专利名称：(a)N－{5－[4－(4－甲基－(哌嗪－1－基)－甲基)－苯甲酰胺基]－2－甲基苯基}－4 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗患有增生性疾病的温血动物、特别是人类的方法，该方法包含给予该动物施用一种组合产品，该组合产品包含(a)N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成(hypusination)抑制剂，特别地如本文所定义；包含如上所定义的(a)和(b)的组合产品，任选至少包含一种可药用的载体，同时、单独或按次序使用，尤其用于增生性疾病的延缓进程或治疗，特别是肿瘤疾病或白血病；包含这样组合产品的药物组合物；这样的组合产品的用途，用于制备增生性疾病延缓进程或治疗的药品，涉及至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂的用途，用于制备伊马替尼耐受白血病延缓进程或治疗的药物；并涉及商业包装产品或包含这样的组合产品的产品。
N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的制备以及其用途，特别是作为抗增生药物的用途，被公开在EP-A-0 564 409中，其在1993年10月6日公开，在许多其他的国家进行了相同的申请，如US5,521,184。该化合物已被知晓并在下文中指伊马替尼[国际无产权名称]。
选择性酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(以前的STI571，Gleevec)已经显示出对酪氨酸残基的磷酸化作用的阻滞，这是通过占据Abl酪氨酸激酶Bcr-Abl、c-Abl、v-Abl和Abl相关基因(ARG)以及血小板衍生生长因子受体(PDGF)α和β和人干细胞因子(SCF)c-kit受体的ATP结合位点实现的。以众多的对慢性髓样白血病(CML)的研究为基础，包括对患有早期慢性期(CP)、加速期(AP)和髓样爆发危象(BC)的患者的研究，伊马替尼被认为是治疗慢性髓样白血病的新的黄金标准(gold standard)。除此之外，伊马替尼在患有胃肠基质肿瘤(GIST)的个体中以及在患有骨髓增生的患者中诱导了持续的反应，并诱导了在染色体5q33上PDGF-R-β基因的重排，胃肠基质肿瘤是一带有c-kit的组成活化的肿瘤实体。
尽管这些有希望的结果，特别在CP中，在AP和BC中对伊马替尼耐受的发展经常出现，并且缓解经常只持续6-12个月。
所以，特别是对于晚期疾病，协同治疗策略是非常合理的。
为了进一步促进治疗的成功，有必要建立协同治疗方法的新的筛选策略。如本文所公开，使用伊马替尼治疗和与之相反的未治疗的Bcr-Alb阳性细胞系的差异蛋白质表达分析，以检测可通过Bcr-Abl表达被调节的蛋白质以及可潜在地作为协同治疗干预新靶点的蛋白质。
现已令人惊奇地发现，在Bcr-Abl细胞系中细胞的细胞毒性和凋亡在包含(a)伊马替尼或其可药用盐和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂的组合产品中远远大于组合成分中的一种单独所能达到的作用，即超出相加或存在协同效应。所以，本文期望这种组合产品可用于治疗增生性疾病，特别是用于治疗白血病，包括但不局限于伊马替尼耐受的白血病。进一步期望这种羟丁赖氨酸形成抑制剂用于治疗白血病特别有用，特别是对伊马替尼或其可药用盐耐受的白血病。
因此，在第一个实施方案中，本发明涉及治疗患有白血病、特别是伊马替尼耐受白血病的温血动物的方法，该方法包括给予该动物施用至少一种抗白血病治疗有效量的羟丁赖氨酸形成抑制剂，在该方法中所述的化合物也可以其可药用盐形式存在。
在第二个实施方案中，本发明涉及至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂用于生产药物的用途，所述药物用于治疗患有白血病、特别是伊马替尼耐受白血病的温血动物。
在第三个实施方案中，本发明涉及治疗患有白血病、特别是伊马替尼耐受白血病的温血动物的方法，该方法包括给予该动物施用至少一种抗白血病治疗有效量的羟丁赖氨酸形成抑制剂，在该方法中所述的化合物也可以其可药用盐形式存在。
此外，本发明涉及组合产品，如组合的制剂或药物组合物，其包含(a)N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂，其中活性成分在每一种情况下均可以游离形式或可药用盐形式存在，并任选包含至少一种可药用的载体，同时、单独或按次序使用。
本发明也涉及治疗患有增生性疾病的温血动物的方法，该方法包括给予该动物施用(a)N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂的组合产品，其量为抗增生性疾病的联合治疗有效量，并且其中的化合物也可以它们的可药用盐形式存在。
此外，本发明还涉及包含一定量的如本文所定义的组合产品和至少一种可药用载体的药物组合物，其对增生性疾病是联合治疗有效的。
在本文公开的方法、组合产品、组合物或用途中，组合成分(a)和(b)优选以协同有效量施用。
术语“增生性疾病”包括恶性和非恶性增生性疾病，如动脉粥样硬化、癌和白血病、肿瘤、血栓形成、牛皮癣、再狭窄、sclerodermitis和纤维症。
本文所用的术语“肿瘤”包括但并不局限于乳腺癌、黑色素瘤、表皮样癌、结肠癌和通常的胃肠道癌、GIST、肺癌，特别是小细胞肺癌和非小细胞肺癌，头和颈癌、泌尿生殖癌，如宫颈、子宫、卵巢、睾丸、前列腺或膀胱癌；何杰金氏病或卡波西肉瘤。期望本发明的组合产品在抑制液体肿瘤并且尤其是实体肿瘤中是有用的。而且，根据肿瘤的类型，可获得降低肿瘤体积的特殊的组合产品。本文公开的组合产品也适合于预防肿瘤的转移扩散和生长或微转移的发展。本文所公开的组合产品也特别适宜于治疗预后不好的患者，如患有非小细胞肺癌或伊马替尼耐受白血病这样的预后不好的患者。
本文所用的术语“白血病”包括但并不局限于慢性骨髓性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)，特别是费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)和伊马替尼耐受的白血病。
优选用本文中公开的方法治疗的白血病变体是CML。
本文中所用的术语“伊马替尼耐受的白血病”特别定义为伊马替尼治疗不再有效或治疗有效性降低的白血病。
本文所用的术语“组合的制剂”特别定义为“含有多个部分的药盒(kitof parts)”，在这个意义上说如上所定义的组成部分(a)和(b)可以独立地被施用，或使用一定量的组成部分(a)和(b)的不同固定组合产品，即同时或在不同的时间点使用。含有多个部分的药盒的各部分可被同时或按时间顺序被施用，即对于含有多个部分的药盒的各部分在不同的时间点并有相同或不同的时间间隔。非常优选地，选择的时间间隔使得各部分组合使用对所治疗的疾病产生的作用大于通过仅仅使用任何一种组合组分(a)和(b)所获得的作用。在组合制剂中施用的组合组分(a)对组合组分(b)的总量的比率是可变的，以满足被治疗的患者亚群或由于患者具体的疾病、年龄、性别、体重等等的差别而造成的单个患者的不同需要。优选地，至少有一个有益的作用，如组合组分(a)和(b)作用的相互提高，特别是协同性，如大于相加的作用，相加的有益作用，较少的副作用，在组合组分(a)和(b)的一个或两个没有作用的剂量下产生组合产品的治疗作用，并强烈优选组合组分(a)和(b)的强协同性。
本文所用的术语“进展的延缓”表示本组合产品给予处于被治疗的疾病的早期状态或早期阶段的患者施用，其中患者的相应疾病的早期形式被诊断或患者处于病症的状态，如在医学治疗的过程中或产生自意外的病症，在这样的状态下相应的疾病可能得到发展。
应当理解，组合组分(a)和(b)也包括可药用盐。如果该组合组分(a)和(b)具有例如至少一个碱性中心，那么它们可形成酸加成盐。如有需要，也可以形成具有另外的碱性中心的相应的酸加成盐。具有酸性基团(如COOH)的组合组分(a)和(b)也能与碱形成盐。组合组分(a)和(b)或其可药用盐也可以水合物或包含其他结晶用溶剂的形式使用，优选N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺，即组合组分(a)，以单甲磺酸盐形式使用。在本发明中优选使用其。根据羟丁赖氨酸形成抑制剂的化学结构，其盐形式可能不存在。
组合组分(a)可如WO 99/03854中描述的那样制备和施用，特别是N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的单甲磺酸盐可如WO 99/03854中实施例4和6中描述的那样被配制。药物可如WO03/090720中公开的那样在药物组合物中被应用。
术语“羟丁赖氨酸形成抑制剂”定义为试剂、药物或化学品，其可在体外和体内降低羟丁赖氨酸(hypusine)的形成。羟丁赖氨酸是一种独特的氨基酸，通过赖氨酸残基在真核启动部分5A(elF-5A)的翻译后修饰而形成，对于细胞的生存和增殖是非常关键的(参阅，如，Chen等人，J.Chin.Chem.Soc.，Vol.46，No.5，1999)。近来，数据显示细胞增殖在体外在细胞中可被螯分子如环吡酮、去铁酮和去铁胺所抑制，其靶点为脱氧羟丁赖氨酸羟基化酶，一种羟丁赖氨酸形成所必需的金属酶(Clement，等人Int.J.Cancer2002 Aug 1；100(4)491-8)。
使用标准的筛选方案可容易地鉴别羟丁赖氨酸形成抑制剂，其中使细胞的提取物或其他具有适宜于羟丁赖氨酸形成的条件的制剂与潜在的抑制剂接触，并且羟丁赖氨酸形成活性的水平在存在或不存在抑制剂的条件下测量，或在存在不同量的抑制剂下测量。用这种方式，不但有用的抑制剂可得到辨别，而且这样的抑制剂的最佳浓度也可在体外确定以进一步用于体内的试验。适宜的羟丁赖氨酸形成抑制剂的实例对于本领域技术人员来说是熟知的，包括但不局限于环吡酮、脱氧精胍菌素、α干扰素、去铁胺、去铁酮以及其他的属于羟基吡啶酮族的化合物(参阅，如，Mycoses 1997；40243-247)和其他有铁螯合剂活性的其他化合物。后者包括公开在PCT公开物WO 03/039541、WO 97/49395和US专利6,465,504和6,596,750中的化合物，如被取代的3，5-二苯基-1，2，4-三唑类。
适宜的羟丁赖氨酸抑制剂也包括，但并不局限于那些通过抑制羟丁赖氨酸形成所必需的酶的活性来抑制羟丁赖氨酸形成的抑制剂，如脱氧精胍菌素和N1-脒基-1，7-二氨基庚烷(GC-7；参阅如，Jansson等人，J.Bacteriology 182No.4，1158-1161)，其通过阻滞脱氧羟丁赖氨酸合成酶而起作用，环吡酮和去铁胺抑制脱氧羟丁赖氨酸羟基化酶。
在本发明优选的实施方案中羟丁赖氨酸形成抑制剂为环吡酮或6-环己基-1-羟基-4-甲基-2(1H)-吡啶酮，一个本领域技术人员熟知的参阅，例如，Gupta A.K.和Skiner A.R.，Intl.J.Dermatol.2003 Sept；42 Suppl 13-9)并可容易买到的常用抗真菌药物(如Sigma，Taufkirchen，德国)。
在另一个优选的实施方案中，羟丁赖氨酸形成抑制剂为4-[3，5-二(2-羟基苯基)-[1，2，4]三唑-1-基]苯甲酸。该化合物及其制备方法被描述在如US6,465,504B1中。药物可被应用，如在US6,465,504B1或WO2004/035026中所描述。
活性剂的结构通过代码、通用名或商品名而辨别，它们可取自当前版的标准手册“The Merck Index”或取自数据库，如Patents International(如IMS World Publications)。其相应的内容此处引用作为参考。
包含(a)N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂的组合产品，其中在每一种情况下活性成分以游离形式或可药用盐形式存在，并任选含有至少一种可药用载体，在下文中将被称为本发明的组合产品。根据羟丁赖氨酸抑制剂的结构，盐形式可不存在。
象实体瘤一样的增生性疾病的本质是多因素的。在某些条件下，有不同作用机理的药物可以组合。但是，仅仅考虑有不同作用方式的药物的任何组合并不一定能够得到有益作用的组合产品。
本发明治疗增生性疾病如白血病的有用性可通过本发明的组合产品协同地作用以产生细胞毒性并诱导凋亡的能力而证实。具体地说，当数据显示单个药物环吡酮抑制细胞生存能力并诱导K562和HL-60细胞凋亡时，环吡酮和伊马替尼的组合产品在这些细胞中显示出了细胞毒性和凋亡诱导的协同作用。在Bcr-Abl-阴性的HL-60对照细胞中没有观察到这样的协同作用。以这些数据为基础并由于许多羟丁赖氨酸形成抑制剂是临床上被批准的有可接受毒性特性的药物，因此所得到的结果有重要的含义，可用于新协同治疗策略的设计，用于患有Bcr-Abl-阳性的白血病患者并有潜力用于其他的伊马替尼反应性疾病。
另一个益处是可以使用本发明组合产品活性成分的较低剂量，例如，所需的剂量不但经常较小而且应用的频率也较低，或可被使用以降低副反应的发生率。这与被治疗的患者的愿望和要求相一致。
这种超过加成的相互作用与潜在的副作用上的类似增加无关。
通过建立的试验模型尤其是本文所描述的这些试验模型，已经显示本发明的组合产品与其组合中的单个组分中所观察到的作用相比，可被更有效地用于增生性疾病的延缓进程或治疗。本领域熟练的技术人员完全可以选择相关的试验模型以证明上文和下文提到的治疗适应症和有益的作用。本发明组合产品的药理活性可在如临床研究中或在如下文所述的试验方法中被证实。
适宜的临床研究为，例如，在患有晚期增生性疾病的患者中进行的开放非随机、剂量递增的研究。这样的研究尤其能证明本发明组合产品的活性成分的协同性。对增生性疾病的有益作用可直接通过这些研究的结果或通过本领域熟练的技术人员已知的研究设计的改变而确定。这样的研究尤其适宜于比较使用活性成分的单治疗与使用本发明组合产品的作用。优选地，组合组分(a)以固定剂量被施用，组合组分(b)以递增的剂量被施用直至达到最大的耐受剂量。在本研究优选的实施方案中，每一患者每日服用组合组分(a)的剂量。在这样的研究中治疗的有效性可被确定，如在18或24周之后每6周进行肿瘤的放射学评价。
作为选择，可以使用安慰剂对照、双盲的研究以证明本文提及的本发明的组合产品的益处。
本发明组合产品也可与外科手术、全身温热疗法(whole bodyhyperthermia)的轻微延时和/或辐射疗法一起联合使用。
本发明的组合产品可以是组合的制剂或药物组合物。
本发明的一个目的是提供药物组合物，其包含联合治疗有效量的对抗增生性疾病的本发明组合产品。在该组合物中，组合组分(a)和(b)可共同施用，一个接着一个或在一个组合的单位剂型中单独施用或在两个独立的单位剂型中施用。单位剂型也可是固定的组合产品。
组合组分(a)和(b)单独施用的药物组合物以及以固定的组合产品施用的药物组合物，即包含至少两种组合组分(a)和(b)的单个盖伦组合物，根据本发明可采用本质上已知的方法进行制备，并且药物组合物为适宜于经肠的，如口服或直肠、以及肠胃外给予哺乳动物(温血动物)包括人施用，包含至少一种治疗有效量的有药理活性的单独组合组分，或与一种或多种可药用的载体特别是适宜于经肠或肠胃外应用的载体组合。
新的药物组合物含有例如从约10％至约100％，优选从约20％至约60％的活性成分。经肠或肠胃外施用的组合产品治疗的药物制剂为如单位剂型的制剂如糖衣片、片剂、胶囊剂或栓剂，此外还有安瓿剂。如果不是另有说明，它们以本质上已知的方式被制备，例如通过通常的混合、制粒、糖包衣、溶解或冻干的方法。应该理解在每个剂型的单个剂量中所含有的组合组分的单位含量不必本身构成有效量，因为必需的有效量可以通过剂量单位的复数的施用而达到。
尤其地，本发明组合产品治疗有效量的每一个组合组分可同时或连续和以任何顺序被施用，并且组分可独立地被施用，或作为固定的组合产品被施用。例如，根据本发明增生性疾病的延缓进程或治疗可包含(i)施用游离或可药用盐形式的组合组分(a)，以及(ii)施用游离或可药用盐形式的组合组分(b)，同时或连续以任何顺序，以联合治疗有效量，优选以协同有效量，例如，日剂量对应于本文所描述的量。本发明组合严品的单个组合组分在治疗过程中可在不同的时间被独立地施用，或同时以分割的或单个的组合产品形式被施用。而且，术语施用也包含使用在体内可转化成组合组分的前体药物。因此本发明应被理解为包含所有这样的同时或交互治疗的方案，并且术语“施用”也作相应解释。
按顺序施用的实例可以是首先施用N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺直至观察到对治疗的耐受，然后单独施用羟丁赖氨酸抑制剂或施用其与伊马替尼的组合产品。
本发明组合产品中使用的每一个组合组分的有效剂量可依据采用的特定化合物或药物组合物、施用的方式、被治疗的病症、被治疗病症的严重性而变化。因此，本发明组合产品的剂量根据种种因素而选择，包括施用的途径以及患者的肾和肝功能。通常水平的医生、大夫或兽医可容易地确定并开出单个活性成分要求的有效量处方以预防、对抗或阻滞病症的进展。
达到可产生有效性而没有毒性的浓度的活性成分的最佳精度要求建立在活性成分到达靶点的动力学之上的治疗方案。正如在先前已知的许多在其他的适应症(如抗真菌、铁螯合剂)上有治疗有用性的羟丁赖氨酸形成抑制剂一样，对于本文公开的适应症，有效和安全的剂量范围可容易地被本领域技术人员确定而无需进行过度的实验。
N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺单甲磺酸盐，优选在约2.5至850mg/天的剂量范围内给予人施用，更优选5至600mg/天，最优选20至300mg/天。除非本文另有说明，该化合物优选一至四次每天被施用，更优选一天一次。
另外，本发明涉及本发明组合产品对增生性疾病延缓进程或治疗的用途，以及本发明的组合产品用于制备对增生性疾病延缓进程或治疗的药物的用途。
优选地，增生性疾病为白血病、伊马替尼耐受的白血病或肿瘤。
此外，本发明还提供了包含本发明组合产品的商品包装，带有同时、单独或按次序使用的说明，用于增生性疾病的延缓进程或治疗。
下列的实施例说明如上所述的发明，但不以任何方式限制本发明的范围。本发明组合产品的有益作用(即良好的治疗范围、较少的副作用、协同的治疗作用和其他本文提及的优点)，可由本领域熟练的技术人员已知的其他试验模型所确定。也可在临床研究中或在本领域技术人员熟知的实验中证实协同治疗作用。
应注意本文所描述的发明并不局限于所述的具体方法、方案和试剂，因为它们可能改变。应该理解本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不以任何方式限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的术语有相同的意思。虽然类似或相当于本文所描述的任何方法和材料可用于本发明的实施和试验，但优选的方法、装置和材料在下面描述。所有本文提及的公开物均引入本文中作参考，以用于描述和公开与本发明有关的公开物中使用的材料和方法。
在本发明的实施中，使用了许多分子和细胞生物学的常规技术。这些技术是熟知的并被解释在如Current Protocols in Molecular Biology，第I、II、III卷，1997(F.M.Ausubel编辑)；Sambrook等人，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.中。
实施例材料和方法试剂将化合物溶解在DMSO/H2O(1∶1)中而制得伊马替尼的储备液(10mg/ml)并储存在-20℃下，在介质中二甲亚砜的最终浓度低于0.1％，并在本研究中对细胞生长抑制没有影响。环吡酮(Sigma，Taufkirchen，德国)溶于PBS(10mg/ml)用于体外实验。
细胞培养技术K562细胞从DSMZ(Bielefeld，德国)获得。Bühring博士(Tübingen，德国)惠赠HL-60细胞系。两种细胞系都在含有10％胎牛血清(FCS)(Biochrom KG，柏林，德国)的RPMI 1640培养基(Gibco-BRL，Invitrogen，英国)中培养。细胞在37℃带有5％CO2的空气潮湿环境中培养。
细胞溶解和蛋白质增溶蛋白质样品从107个K562细胞中分离出来，这些细胞产生了1000μg的蛋白质。
将细胞溶解在样品缓冲液中，随后在12000g下离心5分钟。根据Bradford的方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.72，248(1976))确定上清液中蛋白质的浓度。
二维(2D)凝胶电泳如先前描述的那样(Grg等人，Electrophoresis 21，1037-1053(2000))进行等电聚焦。样品通过凝胶再水合应用IPG带(pH 4-7，18cm，AmershamBiosciences)。随后在Multiphor II(Pharmacia，瑞典)中进行等电聚焦，IPG带在6M尿素、4％SDS、50mM Tris-HCI、pH 8.8，第一次平衡期含有1％的DTT或第二次平衡期含有4.8％的碘乙酰胺中平衡2×15分钟。带被放置在垂直的SDS-PAGE凝胶中并用0.6％的琼脂糖覆盖。在AmershamBiosciences IsoDalt系统中进行SDS-PAGE，使用1.5mm厚的凝胶和15％T、2.5％C浓度的丙烯酰胺。2D凝胶用胶体考马斯染色过夜，然后脱色1天。
质谱用与先前描述(Shevchenko等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国93，14440-14445(1996))的稍有变动的方法进行凝胶内消化。将蛋白质斑点从凝胶中取出，用微孔过滤纯化水和50％乙睛/水洗涤。
在干燥后，胰蛋白酶(序列分析级，Promega，Mannheim，德国)被加入到每一个样品中。用5％的甲酸和50％乙睛/5％甲酸从凝胶基质中提取胰蛋白酶蛋白质片段。合并提取物并在高速真空浓缩器中浓缩。在用ZipTips(C18-ZipTip，Millipore，Bedford，MA，USA)纯化后，各部分储存在α-氰基-4-羟基肉桂酸/硝化纤维素点上并用配备有N2337nm激光的ReflexIII MALDI-TOF质谱仪(Bruker Daltonic，Bremen，德国)进行分析。所有的测定在加速电压23kV和延缓脉冲离子提取下以阳离子反射方式进行。胰蛋白酶片段的序列验证通过在配有纳米流动电喷离子化源的杂合四极正交加速时间飞跃质谱仪(QSTAR Pulsar i，Applied Biosystems/MDS Sciex，Foster City，CA，美国)上的纳米电喷串联质谱仪而进行。纯化的部分载于纳米电喷针头上(BioMedical Instruments，Zoellnitz，德国)，通过所选前体细胞离子的碰撞诱导衰变获得质谱。本仪器外部校准。
使用来自Matrix Science(Perkins等人，Electrophoresis 20，3551-3567(1999))的MASCOT软件进行数据库检索(NCBlnr，非丰余蛋白质数据库)，半胱氨酸的羧基甲基化和蛋氨酸氧化作为可变的修正(概率值p＜0.05)。
蛋白质印迹法对于蛋白质的提取，在冰上将细胞在包含50mM Tris-HCl、pH 7.5、150mMNaCl、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、5mM EDTA、1mM NaF、25mMNa3VO4和0.1mM PMSF的溶解缓冲液中匀化。裂解物在冰上放置10分钟，细胞碎屑在4℃在14000转/分离心20分钟。上清液在-80℃下冷冻。裂解液的蛋白质浓度用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，美国)确定。
蛋白质(20μg)通过12.5％的SDS-PAGE分离，并用Bio-Rad Transblot系统将其转移至硝化纤维素膜上。在TBS-吐温/5％w/v BSA中封闭1小时后，膜在用TBS-吐温/5％w/v BSA稀释的一级抗体中孵育1小时。
使用下列一级抗体粘着斑蛋白、RHO-GDI。在洗涤后，膜在用TBS-吐温/5％w/v BSA稀释的HRP-共轭兔抗山羊Ig(1/10000)或兔抗小鼠Ig(1/10000)中孵育1h。在洗涤后，增强的化学发光试剂盒(AmershamPharmacia Biotech UK Ldt.)用于二级抗体的可视化。
MTT测定K652和HL-60细胞被平铺在96孔平底微量滴定板中(BectonDickinson，Heidelberg，德国)，每孔1.5×104个在150μl各自介质中的细胞。
在伊马替尼(0-3μM)或环吡酮(0-81μM)或两种药物的组合以浓度递增的方式加入之前细胞预培养24h。
所有的分析以一式三份进行。在24和48小时之后，测定在每一个孔中存活的细胞将3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)转化成紫色的甲的能力(Twentyman等人，Br.J.Haematol.71，19-24(1989)，Arnould等人，Anticancer Res.10，145-154(1990))。所以，10μl的10mg/ml MTT溶液加入到每一个孔中。在37℃下孵育2个小时后，通过加入溶解缓冲液(15％的十二烷基硫酸钠[SDS]在1∶1的DMF/H2O中，pH4.5))并在黑暗中振摇过夜而释放出紫色的甲。样品的吸光度在570nm在一酶联免疫吸附测定(ELISA)板读板仪上测定(Dynatech MR7000)。通过中数作用法(Chou等人，Eur.J.Biochem.115，207-216(1981)，Chou等人，Adv.Enzyme Regul.22，27-55(1984))使用Calcusyn软件(Biosoft，Cambridge，UK)分析在IC50点处的伊马替尼剂量-效应关系。IC50被定义为药物产生50％的细胞生长抑制的浓度，并对应于0.5的受影响分数(Fa值)。
凋亡在上述的条件下K562和HL-60细胞(2×105每孔)在24孔组织板中培养。在24h的预孵育之后，细胞在0.15μM的伊马替尼和浓度增加的环吡酮(0至81μM)中孵育，样品在测定凋亡细胞分数之前24至48小时取样，根据Nicoletti等人(Nicoletti et al.，J.Immunol.Methods 139，271-279(1991))的方法通过流式细胞分析进行测定。
简言之，通过在低渗的溶解缓冲液(1％柠檬酸钠、0.1％Trition X-100、50μg/ml的碘化丙锭)并随后通过流式细胞分析进行测定。含有亚二倍体DNA的2N峰左边的核被认为是调亡的。使用CELLQUEST分析软件在FACScalibur(Becton Dickinson)上进行流式细胞分析。
实施例1差异蛋白质表达通过Bcr-Abl酪氨酸激酶诱导的细胞内信号级联的略图表示了对费城染色体阳性白血病生物学更好理解的必要条件。在本实例中测定了已确定Bcr-Alb阳性的K562细胞系用伊马替尼在体外治疗24小时和48小时的差异蛋白质表达。
进行了来自Bcr-Abl阳性K562细胞的蛋白质的二维凝胶分析，以产生K562细胞与或不与4微摩尔的伊马替尼孵育24小时的蛋白质特性。通过2维凝胶电泳使用IPG凝胶其pH范围4-7(第一维)、15％丙烯酰胺凝胶(第二维)并用胶体考马斯使蛋白质可视化而分离出总数1000μg蛋白质。特殊的蛋白质点被选择用于进一步的通过MALDI-MS和ESI-MS/MS的定性，因为它们在对照中被高度表达(数据未显示)。
通过被处理的细胞与未被处理细胞之间的比较分析，可以检测出十九种不同表达的蛋白质，其中在伊马替尼处理下有7种被过度表达，而十二种被向下调节。以差异表达的观点来分析，只有在三个独立的实验中在24和48小时可重现地被检测到的候选蛋白质才被认为是显著的。
实施例2蛋白质的鉴别使用蛋白质组学的方法来分析伊马替尼诱导与Bcr-Abl在K562细胞中产生信号有关的差异蛋白质表达，发现蛋白质可被差异性地调控。一旦被鉴别，则可根据它们已知的生物学功能而分类。
候选蛋白质的鉴别可通过肽质量指纹和如上所述用MACOT搜索工具和NCBI nr数据库的肽序列分析来进行。
也进行所选代表性蛋白质的免疫印迹以证实二维凝胶的结果。在溶解缓冲液中制备细胞提取物，相等量的蛋白质在12.5％的聚丙烯酰胺凝胶中分离并转移至硝化纤维素膜中。α-微管蛋白的检测被用于确保在所有泳道中具有相当的蛋白质含量(数据未显示)。
结果表明，被分析和被鉴别的蛋白质中，七种与细胞周期的调节和增生控制有关，七种涉及到病灶的粘连和细胞骨架组织的调节，两种蛋白质在核的进口/出口起着作用，两种蛋白质涉及到氨基酸/嘌呤的代谢，两种其他的蛋白质的功能尚不清楚。一种向下调节的特别重要的蛋白质，elF5A，唯一已知的被翻译后羟丁赖氨酸形成所活化的真核蛋白质，成为了进一步研究的焦点。
实施例3elF5A和伊马替尼和环吡酮的协同效应人们对作用机理尚不理解，但是曾认为α干扰素和Ara-C和其他当前用于CML治疗的药物的活性可能与elF5A的羟丁赖氨酸抑制有关。
羟丁赖氨酸形成通过两种机制逐步地被诱导。在第一步，通过酶脱氧羟丁赖氨酸合成酶的催化，通过NAD依赖性的4-氨基丁基转移至elF5A前体细胞的赖氨酸残基而形成脱氧羟丁赖氨酸中间体。第二步产生了elF5A的活性形式，并涉及到了通过第二种被称之为脱氧羟丁赖氨酸羟基化酶的酶进行的脱氧羟丁赖氨酸中间体侧链的羟基化。
elF5a似乎是细胞增殖所必需的，因为羟丁赖氨酸合成的破坏导致细胞循环的抑制。较小的人类同种型，elF5a2，已经被怀疑是一个癌基因。推测elF5a促进了具体的mRNAs的运输和/或翻译。所以，Bcr-Abl诱导的elF5a的上调在Bcr-Abl阳性白血病中观察到的增加的细胞增生中可能起作用。相似地，Bcr-Abl的抑制可通过对elF5a表达的抑制产生它的抗增生作用。
为了检验这个假说，通过用羟丁赖氨酸形成抑制剂和伊马替尼处理Bcr-Abl阳性的白血病细胞而研究是否可检测到相加或甚至协同的效应。特别地，通过测定细胞的细胞毒性和凋亡来分析在Bcr-Abl阳性的K562细胞中伊马替尼和环吡酮之间的潜在协同效应。
使用以四唑盐为基础的MTT分析，定量测定了在24h暴露于单独的环吡酮或伊马替尼后K562细胞的生长抑制，也测定了两种药物的组合对K562细胞以及对Bcr-Abl阴性的HL-60细胞的生长抑制。细胞用如下的浓度增加的环吡酮或伊马替尼处理K562细胞用0、0.33、1、3、9、27、81μM环吡酮和/或0、0.01、0.037、0.11、0.33、1.0、3.0μM的伊马替尼处理；HL-60细胞用0、0.33、1、3、9、27、81μM的环吡酮和/或0、0.33、1、3、9、27、81μM的伊马替尼处理。
尽管单独使用环吡酮可检测到抗增生的作用，但是数据显示伊马替尼和环吡酮的组合对Bcr-Abl阳性的K562细胞的细胞毒性作用是显著协同的。相反，当Bcr-Abl阴性的髓样白血病细胞系HL60用这两种药物处理时没有观察到与伊马替尼的协同效应，Bcr-Abl阴性的HL-60细胞没有被该组合所影响。数据以至少3次独立的实验表示(数据未显示)。
用如上所述的方法通过亚二倍体核的流动细胞计数评价也测定了24h后的凋亡。在这些实验中，K562和HL-60细胞用浓度增加的环吡酮(0至81μM)或0.15μM伊马替尼和浓度增加的环吡酮(0至81μM)处理。数据显示伊马替尼敏化了Bcr-Abl阳性的K562细胞，但对于Bcr-Abl阴性的HL-60细胞不产生对环吡酮诱导的凋亡的敏化。数据以至少3次独立的实验表示(数据未显示)。
申请人的发现支持在Bcr-Abl阳性的白血病中elF5A在细胞周期控制中起着中心作用的观点，并指出该蛋白质对于未来的治疗可作为潜在的新靶点。有趣地，在已知的可抑制羟丁赖氨酸形成的物质中，去铁胺(铁超负荷药物)和环吡酮(局部使用的抗真菌药)为被批准的药物，其具有可接受的毒性特性。所以，鉴于本文所报告的结果，可以使用将羟丁赖氨酸形成抑制剂与/不与伊马替尼进行组合的临床治疗策略，以降低在Bcr-Abl阳性白血病以及其他用伊马替尼治疗的疾病中对伊马替尼临床耐受性的发展。
权利要求
1.治疗患有增生性疾病的温血动物的方法，该方法包括给予所述动物施用一种组合产品，该组合产品包含(a)N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂，其量为对抗增生性疾病的联合治疗有效量，并且其中所述化合物也可以它们的可药用盐形式存在。
2.根据权利要求1的方法，其中所述增生性疾病为白血病或对伊马替尼耐受的白血病。
3.治疗患有白血病、特别是伊马替尼耐受白血病的温血动物的方法，该方法包括给予该动物施用至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂，其量为对抗增生性疾病的治疗有效量，并且其中所述化合物也可以它们的可药用盐形式存在。
4.组合产品，该组合产品包含(a)N-{5-[4-(4-甲基-(哌嗪-1-基)-甲基)-苯甲酰胺基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂，其中所述活性成分在每一种情况下以游离形式或以可药用盐形式存在，并任选含有至少一种可药用载体；同时、单独或按次序使用。
5.根据权利要求4的组合产品，其中所述化合物(a)以它的单甲磺酸盐形式使用。
6.根据权利要求4或5的组合产品，该组合产品为组合制剂或药物组合物。
7.药物组合物，该药物组合物包含对抗增生性疾病联合治疗有效量的根据权利要求4或5的组合产品，并包含至少一种可药用载体。
8.根据权利要求4至7中任何一项的组合产品的用途，用于增生性疾病的延缓进程或治疗。
9.根据权利要求4至7中任何一项的组合产品的用途，用于制备对增生性疾病延缓进程或治疗的药物。
10.根据权利要求8至9中任何一项的组合产品的用途，其中所述增生性疾病为白血病或伊马替尼耐受的白血病。
11.至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂在制备用于对白血病、特别是伊马替尼耐受白血病延缓进程或治疗的药物中的用途。
12.至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂用于对白血病、特别是伊马替尼耐受白血病延缓进程或治疗的用途。
13.根据权利要求1至10中任何一项的方法、组合产品、组合物或用途，其中组合组分(a)和(b)以协同有效量被施用。
14.商业包装产品，该包装产品包含根据权利要求4至7中任何一项的组合产品，以及在增生性疾病的延缓进程或治疗中指导同时、单独或按次序使用的说明。
15.根据权利要求1至14中任何一项的方法、组合产品、组合物、商业包装产品或用途，其中的羟丁赖氨酸形成抑制剂选自去铁胺、环吡酮、脱氧精胍菌素、去铁酮和GC-7。
16.根据权利要求1至14中任何一项的方法、组合产品、组合物、商业包装产品或用途，其中的羟丁赖氨酸形成抑制剂为4-[3，5-二(2-羟基苯基)-[1，2，4]三唑-1-基]苯甲酸。
17.根据权利要求1至14中任何一项的方法、组合产品、组合物、商业包装产品或用途，其中的羟丁赖氨酸形成抑制剂为环吡酮。
全文摘要
本发明涉及患有增生性疾病的温血动物、特别是人类的治疗方法，该方法包括给予该动物施用一种组合产品，该组合产品包含(a)N－{5－[4－(4－甲基－(哌嗪－1－基)－甲基)－苯甲酰胺基]－2－甲基苯基}－4－(3－吡啶基)－2－嘧啶－胺和(b)至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂。本发明还涉及包含如上所定义的(a)和(b)和任选的至少含有一种可药用的载体的组合产品，同时、单独或按次序使用，尤其用于增生性疾病的延缓进程或治疗，此外，本发明还涉及至少一种羟丁赖氨酸形成抑制剂的用途，用于制备对白血病、特别是伊马替尼耐受的白血病延缓进程或治疗的药物。
文档编号A61P35/00GK1889952SQ200480036274
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月19日
发明者T·H·布吕门多夫, S·巴拉巴诺夫, U·哈特曼, W·卡默, A·努尔海姆 申请人:诺瓦提斯公司