专利名称：三七皂甙免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种三七皂甙免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗制剂。更具体地，本发明涉及一种从五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根中分离得到的皂甙，一种含有该皂甙作为免疫佐剂的疫苗制剂，一种增强对抗原的免疫应答的方法，该方法采用一包含该皂甙和一第二佐剂的佐剂组合物。
背景技术：
近年来，随着免疫学基础理论研究的深入，以及抗原提纯技术和基因工程技术的迅速发展，出现了多种DNA重组疫苗、合成肽疫苗等。这些新型疫苗具有纯度高、分子量小、特异性强，安全性好等优点。但迄今为止，开发成功的相关疫苗却为数甚少。其原因主要是纯化后的抗原免疫原性弱，单独使用难以诱导机体产生有效的免疫应答。解决这一关键问题的有效途径是使用佐剂(O`Hagan DT，Mackichan ML，Singh M.Biomolecular Engineering 2001；1869-85)。
自20年代Glenny应用氢氧化铝(明矾)作为免疫佐剂以来，铝胶佐剂因其低毒性而仍是至今唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂。但其存在一些无法克服的缺点(1)对人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、流感病毒以及吸血虫病、百日咳和伤害的抗原无免疫佐剂性效果(Scanhez P，et al.Journal of Immunology，141，1720-1727(1988)James SL，et al.JImmunol，140，2753-2759(1988)；Edelman R，Reviews of infective disease，2，370-383(1980))；(2)铝胶制备过程，质量标准难以标化；(3)只能诱导体液免疫，不能诱导细胞介导免疫反应[后者对于机体对细胞内寄生病原体(病毒、原虫等)以及肿瘤产生免疫力尤为必要]，远远不能满足新型疫苗发展的要求(O’Hagan DT，Mackichan ML，Singh M.Biomolecular Engineering 1869-85(2001)；Gupta RK.Advanced Drug Delivery Reviews 32155-172(1998))。为此，近年来各国科研工作者为寻找新的棉衣佐剂开展了广泛研究，并取得了一定进展。目前研究报道的免疫佐剂种类很多，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隐患等一些不可避免的缺点，限制了它们的实际应用因此，迫切需要开发安全、高效的新型免疫佐剂。
皂甙(saponin)是中草药中一类重要的生物活性成分。最近证明从南美的Quillaja saponaria Molina树皮中分离得到的皂树皂甙具有免疫佐剂活性(EspinetEG.Gac Vet，74，1-13(1951)；Dalsgaard K.Bull of Int Epiz，77，1289-1295(1972)；Morein B.Nature，322，287-288(1988))。大量研究结果表明Quil A为目前唯一对外源性抗原既能刺激Th1免疫应答，又能诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的佐剂(Kensil CR，et al..J Immunol，146，431-7(1991)；Van setten DC，et al..Adv Exp Med Biol，404，185-93(1996)；Nord LI，et all.Carbohydr Res，320，70-81(1999)；Takahashi H，et all.Nature，344，873-5(1990)；Wu JY，et al..J Immunol，148，1519-25(1992)。这一独特特性使其成为亚单位疫苗、细胞内寄生病原体疫苗及癌症疫苗的理想佐剂。一种皂树皂甙的提纯形式以“Quil-A”的品名出售(Iscotec AB，瑞典；Superfos Biosector a/s，Frydenlundsvei 30，DK-Vedbaek，丹麦)。然而，Quil A存在严重的毒副作用，可引起溶血、局部组织坏死，甚至全身不良反应、中毒。其对小鼠致死量为100～125μg，引起50％溶血浓度为10μg/ml[11-13]，因此，Quil-A用在人用药物制剂中是不安全的(Hersten等，InfectImmun，56，432-438(1988)。这严重阻碍了其推广应用。目前Quil A除了用于为某些绝症设计的疫苗如癌症疫苗、HIV重组疫苗外，仍主要限用于兽用疫苗。因此，寻找筛选无毒、安全的皂甙佐剂成为当前佐剂研究中的一个热点(SantosWR，等，Vaccine，15，1024-29(1997))。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于疫苗时具有高佐剂活性的无毒的皂甙；本发明的另一个目的是提供一种包含所述皂甙作为佐剂的疫苗制剂；本发明还有一个目的是提供所述皂甙和复合免疫佐剂在疫苗制备中的应用。
疫苗免疫佐剂——三七皂甙是从五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根中提取、分离得到的总皂甙。
疫苗制剂包括抗原、作为免疫佐剂的三七皂甙或三七皂甙和一种第二佐剂的复合免疫佐剂。
三七皂甙作为免疫佐剂在疫苗制备中的应用。
本发明的三七皂甙具有毒性及溶血性小。其对小鼠的腹腔注射LD50为825.6(730.7-934.8)mg/kg；引起兔红细胞50％溶血浓度大于500μg/ml。三七皂甙与抗原单独使用时显示出比现有技术中已知的Quil-A能诱导机体产生更高的细胞免疫应答和体液免疫应答。
疫苗制剂中的抗原不受任何特定抗原族的限制，其包括B型肝炎病毒表面抗原、HIV和HCV抗原，等等。在本发明的制剂中抗原的浓度可根据各种因素调节，例如抗原种类、所需的抗原性水平、接种对象的特异性及所需的免疫程度。该制剂还可包括含有治疗有效量的作为免疫佐剂的三七皂甙，以及含有一种或多种药学上可接受的载体的组合物。疫苗制剂可以口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要接种的对象。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊籍、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、脂质体、微囊、微球、毫微粒等。优先的形式是注射剂和微丸。
图1为三七皂甙(PNS)体外对分裂原诱导小鼠脾细胞增殖反应的影响；图2为三七皂甙(PNS)对分裂原诱导OVA免疫小鼠脾细胞增殖反应的影响(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01 vs OVA对照组)；图3为三七皂甙(PNS)对OVA免疫小鼠血清中特异性IgG，IgG1和IgG2b抗体水平的影响(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.01 vs OVA对照组；(ap＜0.05，aap＜0.01，aaap＜0.01 vs Alum/OVA组和Quil-A/OVA组)。
具体实施例方式
本发明的三七皂甙是从五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根中分离得到、无毒，而且单独使用或与另一种佐剂例如铝胶联合使用时显示出高免疫佐剂活性。
从五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根中分离三七皂甙的制备方法，该方法包括以下步骤a.将三七根粉碎后，以乙醇提取；b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用有机溶剂萃取；c.浓缩后的萃取液在大孔树脂柱中进行色谱分离，以洗脱剂进行洗脱；d.硅胶薄层检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得得到总皂甙；上述步骤b中所说的有机溶剂为正丁醇。步骤c中所说的洗脱剂为水、甲醇、乙醇或它们的混合物。
本发明的疫苗制剂可根据任何常规程序制备。
本发明的疫苗制剂优选含有三七皂甙占总重量比为0.01％～50.0％。最优选含有活性成分占总重量比为0.1％～10％。
疫苗制剂的典型单剂量可以根据制剂的形式而变化，并应根据上述相关因素进行确定。本发明的疫苗制剂中的三七皂甙的量可为1-1000μg/单剂量，优选为10-500μg/单剂量。可以一次或多次施用。
本发明提供一种增强所述疫苗制剂中的抗原的抗原性的方法，该方法采用以三七皂甙单独作为免疫佐剂以及采用第二佐剂优选铝胶联合应用的三七皂甙作为免疫佐剂。
实施例1 三七皂甙提取、精制三七药材粗粉各(1Kg)用70％乙醇提取(3×4L)，提取液减压回收乙醇，加适量水混悬，以乙醚分次萃取(3×0.5L)。水层以水饱和正丁醇萃取至醇液近无色，合并正丁醇液，减压回收正丁醇，经D101大孔树脂柱以水洗去水溶性杂质，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，并干燥，得精制三七皂甙。
实施例2 溶血性测定以真空采血管从兔耳静脉采血，加二倍量生理盐水洗涤，2000r/min离心10min，洗涤3次，红细胞悬浮液用生理盐水稀释成0.5％。取上述九种皂甙，用生理盐水倍比稀释制成5～1000μg/ml稀释液。在96孔微量板中，每孔加入100ul红细胞悬液及100μl不同浓度的皂甙稀释液，每个浓度3复孔，每种皂甙重复3次。将微量板置于微量震荡器上，混匀，37℃培养30min，1000r/min离心10min，取各孔中上清液100μl用酶标仪在420nm处读取OD值。以生理盐水和蒸馏水作为最小和最大的溶血性对照，各组的吸收值减去生理盐水对照组的吸收值表示溶血性，结果见表1表1 三七皂甙对兔红细胞的溶血活性Group吸收值(A)溶血百分率/％蒸馏水 1.637±0.040 100.00±2.45***生理盐水 0.094±0.009 0.000±5.19三七皂甙500μg/ml0.284±0.019 11.59±1.44*250μg/ml0.153±0.007 3.60±1.30125μg/ml0.090±0.015 -0.22±0.5550μg/ml 0.072±0.009 -1.32±0.6625μg/ml 0.073±0.011 -1.28±0.8612.5μg/ml 0.078±0.007 -1.00±0.532.5mg·L-10.061±0.005 -2.02±0.38从表1可见，三七皂甙浓度为500和250mg/L时兔红细胞的溶血百分率分别为11.59％和3.60％。说明三七皂甙的溶血性很小。
实施例3 体外淋巴细胞转化试验取100μl脾细胞悬液(1×107个/ml)加96孔板内，每份样品12孔，其中3孔加Con A(终浓度5μg/ml)，3孔加PWM(终浓度10μg/ml)，3孔加PHA(终浓度10μg/ml)，3孔加100μl RPMI1640液。各孔再加入不同浓度的三七皂甙稀释液(终浓度0-100μg/ml)，37℃、5％CO2培养72h。结束前4h，各孔加入MTT(2mg/ml)50μl/孔，继续培养4h。弃去各孔内液体，各加酸性异丙醇150ul，置暗处室温15min，以酶标仪于578nm波长测定OD值。结果见图1。
由图1可见，三七皂甙在0.1～1000μg/ml浓度范围内对刀豆蛋白A(Con A)、美洲商陆(PWM)和植物凝集素(PHA)三种分裂原诱导小鼠脾细胞增殖反应呈浓度依赖性的双向免疫调节作用，浓度1.0and 10.0μg/ml时能极显著促进这三种分裂原诱导的小鼠脾细胞增殖反应。
实施例4 三七皂甙体外对小鼠脾细胞释放白细胞介素(IL)-2的影响24孔板中加入细胞悬液(1×107个/ml)0.6ml，20ug/mlConA0.6ml，37℃5％CO2中培养48h，收集上清液，-24℃保存；将生理盐水组的细胞悬液合并至细胞瓶中，加入完全培养液，加入ConA(终浓度为5ug/ml)，37℃5％CO2中培养72h，用PBS离心洗涤2次，加入完全培养液，计数，调整细胞浓度至1×106个；在96孔板中对IL-2上清液进行1/2、1/4、1/8三个浓度的稀释，每孔100ul，加入调整好的靶细胞悬液100ul，37℃5％CO2中培养48h。结束前4h，各孔加入MTT(2mg/ml)50μl/孔，继续培养4h。弃去各孔内液体，各加酸性异丙醇150ul，置暗处室温15min，以酶标仪于578nm波长测定OD值。结果见表2。
表2 三七皂甙体外对小鼠脾细胞释放IL2的影响三七皂甙 上清液稀释液的吸收值(A)(μg/ml)1∶21∶41∶80 0.283±0.0160.257±0.0170.237±0.0153.125 0.310±0.0280.277±0.0160.253±0.0156.250.355±0.018**0.309±0.022*0.281±0.017*12.50.375±0.011***0.350±0.017**0.310±0.016**25 0.390±0.018***0.369±0.019***0.334±0.017**50 0.395±0.019***0.381±0.015***0.366±0.014***由表2可见，三七皂甙在6.25～50μg/ml浓度范围内能显著促进体外小鼠脾细胞释放IL-2的能力，增强效应呈浓度依赖关系。
实施例5 三七皂甙对OVA免疫小鼠细胞免疫的影响将40只小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组每只注射生理盐水0.2ml；OVA对照组每只注射等体积OVA溶液(0.5mg/ml)；氢氧化铝对照组每只注射0.2ml含200μg氢氧化铝的OVA溶液(0.5mg/ml)；Quil-A对照组每只注射0.2ml含10、50μg Quil-A的OVA溶液(0.5mg/ml)；三七皂甙试验组每只注射0.2ml含50、100、200μg三七皂甙的OVA溶液(0.5mg/ml)。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天，于二免后14天，取小鼠放血处死，无菌取脾，磨碎、过滤，加Hank`s液，1500rpm离心3分钟，弃上清，重复洗涤2次，以RPMI1640培养液混悬细胞。取0.1ml脾细胞悬液加WBC稀释液3.9ml，台盼兰染色计数，活细胞数不小于95％；取1ml脾细胞悬液，用RPMI1640液稀释、调整细胞浓度至1×107个/ml。取100μl脾细胞悬液加96孔板内(重复12孔)，其中3孔加ConA液100μl(5μg/ml)，3孔加PWM液100μl(5μg/ml)，3孔加PHA液100μl(10μg/ml)，3孔加100μl RPMI1640培养液。37℃、5％CO2培养68h。结束前4h，各孔加入50μl MTT溶液(2mg/ml)，继续培养4h。弃去各孔内液体，加DMSO∶1NHCl(9∶1)溶液150ul，置暗处室温15min，以酶标仪于578nm波长测定OD值。计算刺激指数(SI)＝(有丝分裂原培养物的OD值)/(无有丝分裂原培养物的OD值)。结果见图2。
从图2可见，三七皂甙100μg能显著促进刀豆蛋白A(ConA)、美洲商陆(PWM)和植物凝集素(PHA)三种分裂原诱导OVA免疫小鼠脾细胞增殖反应，而铝胶组与OVA组无显著性差异。说明三七皂甙能显著增强OVA受免小鼠的细胞免疫反应，而铝胶则无此活性。
实施例6 三七皂甙对OVA免疫小鼠体液免疫的影响将40只小鼠随机分组，每组5只。生理盐水对照组每只注射生理盐水0.2ml；OVA对照组每只注射等体积OVA溶液(0.5mg/ml)；氢氧化铝对照组每只注射0.2ml含200μg氢氧化铝的OVA溶液(0.5mg/ml)；Quil-A对照组每只注射0.2ml含10、50μgQuil-A的OVA溶液(0.5mg/ml)；三七皂甙试验组每只注射0.2ml含50、100、200μg三七皂甙的OVA溶液(0.5mg/ml)。各组皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫间隔14天，于二免后14天分离血清。在96孔酶标板每孔加入100μl包被液，置4℃孵育24h后，用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加100μl封闭液，于37℃孵育1h后，用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加待测血清稀释液100μl，每个样品3复孔，重复3次。37℃孵育1.5h，用洗涤液洗涤3次，每次3min。每孔加入辣根过氧化物酶标兔抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标羊抗小鼠IgG1或IgG1b抗体稀释液100μl，37℃孵育1h后，洗涤3次，每次3min。每孔加1mg/ml邻苯二胺底物溶液100ul，37℃显色10min，每孔加2M硫酸50ul终止反应。置酶标仪于490nm处测定OD值。结果见图3。
由图3可见，三七皂甙100μg能显著提高OVA免疫小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2b抗体水平，且三七皂甙三个剂量组小鼠血清中IgG2b抗体水平显著高于Alum/OVA和Quil-A/OVA对照组。说明三七皂甙能显著增强OVA受免小鼠的体液免疫反应，其免疫佐剂性效果优于Quil-A和铝胶。
权利要求
1.一种疫苗免疫佐剂——三七皂甙，其特征在于是从五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根中提取、分离得到的总皂甙。
2.根据权利要求1所述的一种疫苗免疫佐剂，其特征在于所说三七皂甙的制备方法包括以下步骤a.将三七根粉碎后，以乙醇提取；b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用有机溶剂萃取；c.浓缩后的萃取液在大孔树脂柱中进行色谱分离，以洗脱剂进行洗脱；d.硅胶薄层检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得得到总皂甙。
3.根据权利要求2所述的一种疫苗免疫佐剂制备方法，其特征在于所说步骤b中的有机溶剂为正丁醇。
4.根据权利要求2所述的一种疫苗免疫佐剂制备方法，其特征在于所说制备方法步骤c中的洗脱剂为水、甲醇、乙醇或它们的混合物。
5.一种疫苗制剂，其特征在于包括抗原、作为免疫佐剂的三七皂甙或三七皂甙和一种第二佐剂的复合免疫佐剂。
6.根据权利要求5所述的一种疫苗制剂，其特征在于所说第二佐剂是氢氧化铝。
7.根据权利要求5或6所述的一种疫苗制剂，其特征在于所说抗原吸附在氢氧化铝上。
8.根据权利要求5所述的一种疫苗制剂，其特征在于所说的抗原是乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。
9.根据权利要求5所述的一种疫苗制剂，其特征在于所说三七皂甙的量为1-1000μg/单剂量。
10.三七皂甙作为免疫佐剂在疫苗制备中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种三七皂甙免疫佐剂及含有该佐剂的疫苗制剂。本发明还涉及该皂甙的制备方法，以该皂甙为免疫佐剂的疫苗制剂，以及本发明三七皂甙在疫苗制备方面的用途。三七皂甙作为免疫佐剂能显著增强疫苗的免疫原性，毒性很小，对机体免疫功能有广泛的调节作用，免疫佐剂性效果优于Quil－A和至今唯一人用的免疫佐剂氢氧化铝胶，同时也可以用作免疫治疗剂。
文档编号A61K31/7028GK1471973SQ0311572
公开日2004年2月4日 申请日期2003年3月8日 优先权日2003年3月8日
发明者孙红祥 申请人:浙江大学