬化症，和斯耶格伦氏疾病综合征。
在上述治疗方法中，优选将两种化合物在还含有药学可接受载体的一种药用组合物中一起提供。
本发明特征还在于一种药用组合物包括(i)TCA(例如，阿莫沙平)；和(ii)皮质甾类(例如，强的松龙)，以及药学可接受载体，稀释剂或赋形剂。
本发明特征还在于一种鉴定用于治疗患有炎性疾病的患者的化合物的方法。该方法包括步骤在试管内使免疫细胞与(i)TCA或皮质甾类；和(ii)候选化合物接触，并且相对于(a)与TCA或皮质甾类接触但没有与候选化合物接触的免疫细胞，和(b)与候选化合物接触但没有与TCA或皮质甾类接触的免疫细胞测定该免疫反应是否被调制。当与所述的TCA或皮质甾类联合时，那些与对照相比调制该免疫反应达到更高程度的候选化合物是潜在的有效治疗患有炎性疾病患者的化合物。
本发明中所用的化合物包括在此所述的以其任意药学可接受形式的那些，包括异构体例如非对映异构体和对映异构体，盐、溶剂化物和其多晶型物，以及在此所述化合物的外消旋混合物。
所谓＂三环类抗抑郁药＂或＂TCA＂是指具有式(I)、(II)或(III)之一的化合物
其中各X独立地是，H，Cl，F，Br，I，CH3，CF3，OH，OCH3，CH2CH3，或OCH2CH3；Y是CH2，O，NH，S(O)0-2，(CH2)3，(CH)2，CH2O，CH2NH，CHN，或CH2S；Z是C或S；A是支链或直链、饱和或不饱和的具有3-6个碳的烃链；各B独立地是H，Cl，F，Br，I，CX3，CH2CH3，OCX3或OCX2CX3；和D是CH2，O，NH，S(O)0-2。
在优选实施方式中，各X独立地是H，Cl或F；Y是(CH2)2，Z是C；A是(CH2)3；和各B独立地是H，Cl或F。
示例三环类抗抑郁药包括，例如，阿莫沙平，8-羟基阿莫沙平，7-羟基阿莫沙平，克塞平，琥珀酸克塞平，盐酸克塞平，8-羟基克塞平，阿米替林，clopramine，多塞平，丙咪嗪，三甲丙咪嗪，去甲丙米嗪，去甲替林，和普罗替林。
所谓＂皮质甾类＂是指天然或合成的甾类激素，其可以衍生自胆甾醇且特征在于氢化的环戊烷并全氢菲环系。天然皮质甾类一般是由肾上腺皮质产生的。合成的皮质甾类可以卤化。活性所需的官能团是在Δ4位的双键，C3酮和C20酮。
皮质甾类可以具有糖皮质激素和/或盐皮质激素活性。
示例皮质甾类包括，例如，地塞米松，丙酸氯地米松，确炎舒松，醋酸确炎舒松，去炎松，己酸丙炎松，氯地米松双丙酸酯，氯地米松双丙酸酯一水合物，特戊酸氟地塞米松，双醋二氟松，醋酸氟轻松，氟氢缩松，氟甲孕松醋酸酯，丙酸倍氯他索，去羟米松，氟甲睾酮，氟强的松龙，氢化可的松，醋酸氢化可的松，氢化可的松丁酸酯，氢化可的松磷酸钠，氢化可的松琥珀酸钠，氢化可的松环戊丙酸酯，氢化可的松probutate，戊酸氢化可的松，醋酸可的松，醋酸对氟米松，甲基强的松龙，甲基强的松龙醋酸酯，甲基强的松龙琥珀酸钠，强的松龙，强的松龙醋酸酯，强的松龙磷酸钠，强的松龙叔丁乙醇酸酯，氯氟土龙特戊酸酯，flucinolone，地塞米松21-醋酸酯，丙酸氯地米松17-特戊酸酯，异氟龙，9-氟可的松，6-羟基地塞米松，二氯松，甲二氯松，flupredidene，去氧倍他米松，溴氟龙，氯二氟美松，去氢氯氟美松，二氟米松，醋酸异氟龙，氟羟基雄甾烯二酮，丙酸倍氯米松，氟地塞米松，二氟松，氟轻松，氯氟美松，可的松，对氟米松，氯氟土龙，强的松龙21-半琥珀酸酯游离酸，强的松龙间磺苯甲酸酯，强的松龙叔丁乙醇酸酯，和醋酸确炎舒松21-棕榈酸酯。
所谓＂低剂量皮质甾类＂是指小于为治疗炎症给予患者的典型剂量的剂量。皮质甾类的低剂量实例如下皮质醇12mg/天；可的松15mg/天；强的松3mg/天；甲基强的松龙2.5mg/天；确炎舒松2.5mg/天；丙酸氯地米松250μg/天；地塞米松450μg/天；氢化可的松9mg/天。
所谓的＂阿莫沙平剂量的等效剂量＂是指TCA的剂量，该剂量与指定剂量的强的松龙合用时在患者中产生等同于一定剂量的阿莫沙平与该剂量的强的松龙合用所具有的抗炎作用。
所谓＂强的松龙剂量的等效剂量＂是指皮质甾类的剂量，该剂量与指定剂量的阿莫沙平合用产生等同于一定剂量的强的松龙与该剂量阿莫沙平合用所具有的抗炎作用。
本发明的其他特征和优点可以从下面的详述和权利要求中清楚地看出。
详述我们发现阿莫沙平和强的松龙的联合对PBMCs具有巨大的TNFα抑制活性。显示有效TNFα抑制活性的浓度对于正常细胞没有不可接受的毒性。所以，这种药物联合有效治疗炎性疾病。
阿莫沙平阿莫沙平是二苯并氧杂氮杂类的三环抗抑郁药(TCA)。结构上类似于早期的TCA类药物且也与吩噻嗪类具有相似处。
人们还不完全了解TCA类的准确作用，但可以肯定的是其重要作用之一是通过阻断多种神经递质在神经元膜的再吸收来增强去甲肾上腺素和5-羟色胺的作用。阿莫沙平也与抗精神病药物具有相同之处，其中它阻断多巴胺受体且可以引起运动障碍。阿莫沙平还阻断去甲肾上腺素的再吸收，类似于去甲丙米嗪和马普替林的作用。
基于阿莫沙平与强的松龙一致抑制TNFα水平的能力，所属领域技术人员应理解其他TCAs，以及阿莫沙平的结构和功能类似物，也可以与强的松龙(或另一种皮质甾类——如下所述)联合使用。
阿莫沙平类似物包括，例如，8-羟基阿莫沙平，7-羟基阿莫沙平，克塞平，琥珀酸克塞平，盐酸克塞平，8-羟基克塞平，氯噻平，哌拉平，氟哌拉平和二苯并(b，f)(1，4)氧杂氮杂，2-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-，一氢氯化物。
强的松龙强的松龙，一种合成的肾上腺皮质激素，具有抗炎作用，并且应用于多种炎性疾病中。人们希望减小强的松龙的给药量，因为甾族物质的长期给药可能产生严重副作用。
强的松龙是甾类的皮质甾类族的一员。基于皮质甾类族共有的结构特征和明确作用机理，所属领域技术人员应理解其他皮质甾类可与阿莫沙平或阿莫沙平类似物联合使用来治疗炎性疾病。所述皮质甾类包括，例如，地塞米松，丙酸氯地米松，确炎舒松，醋酸确炎舒松，去炎松，己酸丙炎松，氯地米松双丙酸酯，氯地米松双丙酸酯一水合物，特戊酸氟地塞米松，双醋二氟松，醋酸氟轻松，氟氢缩松，氟甲孕松醋酸酯，丙酸倍氯他索，去羟米松，氟甲睾酮，氟强的松龙，氢化可的松，醋酸氢化可的松，氢化可的松丁酸酯，氢化可的松磷酸钠，氢化可的松琥珀酸钠，氢化可的松环戊丙酸酯，氢化可的松probutate，戊酸氢化可的松，醋酸可的松，醋酸对氟米松，甲基强的松龙，甲基强的松龙醋酸酯，甲基强的松龙琥珀酸钠，强的松龙，强的松龙醋酸酯，强的松龙磷酸钠，强的松龙叔丁乙醇酸酯，氯氟土龙特戊酸酯，flucinolone，地塞米松21-醋酸酯，丙酸氯地米松17-特戊酸酯，异氟龙，9-氟可的松，6-羟基地塞米松，二氯松，甲二氯松，flupredidene，去氧倍他米松，溴氟龙，氯二氟美松，去氢氯氟美松，二氟米松，醋酸异氟龙，氟羟基雄甾烯二酮，丙酸倍氯米松，氟地塞米松，二氟松，氟轻松，氯氟美松，可的松，对氟米松，氯氟土龙，强的松龙21-半琥珀酸酯游离酸，强的松龙间磺苯甲酸酯，强的松龙叔丁乙醇酸酯，和醋酸确炎舒松21-棕榈酸酯。
治疗按照本发明联合治疗可以单独进行或与另一种治疗相结合并且可以在家、医生办公室、诊所、医院门诊科或医院提供。治疗一般是在医院开始以使医生可以密切观察到该疗法的效果且作出必要的调整。联合治疗的持续时间取决于要治疗炎性疾病的类型、患者的年龄和情况、患者疾病的阶段和类型，以及患者对该治疗的反应如何。此外，具有发展为炎性疾病的较高危险性的人(例如，遗传因素造成或先已患有炎性疾病的人)可以接受预防性治疗来阻止或延迟炎性反应。
所述联合的各组分的给药剂量、频率和方式可以独立地进行控制。例如，一种化合物可以每天经口服给药3次，而第二种化合物可以每天经肌肉内给药1次。联合疗法可以以包括静止期在内的断续周期。所述的化合物也可以一起配制使一次给药提供两种化合物。
药组合物的配制适当的给药方式包括口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下、吸入、局部或透皮、阴道和眼部。
本发明的联合形式也可以提供为药用包装的各组分。两种药物可以一起或单独且以各自的剂量配制。
本发明的化合物在配制时也作为盐使用。例如，amytriptiline，另一种三环抗抑郁药，被配制为盐酸盐，表明同样可以这样配制阿莫沙平。强的松龙盐包括，例如，强的松龙21-半琥珀酸钠盐和强的松龙21-磷酸二钠盐。
所述联合形式的各个化合物的给药可以采取任何使该化合物在与其他化合物合用时达到抗炎浓度的适当方式。各化合物与适当载体物质混合，并且一般占该组合物总重量的1-95％(重量)。该组合物可以以适合口服、非肠道(例如，静脉内，肌肉内，皮下)、直肠、透皮、经鼻、阴道、吸入或眼部给药的剂型提供。所以，所述的组合物可以是例如片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、软膏、霜剂、膏药、灌服药、分送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入剂、喷雾剂或气雾剂的形式。所述的药物组合物可以按照常规药学实践(参见，例如，RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，1995，Mack Publishing Company，Easton，PA.和Encyclopedia ofPharmaceutical Technology，J.Swarbrick和J.C.Boylan编辑，1988-1999，Marcel Dekker，New York.)配制。
本发明的药物组合物可以配制为基本上在给药后即刻释放活性成分或者利用控释制剂，在给药后的任何预定时间内释放活性成分。
控释制剂中化合物的给药适用于当单用或合用的化合物具有(i)窄治疗指数(例如，产生有害副作用或毒性反应的血浆浓度与产生治疗效果的血浆浓度之间的差异小；一般地，治疗指数，TI，被定义为中间致死剂量(LD50)与中间有效剂量(ED50)之比)；(ii)在胃肠道中的吸收窗窄；或(iii)短的生物半寿期，由此需要在一天内多次给药从而维持血浆水平在治疗水平。
可以推荐许多策略来控释，其中治疗化合物的释放速率超过代谢速率。例如，通过适当选择制剂参数和组分可以获得控释，包括，例如，适当的控释组合物和包衣。实例包括单或多单元片剂或胶囊组合物，油溶液，混悬剂，乳剂，微囊，微球，毫微颗粒，贴剂和脂质体。
口服使用的固体剂型用于口服的制剂包括在具有无毒药学可接受赋形剂的混合物中含有活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)，润滑剂，助流剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁，硬脂酸锌，硬脂酸，硅石，氢化植物油或滑石粉)。
所述的两种化合物可以一起混合在片剂或其他载体中，或者可以分开。在一个实例中，第一化合物含在片剂的内部，并且第二化合物含在外部，从而第二种化合物的绝大部分是在第一化合物的释放之前释放。
口服用制剂还可以提供为咀嚼片，或者作为硬明胶胶囊其中所述的活性成分与惰性固体稀释剂混合，或者成为软明胶胶囊其中所述的活性成分与水或油介质混合。
剂量所述联合形式的各化合物的剂量取决于几种因素，包括给药方法，要治疗的疾病，疾病的严重程度，是治疗还是预防疾病，被治疗者的年龄、体重和健康。此外，有关特定患者的遗传药理学(遗传型对药代动力学、药效学和治疗的功效性能的影响)信息可以影响所用的剂量。
连续每天用本发明的联合形式给药可能不需要。一种治疗方案可能需要多个周期，期间不是施用一种药物，或者治疗可以在必要的基础上在急性炎症期间提供。
如上所述，所述的化合物可以经口服以片剂、胶囊、酏剂或糖浆的形式给药，或者经直肠以栓剂的形式给药。化合物的非肠道给药适合以例如盐水溶液或掺混在脂质体中的化合物的形式进行。在其中化合物本身不足以溶解的情形下，可以使用增溶剂例如乙醇。
下面，出于举例说明的目的，说明阿莫沙平和强的松龙的剂量。所属领域技术人员应能够很容易地确定其他TCA类和皮质甾类类的剂量。例如，TCA可以以下面所述的阿莫沙平剂量的等效剂量给药，并且皮质甾类可以以下面所述的强的松龙剂量的等效剂量给药。在一个实施方式中，所述的皮质甾类是低剂量皮质甾类。
口服给药对于适合系统性使用的口服给药的阿莫沙平，总的日剂量一般是约1-600mg(0.01-8.5mg/kg)，优选约25-400mg(0.35-5.7mg/kg)，和更优选约100-300mg(1.4-4.2mg/kg)总日剂量。给药可以是每天1-3次达1天至1年，并且甚至可以是在患者的生存期间给药。在许多情况中将表明持续、长时间的给药。可能需要高达600mg的日剂量。
对于适合系统性使用的口服给药的强的松龙，日剂量一般是约0.05-200mg(0.7-2800mcg/kg)，优选约0.1-60mg(1-850mcg/kg)，和更优选约0.1-5mg(4-70mcg/kg)。由于阿莫沙平对强的松龙抗炎活性表现出增强作用，当与TCA联合使用时，低剂量的强的松龙(例如，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，或3mg/天)可以有效治疗炎症。理想的是每天给药1-4次。如同阿莫沙平，泼尼松龙(prednisilone)可以给药1天至1年，并且可能甚至在患者的生命期间给药。可能需要高达200mg/天的剂量。
直肠给药对于适合直肠给药用于预防疾病的组合物，通常优选略高量的化合物。所以阿莫沙平的总日剂量一般为约1-600mg(0.01-8.5mg/kg)。阿莫沙平的直肠给药一般是每天1-3次。强的松龙的总日剂量一般是约0.1-100mg(1-1420mcg/kg)。强的松龙的直肠给药一般是每天1-4次。
静脉内给药对于阿莫沙平的静脉内给药，总的日剂量是约1-400mg(0.014-5.7mg/kg)，优选约10-200mg(0.14-2.8mg/kg)并且更优选约25-100mg(0.35-1.4mg/kg)。阿莫沙平的静脉内给药一般每天1-4次，但可以连续输注。
对于强的松龙的静脉内给药，总的日剂量是约0.05-200mg(0.0007-2.8mg/kg)，优选约0.1-60mg(0.001-0.85mg/kg)，和更优选约0.1-5mg(4-70mcg/kg)。最优选上述低剂量的强的松龙。强的松龙的静脉内给药一般每天1-4次，但如同阿莫沙平，可以连续输注。
其他给药途径对于阿莫沙平的肌肉内、皮下、吸入、局部、阴道或眼部给药，总的日剂量是约1-400mg(0.014-5.7mg/kg)，优选约10-200mg(0.14-2.8mg/kg)，和更优选约25-100mg(0.35-1.4mg/kg)，和强的松龙的总日剂量是约0.1-100mg(0.0014-1.42mg/kg)。通过这些途径，阿莫沙平和强的松龙各自的给药独立地是每天1-4次。
下列实施例举例说明本发明。它们不以任何方式限定本发明。
实施例1成对化合物混合的联合连续稀释基质的制备在二甲基亚砜(DMSO)中制备阿莫沙平(16mg/ml)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；目录号A129)和强的松龙(1.6mg/ml)(Sigma-Aldrich，目录号P6004)的储备液。阿莫沙平主平板的制备是通过将25μl的浓储备液加入到聚丙烯384孔储备平板的3、9和15(C-N行)栏，该平板已经预填充了75μl的无水DMSO。利用TomTecQuadra Plus液体处理器，将25μl的阿莫沙平储备液稀释2倍共连续4次到相邻栏(第4-7、10-13、16-19栏)内。第6栏(8、14和20)不接受任何化合物并充当赋形剂对照。强的松龙主平板的制备是通过将25μl的浓强的松龙储备液加入到适当强的松龙主聚丙烯384孔储备平板的适当孔(C行，3-8栏；C行，9-14栏；C行，15-20栏；I行，3-8栏；I行，9-14栏；I行，15-20栏)中。这些主平板已经预填充有75μl的无水DMSO。利用TomTec Quadra Plus液体处理器，将25μl稀释2倍连续4次到相邻行(D-G，和J-M行)。第6行(H和N)不接受任何化合物用作赋形剂对照。将主平板密封并储存在-20℃直至准备使用。
最终的阿莫沙平/强的松龙联合平板是用TomTec Quadra Plus液体处理器分别从阿莫沙平和强的松龙主平板取1μl到含100μl培养基(RPMI；Gibco BRL，#11875-085)、10％胎牛血清(GibcoBRL，#25140-097)，2％青霉素/链霉素(Gibco BRL，#15140-122))的稀释平板中来制备。该稀释平板随后混合并将10μl等分试样转移到最终试验平板中，其中已经预填充有含适当激活TNFα分泌的刺激物的40μl/孔RPMI培养基(参见下文)。
实施例2对于阿莫沙平和强的松龙的TNFα抑制活性的试验所述的化合物稀释基质用TNFαELISA法分析。简单而言，含在聚丙烯384孔平板(NalgeNunc)的各孔内的稀释人外周血单核细胞(PBMCs)的100μl混悬液通过用终浓度为10ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯(Sigma)和750ng/μl伊屋诺霉素(Sigma)处理来刺激分泌TNFα。在刺激时加入不同浓度的各试验化合物。37℃下在加湿培养箱中温育16-18小时后，离心该平板且将上清液转移到涂布有抗TNF抗体(PharMingen，#18631D)的白色不透明聚苯乙烯384孔平板(NalgeNunc，Maxisorb)。温育2小时后，用含0.1％吐温20(聚氧化乙烯脱水山梨糖醇一月桂酸酯)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤该平板(Tecan PowerWasher 384)且继续与另一生物素标记的抗-TNF抗体(PharMingen，18642D)和偶联于strepavidin的辣根过氧化物酶(HRP)(PharMingen，#13047E)一起温育另一小时。平板用0.1％吐温20/PBS洗涤后，将HRP底物(其含有鲁米诺，过氧化氢，和增强剂例如对碘苯酚)加入到各孔并用LJL分析照度计测量光强度。对照孔含有1μg/ml环孢菌素A(Sigma)的终浓度。
实施例3阿莫沙平和强的松龙的联合形式对于佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯和伊屋霉素处理的血液的TNFα分泌的抑制作用阿莫沙平和强的松龙能够共同抑制佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯和伊屋诺霉素在血液中诱发的TNFα分泌。如表1和2所示，阿莫沙平能够使强的松龙的剂量反应提供近2倍。在1.11μM的浓度下，强的松龙单用能够抑制28％的TNFα分泌。加入0.2μM阿莫沙平使1.11μM强的松龙的TNFα抑制作用提高至51％。在82％的活性上的巨大增加是通过仅为18的较小增加的总药物种类就可达到。
表1 表2 阿莫沙平增强强的松龙活性也可以在跟踪二级筛选中观察到。在400nM阿莫沙平的存在下强的松龙在9nM的浓度下的TNFα抑制作用提高了2.9倍达到40％。强的松龙和阿莫沙平在此浓度下单用的TNFα抑制活性分别只有14和16％。此外，9nM强的松龙与398nM阿莫沙平(40％)合用下获得的TNFα抑制的水平不小于1110nM强的松龙单用(35％)。与强的松龙单用相比，所述的联合形式在TNFα抑制作用上的增强使效价移动了约100倍。
阿莫沙平和强的松龙抑制被LPS刺激血液的TNFα分泌的能力如表3所示。
表3 其他实施方式说明书上文中提及的所有出版物和转录在此引入作为参考。本发明所述的方法和体系的多种改进和变化对于所属领域技术人员来说是显而易见的，不脱离本发明的范围和实质。虽然本发明结合具体优选实施方式进行了说明，应懂得本发明不应受到这些具体实施方式
的不适当限制。事实上，所述的实施本发明的方式的多种改进对于分子生物学或有关领域的技术人员来说显然是在本发明的范围内。
权利要求
1.一种治疗患有炎性疾病的患者或具有发展为炎性疾病危险性的患者的方法，该方法包括给予该患者(i)三环抗抑郁药；和(ii)皮质甾类，其中所述的药物(i)和(ii)同时或各自在14天内以足以减轻或抑制该患者中的炎症的量施用。
2.权利要求1的方法，其中所述的三环抗抑郁药是阿莫沙平，8-羟基阿莫沙平，7-羟基阿莫沙平，克塞平，琥珀酸克塞平，盐酸克塞平，8-羟基克塞平，阿米替林，clopramine，多塞平，丙咪嗪，三甲丙咪嗪，去甲丙米嗪，去甲替林，或普罗替林。
3.权利要求2的方法，其中该三环抗抑郁药是阿莫沙平。
4.权利要求1的方法，其中该皮质甾类是地塞米松，丙酸氯地米松，确炎舒松，醋酸确炎舒松，去炎松，己酸丙炎松，氯地米松双丙酸酯，氯地米松双丙酸酯一水合物，特戊酸氟地塞米松，双醋二氟松，醋酸氟轻松，氟氢缩松，氟甲孕松醋酸酯，丙酸倍氯他索，去羟米松，氟甲睾酮，氟强的松龙，氢化可的松，醋酸氢化可的松，氢化可的松丁酸酯，氢化可的松磷酸钠，氢化可的松琥珀酸钠，氢化可的松环戊丙酸酯，氢化可的松probutate，戊酸氢化可的松，醋酸可的松，醋酸对氟米松，甲基强的松龙，甲基强的松龙醋酸酯，甲基强的松龙琥珀酸钠，强的松龙，强的松龙醋酸酯，强的松龙磷酸钠，强的松龙叔丁乙醇酸酯，氯氟土龙特戊酸酯，flucinolone，地塞米松21-醋酸酯，丙酸氯地米松17-特戊酸酯，异氟龙，9-氟可的松，6-羟基地塞米松，二氯松，甲二氯松，flupredidene，去氧倍他米松，溴氟龙，氯二氟美松，去氢氯氟美松，二氟米松，醋酸异氟龙，氟羟基雄甾烯二酮，丙酸倍氯米松，氟地塞米松，二氟松，氟轻松，氯氟美松，可的松，对氟米松，氯氟土龙，强的松龙21-半琥珀酸酯游离酸，强的松龙间磺苯甲酸酯，强的松龙叔丁乙醇酸酯，或醋酸确炎舒松21-棕榈酸酯。
5.权利要求4的方法，其中所述的皮质甾类是强的松龙。
6.权利要求1的方法，其中所述的三环抗抑郁药是以与1-600毫克阿莫沙平等效的剂量给药。
7.权利要求6的方法，其中所述的三环抗抑郁药是以与100-300毫克阿莫沙平等效的剂量给药。
8.权利要求1的方法，其中所述的皮质甾类是以与0.05-200毫克强的松龙等效的剂量给药。
9.权利要求8的方法，其中所述的皮质甾类是以与0.05-5毫克强的松龙等效的剂量给药。
10.权利要求9的方法，其中所述的皮质甾类是以与0.1-3毫克强的松龙等效的剂量给药。
11.权利要求1的方法，其中所述的三环抗抑郁药和所述的皮质甾类各自是在10天内给药。
12.权利要求11的方法，其中所述的三环抗抑郁药和所述的皮质甾类各自在5天内给药。
13.权利要求12的方法，其中所述的三环抗抑郁药和所述的皮质甾类各自在24小时内给药。
14.权利要求13的方法，其中所述的三环抗抑郁药和所述的皮质甾类是同时给药。
15.权利要求1的方法，其中所述的炎性疾病是免疫炎性疾病。
16.权利要求15的方法，其中所述的免疫炎性疾病是类风湿性关节炎，牛皮癣，溃疡性结肠炎，克罗恩氏病或中风诱发的脑细胞死亡。
17.权利要求16的方法，其中所述的免疫炎性疾病是类风湿性关节炎。
18.权利要求1的方法，其中所述的炎性疾病是自体免疫疾病。
19.权利要求18的方法，其中所述的自体免疫疾病是哮喘，多发性硬化，I型糖尿病，系统性红斑狼疮，硬皮病，系统性硬化，和斯耶格伦氏疾病综合征。
20.权利要求1的方法，其中所述的三环抗抑郁药和所述的皮质甾类经口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下、吸入、局部、阴道或眼部给药施用给该患者。
21.一种治疗患有炎性疾病的患者或具有发展为炎性疾病危险性的患者的方法，该方法包括给所述患者施用药物(i)氯噻平，哌拉平，氟哌拉平，或二苯并(b，f)(1，4)氧杂氮杂，2-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-，一氢氯化物；和(ii)皮质甾类，其中所述药物(i)和(ii)同时或各自在14天内以足以减轻或抑制该患者中的炎症的量给药。
22.一种治疗患有炎性疾病的患者或具有发展为炎性疾病危险性的患者的方法，所述方法包括给该患者施用一种药物组合物，该组合物含有药学可接受载体和共同减轻或抑制该患者炎症的剂量的药物(i)阿莫沙平和(ii)强的松龙。
23.权利要求22的方法，其中药物(i)在该组合物中是以1-600毫克的量存在。
24.权利要求23的方法，其中药物(i)在该组合物中是以100-300毫克的量存在。
25.权利要求22的方法，其中药物(ii)在该组合物中是以0.05-200毫克的量存在。
26.权利要求25的方法，其中药物(ii)在该组合物中是以0.05-5毫克的量存在。
27.权利要求26的方法，其中药物(ii)在该组合物中是以0.1-3毫克的量存在。
28.权利要求22的方法，其中所述的组合物是经口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下、吸入、局部、阴道或眼部给药施用给该患者。
29.一种含有药学可接受载体和药物(i)阿莫沙平和(ii)强的松龙的药物组合物，其中药物(i)和(ii)分别以当共同施用给患有炎性疾病的患者时抑制或减轻炎症的量存在。
30.权利要求29的组合物，其中药物(i)在该组合物中是以1-600毫克的量存在。
31.权利要求30的组合物，其中药物(i)在该组合物中是以100-300毫克的量存在。
32.权利要求29的组合物，其中药物(ii)在该组合物中是以0.05-200毫克的量存在。
33.权利要求32的组合物，其中药物(ii)在该组合物中是以0.05-5毫克的量存在。
34.权利要求33的组合物，其中药物(ii)在该组合物中是以0.1-3毫克的量存在。
35.权利要求29的组合物，其中所述的组合物配制用于口服、直肠、静脉内、肌肉内、皮下、吸入、局部、阴道或眼部给药。
36.一种含有药物(i)阿莫沙平和(ii)强的松龙的药物包装。
37.权利要求36的药物包装，其中药物(i)和(ii)分开且以独立剂量配制。
38.权利要求36的药物包装，其中药物(i)和(ii)一起并以独立剂量配制。
39.一种鉴定适用于治疗患有炎性疾病的患者的化合物的联合形式的方法，该方法包括步骤(a)在试管内使免疫细胞与(i)三环抗抑郁药或皮质甾类；和(ii)候选化合物接触，和(b)相对于与三环抗抑郁药或皮质甾类接触但没有与候选化合物接触的细胞，或与候选化合物接触但没有与三环抗抑郁药或皮质甾类接触的细胞而言测定该三环抗抑郁药或皮质甾类和候选化合物的联合形式是否降低了该外周血单核细胞的细胞因子水平，其中所述细胞因子水平的降低确定该联合形式是适用于治疗患有炎性疾病的患者的联合形式。
全文摘要
本发明涉及一种治疗患有炎性疾病的患者的方法，该方法通过同时或各自在14天内以足以减轻或抑制炎症的量给该患者施用(i)三环抗抑郁药(例如阿莫沙平)；和(ii)皮质甾类(例如强的松龙)。
文档编号A61K31/553GK1553804SQ02817638
公开日2004年12月8日 申请日期2002年6月26日 优先权日2001年7月9日
发明者R·萨基菲奥, R 萨基菲奥, J·冯, 固, N·胡尔斯特, 嵬呷 , P·曼尼瓦萨卡姆, 乔斯特-普里斯, E·R·乔斯特－普里斯, 锼, G·齐默曼, C·凯斯, A·博里斯 申请人:康宾纳特克斯公司