专利名称：灯盏细辛内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种经发酵能够产生抗肿瘤及具有治疗人类心脑血管疾病药用成份的微生物。
灯盏细辛为菊科植物短葶飞蓬的全草。传统医学认为它有散寒解表、止痛舒络、活血治瘫痪的功效。临床用于治疗脑血栓形成、脑栓塞、多发性神经炎、慢性蛛网膜炎等脑血管意外所致的瘫痪，效果十分显著，主要药用成分为灯盏花乙素。目前由于灯盏花素的来源主要是从植物中提取获得，而以其它方式的获得途径尚有待于研究。
本发明的目的是提供一种经发酵能够产生抗肿瘤及具有治疗人类心脑血管疾病药用成份的微生物——灯盏细辛内生真菌。
本发明所述的灯盏细辛内生真菌命名为交链孢霉(Alternaria sp.)，保藏登记号为CCTCC NOM201028。
本发明所述的灯盏细辛内生真菌是从短葶飞蓬[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz]菊科植物活体中采用内生真菌微生物分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为交链孢霉Alternaris sp.，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期2001年7月27日，保藏登记号为CCTCC NOM201028。
本发明所述的灯盏细辛内生真菌的固体培养特征为一、PDA培养基28℃培养4天，菌落直径47mm，7天75mm，11天90mm。菌落铺展较疏松，灰黑色絮状，边缘整齐，背面黑色；二、麦芽法培养基28℃培养4天，菌落直径45mm，7天75mm，11天90mm。菌落隆起较疏松，边缘整齐，黄灰褐色绒絮状，背面黑色；三、察贝克培养基28℃培养4天，菌落直径33mm，7天70mm，11天mm 90mm。菌落疏松扁平，黄褐色长绒状，边缘整齐，背面肉褐色。
本发明所述的灯盏细辛内生真菌的液体培养特征为
一、培养基PDA，摇瓶培养时间5天，培养温度28℃±2℃；二、发酵培养特征培养第1天，菌种有零星的自色菌丝点；培养第2天，长满白色菌丝；培养第3天，发酵液菌丝体密集，菌丝体呈淡褐色；培养第4天，长满深黑褐色菌丝体，发酵液粘稠，培养第5天，发酵液菌丝体密集成块状，黑褐色菌丝体。
形态特征一、无性世代，菌丝橄榄褐色有隔，分生孢子梗分化明显，分枝淡褐色，分生孢子聚为分枝的链，倒梨形或卵形，纵横分隔，具短喙，淡褐至金黄褐色，光滑，孢子直径10.0～13.75×25.0～43.75微米。
二、有性世代，未发现。
本发明所述的灯盏细辛内生真菌菌株18SRNA碱基组成系列CTAAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACCGGGAAANCTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTGGATAGTACCTTACTNACTNGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCCCAANCTTCGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTNTCTTGGTGATTCATGATAACTTCACGGATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGANCGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAGGTATTGGCNTTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGNGGAGCCTGAGAAACGGTTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAANTTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGNCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTCCAATTTAAACCTCTTAACGANN本发明所述的灯盏细辛内生真菌，经发酵可获得异香豆素化合物及黄酮类化合物，其工艺步骤为菌种→试管斜面→种子培养→发酵培养→发酵物提取→分离化合物→有效成分。
其中，发酵原料为马铃薯培养基(PDA)，发酵方式为液态发酵；菌种斜面试管斜面菌种培养采用马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA)；种子培养为马铃薯葡萄糖培养基(液体PDA)；发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)，PH自然，培养时间试管斜面菌种活化培养96小时，种子摇床培养时间72小时，发酵培养时间5天，培养温度试管斜面菌种培养温度28℃±1℃种子摇床培养28℃±1℃温度，发酵培养温度为28℃±2℃；发酵物提取发酵完毕，收集发酵液，按常规化学提取方法，采用95％乙醇4分级提取黄酮类化合物，采用三氯甲烷、丙酮溶系统提取异香素类化合物；分离化合物采用硅胶柱层析方法分离纯化获得灯盏花乙素；采用葡聚糖凝胶柱层析方法分离纯化获得异香豆素类化合物。
本发明所述的灯盏细辛内生真菌，该菌株最显著的特征是该菌株液体发酵能够产生抗心血管疾病的临床有效成分灯盏花乙素及黄酮类化合物，能够产生抗肿瘤的药用成分异香豆素化合物，如链格孢菌素(Alternariol)、链格孢醇甲基醚(Alternariol Monomethyl Ether)等，是寻找具有抗肿瘤和治疗人类心脑血管疾病药用成份生物资源的重要微生物。
图1为本发明所述的灯盏细辛内生真菌菌丝体用400倍显微镜观察到的形态图。
图2为本发明所述的灯盏细辛内生真菌分生孢子用400倍显微镜观察到的形态图。
图3为本发明所述的灯盏细辛内生真菌菌株细微结构图(菌丝体电子显微镜图片，放大倍数33000倍)。
图4为本发明所述的灯盏细辛内生真菌菌株细微结构图(电子显微镜图片，放大倍数16000倍)。
实施例取编号为YM31961菌种，在无菌条件下(无菌室或超净工作台)，用接种针挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体PDA培养基试管(18×180mm)中，置培养箱内28℃±1℃活化培养96小时。
取出活化96小时的菌种，在无菌条件下，以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的种子液体PDA培养基中，在28℃±1℃下摇床培养72小时，即为YM31961种子。
发酵采用500毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基100毫升，15磅灭菌30分钟后，取出待冷却至30℃在无菌条件下，取YM31961种子，接种子装有100毫升液体PDA培养基的500毫升玻璃三角瓶中，种子接种量为5～10％(28℃±2℃转到通气培养5天。在发酵期间，注意发酵室温度变化，检查有无染菌现象。
发酵完毕，收集发酵物，装入一定体积的容器内，按常规化学分离提取方法，采用95％乙醇分级萃取黄酮类化合物，硅胶柱层析方法分离纯化可得到灯盏花乙素。采用三氯甲烷、丙酮溶剂系统提取异香豆素类化合物，葡聚糖凝胶柱层析方法分离纯化可得到链格孢菌素及链格孢醇甲基醚。
权利要求
1.一种灯盏细辛内生真菌，其特征在于命名为交链孢霉(Alternaria sp.)，其保藏登记号为CCTCC NOM201028。
2.根据权利要求1所述的一种灯盏细辛内生真菌，其特征在于所述的固体培养特征为一、PDA培养基28℃培养4天，菌落直径47mm，7天75mm，11天90mm。菌落铺展较疏松，灰黑色絮状，边缘整齐，背面黑色；二、麦芽法培养基28℃培养4天，菌落直径45mm，7天75mm，11天90mm。菌落隆起较疏松，边缘整齐，黄灰褐色绒絮状，背面黑色；三、察贝克培养基28℃培养4天，菌落直径33mm，7天70mm，11天mm 90mm。菌落疏松扁平，黄褐色长绒状，边缘整齐，背面肉褐色。
3.根据权利要求1所述的一种灯盏细辛内生真菌，其特征在于所述的的液体培养特征为一、培养基PDA，摇瓶培养时间5天，培养温度28℃±2℃；二、发酵培养特征培养第1天，菌种有零星的白色菌丝点；培养第2天，长满白色菌丝；培养第3天，发酵液菌丝体密集，菌丝体呈淡褐色；培养第4天，长满深黑褐色菌丝体，发酵液粘稠，培养第5天，发酵液菌丝体密集成块状，黑褐色菌丝体。
4.根据权利要求1所述的一种灯盏细辛内生真菌，其特征在于所述的形态特征一、无性世代，菌丝橄榄褐色有隔，分生孢子梗分化明显，分枝淡褐色，分生孢子聚为分枝的链，倒梨形或卵形，纵横分隔，具短喙，淡褐至金黄褐色，光滑，孢子直径10.0～13.75×25.0～43.75微米。二、有性世代，未发现。
5.根据权利要求1所述的一种灯盏细辛内生真菌，其特征在于年述的菌株18SRNA碱基组成系列CTAAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACCGGGAAANCTGCGAATGGCTCATTAATCAGTTATCGTTTATTGGATAGTACCTTACTNACTNGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCCCAANCTTCGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTNTCTTGGTGATTCATGATAACTTCACGGATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGANCGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAGGTATTGGCNTTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGNGGAGCCTGAGAAACGGTTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAANTTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGNCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTCCAATTTAAACCTCTTAACGANN
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，本发明所述的灯盏细辛内生真菌是从短葶飞蓬菊科植物活体中采用内生真菌微生物分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为交链孢霉，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期2001年7月27日，保藏登记号为CCTCC NOM201028。本发明最显著的特征是该菌株液体发酵能够产生抗心血管疾病的临床有效成分灯盏花乙素及黄酮类化合物，能够产生抗肿瘤的药用成分异香豆素化合物，是寻找具有抗肿瘤和治疗人类心脑血管疾病药用成份生物资源的重要微生物。
文档编号C12N1/14GK1421522SQ0113997
公开日2003年6月4日 申请日期2001年11月22日 优先权日2001年11月22日
发明者陈有为, 杨丽源, 李绍兰, 李治滢, 周斌, 张琦 申请人:云南省微生物研究所