专利名称：二膦酸类化合物的药物应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及二膦酸类化合物、特别是其新的药物应用和包含二膦酸类化合物的治疗方法。
在多种良性和恶性疾病(包括过度或不适当的骨吸收)中，二膦酸类化合物广泛用于抑制破骨细胞的活性。这些焦膦酸盐类似物不仅可以减少骨骼相关事件的发生，还可为患者提供临床益处和提高存活率。二膦酸类化合物可以阻止体内的骨吸收；二膦酸类化合物的治疗效果已经在骨质疏松、骨质减少、佩吉特骨病、肿瘤诱导的高钙血症(TIH)以及更近期的骨转移(BM)和多发性骨髓瘤(MM)的治疗中得到了证明(综述参见Fleisch H 1997，Bisphosphonates clinical.InBisphosphonates in Bone Disease.From theLaboratory to the Patient编辑The Parthenon Publishing Group，纽约/伦敦第68-163页)。二膦酸类化合物抑制骨吸收的机制尚未完全了解，而且看来是根据被研究的二膦酸类化合物而有所不同。已经证明二膦酸类化合物与骨的羟基膦灰石晶体牢固结合，减少骨转换和骨吸收，降低血液中的羟脯氨酸或碱性膦酸酶的水平，此外还抑制成骨细胞的形成、补充、活化和活性。
近期研究还已经证明一些二膦酸类化合物可对肿瘤细胞具有直接作用。因此，例如已经发现相对高浓度的二膦酸类化合物(包括唑来膦酸盐)在体外诱发乳腺癌和前列腺癌以及骨髓瘤细胞的细胞凋亡(Senaratne等人，Br.J.Cancer，821459-1468，2000；Lee等人，Cancer Res.，612602-2608，2001，Shipman等人，Br.J.Cancer，98665-672(1997))。
现在已经发现，与单独使用二膦酸类化合物或化疗药物相比，如果将某种类型的二膦酸类化合物与其它化疗药物组合使用在体外处理癌细胞时，获得增强的且在某些情况下是协同的细胞生长抑制。适宜的化疗药物包括紫杉酚(taxol)或其衍生物、芳香酶抑制剂(例如来曲唑)和TNF相关性细胞凋亡诱导配体(TRAIL)。具体而言，现在已经确立了相继施用常用化疗药物紫杉醇(Paclitaxel，PAC)和有效的抗重吸收药物唑来膦酸(ZOL)、相继施用来曲唑和ZOL以及相继施用TRAIL和ZOL的特定组合在体外诱导乳腺癌和前列腺癌细胞凋亡的能力。这些药物的施用顺序显著影响所达到的凋亡最高水平。
本发明提供了治疗恶性疾病患者的方法，包含对患者施用有效量的选自紫杉酚或其衍生物或者芳香酶抑制剂的化疗药物；随后施用有效量的二膦酸类化合物。
本发明还提供了治疗恶性疾病患者的方法，包含对患者施用有效量的二膦酸类化合物，随后施用有效量的TRAIL。
本发明还提供了化疗药物和二膦酸类化合物用于抑制癌细胞生长或诱导癌细胞凋亡的相继应用，其中所述的化疗药物选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL。
本发明还提供了二膦酸类化合物在制备药物中的应用，所述的药物用于在已经接受选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL的化疗药物的患者中治疗恶性病。
本发明还提供了选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL的化疗药物在制备药物中的应用，所述的化疗药物用于在已经接受二膦酸类化合物的患者中治疗恶性病。
本发明还提供了商业包装，其包含单位剂量形式的二膦酸类化合物或其可药用盐或其任意水合物以及单位剂量形式的选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL的化疗药物；以及相继施用单位剂量的所述化疗药物和所述二膦酸类化合物来治疗恶性疾病的说明。
本发明还提供了药盒，其包含单位剂量形式的二膦酸类化合物或其可药用盐或其任意水合物以及单位剂量形式的选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL的化疗药物；以及相继施用单位剂量的所述化疗药物和所述二膦酸类化合物来治疗恶性疾病的说明。
在本说明书中，术语“治疗”包括预防性或防止性治疗以及治愈性或疾病修饰治疗，包括对罹患疾病的处危患者或者被怀疑已经感染疾病的患者及患病患者的治疗。
本发明通常可用于治疗指明用二膦酸类化合物治疗的恶性疾病。因而通常该类疾病为伴有骨转移或过度骨吸收发展的恶性疾病。这类疾病的实例包括癌症，例如乳腺癌和前列腺癌、多发性骨髓瘤(MM)、肿瘤诱导的高钙血(TIH)及类似的疾病和病症。本发明特别适用于治疗与癌症(例如乳腺癌、肺癌、结肠癌或前列腺癌)有关的骨转移(BM)。
本发明的组合物、应用和方法代表了对现有恶性病疗法的改善，其中使用二膦酸类化合物来防止或抑制骨转移或过度骨吸收的发展，且其中(如本发明已发现的那样)二膦酸类化合物治疗还抑制癌细胞生长或诱导癌细胞凋亡。相继使用化疗药物(例如紫杉醇或来曲唑)和二膦酸类化合物可有利地产生增强或甚至是协同水平的癌细胞生长抑制或癌细胞凋亡。
本发明所用的二膦酸类化合物优选是N-二膦酸类化合物。
对于本发明的目的，N-二膦酸类化合物是除了特征性的孪位二膦酸部分外还包含含氮侧链的化合物，例如式I化合物或其可药用盐或其任意水合物， 其中，X是氢、羟基、氨基、烷酰基或者被C1-C4烷基或烷酰基取代的氨基；R是氢或C1-C4烷基，且Rx是含有任选被取代的氨基的侧链，或者是含氮杂环(包括含氮芳香杂环)。
因此，例如适用于本发明的N-二膦酸类化合物可以包含下列化合物或其可药用盐或其任意水合物3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸(帕米膦酸)，例如帕米膦酸盐(APD)；3-(N，N-二甲基氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸，例如二甲基-APD；4-氨基-1-羟基丁烷-1，1-二膦酸(阿仑膦酸)，例如阿仑膦酸盐；1-羟基-3-(甲基戊基氨基)-亚丙基-二膦酸(伊班膦酸)，例如伊班膦酸盐；6-氨基-1-羟基己烷-1，1-二膦酸，例如氨基-己基-BP；3-(N-甲基-N-正戊基氨基)-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸，例如甲基-戊基-APD(＝BM21.0955)；1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸，例如唑来膦酸；1-羟基-2-(3-吡啶基)乙烷-1，1-二膦酸(利塞膦酸)，例如利塞膦酸盐，包括其N-甲基吡啶盐，例如N-甲基吡啶碘化物(例如NE-10244或NE-10446)；3-[N-(2-苯基硫乙基)-N-甲基氨基]-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸；1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1，1-二膦酸，例如EB 1053(Leo)；1-(N-苯基氨基硫代羰基)甲烷-1，1-二膦酸，例如FR 78844(Fujisawa)；5-苯甲酰基-3，4-二氢-2H-吡唑-3，3-二膦酸四乙基酯，例如U-81581(Upjohn)；和1-羟基-2-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)乙烷-1，1-二膦酸，例如YM 529。
在一项实施方案中，特别优选的用于本发明的N-二膦酸类化合物包含式II化合物及其药理上可接受的盐， 其中，Het是咪唑、唑、异唑、二唑、噻唑、噻二唑、吡啶、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑或苯并咪唑基，任选被烷基、烷氧基、卤素、羟基、羧基、氨基或苄基取代，其中所述的氨基取代基任选被烷基或烷酰基取代，所述的苄基取代基任选被烷基、硝基、氨基或氨基烷基取代；A是含有1至8个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烃部分；X’是氢原子，任选被烷酰基取代，或任选被烷基或烷酰基取代的氨基；R是氢原子或烷基。
在另一实施方案中，特别优选的用于本发明的二膦酸类化合物包含式III化合物及其药理上可接受的盐和异构体， 其中，Het’是取代或未取代的选自咪唑基、咪唑啉基、异唑基、唑基、唑啉基、噻唑基、噻唑啉基、三唑基、二唑基和噻二唑基的杂芳香族五元环，其中所述的环可以部分氢化且所述的取代基选自C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、苯基、环己基、环己基甲基、卤素和氨基中的至少一个，且其中Het’的两个相邻烷基取代基可以一起形成第二个环；Y是氢或C1-C4烷基；X”是氢、羟基、氨基或被C1-C4烷基取代的氨基，且R是氢或C1-C4烷基。
在另一实施方案中，特别优选的用于本发明的二膦酸类化合物包含式IV化合物及其药理上可接受的盐， 其中，Het是咪唑基、2H-1，2，3-、1H-1，2，4-或4H-1，2，4-三唑基、四唑基、唑基、异唑基、二唑基、噻唑基或噻二唑基，未取代或被低级烷基、低级烷氧基、苯基(它又可被低级烷基、低级烷氧基和/或卤素单或二取代)、羟基、二低级烷氨基、低级烷硫基和/或卤素C-单-或二-取代，且在可被取代的N-原子上被低级烷基或苯基低级烷基(它又可在苯基部分被低级烷基、低级烷氧基和/或卤素单-或二-取代)N-取代，且
R2是氢、羟基、氨基、低级烷硫基或卤素，其中低级基团具有最多且包含7个C原子。
特别优选的用于本发明的N-二膦酸类化合物的实例是2-(1-甲基咪唑-2-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸；2-(1-苄基咪唑-2-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸；2-(1-甲基咪唑-4-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸；1-氨基-2-(1-甲基咪唑-4-基)乙烷-1，1-二膦酸；1-氨基-2-(1-苄基咪唑-4-基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(1-甲基咪唑-2基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(1-苄基咪唑-2基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(咪唑-1-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸；2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(4H-1，2，4-三唑-4-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸；2-(噻唑-2-基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(咪唑-2-基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(2-甲基咪唑-4(5)-基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(2-苯基咪唑-4(5)-基)乙烷-1，1-二膦酸；2-(4，5-二甲基咪唑-1-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸；和2-(2-甲基咪唑-4(5)-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸，以及它们的药理上可接受的盐。
最优选的用于本发明的N-二膦酸类化合物是2-(咪唑-1-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(唑来膦酸)或其药理上可接受的盐。
上面提到的所有N-二膦酸衍生物在文献中是众所周知的。这包括它们的生产(参见例如EP-A-513760，第13-48页)。例如，3-氨基-1-羟基丙烷-1，1-二膦酸按照如美国专利3,962,432中所描述的方法制备，其二钠盐按照如美国专利4,639,338和4,711,880中所描述的方法制备，且1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1，1-二膦酸按照如美国专利4,939,130中所描述的方法制备。还可参见美国专利4,777,163和4,687,767。
二膦酸类化合物可以酌情以异构体或异构体混合物的形式使用，通常以例如对映异构体或非对映异构体或几何异构体的旋光异构体形式使用，通常为顺-反式异构体。旋光异构体以纯的对映体和/或外消旋物形式获得。
二膦酸类化合物还可以以其水合物形式使用，或者含有用于其结晶的其它溶剂。
二膦酸类化合物的药理可接受的盐优选是与碱生成的盐，方便地是来自元素周期表中Ia、Ib、IIa和IIb族的金属盐，包括碱金属盐(如钾盐和尤其是钠盐)或碱土金属盐(优选钙盐或镁盐)，还有与氨或有机胺形成的铵盐。
尤其优选的二膦酸类化合物的可药用盐是其中二膦酸的一个、两个、三个或四个且特别是一个或两个酸性氢被可药用阳离子、特别是钠、钾或铵代替的盐，首先例如是钠盐。
一组非常优选的二膦酸类化合物的可药用盐的特征在于在每个膦酸基团中有一个酸性氢和一个可药用阳离子、尤其是钠。
二膦酸类化合物优选以药物组合物的形式使用，所述的组合物包含治疗有效量的活性成分，任选与适于施用的无机或有机、固体或液体的可药用载体一起或与之混合。
二膦酸类化合物药物组合物可以是例如经肠内施用(例如口服、直肠、气雾剂吸入或经鼻施用)的组合物、胃肠道外施用(例如静脉内或皮下施用)的组合物或经皮施用(例如被动或离子电渗施用)的组合物。
优选的是，二膦酸类化合物的药物组合物适合口服或胃肠道外(特别是静脉内、动脉内或经皮)施用。静脉内施用和口服施用且首要是静脉内施用被认为特别重要。N-二膦酸类化合物活性成分优选为胃肠道外施用形式，最优选为静脉内施用形式。
具体的施用模式和剂量可由参与医师酌情考虑患者的具体情况、特别是年龄、体重、生活方式、活动水平和疾病状态来选择。但是最优选二膦酸类化合物经静脉内施用。
本发明使用的二膦酸类化合物的剂量依赖于多种因素，例如活性成分的作用效果和持续时间、施用模式、温血动物的种属和/或性别、年龄、体重和个体状态。
紫杉酚(taxol)是化合物[2aR-[2aα，4β，4αβ，6β，9α(αR*，βS*)，-11α，12α，12aα，12bα]]-β-(苯甲酰氨基)-α-羟基苯丙酸6，12b-二(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2α，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-亚甲基-1H-环癸五烯并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基酯，或者称为紫杉醇，其为抗白血病和抗肿瘤药物，最早以l-形式从太平洋紫杉属树木——红豆杉科短叶红豆杉(Taxus brevifolia，Taxaceae)的树皮中分离出。适用于本发明的紫杉酚衍生物包括泰索帝(taxotere，即化合物[2aR-[2aα，4β，4αβ，6β，9α(αR*，βS*)，-11α，12α，12aα，12bα]]-β-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-氨基]-α-羟基苯丙酸12b-(乙酰氧基)-12-(苯甲酰氧基)-2α，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，6，11-三羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-亚甲基-1H-环癸五烯并[3，4]苯并[1，2-b]氧杂环丁烷-9-基酯，或者称为多西他赛)、紫杉烷类、紫杉碱类(即紫杉碱I、紫杉碱II、紫杉碱A或紫杉碱B)或任何其它适宜的紫杉酚衍生物。紫杉酚及其适宜的衍生物可以与本发明中的二膦酸类化合物组合使用。紫杉醇(PAC)是优选用于本发明的紫杉酚衍生物。紫杉酚或紫杉酚衍生物的药物组合物可以是例如经肠内施用(例如口服、直肠、气雾剂吸入或经鼻施用)的组合物、胃肠道外施用(例如静脉内或皮下施用)的组合物或经皮施用(例如被动或离子电渗施用)的组合物。
文中所用的术语“芳香酶抑制剂”涉及抑制雌激素产生、即分别抑制底物雄烯二酮和睾酮向雌酮和雌二醇的转化的化合物。该术语包括但不限于类固醇类，特别是阿他美坦、依西美坦和福美坦，以及特别是非类固醇类，特别是氨鲁米特、罗谷亚胺、吡鲁米特、曲洛司坦、睾内酯、酮康唑、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和来曲唑。依西美坦可以以例如市售形式、例如商标AROMASIN施用。福美坦可以以例如市售形式、例如商标LENTARON施用。法倔唑可以以例如市售形式、例如商标AFEMA施用。阿那曲唑可以以例如市售形式、例如商标ARIMIDEX施用。来曲唑可以以例如市售形式、例如商标FEMARA或FEMAR施用。氨鲁米特可以以例如市售形式、例如商标ORIMETEN施用。
本发明优选的芳香酶抑制剂为来曲唑。来曲唑是化合物4-[α-(4-氰基苯基)-1-(1，2，4-三唑基)甲基]-苄氰。来曲唑可以以市售形式、例如商标FEMARATM或FEMARTM或通过其它任何适宜的形式施用，例如作为经肠内施用(例如口服、直肠、气雾剂吸入或经鼻施用)的组合物、胃肠道外施用(例如静脉内或皮下施用)的组合物或经皮施用(例如被动或离子电渗施用)的组合物。
本发明的药物(a.紫杉酚或其衍生物、来曲唑或TRAIL和b.二膦酸类化合物)以单独的药物制剂的形式使用，所述的制剂各自含有相关治疗有效量的单独活性成分，任选与适于施用的无机或有机、固体或液体的可药用载体一起或与之混合。
具体的施用模式和剂量可由参与医师考虑患者的具体情况、特别是年龄、体重、生活方式、活动水平等来选择。
本发明的药物的剂量依赖于多种因素，例如活性成分的作用效果和持续时间、施用模式、温血动物的种属和/或性别、年龄、体重和个体状态。
本发明的药理学活性化合物可用于生产药物组合物，该组合物含有有效量的该化合物和与之组合或混合的适于经肠或胃肠道外施用的赋形剂或载体。优选片剂和胶囊形式，其含有活性成分和a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；对于片剂还含有c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果期望还含有d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或泡腾合剂；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射的组合物优选是水性等渗溶液或混悬液，栓剂可由脂肪乳液或混悬液方便地制备。所述的组合物可以是灭菌的和/或含有辅料，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。所述组合物可分别按照常规的混合、制粒或包衣方法来制备，含有约0.1％-75％、优选约1％-50％的活性成分。
片剂可根据本领域公知的方法进行薄膜包衣或肠溶衣包衣。
适于经皮应用的制剂包括有效量的活性成分和载体。有利的载体包括可吸收的药理上可接受的溶剂以有助于穿透宿主皮肤。例如，经皮装置为绷带剂形式，所述的绷带剂包括背衬膜和含有化合物及任选载体的储库，该绷带剂还可任选地包括控速屏障以将化合物在较长时期内以控制和预定的速度传送至宿主皮肤上，并且该绑带剂还包括确保将装置保持在皮肤上的工具。
适于局部应用(例如用于皮肤和眼)的剂型包括水性溶液、混悬液、软膏、乳剂、凝胶剂或可喷雾制剂(例如通过气雾剂等来传送)。这种局部传送系统特别适宜于皮肤应用，例如用于治疗皮肤癌，例如以乳剂、洗剂、喷雾剂等作为预防用途。
其它可口服施用的药物制剂是由明胶制成的干填充胶囊剂和由明胶及增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊剂。干填充胶囊剂可含有颗粒形式的活性成分，所述的活性成分例如与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或助流剂如滑石粉或硬脂酸镁以及酌情与稳定剂混合。在软胶囊中，活性成分优选溶于或悬浮于适宜的液体如脂肪油、石蜡油或液态聚乙二醇中，其还可能加入稳定剂。
胃肠道外制剂尤其是在多种方式中均有效的可注射液体，所述的方式例如是静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、皮内或皮下。该液体优选是临用前配制的等张水溶液或混悬液，例如由仅含有活性成分或还含有可药用载体的冷冻干燥制剂来配制。药物制剂可以是灭菌的和/或含有辅料，所述的辅料例如是防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。
适于经皮应用的制剂包括有效量的活性成分和载体。有利的载体包括可吸收的药理上可接受的溶剂以有助于穿透宿主皮肤。就特征而言，经皮装置为绷带剂形式，所述的绷带剂包括背衬膜和含有化合物及任选载体的储库，该绷带剂还可任选地包括控速屏障以将活性成分在较长时期内以控制和预定的速度传送至宿主皮肤上，并且该绑带剂还包括确保将装置保持在皮肤上的工具。
下述实施例意欲解释本发明，但不应当看作对本发明的限制。
实验方法1PAC和ZOL将MCF7细胞接种和预培养，接着用ZOL和/或PAC以下文给出的顺序进行处理。对于先PAC然后ZOL的顺序，在其中一个实验中加入香叶基丙三醇(GGOH，50μM)，接着用ZOL除去。通过对核形态学进行评价来确定细胞凋亡。
实验1第1组25μM ZOL(在第1天，1小时)，然后2nM PAC(在第2天，4小时)第2组2nM PAC(在第1天，4小时)，然后25μM ZOL(在第2天，1小时)最后一次药物接触后，每组细胞在不含药物的培养基中培养48小时。
实验22nM PAC(在第1天，4小时)，然后1μM ZOL(在第2天，1小时)。最后一次药物接触后，细胞在不含药物的培养基中培养48小时。
实验32nM PAC(在第1天，4小时)，然后25μM或1μM ZOL(在第2天，1小时)，使用或不使用香叶基丙三醇(GGOH，50μM)(加入并同时用ZOL除去)。最后一次药物接触后，每组细胞在不含药物的培养基中培养48小时。
结果实验1结果在PAC之前给予25μM ZOL(第1组)产生2.4％的细胞凋亡，然而最大细胞凋亡的诱导出现于在第1天用PAC处理、然后在第2天用ZOL(25μM＝处理的细胞(第2组)中；(与单独使用ZOL或PAC相比，6.1％，p＜0.001)。
从这些结果中可以看出，细胞凋亡以协同方式诱导，但是药物接触的顺序对于最大细胞凋亡而言是重要的。
实验2结果正如使用较高剂量所发现的，对于用PAC(第1天)、然后用1μM ZOL(第2天)处理MCF7细胞而言以协同方式诱导细胞凋亡，与单独使用PAC(1.25％，p＝0.004)和单独使用1μM ZOL(0.25％，p＝0.004)相比，组合施用组为4.1％。这些结果证实临床恰当剂量的ZOL在诱导细胞凋亡中是有效的。在体内输注ZOL后血浆浓度峰值为1-2μM达数小时。
实验3结果香叶基丙三醇是可逆转ZOL作用的甲羟戊酸(MVA)途径的中间体。用PAC、然后用ZOL组合香叶基丙三醇(GGOH，50μM)处理MCF7细胞阻止70％-80％的细胞凋亡死亡的协同增加。这表明ZOL通过抑制MVA途径使MCF7细胞凋亡。
讨论ZOL和PAC的组合被证明对诱导细胞凋亡有协同作用。此外，发现在ZOL温育较短时期和在其临床恰当剂量下可获得协同作用。对于诱导最大细胞凋亡，必须将细胞首先接触PAC、然后接触ZOL，优选在不同日子。细胞凋亡的诱导是通过对MVA途径的抑制。我们的结果表明，PAC和临床恰当剂量的ZOL的组合确实可诱导肿瘤细胞的细胞凋亡，并且药物顺序对于获得组合疗法的最大效果是重要的。
方法2ZOL和TRAIL将乳腺癌细胞系MDA-MB-426和MCF7以及前列腺癌细胞系PC3用ZOL(25μM)和TRAIL(购自R&D systems，阿宾登，英国；10ng/ml)以如下的不同培养期和顺序进行处理第1组首先给予24小时的TRAIL，接着48小时的ZOL。
第2组首先给予24小时的ZOL，接着24小时的TRAIL。
第3组同时给予24小时的ZOL和TRAIL。
第4组首先给予24小时的TRAIL，接着4小时的ZOL，然后48小时的不含药物的培养基。
第5组首先给予4小时的ZOL，接着将细胞在不含药物的培养基中维持48小时，继而24小时的TRAIL。
结果ZOL和TRAIL的组合被证明对诱导乳腺癌细胞的细胞凋亡有协同作用，但是给药的顺序是重要的。在组合给药组中，先给予TRAIL后给予ZOL(第1组)使细胞凋亡从1.75％(仅给予TRAIL)和0.5％(仅给予ZOL)增加至2.4％。同样，在组合给药组中，用ZOL和TRAIL一起处理24小时(第3组)使细胞凋亡水平从1.75％(仅给予TRAIL)和0.7％(仅给予ZOL)增加至2.5％。当细胞用ZOL处理48小时、然后用TRAIL处理(第2组)时，结果表明这两种药物之间存在协同作用。在组合给药组中，有14.65％的细胞凋亡，其显著高于仅用ZOL(0.7％，p＜0.001)和仅用TRAIL(2.7％，p＜0.001)时的细胞凋亡。当使用ZOL进行较短孵育期(4小时)时获得类似结果，仅给予ZOL后给予TRAIL时获得显著的协同作用。当如第5组中所述处理前列腺癌细胞时，这些细胞同样对ZOL和TRAIL的组合敏感。
这些结果表明，ZOL和TRAIL的组合在诱导肿瘤细胞的细胞凋亡中具有协同作用。为了获得最大效力，必须在TRAIL处理之前给予ZOL。
方法3来曲唑(LET)和ZOL材料与方法使用乳腺癌细胞MCF7Ca(由Dr Chen赠与，美国纽约)。来曲唑和唑来膦酸由Novartis AG(瑞士巴塞尔)提供。
进行下列研究1.单用唑来膦酸对MCF7Ca生长的影响2.单用来曲唑对MCF7Ca生长的影响3.单用唑来膦酸对MCF7Ca的细胞凋亡和坏死的影响4.单用来曲唑对MCF7Ca的细胞凋亡和坏死的影响
5.组合处理(唑来膦酸和来曲唑一起)对MCF7Ca的细胞凋亡的影响6.相继处理(先唑来膦酸后来曲唑)对MCF7Ca的细胞凋亡的影响7.相继处理(先来曲唑后唑来膦酸)对MCF7Ca的细胞凋亡的影响8.加入GGOH对先来曲唑后唑来膦酸所引起的细胞凋亡水平的影响9.在无血清培养基中相继处理和组合处理的影响所用剂量和温育时间在初始剂量响应研究后，使用各处理24小时的10μM唑来膦酸和100nM来曲唑进行相继处理和组合处理，然后进行至24小时的不含药物的温育期。在某些其它研究中仅使用1小时的1μM唑来膦酸。
细胞凋亡/坏死的测量凋亡和坏死的肿瘤细胞死亡的水平通过用Hoechst和碘化丙啶对细胞染色后的核形态学评价来测定。
结果1)唑来膦酸对MCF7Ca细胞生长的影响将MCF7Ca细胞接触递增剂量的唑来膦酸达1小时，除去药物，将细胞在不含药物的培养基中培养至72小时。采用库尔特计数器对细胞数量进行计数。
高于1μM的唑来膦酸剂量引起MCF7Ca数量减少，而较低剂量对细胞生长无影响。在1、20和25μM的唑来膦酸之间效果没有显著性差异。
2)来曲唑对MCF7Ca细胞生长的影响将MCF7Ca细胞接触24、48和72小时的递增剂量的来曲唑。在24和48小时的时间点，除去药物，将细胞在不含药物的培养基中培养至72小时。采用库尔特计数器对细胞数量进行计数。
来曲唑对细胞生长的影响表现为两相。当细胞用0.1nM(所有时间点)、1nM(24和48小时)的来曲唑处理时所计数的细胞数目增加。甚至在有100nM来曲唑存在下培养72小时后，细胞生长的抑制是中等的，与对照相比细胞数目减少31％。
3)唑来膦酸对MCF7Ca细胞的细胞凋亡和坏死的影响通过将细胞接触1小时的唑来膦酸，然后在不含药物的培养基中温育72小时，测定由唑来膦酸的递增剂量引起的细胞凋亡和坏死的水平。
MCF7Ca细胞表现出对唑来膦酸相对不敏感，在接触100μM唑来膦酸后所计数的凋亡细胞少于3％。培养基中坏死细胞死亡的水平同样较低，接触100μM唑来膦酸后最大为4.5％。
4)来曲唑对MCF7Ca细胞的细胞凋亡和坏死的影响将细胞与来曲唑接触72小时，测定来曲唑的递增剂量所引起的细胞凋亡和坏死的水平。
在培养基中坏死和凋亡细胞死亡的水平均较低，所测试的最高剂量(100nM)引起少于4％的坏死和少于3％的细胞凋亡。
5)使用来曲唑和唑来膦酸的组合处理对MCF7Ca细胞的细胞凋亡的影响将细胞用100nM来曲唑和10μM唑来膦酸的组合处理24小时，在不含药物的培养基中另外培养48小时后测定凋亡细胞死亡的水平。
在该组合处理后细胞凋亡水平没有统计学意义上的显著增加。
6)使用来曲唑和唑来膦酸的相继处理对MCF7Ca细胞的细胞凋亡的影响在这一系列实验中，将细胞接触10μM唑来膦酸达24小时，洗涤，然后用100nM来曲唑处理24小时。在不含药物的培养基中进一步培养24小时后测定凋亡细胞死亡的水平。
当细胞先用唑来膦酸然后用来曲唑处理时未观察到凋亡细胞死亡水平显著增高。如果逆转顺序，使细胞先接触来曲唑再接触唑来膦酸，则我们观察到培养基中凋亡细胞的数目显著增加。
7)香叶基丙三醇(GGOH)对先来曲唑后唑来膦酸的相继处理引起的细胞凋亡的影响为了确定在来曲唑和唑来膦酸的相继处理后所观察到的细胞凋亡增加有多大程度归因于唑来膦酸的作用，进行如下实验其中细胞用与唑来膦酸同时加入的50μM GGOH进行处理(GGOH是甲羟戊酸途径的中间体，通常用于逆转唑来膦酸对该途径的抑制作用)。在该项实验中，细胞用100nM来曲唑处理24小时，继而用10μM唑来膦酸+50μM GGOH处理1小时。在72小时测定细胞凋亡水平。
所有组都显著低于先来曲唑后唑来膦酸的组(p＜0.05)，同时，先来曲唑后唑来膦酸+GGOH的组具有显著低于先来曲唑后唑来膦酸的组的细胞凋亡水平(p＝0.05)。
通过与唑来膦酸同时加入GGOH，培养基中的细胞凋亡水平降低至与单独使用来曲唑时所观察的水平相同的水平。这些结果表明大部分细胞凋亡作用是由于唑来膦酸。
8)在无血清培养基中相继处理和组合处理的影响为了确定唑来膦酸和来曲唑的作用是否受将细胞在无血清条件下处理使之饥饿的影响，进行这些实验。
当在无血清条件下处理细胞时，对于先用来曲唑后用唑来膦酸处理的细胞，观察到凋亡细胞死亡的统计学上显著的协同增加。
结论当用各药物单独处理MCF7Ca时，唑来膦酸和来曲唑不能诱导显著水平的凋亡细胞死亡。
细胞凋亡的协同诱导的潜力是可达到的，但是依赖于药物顺序。在施用来曲唑之前或同时施用唑来膦酸分别产生2.69％和1.27％的细胞凋亡，而用“先来曲唑后唑来膦酸”处理的细胞诱导了9.21％的细胞凋亡(与各药物单独使用相比，p＜0.05)。
权利要求
1.治疗恶性病的药物制剂，其包含用于相继应用的选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL的化疗药物以及二膦酸类化合物。
2.权利要求1的药物制剂，其中的二膦酸类化合物是N-二膦酸类化合物。
3.权利要求1的药物制剂，其中的二膦酸类化合物是式I化合物或其可药用盐或其任意水合物， 其中，X是氢、羟基、氨基、烷酰基或者被C1-C4烷基或烷酰基取代的氨基；R是氢或C1-C4烷基，且Rx是含有任选被取代的氨基的侧链，或者是含氮杂环(包括含氮芳香杂环)。
4.权利要求1的药物制剂，其中的二膦酸类化合物是2-(咪唑-1-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(唑来膦酸)或其药理上可接受的盐。
5.权利要求1的药物制剂，其中的化疗药物是紫杉醇或来曲唑。
6.权利要求1的药物制剂，其中的化疗药物是TNF相关性细胞凋亡诱导配体。
7.治疗恶性疾病患者的方法，该方法包含对患者施用有效量的选自紫杉酚或其衍生物或来曲唑的化疗药物；随后施用有效量的二膦酸类化合物。
8.权利要求7的方法，其中的二膦酸类化合物是N-二膦酸类化合物。
9.权利要求7的方法，其中的二膦酸类化合物是式I化合物或其可药用盐或其任意水合物， 其中，X是氢、羟基、氨基、烷酰基或者被C1-C4烷基或烷酰基取代的氨基；R是氢或C1-C4烷基，且Rx是含有任选被取代的氨基的侧链，或者是含氮杂环(包括含氮芳香杂环)。
10.权利要求7的方法，其中的二膦酸类化合物是2-(咪唑-1-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(唑来膦酸)或其药理上可接受的盐。
11.权利要求7的方法，其中的化疗药物是紫杉醇。
12.权利要求7的方法，其中的化疗药物是芳香酶抑制剂，以及是来曲唑。
13.治疗恶性疾病患者的方法，该方法包括对患者施用有效量的二膦酸类化合物，随后施用有效量的TNF相关性细胞凋亡诱导配体。
14.权利要求13的方法，其中的二膦酸类化合物是2-(咪唑-1-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(唑来膦酸)或其药理上可接受的盐。
15.化疗药物和二膦酸类化合物用于抑制癌细胞生长或诱导癌细胞凋亡的相继应用，其中所述的化疗药物选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL。
16.权利要求15的应用，其中的化疗药物是紫杉醇，并且在二膦酸类化合物前施用。
17.权利要求15的应用，其中的化疗药物是来曲唑，并且在二膦酸类化合物前施用。
18.权利要求15的应用，其中的化疗药物是TRAIL，并且在二膦酸类化合物后相续施用。
19.二膦酸类化合物在制备药物中的应用，所述的药物用于在已经接受选自紫杉酚及其衍生物、来曲唑和TRAIL的化疗药物的患者中治疗恶性病。
20.选自紫杉酚及其衍生物、来曲唑和TRAIL的化疗药物在制备药物中的应用，所述的化疗药物用于在已经接受二膦酸类化合物的患者中治疗恶性病。
21.权利要求18或19的应用，其中的化疗药物选自紫杉酚及其衍生物和来曲唑，且其中的二膦酸类化合物在化疗药物之后相继施用。
22.权利要求18或19的应用，其中的化疗药物是TRAIL，且其中TRAIL在二膦酸类化合物之后相继施用。
23.权利要求15至22中任一项的应用，其中的二膦酸类化合物是N-二膦酸类化合物。
24.权利要求15至22中任一项的应用，其中的二膦酸类化合物是式I化合物或其可药用盐或其任意水合物， 其中，X是氢、羟基、氨基、烷酰基或者被C1-C4烷基或烷酰基取代的氨基；R是氢或C1-C4烷基，且Rx是含有任选被取代的氨基的侧链，或者是含氮杂环(包括含氮芳香杂环)。
25.权利要求15至22中任一项的应用，其中的二膦酸类化合物是2-(咪唑-1-基)-1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(唑来膦酸)或其药理上可接受的盐。
26.商业包装，包含单位剂量形式的二膦酸类化合物或其可药用盐或其任意水合物以及单位剂量形式的选自紫杉酚及其衍生物、芳香酶抑制剂和TRAIL的化疗药物；以及相继施用单位剂量的所述化疗药物和所述二膦酸类化合物来治疗恶性疾病的说明。
全文摘要
治疗恶性疾病患者的方法，该方法包括对患者施用有效量的选自紫杉酚及其衍生物和来曲唑的化疗药物，随后施用有效量的二膦酸类化合物。本发明还提供了治疗恶性疾病患者的方法，该方法包括对患者施用有效量的二膦酸类化合物，随后施用有效量的TRAIL。
文档编号A61K31/337GK1889962SQ200480036073
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月2日 优先权日2003年12月3日
发明者R·E·科尔曼, I·赫伦, H·内维尔-韦布, C·A·埃万斯 申请人:设菲尔德大学