专利名称：一种灯盏细辛有效组分的制备方法
技术领域：
本发明涉及植物药领域，具体地说，是一种灯盏细辛有效组分的提取方法及其在制备心脑血管疾病防治药物或保健品中的应用。
灯盏细辛又称灯盏花，为菊科草本植物，学名Erigeron breviscapus(Vant)Hand.-Mazz.，主要分布在云南省及周边部分地区，是一种家喻户晓的民族植物药，全草对多种缺血性心脑血管疾病有独特疗效，尤其对中风后遗症效果显著，以该植物为原料制成的多种制剂已在临床上广泛使用。研究显示，灯盏细辛含多种类型的化学成分，包括黄酮类、苯甲酸类、咖啡酰奎宁酸类、γ-吡喃酮类、萜类、精油等等，这些成分结构各异，理化性质多样，活性十分复杂，其中有些是有效成分，有些是无效杂质，还有些则可能是有害成分。受现有条件限制，尚不能对每种化合物的药理机制及其相互作用关系逐一进行评价，对药效物质基础的认识依然存在许多盲区，但目前可以确定的是，黄酮和咖啡酰奎宁酸这两类酚酸性成分是主要药效物质(结构式见附图1)。由于灯盏细辛巨大的药用潜力，当前对该药用植物的研究和开发仍方兴未艾。
因提取工艺不同，所得原料在化学上将表现出较大差异。发明专利CN90100451公开了一种灯盏花素，即灯盏细辛黄酮的提取工艺，现已被广泛采用，产品有灯盏花素注射液、灯盏花素片、注射用灯盏花素等，其原料制备过程中包括醇提、水溶、酸沉、结晶等步骤，所得提取物成分单一，主要含灯盏花乙素(scutellarin)，含量约50％～90％，基本不含其他非黄酮类成分，咖啡酰奎宁酸类完全丢失(见附图3-B)。发明专利CN93104701公开了一种灯盏花注射液制备工艺，提取环节主要是水煮、醇沉、醋酸乙酯萃取，其提取物成分复杂，除咖啡酰奎宁酸、黄酮、咖啡酸等酚性成分外，还含大量非酚性物质，如碳水化合物、精油、焦袂康酸(pyromeconic acid，结构式见附图1)等等，而灯盏花乙素因不溶于醋酸乙酯几乎损失殆尽(见附图3-C)，现有产品“灯盏细辛注射液”就是用该工艺制备。发明专利CN00113019公开了一种灯盏花有效部位制备工艺，其技术特征是用稀醇或稀丙酮提取，用聚苯乙烯大孔树脂精制，所得有效部位含有黄酮类、咖啡酸、咖啡酰奎宁酸、焦袂康酸及其衍生物，既有酚性成分，也有非酚性成分。发明专利CN01115358公开的方法是用热水或酒精提取，用正丁醇萃取进行精制；因正丁醇沸点较高(120℃)，增加了溶剂回收的难度，有溶剂残留问题，另外，该方法也不能除去焦袂康酸。
总之，现有技术都是用酒精、稀丙酮，或者是水煮方法进行提取，粗提物再用醋酸乙酯或正丁醇萃取，或者用大孔树脂吸附，以达到精制目的，这些方法均不同程度存在有机溶媒损耗大、有效成分丢失、含焦袂康酸等问题。另外，一些现有灯盏细辛系列口服制剂，如灯盏细辛胶囊和灯盏花冲剂，其制备工艺是用灯盏细辛醇浸膏不加精制直接制成制剂，这种醇浸膏成分最复杂，或者可以说多数成分是杂质，根本不适宜制成注射剂。值得注意得是，灯盏细辛中含量较高的焦袂康酸对心脑血管无明显有益活性，相反地，对肝脏有确切毒性，已经被用作肝毒工具药(Experientia，1984，40(8)894-6)，无疑这种成分是有害杂质，若长期使用，将对人体健康造成损害。
本发明的目的就是针对现有灯盏细辛提取技术上存在的种种缺陷提供一种新的制备工艺，为心脑血管疾病的防治提供更加安全、有效和质量可控的灯盏细辛系列医药保健产品。
本发明人发现，聚酰胺吸附柱可以有效地提取出灯盏细辛的水溶性活性组分。因此，本发明的目的之一是提供新的制备灯盏细辛有效组分的方法，该方法包括取灯盏细辛全草或地上部分，粉碎成粗粉，用6～12倍量，优选8倍量左右的稀碱溶液常温下提取；提取液加酸调pH值2-3，静置，滤过；沉淀部分用4～8倍量左右，优选6倍量左右的55％-95％酒精提取3～4次，优选3次回流提取；滤液部分通过聚酰胺柱进行吸附，先用水洗除杂，再用30％-95％酒精洗脱；将聚酰胺柱酒精洗脱液和沉淀部分的酒精提取液合并，减压浓缩，即得总酚酸；进一步加稀碱溶解，滤过，喷雾干燥，即得总酚酸盐。
上述方法中所述的常温是指0-40℃，优选室温。
上述方法中所述的稀碱溶液是指用碳酸氢钠、碳酸钠(钾)或氢氧化钠(钾)等无机碱配制而成的水溶液，浓度在0.1-10％范围；提取液酸化时可以使用稀硫酸或稀盐酸。
本发明的另一目的是提供用本发明方法制备的灯盏细辛有效组分，所述有效组分中的总酚酸主要含黄酮和咖啡酰奎宁酸两类成分，其中黄酮以灯盏花乙素为主，兼有少量灯盏花甲素、芹菜素、高黄芩素等；咖啡酰奎宁酸类包括1，5-O-、3，5-O-、4，5-O-、1，3-O-和3，4-O-等二咖啡酰奎宁酸，以及绿原酸和4-O-咖啡酰奎宁酸；另含少量咖啡酸和多舌飞蓬甙(结构式见附图1)，不含焦袂康酸及其它非酚性杂质。附图3-A为本发明工艺制备的灯盏细辛总酚酸的高效液相色谱图，与附图3-B和附图3-C比较可知，三者有显著差异A图中最大色谱峰为灯盏花乙素，并含较多咖啡酰奎宁酸；B中主要含灯盏花乙素，不含咖啡酰奎宁酸；C中含较多咖啡酰奎宁酸，而灯盏花乙素几乎不含。
本发明的另一目的是提供用本发明产物制备的药物和保健品。本发明产物中的总酚酸有效组分可单独或与其它药用许可的物质配合制成各种药物剂型，用于医疗保健用途。总酚酸盐为黄色粉末，易溶于水，无溶血性，更适合于制备注射剂型，如粉针、小水针、输液等。
本发明工艺的特点在于①用稀碱水溶液常温下进行提取，提取液几乎不含油脂、叶绿素、精油等各种脂溶性杂质，方便了后续过滤或其它精制处理；②大量的提取液不经加热浓缩，酸化过滤后直接上柱吸附，既节约能源，又避免了长时间受热可能对成分结构造成的破坏；③采用聚酰胺对黄酮、咖啡酰奎宁酸进行选择性吸附，能高效彻底去除各种杂质；④酚酸类有效成分提取完全，总酚酸得率达3％；⑤全过程唯一使用的有机溶剂是酒精，而且是在精制过程中使用，用量少，回收率高；⑥所得总酚酸不含肝毒成分焦袂康酸。附图4为本发明制备的总酚酸与灯盏细辛醇浸膏、焦袂康酸对照品的硅胶薄层比较色谱图，其展开剂为氯仿，显色用1％三氯化铁乙醇溶液喷雾；焦袂康酸遇三氯化铁显红色；从图中可以清晰地看出，灯盏细辛醇浸膏色谱中在与焦袂康酸斑点相同位置有一红色斑点，而总酚酸色谱中无该斑点，说明总酚酸不含焦袂康酸。
图1为黄酮和咖啡酰奎宁酸这两类酚酸性成分的结构式图2为本发明方法的制备工艺图3本发明工艺制备的灯盏细辛总酚酸与现有产品的HPLC比较；其中A.总酚酸；B.灯盏花素注射液；C.灯盏细辛注射液。色谱柱C-18键合硅胶柱；流动相THF-MeOH-0.1％H3PO4(14∶14∶72)，流速1ml/min；柱温40℃；检测波长335nm
下面以更具体的实施例对本发明提取工艺加以说明。
实施例实施例1灯盏细辛有效组分的制备取灯盏细辛全草粗粉2.5kg，装入圆筒内，室温下加0.5％碳酸氢钠渗漉，流速控制在10ml/min左右，共收集流出液20kg。搅拌下向提取液中滴加5％硫酸，使溶液pH值酸化至2-3，静置30分钟，滤过，分成沉淀和滤液两部分，分别精制处理如下①沉淀部分经水洗、烘干，研细，得棕褐色粉末35g，加入90％酒精回流提取三次，每次70ml，合并酒精提取液；②滤液部分上聚酰胺柱(填料2kg，60-90目)，先水洗，至流出液pH近中性时，改用80％酒精洗，收集酒精洗脱液约5L。将两部分酒精液合并，减压浓缩，得到总酚酸80g。加入1％氢氧化钠及水共约800ml使充分溶解，调pH7.5左右，滤过，喷雾干燥，即得总酚酸盐。
实施例2灯盏细辛有效组分的制备取灯盏细辛全草粗粉2.5kg，装入圆筒内，室温下加0.5％碳酸钠渗漉，流速控制在10ml/min左右，共收集流出液22kg。搅拌下向提取液中滴加10％盐酸，使溶液pH值酸化至2-3，静置30分钟，滤过，分成沉淀和滤液两部分，分别精制处理如下①沉淀部分经水洗、烘干，研细，得棕褐色粉末38g，加入95％酒精回流提取四次，每次60ml，合并酒精提取液；②滤液部分上聚酰胺柱(填料2kg，30-60目)，先水洗，至流出液pH近中性时，改用80％酒精洗，收集酒精洗脱液约5L。将两部分酒精液合并，减压浓缩，得到总酚酸82g。加入1％氢氧化钠及水共约800ml使充分溶解，调pH7.5左右，滤过，喷雾干燥，即得总酚酸盐。
实施例3灯盏细辛有效组分的制备取灯盏细辛全草粗粉2.5kg，装入圆筒内，室温下加0.2％氢氧化钠渗漉，流速控制在10ml/min左右，共收集流出液25kg。搅拌下向提取液中滴加5％硫酸，使溶液pH值酸化至2-3，静置30分钟，滤过，分成沉淀和滤液两部分，分别精制处理如下①沉淀部分经水洗、烘干，研细，得棕褐色粉末40g，加入90％酒精回流提取三次，每次75ml，合并酒精提取液；②滤液部分上聚酰胺柱(填料2kg，30-60目)，先水洗，至流出液pH近中性时，改用60％酒精洗，收集酒精洗脱液约5L。将两部分酒精液合并，减压浓缩，得到总酚酸76g。加入1％氢氧化钠及水共约800ml使充分溶解，调pH7.5左右，滤过，喷雾干燥，即得总酚酸盐。
实施例4灯盏细辛有效组分的制备取灯盏细辛全草粗粉2.5kg，装入圆筒内，室温下加0.5％碳酸钾渗漉，流速控制在10ml/min左右，共收集流出液20kg。搅拌下向提取液中滴加5％硫酸，使溶液pH值酸化至2-3，静置30分钟，滤过，分成沉淀和滤液两部分，分别精制处理如下①沉淀部分经水洗、烘干，研细，得棕褐色粉末37g，加入90％酒精回流提取四次，每次60ml，合并酒精提取液；②滤液部分上聚酰胺柱(填料2kg，30-60目)，先水洗，至流出液pH近中性时，改用80％酒精洗，收集酒精洗脱液约5L。将两部分酒精液合并，减压浓缩，得到总酚酸76g。加入5％氢氧化钠及水共约800ml使充分溶解，调pH7.5左右，滤过，喷雾干燥，即得总酚酸盐。
实施例5灯盏细辛有效组分的制备取灯盏细辛全草粗粉2.5kg，装入圆筒内，室温下加0.1％氢氧化钾渗漉，流速控制在10ml/min左右，共收集流出液22kg。搅拌下向提取液中滴加5％硫酸，使溶液pH值酸化至2-3，静置30分钟，滤过，分成沉淀和滤液两部分，分别精制处理如下①沉淀部分经水洗、烘干，研细，得棕褐色粉末38g，加入90％酒精回流提取三次，每次75ml，合并酒精提取液；②滤液部分上聚酰胺柱(填料2kg，30-60目)，先水洗，至流出液pH近中性时，改用55％酒精洗，收集酒精洗脱液约6L。将两部分酒精液合并，减压浓缩，得到总酚酸77g。加入1％氢氧化钠及水共约800ml使充分溶解，调pH7.5左右，滤过，喷雾干燥，即得总酚酸盐。
为便于理解本发明工艺制备的灯盏细辛总酚酸在治疗和预防缺血性心脑血管疾病方面的药用价值，下面提供该有效部位的部分药理实验结果。
实施例6对局灶性脑缺血的影响大鼠静脉输注总酚酸盐，观察本品对三氯化铁所致脑缺血大鼠的行为及梗塞面积的影响，结果显示，大鼠输注组合物2、4、8mg/kg后，动物行为变化及梗塞范围与生理盐水对照组比较有明显改善，24h后行为评分分别降低了50.2％(p＜0.01)、62.8％(p＜0.001)、55.2％(p＜0.001)；脑梗塞面积平均缩小了22.4％(p＞0.05)、55.8％(p＜0.001)、46.4％(p＜0.01)。
实施例7对微循环障碍大鼠软脑膜局部血流量的影响静脉输注总酚酸盐，观察本品对高分子右旋糖苷所致大鼠微循环障碍的影响。结果表明，假手术大鼠软脑膜局部流量60min内无明显改变；静脉推注高分子右旋糖苷后大鼠脑软膜局部流量明显减少，60min内最大下降25.6±6.5PU；静注组合物2、4、8mg/kg组于给药后10min，大鼠脑软膜流量降低值即明显少于溶剂对照组，作用持续60min以上，60min内最大下降分别为20.5±6.5、19.0±4.5、15.5±6.5PU，与溶剂对照组最大下降值比较，p分别＞0.05、＜0.05、＜0.001，说明给予总酚酸盐可缓解静注高分子右旋糖苷导致微循环流量的减少。
实施例8对微循环障碍大鼠血粘度的影响前一实验结束后，从大鼠腹主动脉取血，按体积1∶9比例将3.8％枸橼酸钠加入全血中抗凝，用锥板型血液粘度计在不同切速下(7.5～150s-1)测定大鼠全血粘度。结果表明，与假手术组比较，造型组大鼠在静脉推注高分子右旋糖苷后在不同切速下血粘度均明显高于正常大鼠。给予总酚酸盐2mg/kg后在各切速下大鼠血粘度与模型对照组无明显差别；给予4mg/kg后在低切速(7.5s-1)时血粘度明显低于模型对照组(p＜0.05)；给予8mg/kg后在各切速下大鼠血粘度均明显低于模型对照组。
实施例9对大鼠实验性动脉血栓形成的影响取Wistar大鼠，按体重随机分组，每组10只。对照组大鼠静脉注射生理盐水；给药组静注总酚酸盐2、4、8mg/kg，给药体积均为0.1ml/100g。实验时腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉，仰卧位固定，分离颈总动脉，将实验性体内血栓形成仪的刺激电极和温度探头挂于颈总动脉上，给药后10min开始刺激，刺激强度为2mA，刺激5min后关闭刺激开关，取下电极，3min后调节温控表至零位，记录动脉血栓形成时间。结果表明，大鼠静注总酚酸盐2、4、8mg/kg后，与对照组比较，动脉血栓形成时间分别推迟10％(p＞0.05)、65％(p＜0.001)、105％(p＜0.001)，表明总酚酸盐中、高剂量能明显推迟大鼠实验性动脉血栓形成时间。
实施例10抗血小板聚集作用取Wistar大鼠，按体重随机分组，每组10只。对照组大鼠静注生理盐水，给药组分别静注总酚酸盐2、4、8mg/kg，给药体积均为0.1ml/100g。实验时腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉，仰卧位固定，腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠与全血按1∶9混合抗凝，1000rpm离心7min制备富血小板血浆，3000rpm离心10min制备贫血小板血浆，应用PPP自动平衡血小板聚集仪，将各诱导剂诱导的生理盐水组血小板聚集百分数调至60％左右，诱导剂ADP、花生四烯酸(AA)、胶原终浓度分别为4μmol/L、2mmol/L、20mg/ml。观察对给药组大鼠血小板聚集作用的影响。结果见表1。
表1 总酚酸盐对大鼠血小板聚集功能的影响(X±SD，n＝10)药物 剂量 鼠数血小板聚集百分率(％)(mg/kg) (只) ADP 花生四烯酸 胶原溶剂对照- 10 54.8±18.1 73.8±10.0 50.8±20.0总酚酸盐2 10 38.5±17.7 68.4±7.640.8±15.6总酚酸盐4 10 35.2±14.5*61.1±17.8 38.4±17.8总酚酸盐8 10 34.3±20.0**50.9±16.7*25.2±17.0*注与对照组比较*p＜0.05；**p＜0.01实施例11急性毒性试验取体重18～22g昆明种小鼠雌、雄各50只，按性别、体重分别随机分成各5组，每组10只，静脉推注总酚酸盐2070、1863、1677、1509、1358mg/kg，相邻两剂量组剂距为0.9，静注体积均为0.1ml/10g体重，观察给药后一周内小鼠的毒性反应、死亡分布和死亡动物数，并按Bliss法计算LD50及其95％可信限。结果表明，高剂量静脉注射总酚酸盐后小鼠1min左右出现自主活动减少，静卧，呼吸急促，继而出现行为失调，惊厥，5～20min左右死亡。未死动物在30min后呼吸逐渐恢复正常，1h后行为等均恢复正常，以后6日内均不再出现死亡。死亡小鼠肉眼尸检心、肺、肝等主要脏器未见异常。雌性小鼠LD50为1776mg/kg；雄性小鼠LD50为1840 mg/kg，雌雄动物LD50近似，无明显差异。
实施例12对犬心肌缺血的治疗作用及血流动力学影响静脉输注总酚酸盐2、4mg/kg，明显改善结扎犬冠状动脉前降支所致实验性急性心肌缺血程度，缩小心肌梗塞范围。麻醉开胸犬心脏血流动力学试验结果表明，输注总酚酸盐1、2mg/kg对血流动力学各指标无明显影响；4mg/kg可降低血压、左室内压最大变化速率、左室做功及冠脉阻力，对心率、左室舒张末期压、总外周阻力、心脏泵血功能等其它血流动力学参数无影响，表明总酚酸盐通过减轻心脏后负荷，扩张冠脉及外周血管，减少回心血量及心脏做功发挥抗心肌缺血作用。
本发明将常温水提、酸碱处理、过滤、聚酰胺吸附等简单操作有机组合在一起，形成了独特的灯盏细辛提取工艺，具备简单易行、流程短、成本低、得率高、易于工业化生产等显著优势，所制备的总酚酸纯度高，药效强，毒性低，可方便地制成各种口服或注射剂型，广泛用于心脑血管类疾病的预防和治疗，因此，本发明具有极高的应用价值。
权利要求
1.一种灯盏细辛(Erigeron breviscapus(Vant)Hand.-Mazz.)有效组分的制备方法，其特征在于取灯盏细辛粗粉，用稀碱溶液常温下渗漉提取，收集6～12倍量左右提取液，酸化至pH2～3，滤过；沉淀部分用4～8倍量左右的55％～95％酒精分3～4次回流提取；滤液部分通过聚酰胺柱进行吸附，先用水洗，再用30％～95％酒精洗；将聚酰胺柱酒精洗脱液和沉淀部分的酒精提取液合并，减压浓缩，即得总酚酸有效组分；进一步加稀碱溶解，滤过，喷雾干燥，即得总酚酸盐。
2.根据权利要求1制备方法，其中所述稀碱溶液由碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾等无机碱配制成的水溶液，浓度为0.1％～10％。
3.根据权利要求1-2的制备方法，其中酸化时使用稀盐酸或稀硫酸。
4.根据权利要求1-3的任一制备方法，其中用稀碱溶液常温下渗漉提取，收集9倍量左右的提取液。
5.根据权利要求1-4的任一制备方法，其中沉淀部分用4～8倍量左右的55-95％酒精分三次回流提取。
6.根据权利要求1-5的任一制备方法，其中沉淀部分用4～8倍量左右的55-95％酒精分四次回流提取。
7.用权利要求1-6任一制备方法制备的产物，其特征在于含黄酮和咖啡酰奎宁酸两类主要物质以及少量咖啡酸和多舌飞蓬甙，基本不含焦袂康酸及其它非酚性成分。
8.权利要求7所述的产物，其特征在于黄酮类成分包括灯盏花乙素、灯盏花甲素、芹菜素和高黄芩素。
9.权利要求7所述的产物，其特征在于咖啡酰奎宁酸类成分包括1，5-O-、1，3-O-、3，4-O-、3，5-O-、4，5-O-二咖啡酰奎宁酸以及4-O-咖啡酰奎宁酸和绿原酸。
10.权利要求7-9的任一产物或其盐在制备心脑血管疾病防治药物或保健品中的应用。
11.聚酰胺吸附柱在富集灯盏细辛黄酮和咖啡酰奎宁酸类活性组分中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种新的灯盏细辛有效组分的制备方法，其特征在于①采用碱水常温下进行提取；②用聚酰胺柱吸附进行精制。该法仅用水和酒精作溶媒，具有流程短、成分稳定、成本低、操作简单、得率高的优点。所得有效部位主要含黄酮和咖啡酰奎宁酸两类酚酸性成分，不含肝毒成分焦袂康酸，具备高效低毒优势，可单独或与其它药用许可的材料配合制备成各种口服或注射剂型，适用于心脑血管类疾病的治疗和预防。
文档编号A61P9/00GK1616381SQ20031011353
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月14日 优先权日2003年11月14日
发明者潘锡平, 林艳和 申请人:深圳市生物谷科技有限公司, 深圳市生物谷医药研究院有限公司