专利名称：抗细胞膜糖蛋白kd－43的单克隆抗体gdk－1及其的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体(简称单抗)领域，尤其是关于抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体GDK-1，及其131-碘化单克隆抗体DGDK-1和其在制备治疗肝癌的药物中的应用。
背景技术：
放射治疗对某些局限性的肿瘤病灶非常有效，但并非对所有的恶性肿瘤均敏感，此外，对转移病灶，一般说来放射治疗是无效的。而今天的化学药物治疗至多还只是一种或可缓解病情的辅助手段。即使放射治疗和化学药物治疗今后在疗效上会有进步，也很难说它们是一类理想的治疗方法，因为这类方法无选择地作用于恶性肿瘤细胞和正常细胞，所导致的副作用往往为患者所不能忍受。
德国人Paul Ehrlich在20世纪初最先提出抗肿瘤导向药物的设想，所谓肿瘤的导向治疗(Targeted Therapy)，乃是一种能选择性杀死恶性肿瘤细胞而对正常细胞无毒害的治疗肿瘤的新概念。由于没有理想的导向载体，长时间以来，导向药物的研究一直进展得十分缓慢。
1975年，Koehler和Milstein用杂交瘤技术制备了世界上第一个鼠源单克隆抗体，为生物技术打开了一个全新的领域，随着生物技术的发展，单克隆抗体技术也有了很大的发展，各种整分子的、小分子的、鸡尾酒的、双功能的以至抗独特性的单克隆抗体均陆续问世；单克隆抗体技术的出现和发展激励了不少人再去探索导向治疗的可行性，重新去寻找上世纪初的旧梦。经过十多年的探索和努力，作为生物反应调节治疗(Biological ResponseModulizer)的一种重要的内容，以单克隆抗体为载体的导向抗肿瘤药物已成为一百多年来肿瘤免疫治疗领域中最引人注目的进展之一。
发明内容
本发明提供了一种抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体GDK-1，其特征在于编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的<210>1和<210>2。
其为鼠源的或人鼠嵌合的。
其为整分子IgG或IgG的Fab片段。
还提供了一种抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-磺化单克隆抗体DGDK-1，编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的<210>1和<210>2。
其为鼠源的或人鼠嵌合的。
其为整分子IgG或IgG的Fab片段。
本发明还提供了该131-碘化单克隆抗体DGDK-1在制备治疗肝癌的药物中的应用。
该肝癌为巨块型肝癌或弥漫型肝癌。
其放射剂量范围在20-100mCi之间。
该131-碘化单克隆抗体DGDK-1为液体，使用方法为与生理盐水配制后两周内1-5次注射。
本发明产品能用于降低肝癌患者的甲胎蛋白水平，其有效率高达75％左右；能用于追踪治疗肝癌转移病灶，因而可以用于治疗晚期有转移的肝癌患者；除巨块型外，还可用于治疗弥漫型肝癌；能有效地降低原发性肝细胞肝癌手术后的复发率，延长他们的生存期，对临床II期肝癌患者，二步切除后的10年生存率可达35％以上；能有效地改善患者的食欲、提高患者的体力，有效率达85％以上。
图1DGDK-1能在人体内直接杀死癌细胞的组织化学显色照片。
图1A注射DGDK-1前，组织化学显色表明癌细胞依然存活。
图1B注射DGDK-120天后，组织化学显色表明癌细胞发生玻璃状凝集，说明癌细胞已经被杀死。
图2纵隔转移灶SPECT影象。受试者(No.20)为一例肝癌切除后纵隔转移患者，注射DGDK-1后第6天纵隔转移灶放射性浓集。表明DGDK-1在人体内能追踪转移灶。
图2A纵隔转移灶矢状面的SPECT影象。
图2B纵隔转移灶冠状面的SPECT影象。
图2C纵隔转移灶横断面的SPECT影象。
图3纵隔病灶组织化学显色照片。受试者(No.20)，肝癌切除后纵隔转移，注射DGDK-1一个月后切除，组织化学显色表明单克隆抗体依然结合在病灶组织上，提示注射后至少30天内，在体内的单克隆抗体还能保持其免疫活性。
图3A纵隔病灶放大20倍的组织化学显色照片。
图3B纵隔病灶放大40倍的组织化学显色照片。
图4DGDK-1全身显象(受试者No.8)。注射后24小时及48小时的ECT全身影象，DGDK-1在肝肿瘤上浓集(箭头所示)。
图5注射DGDK-1后的连续动态显象图5A连续观察12天，病灶仍显影。(受试者)图5B连续观察9天，病灶仍显影。(受试者)图5C连续观察13天，病灶仍显影。(受试者)图6DGDK-1的临床药代动力学研究中，受试者(No.8)各脏器的时间-放射性曲线。
图6-1膀胱时间-放射性曲线。
图6-2脑时间-放射性曲线。
图6-3受试者(No.8)肾脏时间-放射性曲线。
图6-4受试者(No.8)肝脏时间-放射性曲线。
图6-5受试者(No.8)肺时间-放射性曲线。
图6-6受试者(No.8)脾脏时间-放射性曲线。
图6-7受试者(No.8)甲状腺时间-放射性曲线。
图7静脉注射DGDK-1后的血液廓清曲线。
具体实施例方式
实施例1、抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体(GDK-1)的制备方法1).抗原和免疫细胞膜糖蛋白KD-43是一种分布在人癌细胞膜表面、特别是在人肝癌细胞膜表面的一种糖蛋白，其分子量为43kD，其特定的变异的决定簇，可能为人癌细胞，特别是人肝癌细胞所特有。
我们以含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜为抗原，免疫BALB/C小鼠，共免疫3-5次，临用前3-5天加强1次，3-5天后取脾作融合。
2).细胞融合将从小鼠体内摘除的脾脏切碎，离心分离脾细胞，悬浮在RPMI1640培养基中并洗净。以同样方法在含有10％胎牛血清的RPMI1640中培养小鼠骨髓瘤细胞株NS-1，在密度达106/ml时将细胞用上述RPMI1640培养基洗净。然后将骨髓瘤细胞和上述脾细胞以1∶5-10的比例放入离心管中并混合，以在聚乙二醇4000作用下按常规方法(Clin.Exp.Immunol.，42，458-462，1980)进行细胞融合。
然后，将所得到的融合细胞分散于含HAT的RPMI1640培养基的96孔平板中，并在37℃和5％CO2条件下在保温箱中培养之。以HAT培养液换液若干次，继以HT培养液换液，直至克隆形成，详见Clin.Exp.Immunol.，42，458-462，1980。
3).筛选以含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜为靶标，筛选出目的克隆。其方法为a.离心并回收靶细胞膜，将细胞膜沉淀物悬浮在100μl杂交瘤培养上清中并在37℃下反应1小时。
b.用PBS清洗1次后，加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体并保温1小时。
c.用PBS清洗1次后，用荧光显微镜观察分析之。
d.然后使用有限稀释法，按常规程序反复克隆(至少6次)，每次的克隆效率应低于35％，所得到的稳定分泌单克隆抗体的融合细胞即为目的克隆。
e.将目的克隆细胞培养于生物反应器中，收集反应器中的培养上清液，50％饱和硫酸铵沉淀保存。
f.或将目的克隆细胞培养于Balb/c小鼠的腹腔中，收集小鼠的腹水，50％饱和硫酸铵沉淀保存。
4).分离和纯化a.按常规高压液相色谱法(如阳离子交换柱)，将所获得的目的克隆的50％饱和硫酸铵沉淀物纯化；b.或按常规低压柱层析法(如Protein G柱)，将所获得的目的克隆的50％饱和硫酸铵沉淀物纯化。
5).专一性分析间接免疫荧光法组织名称N1N2P1P2GDK-1大脑- - + + -小脑- - + + -坐骨神经- - + + -肺 - - + + -肝 - - + + -肾 - - + + -膀胱- - + + -脾 - - + + -胃 - - + + -肠 - - + + -胰腺- - + + -甲状腺 - - + + -肾上腺 - - + + -心 - - + + -横纹肌 - - + + -睾丸- - + + -皮肤- - + + -肝癌- - + + +N1，N2分别为第一和第二阴性对照。
N1相同浓度的人IgG作为第一抗体，以排除因非特异性吸附所致的假阳性。
N2缓冲液代替第一抗体，以排除溶媒成分所致的假阳性。
P1，P2分别为第一和第二阳性对照P1小鼠抗人细胞膜糖蛋白KD-43的全血清(1∶5稀释)作为第一抗体，以检查抗原的活性。
P2以含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜作为抗原，以检查待检抗体的活性。
6).其它生物学特性[性状]无色澄明液体。
pH值6.5-7.5(中国药典1995年版二部附录 VI H)。
本品按生物制品规程(1995年版一部)进行检验。
本品以细菌内毒素试验检查热原。通过供试品的细菌内毒素干扰试验表明，本品稀释10倍后，对细菌内毒素试验不干扰，因而可用细菌内毒素试验检查本品的热原。以单克隆抗体一次最大用量10ml计，再考虑到标记过程中其它试剂也会携带细菌内毒素，因此本品的细菌内毒素为每毫升小于5Eu。
任何生物制品均不允许支原体污染。鉴于人型支原体、肺炎支原体及溶脲脲原体为最有代表性的三种支原体，本标准选定此三种支原体的存在与否为本品是否有支原体污染的判别标准。支原体可以在特定的双相培养基上生长，形成集落；并使培养基变色。肺炎支原体由于能分解葡萄糖产酸，从而使培养基由粉红变黄；人型支原体由于能分解精氨酸并释放氨气，从而使培养基由黄绿变绿；溶脲脲原体由于能分解尿素及释放氨及二氧化碳，从而使培养基由紫变蓝，因此，我们可以通过在特定的双相培养基上直接培养支原体以检测支原体的污染。本品的检测结果均为阴性。
鉴于简捷、可靠、灵敏等优点，本标准选定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳作为单克隆抗体纯度的测定方法，本品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳继以考马斯蓝R-250(Coomassie Blue R-250)染色后，还原条件下为两条明确的显色带(分别位于分子量为55KD及25KD的位置)，非还原条件下为一条或两条明确的显色带，位于分子量为160KD或160KD及320KD的位置。经电泳胶扫描积分计算，本品的单克隆抗体(单体及二聚体)纯度不低于95％。
IgG1[单克隆抗体含量]采用Bradford法测定单克隆抗体的含量。该方法的基本原理系因Coomassie Blue G 250染料能够同蛋白质分子的精氨酸的残基形成稳定结合物，染料在酸性试剂中主要以阳离子形式存在，其最大光吸收(λmax)为470nm，而染料与蛋白质的结合物在酸性试剂中主要以阴离子形式存在，其最大光吸收(λmax)为595nm，据此，可用标准品作标准曲线，在相同条件下测定供试品595nm的光吸收，从而求出单克隆抗体的含量。
采用间接免疫荧光法，以含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜为抗原，本品的免疫活性不高于1微克/毫升。
实施例2、嵌合型抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体(GDK-1)的制备方法1).抗体人源化基于与鼠的序列相似性，人框架组织亚群的kappa链(VK)可变区亚群I和重链可变区(VH)亚群II被选用于抗体人源化。不保留kappa链低危位点42、83和106，但保留对应鼠源单抗的与结合有关位置的框架组织残基并人源化。6个GDK-1 CDRs被嫁接到rGDK-1-A可变区，根据抗体基因表达中最常用的密码子，rGDK-1可变区的完整的氨基酸序列转变成DNA序列。NheI位点位于VH的3’末端(GCTAGC)，另一个限制性位点，hindIII，则被引入5’末端，以便于克隆至哺乳动物细胞的表达载体。此外，通过改变密码子的用法，一些内部的限制性位点，如KpnI(GGTACC)和XbaI(TCTAGA)也被引入人源化的框架DNA序列中。
2).表达载体的构建人源kappa链和重链的不同区域的DNA片断的合成使用六段长的重叠合成DNA寡聚核苷酸，通过重叠PCR方法即可。六段重叠的寡聚核苷酸分两步组建而成。第一步，六段寡聚核苷酸(5pmole)的每一段都在50μl的反应混合液中退火和延伸。第二步，设计每一段的寡聚核苷酸引物(50pmole)在不同片断的5’和3’端进行杂交。人类恒变区域的cDNA片断可使用变性的引物通过PCR法克隆制得重链恒变区。重链载体(pHeavy)的构建首先用hindIII/NheI和NheI/XhoI分别消化人的可变区DNA片断和人重链不变区cDNA片断，然后连接成一个hindIII/XhoI消化的载体，pSectag2B/Hygro(Invitrogen)；kappa链载体(pKappa)的构建用hindIII酶消化人源化的可变区DNA片断，人不变区cDNA片断先5’磷酸化和用XhoI酶消化，然后连接成一个hindIII/XhoI消化的载体，pSectag2B(Invitrogen)。纯化的质粒DNA进行转染和测序，可变区的测序结果与设计的hGDK-1 DNA序列比较，共转染至哺乳动物细胞之前，不同的克隆之间通过交换DNA限制片断纠正点突变和缺失。
3).抗体在CHO-K1细胞系中表达两种表达载体(0.75μg pHeavy和0.75μg pKappa)和杂交瘤-SFM(Gibco)中5μl lipofectamine转染至中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞(ATCC)中，为了选择稳定的转化子，转染48小时后添加含有250μg/ml潮霉素B的选择培养液，选择致密集落并通过夹心ELISA法筛选分泌hGDK-1的抗性克隆的上清，选择分泌抗体达最高水平的抗性克隆，用无血清CHO-S-SFM培养液(Gibco)制备抗体，培养3天后收集上清，用旦白A亲和层析法纯化hGDK-1。离心过滤大约500ml混合的细胞上清，用1MTris-HCL(pH8.0)平衡，处理过的上清上样，用旦白A柱纯化，纯化的抗体在PBS溶液中保存在-20℃，或加1％牛血清白旦白和0.02％NaN3(Sigma)保存在4℃。以已知浓度的人抗体IgG1kappa(Sigma)为标准，通过ELISA试验，用两倍系列稀释的纯化的抗体测定浓度，用标准数据作图，校准回归线的斜率和Y-截距用相关系数不少于0.99来计算，hGDK-1样品的数据点在标准曲线范围内，用于计算抗体浓度，抗体样品的纯度和亚单位(重链和kappa链)的大小，分别在还原和非还原条件下，用SDS-PAGE分析。
4).rGDK-1的鉴定用免疫荧光染色试验证实rGDK-1与含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜的特异性结合，含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜先与抗体rGDK-1和GDK-1反应，随后与FITC偶合的二抗反应，在荧光显微镜下观察染色切片。通过间接ELISA法测定rGDK-1的结合活性，在96孔ELISA板(Coring)中用含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜包被在ELISA板上，1％BSA封闭后，加各种浓度(0-20μg/ml)的rGDK-1和非特异的人IgG kappa抗体(Sigma)，用HRP标记的鼠抗人IgG单克隆抗体(Pharmingen)检测结合的抗体，人组织样品的成功包被是用鼠抗人的心肌钙旦白I单克隆抗体(HyTest)针对心组织样品。对含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜，有rGD-1-A，非特异的人IgG1 kappa抗体(Sigma)和非标记的GD-A抗体三种抗体与生物素标记的GD-A(biotin-GD-A)竞争，加各种浓度(0-20μg/ml)的竞争抗体样品，随后加5μg/ml的生物素-GDK-1，用抗生旦白链菌素-HRP(Pharmingen)检测生物素-GDK-1与含有细胞膜糖蛋白KD-43的癌细胞膜的结合。
对于HAMA血清反应试验，三种液相抗体样品(GDK-1，rGDK-1和人IgG kappa)和固相GDK-1竞争与人抗鼠抗体的结合，在ELISA板上先包被5μg/ml的GDK-1然后加含有HAMA血清(Type 2SQ，Boehringer，Mannheim)和各种浓度的抗体样品(0-0.5μg/ml)的血清/抗体混合液，随后加2.5μg/ml生物素交联的鼠抗人IgG1单克隆抗体和抗生旦白链菌素-HRP，检测HAMA血清中的人抗鼠IgG抗体和固相GDK-1的结合。上述提及的三种试验，都用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.2)包被旦白，结合和检测的温育步骤都是每孔50μl，室温1小时，用封闭液(PBS中1％牛血清白旦白)稀释所有的血清和抗体样品，每步之间用PBS洗板六次，检测之后，加OPO底物溶液(Sigma)显色，吸收光线在450nm。
实施例3、抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体的131-碘标记(DGDK-1)(以Iodogen法为例)[范桢，汤钊猷，钟高仁等，Iodogen和氯胺T标记放射碘人肝癌铁蛋白抗体的评价.上海医科大学学报1992 1912]1).将Iodogen溶于二氯甲烷，浓度为80％(w/v)。
2).取1.0ml上述溶液加入无热源玻璃试管中，旋转蒸发掉二氯甲烷，使Iodogen在管内形成一均匀薄层。
3).在涂管中按一定比例加入Na131I和抗体溶液，冰浴反应30分钟。
4).将Sephadex G-25用生理盐水煮沸半小时，冷却后装柱，柱高20-40cm，直径0.25-1.5cm。
5).用人血清白蛋白少许饱和。
6).将第3步中的反应混合液上柱，分步收集流出液。
7).检测各管收集液的放射强度。
8).检测收集液中各放射峰的蛋白质浓度。
9).保留同时含有放射活性和蛋白的收集液。
10).以0.22微米孔径的醋酸纤维薄膜无菌条件下过滤。
实施例4、131-碘化单克隆抗体DGDK-1的放射生物学特性本品系131-碘化单克隆抗体DGDK-1无菌无病毒无热源溶液。按其标签上记载的时间，含碘[131I]的放射性活度为标示量的90.0-110.0％。
本品含5％人血清白蛋白作为稳定剂。
本品为淡黄色的澄明液体。
1).取本品适量，照γ谱仪法(中国药典1995年版二部附录X III)测定，其主光子能量为0.364Mev。或取本品适量，照半衰期测定法(中国药典1995年版二部附录XIII)测定，符合规定。
2).照放射化学纯度测定法测定，在Rf值约为0处有放射性主峰。
pH值为6.5-7.5(中国药典1995年版二部附 VI H)。
取本品适量，以细菌内毒素检查用水稀释30倍后，依法检查(中国药典1995年版二部附XI E)。每1毫升原液中的细菌内毒素含量小于15Eu。
符合注射剂项下有关的各项规定(中国药典1995年版二部附录IB)。取本品适量，以丙酮-0.9％氯化钠溶液(1∶1)为展开剂，照放射化学纯度测定法(中国药典1995年版二部附录XIII一法)测定，本品的放射化学纯度不低于95％。
取本品适量，以直接放射免疫沉淀法测定本品的免疫活性。
取本品，照放射性浓度测量法(中国药典1995年版二部附录XIII)测量，含碘[131I]的放射性浓度不低于185MBq/ml。
放射性治疗用药。用于治疗原发性肝细胞肝癌。
静脉注射 一次约925-850MBq，最大注入量不得超过10mL。
应用实施例1 DGDK-1的临床前动物药效学研究观察指标1).肿瘤体积按肿瘤长径×短径2计算，以游标卡尺计量径长。
2).生存期观察时间2-3个月。
比放射性限定在3-7uCi/ug范围内。
剂量组的设置药品分为0uCi，25uCi，50uCi，75uCi，100uCi，125uCi等剂量点。以0uCi剂量点为对照。每剂量点由6个载瘤裸小鼠组成。
试验结果表1剂量和有效小鼠数目间的关系有效鼠数0uCi 25uCi 50uCi 75uCi 100uCi 125uCi第1天 0 0 0 0 0 0第3天 0 0 0 0 0 2第5天 0 0 0 1 2 3第7天 0 0 1 3 5 6第9天 0 1 2 5 6 6第11天 0 2 3 6 6 6第13天 0 2 3 6 6 6ED50值(第11天及第13天)确定为50uCi/鼠。
表2.药物注射后实验动物的肿瘤平均体积的变化(50uCi/鼠)注射后 对照组 实验组天数 (n＝12)(n＝12)0 2.25 2.883 227.50 88.334 271.09 95.505 505.63 231.456 524.77 290.667 498.68 339.548 675.45 397.459 837.62 521.33101106.79549.75111302.95623.33121249.83564.37131246.58738.58141382.00824.37151400.33831.25161662.54914.95171761.661009.54192136.271050.45212684.291123.54273152.541646.83303363.581577.29343353.292248.75
P值为0.0408＜0.05表3.药物注射后实验动物的肿瘤平均生存期的观察(50uCi/鼠)注射后 对照组 实验组天数(n＝12) (n＝12)34 12 1235 11 1250 10 1252 91256 91158 71159 71060 51062 5964 2866 0880 08平均生存天数57.0873.08试验结论载瘤动物药效实验表明在剂量为25-125uCi范围内，注射DGDK-1后，肿块体积明显缩小，载瘤动物生存期延长。
应用实施例2 DGDK-1的临床前动物安全性研究1).一般毒理研究试验试验结论抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液的一般毒理研究表明，注射给予大剂量的DGDK-1对动物(昆明种小鼠，家猫)的精神神经系统，呼吸系统及心血管系统无明显影响。
2).动物急性毒性试验方法参照卫生部药审办颁布的“人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点”中急性毒性试验要求进行本试验。
试验结果小鼠一次尾静脉注射抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液20mg/kg(相当于临床推荐剂量的200倍)后，一般状态良好，与对照组小鼠无明显差异。iv后24小时剖检2♂2♀小鼠，肉眼未观察到病变。试验组小鼠仅于给药后2-5天出现一过性摄食减少，体重下降，此后体重逐步恢复正常增长。在14天的观察期内，试验组小鼠各时间段的体重虽明显低于对照组鼠(P＜0.001)，但试验组鼠全部存活，一般状态正常，体重增长，未见明显毒副反应。
3).动物长期毒性试验试验方法参照卫生部新药审评中心编印的“人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点”中慢性毒性试验的要求“连续给药(隔天或每天)10次(按体重计算，总剂量相当于人相对剂量的100倍)，观察3个月，应有80％动物存活。然后处死，解剖，检查有无肉眼可见病变，如有病变则应进一步进行病理切片检查。设有相应的对照组，进行本试验。
试验结果大鼠连续静注抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液10天，未见明显免疫反应及抗抗体产生。观察期间，给药组有93.3％大鼠依然存活，但大鼠的活动明显减少，精神差，挤在一起，被毛无光泽、蓬松，摄食量和饮水量明显减少；给药组大鼠第1-2周体重增长，3-6周至13周给药鼠体重均非常明显低于对照鼠，给药组大鼠的轻度毒性反应，可能是由碘[131I]放射损伤作用所致。
常规血液学检查结果表明连续10天给予抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液的大鼠的红细胞数、白细胞数、血红蛋白含量低于对照组，给药组雌鼠的凝血时间长于对照组。静注抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液大鼠的血清碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)，肌酐(Crea)，总胆固醇(T-CHO)测定值均明显高于对照组(P＜0.05，P＜0.001)。其他生化指标，均在正常值范围内。这些生化学改变可能是由碘[131I]内照射损伤作用引起。
尸解发现心、肝、肺、脾、肾、肾上腺、甲状腺、脑、睾丸、前列腺、肾上腺和甲状腺脏器系数均明显低于对照组。病理组织学检查结果发现，给药组大鼠肾脏发生程度不同的局灶性肾小球血管球增大，充满球囊，肾小球内皮细胞和间质细胞增生，肾皮质部曲管稍混乱，其中三只大鼠可见肾近曲小管空泡样变性。对照组大鼠肾脏未见组织病理学改变。结果表明抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液对大鼠肾脏有一定损害作用。
4).医学内照射吸收剂量的研究方法采用ICRP和MIRD的方法。
内照射吸收剂量表4单次注射后各器官的吸收剂量(mGY/MBq)心12.43肝17.97肾11.15肺41.37脾34.07卵巢 7.86脑12.56膀胱 94.97小肠 7.57上部大肠壁36.50下部大肠壁55.16
结论单次注射抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液后，心脑肝肾等主要脏器所受的辐射剂量比较小，膀胱，肠壁，尤其是下部大肠壁所受的剂量较高，但也在容许范围内。
应用实施例3 DGDK-1的临床前动物药代动力学研究试验内容和试验方法参照卫生部药政局颁布的《新药临床前研究指导原则汇编》中“临床前药物代谢动力学研究指导原则”进行本试验。
结论大鼠静注抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液后，0.15、0.30和0.45mg/kg三个剂量组的血药浓度—时间曲线，符合二室数学模型，其药物动力学t/2α、t/2β，K12，K10，Vd，AUC和CL，分别为10.64±6.35min，328.32±22.17min，0.0486±0.03444min-1、0.03435±0.01575min-1、0.005065±0.001909min-1、349.92±16.82ml/kg、203775±21497μg·min·L-1和0.7424±0.0791ml·kg-1·min-1；7.5678±1.4485min、308.5±7.313min、0.5393±0.1382min-1、0.03705±0.00605min-1、0.005699±0.00034min-1、342.52±19.73ml/kg、39125±30715μg·min·L-1和0.7541±0.0548ml·kg-1·min-1；20.67±1.34min、317.5±9.33min、0.01597±0.00097min-1、0.0149±0.00098min-1、0.004897±0.000103min-1、401.0±25.21ml/kg、515175±24515μg·min·L-1和0.8749±0.0411ml·kg-1·min-1。静注后，72和120hr抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液在荷人肝癌裸小鼠的组织分布基本相似，其放射性计数值以血液最高，肺肾次之，肝癌组织第4，肝、脑、骨骼肌、体脂、睾丸、胃肠、心、脾等组织分布较少，且这些组织的T/NT值均大于1，表明抗体与肝癌组织有特异结合。同时，子宫卵巢组织分布明显高于睾丸组织。大鼠静注单抗后，单抗绝大部分自尿排出，粪排出较少；静注后第一天从尿、粪中排泄速度快，数量多，第二天次之，此后有一个长时间的缓慢排泄过程，每天排泄量逐渐减少，直到第20天仍有微量抗体排出。20天内总排泄量占注入量的50％左右。
应用实施例4 DGDK-1注射液在荷人肝癌裸小鼠体内的组织分布表5瘤/组织比器官2小时后72小时后120小时后心 2.74 2.402.38肺 2.19 1.581.61肝 3.15 2.472.11脾 3.00 2.452.49胃 3.42 4.284.37肠 4.91 3.292.37骨 2.61 5.183.79肌 6.29 5.876.54体脂6.10 4.093.93脑 18.46 14.91 13.69肾 2.57 2.252.55生殖腺 1.56 1.511.32血液0.61 0.490.66应用实施例5 DGDK-1注射液的临床安全性研究剂量分组
根据动物毒理学的试验资料，小鼠单次静脉注射的安全剂量可达3700MBq(100mCi)；又参照动物药效学试验的结果，小鼠显效放射剂量范围为0.925～4.625MBq(25-125uCi)。以国人的标准体重50kg计，相应的人体剂量在3212.5～11562.5MBq(62.5-312.5mCi)之间，均应属安全剂量范围。为谨慎起见，该项研究选用相应的人体显效剂量的1/3，即750MBq(20mCi)作为起始剂量。受试者共分5组，第1组为起始剂量组，剂量逐组递增，组间间隔剂量为740MBq(20mCi)，最高剂量组为3700～MBq(100～mCi)。在上一剂量组连续观察不短于14天、未发现毒副作用后再继续下一剂量组。
740MBq～(20mCi～)组6例1480MBq～(40mCi～)组4例2220MBq～(60mCi～)组11例2960MBq～(80mCi～)组8例3700MBq～(100mCi～)组3例用药方法将新鲜制备的DGDK-1与10ml生理盐水混匀，在5分钟内缓慢经静脉注射入人体，再用同一注射器静脉注入10ml生理盐水，也可经静脉点滴、动脉介入，可在2周内多次注射。
毒副反应观察1.一般毒副反应1)24小时内(注射当日)的急性毒副反应观察对32例受试者进行注射后24小时内的急性毒副反应观察显示，剂量在740-3700MBq(20～100mCi)范围内，所有受试者在注射当日均无休克、紫绀、呼吸困难、昏迷等危象发生，生命指征正常，亦无其它不良症候出现；仅3例有发热，均系注射前已发热者，高于37.5℃，最高为38.6℃，(见表6)。
表6 耐受性试验临床不良反应观察(注射当日)序列 剂量体温血压脉搏 呼吸系统循环系统消化系统其它反应号 (MBq) (℃)1. 802.9 37.5 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化2. 806.6 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化3. 869.5 36.7 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化4. 743.7 37.5 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化5. 817.7 37.3 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化6. 784.4 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化7. 1505.9 37.1 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化8. 1520.7 38.6 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化9. 1698.3 37.2 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化10.1576.2 36.8 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化11.2264.4 36.9 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化12.2238.5 36.4 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化13.2253.3 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化14.2264.4 37.2 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化15.2249.6 36.6 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化17.2249.6 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化18.2223.7 37.2 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化19.2231.1 36.7 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化20.2486.4 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化21.2623.3 36.7 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化22.2652.9 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化24.2967.4 38.7 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化25.2971.1 37.3 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化26.3293.0 37.3 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化27.3133.9 36.8 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化28.2634.4 36.9 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化29.3015.5 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化30.2960.0 37.2 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化31.2878.6 36.5 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化32.3707.4 37.0 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化34.3877.6 36.7 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化35.3814.7 38.3 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化备注1、本表所记录的体温系指注射后24小时内的最高体温。有3例(No.8、No.24和No.35)体温高于37.5℃；均系注射前已发热者；注射后24小时内的最高体温分别为38.6℃、38.2℃和38.3℃，同注射前的体温相比，无明显增高。
2、血压无异常变化系指注射后24小时内未出现注射药品所引起的血压异常变化。
3、脉搏无异常变化系指注射后24小时内未出现注射药品所引起的脉搏异常变化。
4、呼吸系统无异常变化系指注射后24小时内原有呼吸系统的症状或体征在注射后无明显恶化。注射前咳嗽、咳血者2例，呼吸困难者1例，注射后并未观察到原有症状有明显恶化。
5、循环系统无异常变化系指注射后24小时内原有循环系统的症状或体征在注射后无明显恶化。
6、消化系统无异常变化系指注射后24小时内原有消化道症状或体征在注射后无明显恶化。注射前食欲不振者24例，腹胀者23例，腹痛者16例，乏力者16例，肝大并疼痛者22例，黄疸者3例，伴胸腹水者2例，注射后并未观察到原有症状有明显恶化。
7、其它无异常变化系指注射后24小时内未出现皮疹、皮肤瘙痒、烦躁不安等。1例受试者原有皮肤瘙痒，注射后未观察到明显加重。
2)45天内的毒副反应观察对32例受试者注射后45天内的毒副反应观察发现，剂量为740-3700MBq(20～100mCi)时，除注射前原有的症状和体征外，所有受试者均未出现可疑的与该药品有关的不良反应，亦未观察到原有的症状和体征因该药品的使用而进一步恶化(见表7)。
表7 耐受性试验临床不良反应观察(注射后45天内)序列 剂量体温 呼吸系统 循环系统 消化系统其它反应号 (MBq) (℃)1.802.9 38.2无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化2.806.6 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化3.869.5 38.2无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化4.743.7 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化5.817.7 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化6.784.4 37.3无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化7.1505.9 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化8.1520.7 39.4无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化9.1698.3 37.2无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化10. 1576.2 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化11. 2264.4 36.8无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化12. 2238.5 36.8无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化13. 2253.3 37.1无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化14. 2264.4 37.2无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化15. 2249.6 36.7无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化17. 2249.6 36.5无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化18. 2223.7 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化19. 2231.1 36.6无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化20. 2486.4 37.1无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化21. 2623.3 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化22. 2652.9 37.1无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化24. 2967.4 38.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化25. 2971.1 37.3无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化26. 3293.0 37.5无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化27. 3133.9 37.1无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化28. 2634.4 36.7无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化29. 3015.5 36.7无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化30. 2960.0 36.7无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化31. 2878.6 36.8无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化32. 3707.4 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化34. 3877.6 37.0无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化35. 3814.7 38.6无异常变化 无异常变化 无异常变化 无异常变化备注1、本表所记录的体温系指注射后45天内记录到的最高体温。5例(No.1、No.3、No.8、No.24和No.35)有发热，大多表现为一过性或波浪性，最高者39.4℃，可能系癌性发热。在观察期间体温均曾回复至正常。
2、呼吸系统无异常变化系指注射后45天内原有呼吸系统的症状或体征在注射后无明显恶化。注射前咳嗽、咳血者2例，呼吸困难者1例，注射45天内未观察到原有症状有明显恶化。
3、循环系统无异常变化系指注射后45天内原有循环系统的症状或体征在注射后无明显恶化。
4、消化系统无异常变化系指注射后45天内原有消化道症状或体征在注射后无明显恶化。注射前食欲不振者24例，腹胀者23例，腹痛者16例，乏力者16例，肝大并疼痛者22例，黄疸者3例，伴胸腹水者2例，注射后并未观察到原有症状有明显恶化。
5、其它无异常变化系指注射后45天内未出现皮疹、皮肤瘙痒、烦躁不安等。1例原有皮肤瘙痒，注射后未观察到明显加重。
2.血液学毒性32例受试者注射后45天内血液学毒性观察，剂量在740-3700MBq(20～100mCi)范围内，经多次检验，32例受试病人的血红蛋白、白细胞、血小板均在正常范围内；白细胞水平最低者曾达1.8×109/L(No.21，注射后第13天从2.9降至1.8，17天后恢复至2.7)；血小板水平最低者达35×109/L(No.26，注射后第6天从59降至35，4天后恢复至40)；表明注射该药品后45天内绝大多数受试者均未观察到临床上严重的血象异常反应(见表8)。
表8.受试者受试前后的血象Hb(g/L) WBC(109/L) PLT(109/L)序列号 受试前 注射后 受试前 注射后 受试前 注射后1.120 110 3.65.1 123 802.141 131 5.84.1 154 573.98 70 5.95.8 210 1154.149 122 13.0 10.3 201 1735.103 90 7.35.5 137 1486.119 122 26.6 10.5 254 1307.123 110 5.34.2 192 1268.143 89 4.43.8 83 809.144 130 4.13.7 56 3910. 163 130 7.25.1 205 12011. 106 71 5.55.2 110 14612. 137 108 3.84.0 96 8613. 121 118 2.73.9 63 7414. 120 111 9.53.9 266 16415. 102 103 4.13.9 86 6617115 119 4.23.5 83 6518. 135 121 5.45.0 100 10819. 128 111 8.95.8 236 18020. 142 138 6.45.2 216 11421. 133 118 2.91.8 69 4022. 113 109 4.54.6 151 13424. 110 95 4.43.2 84 3925. 112 121 5.45.3 142 12726. 122 121 9.44.8 59 3527. 92 83 5.64.2 62 5128. 131 115 4.44.7 109 11029. 116 94 16.5 12.0 201 8330. 155 147 4.94.7 87 10431. 126 98 6.35.9 243 14832. 126 100 5.23.1 156 10634. 166 146 5.14.5 104 11535. 106 101 7.25.8 126 82备注表中所例的注射后的数据系指注射后45天内多次化验报告中的最低值。
3.肝脏毒性对受试者进行注射后45天内的肝功能观察，以了解该药品对肝脏的毒性作用。在剂量740-3700MBq(20～100mCi)范围内，32例受试者经多次检验，8例(25.00％)白/球比值(A/G)注射后从1.0以上降至1.0以下，最甚者(No.5)降至0.91，但均能很快恢复，如No.5，白/球比值在下降后15天即恢复至1.11。23例受试者的谷丙转氨酶(ALT)值注射前已大于40单位，占受试者总数71.88％；注射后，这些受试者ALT值仍在40单位以上范围内呈小幅波动。2例ALT值从注射前的阴性转呈阳性(No.5从38升至59，No.19从31升至56)，均为III期患者(见表9)。
表9.受试前后的肝功能A/G γ-GT(u/L) ALT(u/L)序列号受试前 注射后受试前 注射后 受试前 注射后1. 33.3/47.3 29.2/43.7108156 65 1870.7 0.672. 47.1/36.4 35.5/31.955 141 47 721.291.113. 36.3/33.7 31.2/30.5750400 31 351.081.024. 42.8/23.8 29.0/27.0112470 12 371.801.075. 42.4/23.8 31.2/34.392 206 38 591.780.916. 33.9/37.1 33.9/43.6320475 47 480.910.787. 38.0/32.5 33.9/33.6218203 46 1041.171.008. 37.1/36.0 27.3/27.474 274 1004901.030.999. 37.1/43.0 33.1/38.0130158 58 670.860.8710. 47.3/31.9 43.6/28.264 90 21 291.481.5511. 47.3/27.7 35.2/23.777 107 44 571.701.4912. 37.0/37.0 35.0/33.291 129 42 711 1.0513. 35.2/26.9 37.0/46.039 53 19 371.310.8014. 45.1/38.9 35.2/40.4223438 66 1881.160.8715. 37.4/51.0 35.3/38.330 95 29 230.730.9217. 38.0/29.7 32.0/33.740 44 21 331.270.9518. 42.1/38.2 37/42.1 49 105 58 1571.100.8819. 30.0/38.0 40.0/38.499 245 31 560.791.0420. 44.3/39.1 34.1/35.141 73 53 1661.130.9721. 32.0/41.6 32.0/41.660 93 66 610.770.7722. 41.8/31.2 37.0/37.557 157 44 701.330.9924. 30.6/38.3 29.2/48.6192243 51 3040.790.6025. 39.5/43 35.2/37.9447453 1892050.920.9326. 31.1/41.8 32.0/39.8165275 53 770.740.8027. 28.9/41.3 27.5/38.549 171 65 1180.690.7128. 42/26.1 40/31190185 65 701.611.2929. 31.0/42.4 24.0/37.0178178 24 280.730.6530. 42.2/32.1 32.5/28.2142215 68 791.311.1531. 38.1/34.6 32.0/40.1250402 52 511.100.8032. 27.0/32.0 24.5/32 165300 54 870.840.7734. 37.6/34.5 41.6/40.1335379 81 741.171.0435. 28.7/41.5 25.9/40.3191275 51 810.690.64备注
表中所列A/G值，系指45天内多次化验报告中的最低值；γ-GT、ALT值，系指45天内多次化验报告中的最高值。
4.肾脏毒性对受试者进行注射后45天内的肾功能观察，以了解该药品对肾脏的毒性作用。在剂量740～3700MBq(20～100mCi)范围内，32例受试者经多次检验，仅1例(No.20，肾转移患者)尿酸(BUN)和肌酐(Cr)值高于正常，其肾功能注射前已不正常，注射后的BUN值波动于7.0～9.2之间，Cr值波动于135～140之间，追踪数据较为稳定(见表10)。
表10.受试前后的肾功能BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)序列号 受试前 注射后 受试前 注射后1. 4.1 5.0 84 922. 5.436.5 83 803. 2.316.1 36 1004. 6.5 6.0 72 885. 4.0 5.0 57 906. 4.026.0 62 827. 5.3 5.71 60 708. 7.5 7.5 96 9595.2 5.6 93 8210. 6.7 6.5 68 7511. 5.6 6.9 79 8012. 7.5 5.4 78 7813. 6.0 7.6 63 8314. 3.8 4.5 89 7615. 3.5 4.9 73 7117. 5.3 6.3 59 6618. 4.9 6.1 89 8519. 2.6 4.1 44 6320. 7.0 9.2 140 13921. 5.0 5.0 78 7822. 4.056.7 76 8424. 3.6 3.8 79 7725. 6 7.2 97 11426. 4.3 4.7 78 9027. 3.7 3.9 46 4728. 4.446.0 54 6229. 5.0 5.6 73 7930. 5.055.97 53 5031. 6.7 5.9 61 9132. 3.1 6.5 59 8734. 5.065.3 70 7135. 5.564.21 51 48备注
表中所列注射后的数据，系指注射后45天内多次化验报告中BUN和Cr的最高值。
5.甲状腺毒性对32例受试者进行注射后45天内的甲状腺功能观察，以了解该药品对甲状腺的毒性作用。注射前甲状腺功能低于正常标准者12例(占受试者总数的37.5％)，其中，T3和T4均低于正常标准者5例(占受试者总数的15.6％)，T3值低于正常标准者7例(占受试者总数的21.9％)，T4值低于正常标准者10例(占受试者总数的31.25％)；上述T3和T4值低于正常标准者，注射后[在剂量740～3700 MBq(20～100mCi)范围内]，其T3和T4值仍在正常标准以下呈小幅度波动。受试前甲状腺功能正常的20例患者中仅1例(No.35)，注射后T3值从正常的2.9降至2.2，下降幅度不大(见表11)。未观察到该药品在短期内对甲状腺的明显毒性。
表11.受试者受试前后的甲状腺激素水平序列 T3(pmol/L)T4(pmol/L)号 受试前注射后受试前注射后1. 3.9 2.7 22.1 18.52. 5.9 4.1 16.7 213. 5.1 4.2 18.8 264. 3.9 3.7 19.1 205. 4.1 2.65 20.39 19.26. 5.0 5.6 20.9 19.57. 5.5 3.8 15.9 24.18. 2.3 2.1 1.21 2.39. 3.1 3.2 10.5 10.910. 2.3 3.0 9.1 17.111. 1.3 1.4 11.1 12.112. 3.6 3.5 14.1 2413. 2.4 7.14 9.2 6.8914. 3.6 2.6 15.3 15.015. 6.4 5.5 12.9 13.717. 3.9 3.6 13.5 18.718. 2.5 6.25 8.7 11.8919. 5.1 6.0 24.6 22.420. 2.5 0.92 1.7 8.921. 2.8 2.75 6.0 6.022. 5.0 5.1 21.2 12.924. 3.5 3.7 8.7 9.125. 3.0 3.2 9.8 10.126. 3.7 3.8 15.0 15.227. 2.6 2.5 10.2 10.228. 4.5 4.6 13.7 17.929. 6.7 2.4 15.1 23.730. 6.1 4.2 15.4 24.031. 1.8 2.1 16.8 13.432. 3.5 3.6 11.1 19.534. 3.9 4.3 15.1 17.235. 2.9 2.2 11.9 10.3
备注表中所列注射后的数据系指注射后45天内多次化验报告中T3和T4的最低值。
应用实施例6 DGDK-1在原发性肝癌患者体内的分布对32例受试者用ECT进行DGDK-1的体内分布研究。肝癌阳性显象率为76.47％(26/34)，提示DGDK-1在人体内对肝癌组织具有相当识别能力(表12，图4)。注射后第4天显象者7例，占20.59％，注射后第6天显象者8例，占23.53％，注射后第14天显象者4例，占11.76％，提示DGDK-1在人体内明显浓集在肝癌组织上，并能存留较长时间(表12)。
表12. DGDK-1的ECT显像结果总结序列号 ECT显像所见 显象时间 显象结果(注射后天数)1.右叶可见较为明显之放射性浓集 14 +2.右叶内段左叶下段可见放射性浓集14 +3.右叶可见放射性浓集4 +4.右叶及方叶区域可见放射性浓集 4 +5.右叶可见异常放射性浓集区 4 +6.右叶可见异常放射性浓集区 10 +7.右叶内显较明显放射性浓集 3 +8.巨块型肝癌组织高强度积聚 2 +9.肝脏肿瘤高强度浓聚9 +10.肝左叶可见不均匀性放射性浓集， 3 +右叶占位区稍有浓集11.肝右叶及左叶可见放射性浓集区 6 +12.右叶占位区放射性高于其它肝组织 6 +13.右叶占位区放射性略高于其它肝组织 6 +14.肝右叶占位区放射性呈逐渐浓集趋势 4 +15.右叶显一放射性浓集区 8 +17.右叶可见明显的放射性浓集区， 6 +分布不均匀18.肝右叶可见放射性浓集于肿瘤组织 1 +19.右叶可见明显放射性浓集 4 +20.纵隔转移性肝癌高强度放射性浓集 14 +21.肝右叶可见放射性浓集区 6 +22.肝右叶可见一大范围放射性缺损区 4 -24.右后叶肿瘤未见放射性积聚 6 -25.肝右叶肿瘤高强度放射性浓集 2 +26.肝内小肿瘤放射性积聚不明显 4 -27.肝肿瘤未见明显积聚 7 -28.肝右叶肿瘤区内放射性明显浓集 8 +29.右叶内可见放射性异常浓集区 7 +30.右叶可见两处放射性过度浓集区 6 +31.肝内可见放射性浓集 6 -右叶外侧部放射性稀疏32.显现多个放射性浓集区 14 +33.肿瘤内未见放射性积聚 4 -34.周边部有少量放射性浓集 13 -35.肝右叶肿瘤浓集 6 +37.肿瘤内未见放射性浓集 3 -显象阳性率 76.47％
应用实施例7 注射DGDK-1后肝癌和肝、肺的放射性比值观察了数例受试者各时相肿瘤和肝、肺的放射性比值，均大于1，瘤/肝比值最高者达39∶1(注射后120小时)，在注射后360小时仍达34∶1(表13)。
表13.各时相肿瘤和肝、肺的放射性比值(受试者No.8)Time(h) T/Liver T/Lung2 177824 164548 166372 215696 2689120 39100144 27102168 26.2 103192 30120240 2789360 34147连续观察部分病例的放射性分布动态变化，示于图5-1、5-2、5-3。观察到单克隆抗体在病灶上的浓集需要一段时间过程，浓集的高峰时间因人而异。
应用实施例8 DGDK-1的临床药代动力学研究对6例受试者进行了药代动力学研究。6例受试者的受试序列号为8、9、18、28、33、37。注药后，分别于1min、2min、5min、10min、15min、20min、3hr、4hr、6hr、24hr、48hr、72hr、120hr、144hr、168hr、192hr、240hr抽取2ml静脉血样，用肝素抗凝，然后取各时间点血清200ul，用γ计数器测量放射性。据此，描绘血液和有关脏器(肝、甲状腺、肾等)的廓清曲线以及时间-放射性曲线；获得DGDK-1的血液动力学效应值及有关排泄常数。测定2例受试者的药代动力学参数(见表14)，DGDK-1在肝、血液和肺的半数廓清时间均为24小时以内，肾脏的半数廓清时间约为48-72小时之间，甲状腺的半数廓清时间为24小时，脏器的时间-放射性曲线见图6-1、6-2、6-3、6-4、6-6、6-7。血液廓清时间-放射性曲线见图7。
表14.若干脏器的药代动力学排泄常数序列号 No.8 No.9肝 A(t)＝259.95e-0.108t+84.26e-0.0059t-904.68e-0.82tA(t)＝738.40e-0.00513t-682.96e-0.005t+160.3e-0.043t肾 A(t)＝25.28e-0.01215t+4.895e-1.395t甲状腺 A(t)＝44.34e-1.07t+14.36e-0.0106tA(t)＝715.52e-0.0023t-706.0e-0.0023t+24.87e-0.029t肺 A(t)＝57.63e-0.01132t+66.99e-0.01132t脾 A(t)＝10.01e-0.00012t+111.23e-0.89tA(t)＝696.71e-0.0069t-725.1e-0.007t+61.16e-0.01t心 A(t)＝24.43e-0.009t+34.22e-0.605tA(t)＝716.44e-0.00179t-705.0e-0.0018t+23.68e-0.02t颅腔 A(t)＝14.44e-0.0124t+15.78e-0.72tA(t)＝716.44e-0.0179t-705.1e-0.018t+23.68e-0.02t血液 A(t)＝-40075.04e-22.38t+7683.61e-0.0189t+22120.19e-0.29t肿瘤 A(t)＝34.35e-0.0499t+88.90e-0.00634tA(t)＝717.68e-0.0023t-704.5e-0.0024t+52.59e-0.04t应用实施例9 DGDK-1的内照射辐射吸收剂量计算对6例受试者以Mirdose3软件进行DGDK-1的吸收剂量计算，其主要脏器内的滞留时间研究作为计算脏器吸收剂量的基础。DGDK-1在脏器内滞留时间以颅腔最长(32.14hr)，以后依次为肝脏(15.65hr)、肺(10.63hr)、甲状腺(9.10hr)等(见表15)。
表15.抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液在若干脏器内的滞留时间(hr)序列号 No.8 No.9 No.18 No.28 No.33 No.37平均值注射剂量(MBq) 1520.71698.32223.72634.42031.31853.71993.7源器官颅腔 1.26E+00 2.47E+00 1.51E+00 18.5E+01 1.81E+00 7.60E-01 32.14E+00双肾 1.21E+00 4.18E+00 1.47E+00 2.16E+01 3.68E+00 2.73E+00 5.81E+00肝脏 2.41E+01 7.79E+00 1.14E+01 2.26E+01 1.37E+01 1.43E+01 15.65E+00肺4.68E+00 1.20E+01 6.81E+00 2.26E+01 9.40E+00 8.28E+00 10.63E+00脾脏 1.21E+00 2.45E+00 2.24E+00 2.11E+01 3.99E+00 1.12E+00 5.35E+00甲状腺4.70E+00 2.07E+00 1.50E+00 2.66E+01 1.31E+01 6.61E+00 9.10E+00膀胱 3.00E+00 3.29E+00 2.40E+001.90E+00 7.90E-01 2.28E+00依上述参数用Mirdose软件计算6例受试者脏器内照射吸收剂量，结果显示脏器内照射吸收剂量(mGy/MBq)从高到低依次为甲状腺(225.7E-01)、脾(37.95E-01)、双肾(35.45E-01)、肝(25.86E-01)、肺(13.31E-01)、心肌(11.16E-01)，以下较低的依次为下段大肠(0.18E-01)、睾丸(0.33E-01)、上段大肠(0.40E-01)、皮肤(0.46E-01)(表16)。除甲状腺外，体内主要脏器所受到的内照射辐射剂量均在允许范围以内。
表16中的有效剂量(effective dose)系指各器官所受到的内照射辐射剂量乘以权重因子后的加和值，代表射线引起机体效应(包括随机效应)所需要的剂量，由表16可知，该项研究中的平均有效剂量为28.69E-01mSv/MBq，也在允许范围以内。
表16.抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液对各脏器的内照射吸收剂量(mGy/MBq)序列号 No.8No.9No.18 No.28 No.33 No.37 平均值注射剂量(MBq) 1520.7 1698.3 2223.7 2634.4 2031.3 1853.7 1993.7源器官肾上腺 1.30E-011.05E-018.71E-025.95E-011.28E-011.08E-011.92E-01颅腔 1.32E-012.60E-011.59E-011.98E+002.08E-018.98E-029.36E-01乳腺 3.14E-023.84E-022.76E-022.62E-014.14E-023.49E-020.73E-01胆囊壁 2.13E-019.54E-021.10E-014.92E-011.43E-011.39E-011.99E-01下段大肠 2.26E-022.39E-021.77E-021.78E-029.72E-030.18E-01小肠 3.92E-022.95E-022.50E-022.73E-013.38E-022.69E-020.71E-01胃 5.46E-025.51E-024.59E-024.62E-017.14E-024.70E-021.23E-01上段大肠 5.40E-023.35E-023.17E-024.24E-023.65E-020.40E-01心肌 7.80E-027.72E-026.05E-026.32E+008.69E-027.50E-0211.16E-01双肾 5.90E-011.80E+006.71E+009.35E+001.62E+001.20E+0035.45E-01肝 1.85E+006.33E-018.91E+001.92E+001.08E+001.12E+0025.86E-01肺 6.15E-011.47E+008.50E-012.83E+001.18E+001.04E+0013.31E-01肌肉 3.09E-023.20E-022.48E-022.64E-014.66E-023.24E-020.72E-01胰腺 1.19E-011.02E-019.03E-027.11E-011.38E-019.56E-022.09E-01红骨髓 3.60E-023.89E-022.87E-023.15E-014.94E-023.66E-020.84E-01骨表皮 3.07E-023.41E-022.55E-023.42E-014.80E-023.35E-020.86E-01皮肤 1.57E-021.57E-021.23E-021.93E-012.22E-021.59E-020.46E-01脾脏 8.75E-011.76E+001.59E+001.49E+012.82E+008.24E-0137.95E-01睾丸 1.21E-021.29E-029.53E-031.52E-018.06E-033.77E-030.33E-01胸腺 3.03E-024.46E-023.04E-023.82E-015.88E-024.43E-020.98E-01甲状腺 2.66E+001.17E+018.46E+001.50E+007.38E+013.73E+01225.70E-01膀胱壁 9.47E-011.04E+007.56E-011.81E-016.01E-012.52E-016.30E-01全身其他部位 9.32E-028.63E-026.99E-025.16E-011.24E-019.14E-021.63E-01有效剂量当量 4.39E-018.74E-016.13E-017.00E+002.76E+001.47E+0021.93E-01有效剂量 4.02E-019.43E-016.79E-018.75E+004.22E+002.22E+0028.69E-01有效剂量当量和有效剂量单位为mSv/MBq或者rem/mCi
应用实施例10 DGDK-1引起的抗抗体反应对33例受试者进行注射该药品后45天血液HAMA水平检测，以了解该药品所引起的抗抗体反应。在用药剂量740-3700MBq范围内，经反复多次检验，所有受试者注射后15天以内HAMA检测均为阴性，但45天后大部分受试者出现HAMA阳性反应，45天后的HAMA阳性率达81.82％(表17)。
表17. 受试前后的血液HAMA水平(O.D值)序列号 受试前注射后15天注射后45天1. - - +2. - - +3. - - +4. - - +5. - - +6. - - -7. - - +8. - - +9. - - +10. - - +11. - - -12. - - +13. - - +14. - - +15. - - -17. - - +18. - - +19. - - -20. - - +21. - - +22. - - +24. - - -25. - - +26. - - +27. - - -28. - - +29. - - +30. - - +31. - - +32. - - +34. - - +35. - - +37. - - +
备注高于Cut off值为阳性，以+表示；低于Cut off值为阴性，以-表示。阳性对照减去阴性对照的二分之一值为Cut off值。
应用实施例11 抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1注射液的临床疗效观察指标包括甲胎蛋白水平以明显降低或恢复至20ng/ml以下为有效。
肿块体积生存期参照文献(“原发性肝癌”第2版，p539，汤钊猷、余业勤主编，1998年)，II期肝癌患者(中位肿瘤直径为9cm)的自然平均生存期为6个月；III期肝癌患者(有黄疸、腹水、或转移等)的自然平均生存期为2个月；考虑到该项临床试验大部分受试者观察时间尚短，故对II期和III期受试者分别设定判断初步疗效的指标如下II期受试者参照文献，以自然平均生存期6个月的1.33倍即存活8个月，和2.00倍即存活12个月，作为初步有效或有效的两项指标，分别计算8个月和12个月平均生存率。
III期受试者参照文献，以自然平均生存期2个月的2.00倍即存活4个月，和3.00倍即存活6个月，作为初步有效或有效的两项指标，分别计算4个月和6个月平均生存率。
4.一般症状以食欲改进、疲劳恢复、体力增进、痛苦减轻、主观症状好转为有效。
疗效1.甲胎蛋白受试前32例中20例血清甲胎蛋白阳性(占受试者总数的62.5％)，最高者＞3500ng/ml(No.13和No.32)，其中30％为弥漫型肝癌患者。注射DGDK-1后45天内，4例甲胎蛋白水平恢复至正常，占甲胎蛋白阳性受试者总数的20％(4/20)，11例甲胎蛋白水平明显下降，占甲胎蛋白阳性受试者总数的55％(11/20)，甲胎蛋白水平微弱下降或不再升高者4例，占甲胎蛋白阳性受试者总数的20％(4/20)。甲胎蛋白水平反而升高者1例，占甲胎蛋白阳性受试者总数的5％(1/20)。(见表18)。
表18.受试前后甲胎蛋白(ng/ml)水平变化序列号 受试前受试后1. 198.7 188(治疗后45天)2. ＜20 ＜203. ＜20 ＜204. ＜20 ＜205. ＜20 ＜206. ＜20 ＜207. ＜20 ＜208. ＜20 ＜209. 313.39＜20(治疗后50天)10. 22.1 ＜20(治疗后7天)11. 2616 1960(治疗后45天)12. 1746 304(治疗后45天)13. ＞35001052(治疗后80天)14. 143 123.6(治疗后45天)15. ＜20 ＜2017. 82.6 30(治疗后60天)18. 2000 ＜20(治疗后120天)19. 214 200(治疗后63天)20. 845 300(治疗后47天)21. 2792 400(治疗后45天)22. 277.2 ＜20(治疗后60天)24. ＞30001000(治疗后62天)25. ＜20 ＜2026. ＜20 ＜2027. 658.2 199(治疗后48天)28. 537 720(治疗后45天)29. ＜20 ＜2030. 219.5 108(治疗后45天)31. 500.6 216(治疗后60天)32. ＞35001020(治疗后43天)34. 177 180(治疗后45天)35. ＜20 ＜20
备注表中所列受试后数据系指注射后45天内多次化验报告中甲胎蛋白(AFP)的最低值。
2.肿块体积根据对60余例患者的观察II期患者的肿块缩小率为72.4％(上海中山医院)III期患者肿块缩小率为54.8％(上海东方肝胆外科医院)3.生存率1).对第一批35例II期患者的临床观察1年生存率为44.2％，其中二步切除率为75％10年生存率为31.4％2).对第二批32例受试者进行注射DGDK-1后的生存观察截止于2002.11.15，上述32例受试者的平均生存期为7.6月；存活6个月以上者13例，占总数的40.6％；存活10个月以上者10例，占总数的31.3％；存活12个月以上者10例，占总数的31.3％；至今仍存活者10例，占总数的31.3％(表19)。
如按受试者受试前肿瘤有无转移分析18例无转移患者的受试者平均生存期为10.3月；存活6个月以上者12例，占总数的66.67％，存活10个月以上者9例，占总数的50.0％，存活12个月以上者9例，占总数的50.0％，至今仍存活者9例，占总数的50.0％。14例已有转移患者的受试者平均生存期为4.2月，其中存活6个月以上者1例，存活12个月以上者1例，至今仍存活者1例(表19)。
如按受试者受试前的临床分期分析15例II期患者的平均存活期为11.73月，其中存活6个月以上者12例，占总数的80.0％，存活10个月以上者9例，占总数的60.0％，存活12个月以上者9例，占总数的60.0％，至今仍存活者9例，占总数的60.0％。17例III期患者平均生存期为3.97月，其中存活6个月以上者1例，存活10个月以上者1例，存活12个月以上者1例，至今仍存活者1例(表19)。
4.对32例受试者观察注射药物后45天内的一般情况。主管医师判断一般状况(如食欲、精神、体力、腹胀等)明显好转者27例，占84.3％(表19)。
表19.临床症状及生存期观察表(生存期统计截止期2002.11.15)序列号 一般情况 生存期(月)1. 好转 42. 好转 2.53. 无明显变化 24. 好转 45. 好转 26. 好转 57. 好转 48. 好转 239. 好转 22***10.好转 5.511.好转 612.好转 17***13.好转 17***14.好转 515.好转 16***17.无明显变化 3.518.好转 14***19.好转 420.好转 14***21.好转 722.好转 14***24.无明显变化 2.525.好转 12***26.好转 12***27.无明显变化 2.528.好转 429.好转 230.无明显变化 231.好转 332.好转 234.好转 8***35.好转 2***为至今仍存活者，共10人应用实施例12 DGDK-1的用药剂量与疗效间的关系表20所列各剂量组的生存统计(截止期2002年11月15日)，在用药剂量1480～2960MBq(40～80mCi)/10mg抗体/剂范围内，初步疗效较高。需说明的是，2960～MBq(80～mCi)组平均生存月数仅5.0个月，8个月生存率仅25％；但考虑到该组8例受试者中有5例为转移患者，3例非转移受试者中的2例注射后生存期均高于12月，至今仍健康存活，故将此剂量包括在上述临床剂量范围内。
表20各剂量组的生存统计(截止期2002年11月15日)剂量组例数8个月生存率(％)平均生存月数0740～MBq(20～mCi) 6 3.251480～MBq(40～mCi) 4 50 13.602220～MBq(60～mCi) 11 54.5 10.682960～MBq(80～mCi) 8 25 5.03700～MBq(100～mCi) 3 33.3 4.0
SEQUENCELISTING<110>上海中科生龙达生物技术(集团)有限公司神农氏医药股份有限公司<120>抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体GDK-1及其131碘化物DGDK-1和应用<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1464<212>DNA<213>抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体GDK-1可变区蛋白<400>1atggactgga cctggaggat cttcttcttg gtggcagcag caacaggtgc ccacttccca60gggtcaactg gtgcagtctg gacctgaaag tgaaaaggcc tggggcctca gtgaaggtct120cttgcaaggc ctctggtttc tacttttcac taatgaataa tagatattgg ggtatacatt180gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg tgtgatttgg aacagtggtg240gacagggcca ccacagacta taatgcggca ggttcaatgg tcgtatccag agtcaccagg300
accacagaca cctctacgag tactgcctac atggaactga gaagcctgac atctgacgac360acggccgtgt tctactgtgc gagaaatgat actaacccct attttgagga tggttacgac420ggggggccct ttccttactg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc480aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg ggacacagcg540gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca600ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac660tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc720aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagtagagcc caaatcttgt780gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc840ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca900tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac960ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac1020cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag1080tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa1140gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag1200aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag1260
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1.一种抗细胞膜糖蛋白KD-43的单克隆抗体GDK-1，其特征在于编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的<210>1和<210>2。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体GDK-1，其特征在于其为鼠源的或人鼠嵌合的。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体GDK-1，其特征在于其为整分子IgG或IgG的Fab片段。
4.一种抗细胞膜糖蛋白KD-43的131-碘化单克隆抗体DGDK-1，其特征在于编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的<210>1和<210>2。
5.根据权利要求4所述的131-碘化单克隆抗体DGDK-1，其特征在于其为鼠源的或人鼠嵌合的。
6.根据权利要求4所述的131-碘化单克隆抗体DGDK-1，其特征在于其为整分子IgG或IgG的Fab片段。
7.根据权利要求4、5或6所述的131-碘化单克隆抗体DGDK-1在制备治疗肝癌的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于该肝癌为巨块型肝癌或弥漫型肝癌。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于其放射剂量范围在20-100mCi之间。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于该131-碘化单克隆抗体DGDK-1为液体，使用方法为与生理盐水配制后两周内1-5次注射。
全文摘要
本发明提供一种抗细胞膜糖蛋白KD－43的单克隆抗体GDK－1，编码其可变区蛋白的核苷酸序列为序列表中的<210>1和<210>2；还提供了一种抗细胞膜糖蛋白KD－43的
文档编号A61K39/395GK1523039SQ03115490
公开日2004年8月25日 申请日期2003年2月21日 优先权日2003年2月21日
发明者谢弘, 王根凤, 姚鑫, 陈瑞铭, 来文, 谢雍, 王放, 陈中健, 褚云芳, 李隽吉, 朱海颖, 戴慧敏, 强家模, 谢 弘 申请人:上海中科生龙达生物技术(集团)有限公司, 神农氏医药股份有限公司, 上海中科生龙达生物技术(集团)有限