专利名称：用作聚(adp－核糖)聚合酶抑制剂的6－取代的2－喹啉酮和2－喹喔啉酮的制作方法
技术领域：
本发明涉及PARP抑制剂，提供化合物和含有所公开的化合物的组合物。此外，本发明提供使用公开的PARP抑制剂作为例如药物的方法。
现有技术核酶聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)是由PARP-1和几种最近确认的新聚(ADP-核糖化)酶所组成的PARP酶家族的成员。PARP也称为聚(腺苷5’-二磷酸-核糖)聚合酶或PARS(聚(ADP-核糖)合成酶)。
PARP-1是由以下三个区域组成的116kDa的主要核蛋白质含有两个锌指的N-端DNA结合区域、自体修饰区域及C-端催化区域。其存在于几乎所有真核细胞中，该酶合成聚(ADP-核糖)，一种可由超过200个ADP-核糖单元组成的支链聚合物。聚(ADP-核糖)的蛋白质受体是直接或间接包含在保持DAN完整性中，其包括组蛋白、拓朴异构酶、DNA及RNA聚合酶、DNA连接酶和Ca2+-及Mg2+-依赖的核酸内切酶。PARP蛋白质在许多组织中高度表达，在免疫系统、心脏、脑及生殖系细胞中最明显。在正常生理条件下，存在最低PARP活性，然而DNA损坏导致PARP立即活化至高达500倍。
在属于PARP，尤其是PARP-1的许多功能中，其主要作用是通过ADP-核糖化帮助DNA修复，并因此协调许多DNA修复蛋白质。作为PARP活化的结果，NAD+浓度明显降低，过度的PARP活化导致在大量DNA损坏的细胞中NAD+严重消耗。聚(ADP-核糖)的短半衰期导致迅速的周转速率。一旦形成聚(ADP-核糖)，其迅速被结构活性聚(ADP-核糖)糖水解酶(PARG)与磷酸二酯酶及(ADP-核糖)蛋白质裂解酶一起降解。PARP和PARG形成一个周期，它将大量NAD+转变为ADP-核糖。在1小时内，PARP的过度刺激导致NAD+及ATP降低至正常水平的20％以下。该情况在局部缺血期间当缺氧已急剧危害细胞能量输出时特别有害。后续再灌流期间的自由基产生被推论是组织受损的主要原因。APT的部分降低，在局部缺血及再灌注期间这通常发生在许多器官中，可能与由于聚(ADP-核糖)周转所导致的NAD+耗竭有关。因此，人们预期PARP或PARG抑制可保留细胞能量水平，以增强在发作后局部缺血器官的存活性。
聚(ADP-核糖)合成还包含在对炎性响应所必要的许多基因的诱导表达中，PARP抑制剂抑制在巨噬细胞中的可诱导的氮氧化物合成酶(iNOS)、P型选择素及内皮细胞中细胞间粘连分子-1(ICAM-1)的产生。该活性构成PARP抑制剂显示的强消炎效果的基础。PARP抑制可通过防止嗜中性白血球易位和渗入受损组织而减少坏死。
PARP由受损的DNA片段活化，一旦活化，则催化高达100个ADP-核糖单元连接于各种核蛋白，包含组蛋白及PARP本身。在主要细胞应激过程中，PARP的过度活化会通过能量储存的耗竭而迅速导致细胞损伤或死亡。由于对于每分子再生的NDA+消耗四分子ATP，当大量PARP活化时NAD+耗竭，从而努力再合成NAD+，亦会耗尽ATP。
已报道PARP活化在NMDA-及NO-诱发的神经毒性中都起重要角色。此点已由在皮质培养物和海马切片中得到证实，其中毒性的预防直接与PARP抑制效能有关。因此，即使作用的确切机制仍不清楚，但PARP抑制剂在治疗神经退化疾病及头部创伤中的有效作用已得到确认。
同样，已证明PARP抑制剂的单次注射减小由兔子心脏或骨骼肌局部缺血和再灌注所引起的梗塞的尺寸。在这些研究中，在阻塞前一分钟或在再灌注前一分钟单次注射3-氨基-苯甲酰胺(10mg/kg)在心脏中导致类似的梗塞尺寸缩小(32％-42％)，而1，5-二羟基异喹啉(1mg/kg)，另一种PARP抑制剂，以相当程度(38-48％)缩小梗塞尺寸。这些结果可合理地推论，PARP抑制剂可预先抢救局部缺血的心脏或骨骼肌的再灌注损伤。
PARP活化也可用作在由于暴露于任何下列参与生物状况，例如中风、早老性痴呆及帕金森病的诱发剂，如谷氨酸盐(经NMDA受体刺激)、反应性氧中间体、淀粉样β-蛋白质、N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)或其活性代谢物N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)而导致神经毒性发作后损害的度量。其他研究持续揭示PARP活化在体外小脑粒细胞和MPTP神经毒性中的作用。过度的神经暴露于谷氨酸盐，其作为主要的中枢神经系统神经传递质并作用于N-甲基D-天冬氨酸酯(NMDA)受体及其他亚型受体，大多由于中风或其他神经退化过程而出现。缺氧的神经元在局部缺血脑部损伤期间，诸如在中风或心脏病发作期间，释放出大量谷氨酸盐。谷氨酸盐的过量释放随后导致N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA)、AMPA、红藻氨酸盐及MGR受体的过度刺激(刺激毒性)，它开启离子通道且允许不受控制的离子流(例如Ca2+和Na+进入细胞和K+离开细胞)，从而导致神经元的过度刺激。该过度刺激神经元分泌更多谷氨酸盐，产生反馈回路或多米诺效应，最后经蛋白酶、脂酶及自由基的产生而导致细胞受损或死亡。谷氨酸盐受体的过度活化伴随着各种神经疾病及症状，包括癫痫、中风、早老性痴呆、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、精神分裂症、慢性疼痛、局部缺血及在缺氧、血糖过低、局部缺血、外伤及神经病症发作之后的神经元损失。谷氨酸盐暴露及刺激也是强迫疾病的根本原因，尤其是药物依赖性。证据包括在许多动物种类中以及在经谷氨酸盐或NMDA治疗的大脑皮质培养物中发现，谷氨酸盐受体拮抗剂(即阻断谷氨酸盐结合或活化其受体的化合物)阻断血管中风后的神经损伤。通过阻断NMDA、AMPA、红藻氨酸盐及MGR受体来预防刺激毒性的尝试已证实极为困难，因为每种受体都有可结合谷氨酸盐的多重位置，因此难以发现用来防止谷氨酸盐结合于所有受体且可测试该理论的有效拮抗剂混合物或通用拮抗剂。而且，许多在阻断受体中有效的组分对动物也具有毒性。因此，目前对于谷氨酸盐异常并无已知的有效治疗方法。
谷氨酸盐对NMDA受体的刺激例如活化神经元氮氧化物合成酶(nNOS)导致氮氧化物(NO)的形成，它也传递神经毒性。NMDA神经毒性可通过氮氧化物合成酶(NOS)抑制剂治疗或经由体外的nNOS靶基因分裂来预防。
PARP抑制剂的另一用途是治疗末梢神经损伤和形成的称为神经学疼痛的病毒学疼痛综合症，例如由常见坐骨神经的慢性紧缩损害(CCI)引起的疼痛和其中发生以细胞质和核质的增色(所谓的“黑”神经元)为特征的骨髓背角的突触改变。
还存在PARP抑制剂用于治疗炎性肠炎，例如结肠炎的证据，具体地说，在大鼠中通过在管腔内给药在50％乙醇中的半抗原三硝基苯磺酸而引发结肠炎，治疗的大鼠接受3-氨基苯甲酰胺，一种PARP活性的特殊抑制剂。PARP活性的抑制降低了炎性响应和恢复远侧结肠的形态和能量状态。
进一步的证据建议PARP抑制剂用于治疗关节炎，此外，PARP抑制剂显然可用于治疗糖尿病，PARP抑制剂已显示用于治疗内毒素性休克或败血性休克。
PARP抑制剂还用于延长细胞的生命期限和繁殖能力，包括治疗下列疾病，例如皮肤老化、早老性痴呆、动脉硬化、骨关节炎、骨质疏松症、肌营养不良、骨骼肌退化疾病，包括复制性衰老、与年龄有关的肌退化、免疫衰老、AIDS及其他免疫衰老疾病；和改变衰老细胞的基因表达。
还已知PARP抑制剂，例如3-氨基苯甲酰胺，在例如对过氧化氢或离子化放射的响应中影响整体DNA修复。
PARP在DNA链断修复中的关键作用已充分证实，尤其是在直接由离子化放射引起或间接地在甲基化试剂、拓朴异构酶I抑制剂和其它化学治疗药物，如顺铂和博来霉素引起的DNA损伤的酶修复后时。使用“分离”小鼠、反显性抑制模型(DNA结合功能域的过度表达)、反义和小分子量抑制剂的各种研究证明PARP在诱发DNA损伤后的修复和细胞存活中的作用。PARP酶活性的抑制应导致提高的对DNA损伤治疗的敏感性。
已报道PARP抑制剂在放射致敏化(缺氧)肿瘤细胞中是有效的，有效防止在放射治疗后肿瘤细胞由DNA的潜在致死和亚致死损害状态恢复，推测其防止DNA链断再连接的能力和影响若干DNA损害信号路径。
PARP抑制剂已用于治疗癌症，此外，US 5,177,075讨论了用于提高离子放射或化学治疗剂对肿瘤细胞的致死效果的若干异喹啉。Weltin等，“Effect of 6-(5-Phenanthridinone，an Inhibitor of Poly(ADP-ribose)Polymerase，on Cultured Tumor Cells”，Oncol.Res.，69，399-403(1994)讨论PARP活性的抑制、降低的肿瘤细胞繁殖和在使用烷基化药物共同治疗肿瘤细胞时明显的协同作用。
Li和Zhang在IDrugs 2001，4(7)804-812中公开了现有技术状况的最新综述。
人们仍需要有效和潜在的PARP抑制剂，尤其是产生最小副作用的PARP-1抑制剂。本发明提供抑制PARP活性的化合物、组合物和方法，用于治疗癌症和/或预防由于例如细胞坏死或凋亡引起的细胞完成任务或死亡而导致的细胞、组织和/或器官损害。本发明的化合物和组合物尤其用于提高其中治疗的主要用途是导致在靶细胞中DNA损害的化学治疗和放射治疗的效果。
背景技术：
1990年6月6日公开的EP 371564公开了(1H-吡咯-1-基甲基)取代的喹啉、喹唑啉或喹喔啉衍生物，所述的化合物抑制视黄酸的血浆脱除。更具体地说，公开了化合物3-乙基-6-[2-甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.20)、3-乙基-6-[1-(1H-咪唑-1-基)-2-甲基丙基]-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.21)、6-[2-甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-3-(2-噻吩基)-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.22)、6-[2-甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-3-(噻吩基)-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.23)、6-[1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-2-甲基丙基]-3-(噻吩基)-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.24)和6-[1-(1H-咪唑-1-基)戊基]-3-甲基-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.25)。
发明概述本发明涉及式(I)化合物 其N-氧化物形式、加成盐和立体化学异构体形式，其中n是0、1或2；X是N或CR5，其中R5是H或与R1一起可形成式-CH＝CH-CH＝CH-的二价基团；R1是C1-6烷基或噻吩基；
R2是H或羟基或与R3或R4一起形成＝O；R3是选自如下的基团-(CH2)s-NR6R7(a-1)，-O-H (a-2)，-O-R8(a-3)，-S-R9(a-4)，或-C≡N(a-5)其中s是0、1、2或3；R6是-CHO、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、哌啶基、哌啶基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、C1-6烷氧基、噻吩基C1-6烷基、吡咯基C1-6烷基、芳基C1-6烷基哌啶基、芳基羰基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基、卤代吲唑基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R7是H或C1-6烷基；R8是C1-6烷基、C1-6烷基羰基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；和R9是二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；或R3是下式的基团-Z- (b-1)，其中Z是选自如下的杂环环系
其中每个R10分别是H、C1-6烷基、氨基羰基、羟基、 C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基氨基、芳基C1-6烷基、二(苯基C2-6烯基)、哌啶基C1-6烷基、C3-10环烷基、C3-10环烷基C1-6烷基、芳氧基(羟基)C1-6烷基、卤代吲唑基、芳基C1-6烷基、芳基C2-6烯基、吗啉基、C1-6烷基咪唑基，或吡啶基C1-6烷基氨基；R4是H、C1-6烷基、呋喃基、吡啶基、芳基C1-6烷基或 芳基是苯基或被卤素、C1-6烷基或C1-6烷氧基取代的苯基；其前提是当n是0、X是N、R2是H、R3是式(b-1)的基团、Z是杂环环系(c-2)或(c-4)，其中所述杂环环系Z是用氮原子连接于分子的其余基团，和R10是H时，则R4不是C1-6烷基或吡啶基。
每当杂环环系Z包含-CH2-、-CH＝或-NH-基团时，取代基R10或分子的其它部分可连接于碳或氮原子，在该情况下，一个或两个氢原子被替换。
式(I)化合物还可存在其互变形式，尽管该形式不能清楚显示于上述分子式中，但包括在本发明的范围内。
如下解释在上述定义和下文中使用的许多术语，这些术语有时作为本身使用或在复合术语中使用。
在上述定义和下文中使用的卤素是指氟、氯、溴和碘；C1-6烷基定义含有1-6个碳原子的直链和支链饱和烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基等；C1-6烷二基定义含有1-6个碳原子的二价直链和支链饱和烃基，例如亚甲基、1，2-乙二基、1，3-丙二基、1，4-丁二基、1，5-戊二基、1，6-己二基和其支链异构体，例如2-甲基戊二基、3-甲基戊二基、2，2-二甲基丁二基、2，3-二甲基丁二基等；C2-6烯基定义含有一个双键和2-6个碳原子的直链和支链烃基链，例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等；C3-10环烷基包括含有3-10个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基等。
术语“加成盐”包括式(I)化合物能够与有机或无机碱，例如胺、碱金属碱和碱土金属碱或季铵碱或与有机或无机酸，例如无机酸、磺酸、羧酸或含磷酸形成的盐。
术语“加成盐”还包括式(I)化合物能够形成的可药用的盐、金属配合物和溶剂化物和其盐。
术语“可药用的盐”是指可药用的酸或碱加成盐，上述可药用的酸或碱加成盐是指包括式(I)化合物能够形成的治疗活性的无毒酸和无毒碱加成盐形式。具有碱性性质的式(I)化合物可通过用合适的酸处理所述碱形式转化为其可药用的酸加成盐，合适的酸包括，例如无机酸，例如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等酸；或有机酸，例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己氨磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸等酸。
具有酸性性质的式(I)化合物可通过用合适的有机或无机碱处理所述酸形式转化为其可药用的碱加成盐。合适的碱性盐形式包括例如铵盐、碱金属和碱土金属盐，例如锂、钠、钾、镁、钙盐等、与有机碱，例如苄星青霉素、N-甲基-D-葡糖胺形成的盐、hydrabamine盐和与氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸等的盐。
术语酸或碱加成盐还包括式(I)化合物能够形成的水合物和溶剂加成形式，该形式的实例是例如水合物、醇合物等。
术语“金属配合物”是指式(I)化合物和一种或多种有机或无机金属盐形成的配合物。所述有机或无机盐的实例包括周期表第II主族的金属，例如镁或钙盐、第III或第IV主族金属，例如铝、锡、铅以及周期表第I至第VIII过渡金属族，例如铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌等的卤化物、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、磺酸盐，例如甲基磺酸盐、4-甲基苯基磺酸盐、水杨酸盐、苯甲酸盐等。
用于上文的术语式(I)化合物的立体化学异构体形式定义式(I)化合物可能具有的由相同的原子通过相同顺序的键键合，但具有不相互改变的三维结构的所有可能的化合物。除非另有说明或指示，化合物的化学命名包含所述化合物可能具有的所有可能的立体化学异构体形式的水合物。所述混合物可含有所有所述化合物的基本分子结构的非对映体和/或对映体，式(I)化合物的所有立体化学异构体形式，纯形式或其混合物都被包括在本发明的范围内。
式(I)化合物的N-氧化物形式是指包括那些式(I)化合物，其中一个或几个氮原子氧化成所谓的N-氧化物，尤其是那些N-氧化物，其中哌啶-、哌嗪或哒嗪-氮的一个或多个被N-氧化。
在用于下文时，术语“式(I)化合物”是指还包括N-氧化物形式、可药用的酸或碱加成盐和所有立体异构体形式。
EP 371564中描述的化合物抑制视黄酸的血浆脱除。化合物3-乙基-6-[2-甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.20)、3-乙基-6-[1-(1H-咪唑-1-基)-2-甲基丙基]-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.21)、6-[2-甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-3-(2-噻吩基)-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.22)、6-[2-甲基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丙基]-3-(噻吩基)-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.23)、6-[1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-2-甲基丙基]-3-(噻吩基)-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.24)和6-[1-(1H-咪唑-1-基)戊基]-3-甲基-2(1H)-喹喔啉酮(本发明的化合物No.25)在EP371564中公开。出乎意料的是，我们发现本发明的化合物显示PARP抑制活性。
第一组感兴趣的式(I)化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一种或多种如下限制a)n是0或1；b)X是N或CR5，其中R5是H；c)R3是选自(a-1)、(a-2)或(a-3)的基团或式(b-1)的基团，即-Z-；d)s是0、1或2；
e)R6是-CHO、C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；f)R8是C1-6烷基；g)当R3是式(b-1)基团时，则Z是选自(c-2)或(c-4)的杂环环系；和h)每个R10分别是H、C1-6烷基或C1-6烷氧基C1-6烷基氨基。
第二组感兴趣的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一种或多种如下限制a)n是0；b)X是CR5，其中R5是H；c)R1是C1-6烷基；d)R2是H或羟基或与R4一起可形成＝O；e)R3是选自(a-1)或(a-2)的基团；f)s是0或2；g)R6是-CHO或C1-6烷基；和h)R4是H、C1-6烷基或 感兴趣的第三组化合物由其中Z是除式(c-2)或(c-4)的杂环环系外的杂环环系的式(I)化合物、感兴趣的第一组化合物或感兴趣的第二组化合物组成。
一组优选化合物由那些式(I)化合物组成，其中n是0或1；X是N或CR5，其中R5是H；R3是选自(a-1)、(a-2)或(a-3)的基团或式(b-1)的基团，即-Z-；s是0、1或2；R6是-CHO、C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R8是C1-6烷基；当R3是式(b-1)基团时，则Z是选自(c-2)或(c-4)的杂环环系；和每个R10分别是H、C1-6烷基或C1-6烷氧基C1-6烷基氨基。
另一组优选化合物由那些式(I)化合物组成，其中n是0；X是N或CR5，其中R5是H；R1是C1-6烷基；R2是H或羟基或与R4一起可形成＝O；R3是选自(a-1)或(a-2)的基团；s是0或1；R6是-CHO或C1-6烷基；和R4是H、C1-6烷基或 另一组优选化合物由其中Z是除式(c-2)或(c-4)的杂环环系外的杂环环系的式(I)化合物、一组优选化合物或另一组优选化合物组成。
最优选化合物是化合物No1、化合物No5、化合物No7、化合物No3和化合物No.17。
式(I)化合物可根据在EP 371564中描述的一般方法制备。
许多此类制备方法在下文更详细地描述，得到式(I)的最终化合物的其它方法在实施例中描述。
其中R2是H和R3是-NR7-CHO，其中R7是H或甲基的化合物，下文称为式(I-b)化合物可由其中R2与R3一起形成＝O的式(I)化合物，下文称为式(I-a)化合物为原料，在甲酰胺或甲基甲酰胺，下文称为式(II)化合物和甲酸存在下制备。
其中R3是羟基的式(I)化合物，下文称为式(I-c)化合物可通过在合适的溶剂，例如甲醇和四氢呋喃中用合适的还原剂，例如硼氢化钠将式(I-a)化合物的酮基部分转化成羟基制备。
式(I-a)化合物可通过在合适的氧化剂，例如三氧化铬和酸，例如硫酸存在下在合适的溶剂，例如2-丙酮中转变其中R2是H的式(I-c)化合物，下文称为式(I-c-1)化合物制备。
其中W是合适离去基团，例如氯、溴、甲磺酰氧基或苯磺酰氧基的式(IV)中间体可由式(I-c-1)化合物通过用合适的还原剂，例如甲磺酰氧基氯或苯磺酰氧基氯或卤化试剂，例如POCl3或SOCl2处理所述的化合物制备。
式(I)化合物，定义为其中Rb是如R6中所定义和Rc是如R7中所定义的或Rb和Rc与和它们相连的氮连接在一起形成Z定义的合适杂环环系的式(I)化合物，下文称为式(I-h)化合物可通过使式(IV)中间体与式(V)中间体反应制备。反应可在反应惰性溶剂，例如二甲基甲酰胺或乙腈和任选在合适的碱，例如碳酸钠、碳酸钾或三乙胺存在下进行。
式(I)化合物还可经现有技术已知的反应或官能团转变过程彼此转化。许多上述转变过程已在上文描述，其它实例是羧酸酯水解成相应的羧酸或醇；酰胺水解成相应的羧酸或胺；腈水解成相应的酰胺；咪唑或苯基上的氨基可通过已知的重氮化反应，随后用氢置换重氮基而被氢置换；醇可转化为酯和醚；伯胺可转化为仲胺或叔胺；双键可氢化为相应的单键；苯基上的碘基可通过在合适的钯催化剂存在下的一氧化碳插入反应转化为酯基。
因此，式(I)、(I-a)、(I-b)、(1-c)、(I-c-l)、(I-h)、(I-i)、(1-j)和(I-k)化合物可任选以任何所需顺序进行一种或多种如下的转化(i)将式(I)化合物转化为式(I)的不同化合物；(ii)将式(I)化合物转化为其相应的可接受的盐或N-氧化物；(iii)将式(I)化合物的可药用的盐或N-氧化物转化为式(I)的母体化合物；(iv)制备式(I)化合物或其可药用的盐或N-氧化物的立体化学异构体形式。
其中Rd和Re是合适的基团或和与它们相连的碳一起形成Z中定义的合适杂环环系的式(VII)中间体可通过其中R3是式(b-1)的基团或式(a-1)的基团(其中s不是0)(本文称为Rg)的式(VI)中间体根据已知方法水解制备，例如在反应惰性溶剂，例如四氢呋喃存在下搅拌在含水酸溶液中的中间体(VI)，合适的酸是例如盐酸。
其中R2是H和Rg是如上定义的式(I)化合物，本文称为式(I-k)化合物，可由式(VII)中间体为原料通过用合适的还原剂，例如贵金属催化剂，例如铂/碳、钯/碳等和合适的还原试剂，例如氢气在合适的溶剂，例如甲醇中选择性氢化所述中间体制备。
式(I)化合物可根据已知的方法，通过将式(VIII)中间体与合适的试剂，例如氯化锡、乙酸和盐酸在反应惰性溶剂，例如四氢呋喃存在下接触，水解式(VIII)中间体制备。
式(I)化合物可用式(IX)的N-氧化物为原料，通过在合适的试剂，例如碳酸钠或乙酐和如果需要在溶剂，例如二氯甲烷存在下转化式(IX)中间体制备。
其中X是CH的式(I)化合物，本文称为式(I-j)化合物，还可通过环化式(X)中间体得到，式(X)中间体的环化反应可根据已知环化方法进行。反应优选在合适的路易斯酸，例如氯化铝存在下，无溶剂或在合适溶剂，例如芳香烃，例如苯、氯苯、甲苯等；卤代烃，例如三氯甲烷、四氯甲烷等；醚，例如四氢呋喃、1，4-二氧六环等或这些溶剂的混合物中进行。稍高的温度，优选70-100℃和搅拌可提高反应速率。
其中X是N的式(I)化合物，本文称为式(I-i)化合物，可通过缩合合适的式(XI)的邻苯二胺和其中Rh是C1-6烷基的式(XII)的酯得到。式(XI)的取代的邻二胺与式(XII)的酯的缩合反应可在羧酸，例如乙酸等；无机酸，例如盐酸、硫酸或磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸等存在下进行。稍高的温度可合适地提高反应速率，在某些情况下，反应甚至在反应混合物的回流温度下进行。在缩合过程中释放的水可通过共沸蒸馏、蒸馏等方法由混合物中除去。
式(XI)中间体可用中间体式(XIII)为原料通过在金属催化剂，例如雷内镍和合适的还原试剂，例如氢气在合适的溶剂，例如甲醇中由硝基向胺的还原反应制备。
式(XIII)的中间体可通过已知方法，例如在反应惰性溶剂，例如四氢呋喃存在下在含水酸溶液中搅拌中间体(XIV)，水解式(XIV)中间体制备，合适的酸是例如盐酸。
式(X)的中间体可方便地通过使式(XV)苯胺与式(XVI)卤化物在碱，例如吡啶存在下在合适的溶剂，例如二氯甲烷中反应制备。
其中n是0、R2是H或羟基和当R2是H，则R3是羟基的式(VIII)中间体，本文称为式(VIII-a)中间体，可通过用有机锂试剂，例如正丁基锂在反应惰性溶剂，例如四氢呋喃中处理其中W是卤素的式(XVII)中间体，随后使所述中间体与其中Ri是H或如R3中定义的基团的式(XVIII)中间体反应制备。
本发明还涉及用作药物的如上定义的式(I)化合物。
由下文实验部分可以看出，本发明的化合物具有PARP抑制性质。
本发明还包含化合物在制备用于在动物中治疗本文描述的任一疾病和症状的药物的用途，其中所述化合物是式(I)化合物 其N-氧化物形式、可药用的加成盐和立体化学异构体形式，其中n是0、1或2；X是N或CR5，其中R5是H或与R1一起可形成式-CH＝CH-CH＝CH-的二价基团；R1是C1-6烷基或噻吩基；R2是H或羟基或与R3或R4一起形成＝O；R3是选自如下的基团-(CH2)s-NR6R7(a-1)，-O-H (a-2)，-O-R8(a-3)，-S-R9(a-4)，或-C≡N (a-5)其中s是0、1、2或3；R6是-CHO、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、哌啶基、哌啶基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、C1-6烷氧基、噻吩基C1-6烷基、吡咯基C1-6烷基、芳基C1-6烷基哌啶基、芳基羰基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基、卤代吲唑基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R7是H或C1-6烷基；R8是C1-6烷基、C1-6烷基羰基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；和R9是二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；或R3是下式的基团-Z-(b-1)，其中Z是选自如下的杂环环系 其中每个R10分别是H、C1-6烷基、氨基羰基、羟基、 C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基氨基、芳基C1-6烷基、二(苯基C2-6烯基)、哌啶基C1-6烷基、C3-10环烷基、C3-10环烷基C1-6烷基、芳氧基(羟基)C1-6烷基、卤代吲唑基、芳基C1-6烷基、芳基C2-6烯基、吗啉基、C1-6烷基咪唑基，或吡啶基C1-6烷基氨基；R4是H、C1-6烷基、呋喃基、吡啶基、芳基C1-6烷基或
芳基是苯基或被卤素、C1-6烷基或C1-6烷氧基取代的苯基。
考虑到它们PARP的结合性质，本发明的化合物可用作参考化合物或示踪化合物，在这种情况下，分子的一个原子可被例如放射活性同位素取代。
为制备本发明的药物组合物，作为活性成分的有效量的碱或酸加成盐形式的具体化合物与可药用的载体在均匀混合物中混合，载体可根据给药所需的制剂形式采用各种形式。这些药物组合物合适地是以适合于优选用于口服、直肠、经皮或肠胃外注射给药的单位剂型。例如，在制备口服剂型的组合物时，可采用任何常用的药物介质，例如在口服液体制备，例如悬浮液、糖浆、酏剂和溶液情况下的水、二醇、油、醇等；或在粉剂、丸剂、胶囊和片剂的情况下的固体载体，例如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于容易给药，片剂和胶囊代表了最有利的口服剂型，在此情况下，显然采用固体剂型。对于肠胃外组合物，载体将通常包括无菌水，至少为大部分，虽然可包括其它成分以有助于溶解性。例如可制备可注射溶液，其中载体包括盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物。也可以制备可注射的悬浮液，在此情况下，可采用合适的液体载体、悬浮剂等。在适用于经皮给药的组合物中，载体任选地包括渗透改善剂和/或合适的增湿剂，任选与较少比例的合适的任何性质的添加剂混合，该添加剂对皮肤不导致明显的损害。所述添加剂可有助于向皮肤给药和/或会有助于制备所需的组合物，这些组合物可以各种方式给药，例如作为经皮敷剂、斑或软膏。尤其有利的是配制易于给药和剂量均匀的剂量单位形式的上述药物组合物。用于本说明书和权利要求的剂量单位形式是指适用于单元剂量的物理分散单位，每个单位含有计算的预定量的活性成分以与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。该剂量单位形式的实例是片剂(包括有刻痕或涂覆的片剂)、胶囊、丸剂、粉剂包、糯米纸囊剂、可注射溶液或悬浮液、茶匙容量、汤匙容量等和分隔的多份。
本发明的化合物可治疗或预防由于细胞坏死或凋亡作用所引起的细胞损坏或死亡而产生的组织损坏；可减轻神经或心血管组织损伤，包括在局限性局部缺血、心肌梗塞或再灌注损伤后的损伤；可治疗各种因PARP活性所导致或恶化的疾病和症状；可延长或增加细胞的寿命或繁殖能力；可改变衰老细胞的基因表达；可放射致敏和/或化学致敏细胞。通常，PARP活性的抑制免除细胞的能量损失、在神经细胞情况下，预防神经元的不可逆极化，因而提供神经保护。
基于上述原因，本发明还涉及以足以抑制PARP活性的数量给药治疗有效量的上述化合物的方法，以治疗或预防由于细胞坏死或细胞凋亡引起的细胞损伤或死亡而导致的组织损伤、影响非NMDA毒性传递的神经元活性、影响由NMDA毒性传递的神经元活性、治疗由于局部缺血和再灌注损伤的神经组织损伤、神经系统障碍及神经退化疾病；预防和治疗血管中风；治疗或预防心血管疾病；治疗其他症状和/或疾病，例如与年龄有关的肌肉退化、AIDS及其它免疫衰老疾病、炎症、痛风、关节炎、动脉硬化、恶质病、癌症、骨骼肌退化疾病，包括复制性衰老、糖尿病、头部创伤、炎性肠炎(例如结肠炎和局限性回肠炎)、肌营养不良、骨关节炎、骨质疏松、慢性和/或急性疼痛(例如神经性疼痛)、肾衰竭、视网膜局部缺血、败血性休克(例如内毒性休克)和皮肤老化，延长细胞寿命及繁殖能力；改变衰老细胞的基因表达；或化学致敏和/或放射致敏(缺氧)肿瘤细胞。本发明还涉及在动物中治疗疾病和症状，其包括向所述动物给药治疗有效量的上述化合物。
本发明尤其涉及在动物中治疗、预防或抑制神经学症状的方法，其包括向所述动物给药治疗有效量的上述化合物。该神经学症状选自由物理损伤或疾病状态导致的末梢神经病、创伤性脑损伤、脊髓的物理损伤、与脑损伤有关的中风、局部性局部缺血、普遍性局部缺血、再灌注损伤、脱髓鞘疾病和与神经退化有关的神经学症状。
本发明还包含式(I)化合物抑制PARP活性用于在动物中治疗、预防或抑制由于细胞坏死或凋亡而引起的细胞损伤或死亡而导致的组织损伤，用于治疗、预防或抑制神经元症状的用途。
术语“预防神经退化”包括在新近诊断为具有神经退化症状或处于发展为新的退化疾病的风险的患者中预防神经退化且在已经患有或具有神经退化疾病征兆的患者中进一步预防神经退化的能力。
用于本文的术语“治疗”覆盖在动物，尤其是人中的任何疾病和/或症状的治疗，包括(i)在易患疾病和/或症状但尚未诊断出患病的患者中预防疾病和/或症状；(ii)抑制疾病和/或症状，即遏止其发展；(iii)减轻疾病和/或症状，即使该疾病和/或症状的消退。
用于本文的术语“放射致敏剂”定义为分子，优选为低分子量分子，它以治疗有效量向动物给药以增加细胞对离子化放射的敏感性和/或促进可用离子化放射治疗的疾病的治疗。可用离子化放射治疗的疾病包括瘤形成疾病、良性及恶性肿瘤和癌细胞，其它本文未列出的离子化放射治疗的疾病也包含在本发明中。
用于本文的术语“化学致敏剂”定义为分子，优选为低分子量分子，它以治疗有效量向动物给药以增加细胞对化学治疗的敏感性和/或促进可用化学治疗的疾病的治疗。可用化学治疗的疾病包括瘤形成疾病、良性及恶性肿瘤和癌细胞，其它本文未列出的其他疾病的化学治疗也包含在本发明中。
本发明的化合物、组合物和方法尤其用于由于细胞坏死或凋亡而引起的细胞死亡或损伤而导致的组织损伤。
本发明化合物可以是“抗癌剂”，该术语还包括“抗肿瘤细胞生长剂”和“抗瘤形成剂”。例如，本发明的方法用于治疗癌症和化学致敏和/或放射致敏癌症中的肿瘤细胞，例如ACTH-产生肿瘤、急性淋巴性白血病、急性非淋巴性白血病、肾上腺素皮质癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食道癌、Ewing瘤、胆囊襄、毛细胞性白血病、头颈癌、Hodgkin′s淋巴瘤、Kaposi′s瘤、肾癌、肝癌、肺癌(小和/或非小细胞)、恶性腹腔积液、恶性胸腔积液、黑素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、非Hodgkin淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢(生殖细胞)癌、前列腺癌、胰腺癌、阴茎癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、软组织癌、鳞状细胞瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、滋养层肿瘤、子宫瘤、阴道癌及Wilm肿瘤。
因此，本发明的化合物可用作“放射致敏剂”和/或“化学致敏剂”。
已知放射致敏剂增加癌细胞对于离子化放射的毒性效果的敏感性，放射致敏剂的作用模式的几种机理已在文献中公开，包括低氧细胞放射致敏剂(例如2-硝基咪唑化合物及苯并三嗪二氧化物)，在氧不足下模拟氧或性质类似的生物还原剂；非低氧细胞放射致敏剂(例如卤化嘧啶)可为DNA碱基的类似物，优先并入癌细胞的DNA内，从而促进放射诱导的DNA分子的断裂和/或防止正常的DNA修复机制；和作用的各种其它有效机制已假定为疾病治疗中的放射致敏剂。许多癌症治疗方法目前采用放射致敏剂结合X-射线放射。X-射线活化的放射致敏剂的实例包括，但不限于，如下甲硝唑、米索硝唑、脱甲基米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、E09、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FudR)、羟基脲、顺铂及其治疗有效的类似物和其衍生物。癌症的光动力治疗(PDT)采用可见光作用作为致敏剂的放射活化剂。光动力放射致敏剂的实例包括，但不限于，如下血卟啉衍生物、光敏素、苯并卟啉衍生物、锡初卟啉、脱镁叶绿酸-a、细菌叶绿酸-a、萘花青、酞花青锌及其治疗有效的类似物和其衍生物。
放射致敏剂可与治疗有效量的一种或多种其它化合物结合给药，其包括，但不限于，促进放射致敏剂并入靶细胞的化合物；控制治疗剂、营养素和/或氧流向靶细胞的化合物；在使用或不使用放射下作用于肿瘤的化学治疗剂；或其它用于治疗癌症或其它疾病的治疗有效化合物。可用于与放射致敏剂结合的附加治疗药物的实例包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、亚叶酸、5’-氨基-5’-脱氧胸腺嘧啶核苷、氧、碳氧混合气、红细胞输送液、全氟烃(例如Fluosol 10DA)、2，3-DPG、BW12C、钙离子阻断剂、己酮可可碱、抗血管生成化合物、肼屈嗪和LBSO。可用于与放射致敏剂的化学治疗药物的实例包括，但不限于，多柔比星、喜树碱、碳铂、顺铂、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、干扰素(α、β、γ)、白细胞介素2、伊立替康、紫衫醇、拓朴替康和治疗有效的类似物和其衍生物。
化学致敏剂可与治疗有效量的一种或多种其它化合物结合给药，所述化合物包括，但不限于，促进化学致敏剂并入靶细胞的化合物；控制治疗剂、营养素和/或氧流向靶细胞的化合物；用作于肿瘤的化学治疗芗或其它用于治疗癌症或其它疾病的治疗有效化合物。可与化学致敏剂结合使用的其它治疗药物的实例包括，但不限于，甲基化剂、拓朴异构化酶I抑制剂和其它化学治疗药物，例如顺铂和博来霉素。
式(I)化合物还可用于检测或确认PARP，尤其是PARP-1受体，为此，式(I)化合物可被标记，所述标记可选自放射性同位素、旋转标记、抗原标记、酶标记荧光基团或化学荧光基团。
本领域的技术人员可根据下文所述的试验结果容易地确定有效量，通常采用的有效量是0.01mg/kg-100mg/kg体重，尤其是0.05mg/kg-10mg/kg体重。可合适地以相等的剂量分2、3、4或更多的分剂量在一天内中以合适的间隔给药。所述分剂量可配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有0.5-500mg，尤其是1mg-200mg活性成分。
如下实施例举例说明本发明。
实验部分下文中，“BuLi”定义为丁基锂，“DCM”定义为二氯甲烷，“DIPE”定义为二异丙基醚，“DMF”定义为N，N-二甲基甲酰胺，“EtOAc”定义为乙酸乙酯，“EtOH”定义为乙醇，“MEK”定义为甲基乙基酮，“MeOH”定义为甲醇和“THF”定义为四氢呋喃。
A.中间体化合物的制备实施例A1a)中间体1的制备 将1-(4-氨基-3-硝基苯基)-2-甲基-1-丙酮(0.0144mol)在甲酸(4.93ml)和甲酰胺(18.2ml)中的混合物在160℃搅拌15小时，随后冷却到室温，倾入冰水中，用浓氢氧化铵溶液碱化，用EtOAc提取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂至干，得到4.8g中间体1。
b)中间体2的制备
将中间体1(0.0144mol)在MeOH(50ml)中的混合物在3巴压力下用Raney Nickel(3.4g)作催化剂氢化1小时。在H2(3当量)吸收后，通过C盐过滤出催化剂，用MeOH洗涤，滤液蒸发至干。产物无需进一步纯化而使用，得到4.7g中间体2。
实施例A2中间体3和4的制备 将氯化铝(0.6928mol)分批加入氯-乙酰基氯(0.5196mol)在DCM(50.2ml)中的溶液中，期间温度保持在低于30℃。在温度保持在低于30℃下，加入3-乙基-2(1H)-喹啉酮(0.1732mol)。将混合物回流搅拌15小时，冷却，倾入冰水中。过滤出沉淀，用水洗涤，溶解在DCM中。搅拌有机溶液，过滤，干燥沉淀，得到33.5g中间体3。提取滤液，分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂至干，得到20.46g中间体4。
实施例A3a)中间体5的制备 将6-溴-2-氯-3-甲基-1-喹啉(0.04483mol)和CH3ONa(0.224mol)在MeOH(200ml)中的混合物在70℃搅拌36小时，冷却混合物，倾入水中，加入EtOAc，混合物用EtOAc提取。有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发，得到11g(97％)中间体5。
b)中间体6的制备 将在己烷中的BuLi 1.6M(0.0619mol)在-60℃在N2下滴加到中间体5(0.0476mol)在THF(200ml)中的混合物中。混合物在-60℃搅拌1小时，在-60℃滴加3-(二甲基氨基)-1-(2-呋喃基)-1-丙酮(0.0571mol)在THF(100ml)中的混合物。混合物在-60℃搅拌2小时，随后在-40℃搅拌1小时。将混合物倾入饱和氯化铵溶液中，用EtOAc提取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂，产物无需进一步纯化，得到16.2g中间体6。
c)中间体7的制备 将中间体6(0.0476mol)在盐酸3N(254ml)和THF(128ml)中的混合物搅拌和回流6小时，将混合物倾在冰上，用浓氢氧化铵溶液碱化，用EtOAc提取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂。残余物在硅胶(15-40μm)上经柱色谱法(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2)纯化。收集纯馏分，蒸发溶剂，得到4g(27％)中间体7。
实施例A4中间体8的制备
将在己烷中的nBuLi 1.6M(0.129mol)在-60℃在N2下滴加到6-溴-3-乙基-2-甲氧基-喹啉(0.0996mol)在THF(265ml)中的混合物中。混合物在-60℃搅拌1小时，在-60℃滴加2-乙基-丁醛(0.119mol)在THF(100ml)中的混合物。混合物在-60℃搅拌2小时，随后在-40℃搅拌1小时。将混合物倾入饱和氯化铵溶液中，用EtOAc提取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂，产物无需进一步纯化，得到28.62g中间体8。
实施例A55a)中间体9的制备 将(2-溴甲基)-苯(0.174mol)在乙醚(125ml)中的溶液在0℃滴加至镁屑(0.21mol)在乙醚(125ml)中的悬浮液中，混合物在0℃搅拌1小时。在0℃滴加3-甲基-6-喹啉甲醛(0.116mol)在THF(200ml)中的溶液，混合物在室温下搅拌2小时。将混合物倾入冰水中，通过C盐过滤，产物用EtOAc提取。有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发。残余物由EtOAc/乙醚结晶，得到19g (59％)中间体9。
h)中间体10的制备 将高锰酸钾(19g)在5℃和在N2下滴加到中间体9(0.069mol)在DCM(300ml)和三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(2ml)中的溶液中，混合物在室温下搅拌过夜。混合物通过C盐过滤，蒸发滤液，得到17g(90％)中间体10。
c)中间体11的制备
将3-氯-苯羰基过氧酸(0.123mol)在DCM(200ml)中的溶液在5℃和N2下加入中间体10(0.062mol)在DCM(200ml)中的溶液，混合物在5℃搅拌1小时，随后在室温下搅拌3小时。加入含水碳酸钾10％，产物用DCM提取。有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发。产物无需进一步纯化而使用，得到18g(100％)中间体11。
d)中间体12的制备 在室温下将碳酸钾10％(250ml)加入中间体11(0.062mol)在DCM(250ml)中的溶液中，混合物搅拌10分钟。分批加入甲基磺酰氯(0.093mol)，混合物在室温下搅拌2小时，过滤出沉淀，用水洗涤并干燥。残余物(10.1g)由2-丙酮重结晶，得到2.8g(72％)中间体12。
B.最终化合物的制备实施例B1最终化合物的制备 将中间体2(0.011mol)和2-氧代丁酸乙酯(0.022mol)在EtOH(40ml)中的混合物在60℃搅拌6小时，随后冷却到室温。蒸发溶剂，残余物溶解在饱和NaHCO3溶液中。混合物用DCM提取，分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂至干。残余物在硅胶(15-40μm)上用柱色谱法(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.1和85/15/0.1)纯化。收集纯馏分，蒸发溶剂。残余物(1.9g)在硅胶(15-40μm)上再次用柱色谱法(洗脱液环己烷/2-丙醇/NH4OH 88/12/1)纯化，收集纯馏分，蒸发溶剂。残余物由DIPE结晶，过滤出沉淀，干燥，得到0.33g(11％)化合物1，熔点204℃。
实施例B2最终化合物2的制备 将氯化铝(0.234mol)分批加入N-[4-[1-(1H-咪唑-1-基)-2-甲基丙基]苯基]-2-甲基-3-苯基-2-丙酰胺(0.026mol)在氯苯(60ml)中的溶液中，混合物在100℃搅拌3小时。将混合物倾入冰水中，用NH4OH碱化，用DCM提取。混合物用C盐过滤，倾析滤液。将有机层干燥(MgSO4)，过滤和蒸发至干。残余物在硅胶(35-70μm)上用柱色谱法(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.1)纯化，收集纯馏分，蒸发。残余物(4g)由MEK结晶，得到2.12g(29％)化合物2，211.4熔点℃。
实施例B3最终化合物3的制备 在室温下和氮气流中将二甲胺盐酸盐(0.3mol)分批加入碳酸钾(0.3603mol)在DMF(300ml)中的悬浮液中。混合物搅拌30分钟，小心加入中间体3(0.06mol)和中间体4(0.06mol)的混合物。混合物在室温下搅拌30分钟，加入冰。过滤出沉淀，用水洗涤，过滤和用DCM提取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂至干。残余物(16.6g)在硅胶(20-45μm)上用柱色谱法(洗脱液DCM7MeOH/NH40H 95/5/0.2)纯化，收集纯馏分，蒸发溶剂。残余物(4.9g)由2-丙酮和MeOH结晶，过滤出沉淀，干燥，得到1.2g化合物3，熔点180℃。
实施例B4最终化合物4的制备 将中间体7(0.0113mol)在MeOH(60ml)中的混合物用Pd/C10％(0.35g)作催化剂在40℃和4.8巴压力下氢化6小时，在氢气吸收(1当量)后，用C盐过滤催化剂，蒸发滤液。残余物溶解在水和浓氢氧化铵溶液中，用DCM提取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂。残余物在硅胶(15-40μm)上用柱色谱法(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.3和93/7/0.5)纯化，收集纯馏分，蒸发溶剂。残余物由2-丙酮和乙醚结晶，过滤出沉淀，干燥，得到0.69g(20％)化合物4。
实施例B5最终化合物5的制备 将中间体8(0.0996mol)在盐酸3N(426ml)和THE(274ml)中的混合物在70℃搅拌过夜，随后倾入冰中，用浓NH4OH溶液碱化，用EtOAc提取。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂。残余物由DCM结晶，过滤出沉淀，干燥，得到15.21g(56％)化合物5。
实施例B6
最终化合物6的制备 将中间体12(0.013mol)在甲酰胺(61.8ml)和甲酸(30ml)中的混合物搅拌和回流36小时。将混合物冷却到室温，倾入冰水中，过滤。沉淀用水、2-丙酮和乙醚洗涤，干燥沉淀，由MeOH/THF重结晶，得到1.74g(40％)化合物6，熔点221.3℃。
实施例B7最终化合物7的制备 将硼氢化钠(0.0151mol)在0℃和氮气流下加入化合物3(0.0116mol)在MeOH(50ml)中的溶液中，混合物搅拌1小时，倾入水中。蒸发有机溶剂，含水浓缩物溶解在DCM和水中，提取混合物。分离有机层，干燥(MgSO4)，过滤和蒸发溶剂至干。残余物由2-丙酮和MeOH结晶，过滤沉淀，用乙醚洗涤，干燥，得到2g化合物7，熔点131℃。
表格F-1列出根据上述实施例之一制备的化合物，如下缩写用于表格中。
表格F-1
药理学实施例PARP-1抑制活性的体外闪烁接近试验(SPA)本发明的化合物在基于SPA技术(属于Amersham PharmaciaBiotech)的体外试验中测试。原理上，试验依据用于检测生物素标记的目标蛋白质，即组蛋白的聚(ADP-核糖基)化的已确认的技术，核糖化过程用切口的DNA活化的PARP-1酶和作为ADP-核糖基供体的[3H]-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸([3H]-NAD+)引发。
制备用作PARP-1酶活性诱导物的切口DNA。为此，将25mg DNA(供应商Sigma)溶解在25ml DNAse缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.4；0.5mg/ml胎牛血清(BSA)；5mM MgCl2，6H2O和1mM KCl)，向其中加入50μl DNAse溶液(1mg/ml，在0.15M NaCl中)。在37℃培养90分钟后，通过加入1.45g NaCl停止反应，随后在58℃培养15分钟。反应混合物在冰上冷却，在4℃分别相对1.5L的0.2M KCl透析1.5和2小时，相对1.5L的0.01MKCl透析两次，分别为1.5和2小时。将混合物等分，贮存在-20℃下。组蛋白(1mg/ml，II-A型，供应商Sigma)用Amersham的生物素标记盒进行生物素标记，将等分试样在-20℃下贮存。在PBS中制备100mg/ml SPA聚(乙烯基甲苯)(PVT)珠粒(供应商Amersham)的备用溶液。通过将120μl的[3H]-NAD+(0.1mCi/ml，供应商NEN)加入6ml培养缓冲液(50mMTris/HCl，pH 8；0.2mM DTT；4mM MgCl2)制备的[3H]-NAD+备用溶液，在培养缓冲液(由贮存在-20℃的在水中的100mM备用溶液)中制备4mM NAD+(供应商Roche)溶液。PARP-1酶用现有技术中已知的技术制备，即用人体肝cDNA为原料复制和表达。有关所使用的PARP-1酶的蛋白质顺序的信息，包括参考文献在Swiss-Prot数据库中在寄存编号P09874下找到。将生物素标记的组蛋白和PVT-SPA珠粒混合，在室温下预培养30分钟。PARP-1酶(浓度与批次有关)与切口的DNA混合，混合物在4℃预培养30分钟。将相同份数的组蛋白/PVT-SPA珠溶液和PARP-1酶/DNA溶液混合，将75μl的该混合物和1μl在DMSO中的化合物和25μl[3H]-NAD+一起加入96孔微滴板的每个孔中，在培养混合物中的最终浓度，对生物素标记的组蛋白为2μg/ml，对PVT-SPA珠为2mg/ml，对切口的DNA为2μg/ml，对PARP-1在5-10μg/ml。混合物在室温下培养15分钟后，通过加入在培养缓冲液中的100μl 4mM NAD+(最终浓度2mM)停止反应，将板混合。
使珠粒沉降至少15分钟，将板转移到TopCountNXTTM(Packard)进行闪烁计数，数值以每分钟的次数表示(cpm)。对于每次实验，平行进行对照组(含有PARP-1酶和DMSO，没有化合物)、空白培养液(含有DMSO，但没有PARP-1酶或化合物)和样品(含有PARP-1酶和溶解在DMSO中的化合物)的试验。将所有测试的化合物溶解，最终进一步在DMSO中稀释。在第一种情况下，化合物在10-6M浓度下测试，当化合物在10-6M显示活性时，得到其中化合物在10-5M至10-8M浓度下测试的剂量响应曲线。在每次试验中，空白数值将由对照组和样品组数值中减去，对照样品代表最大PARP-1[酶活性。对于每个样品，cpm数值表示为对照组的平均cpm值百分数。如果需要，在恰高于或低于50％水平的实验点之间用线性插入法计算IC50值(将PARP-1酶活性降低至对照组的50％所需的药物浓度)。本文中，试验化合物的效果用pIC50(IC50值的负log值)表示。作用参考化合物，包括了4-氨基-1，8-萘酰亚胺以验证SPA试验，试验化合物在10-6M的初始试验浓度下显示抑制活性(参见表2)。
PARP-1抑制活性的体外渗滤试验本发明的化合物在体外渗滤试验中测试，用[32P]-NAD作为ADP-核糖基供体通过其组蛋白聚(ADP-核糖基)化活性评价PARP-1活性(在切口的DNA存在下触发)。放射活性的核糖基化组蛋白在96孔滤板中用三氯乙酸(TCA)沉淀，渗入的[32P]用闪烁计数器测量。
在培养缓冲液(50mM Tris/HCl，pH 8；0.2mM DTT；4mMMgCl2)中制备组蛋白(备用溶液5mg/ml H2O)、NAD+(备用溶液100mM H2O)和[32P]-NAD+的混合物，并制备PARP-1酶(5-10μg/ml)和切口的DNA的混合物。切口的DNA如PARP-1抑制活性的体外SAP中所述制备。在96孔滤板(0.45μm，供应商Millipore)的每个孔中加入75μl PARP-1酶/DNA混合物和1μl在DMSO中的化合物和25μl的组蛋白-NAD+/[32P]-NAD+混合物。在培养混合物中的最终浓度对组蛋白为2μg/ml，对NAD+为0.1mM，对[32P]-NAD+为200μM(0.5μC)，对切口的DNA为2μg/ml。板在室温下培养15分钟，通过加入10μl冰冷的100％TCA，然后加入10μl冰冷的100％BSA溶液(在水中的1％)停止反应。使蛋白质馏分在4℃下沉淀10分钟，板真空过滤。板每个孔依次用1ml 10％冰冷的TCA、1ml 5％冰冷的TCA和1ml常温5％TCA洗涤。最后在每个孔中加入100μl闪烁溶液(Microscint 40，Packard)，将板转移到TopCountNXTTM(供应商Packard)进行闪烁计数，数值以每分钟的次数表示(cpm)。对于每次实验，平行进行对照组(含有PARP-1酶和DMSO，没有化合物)、空白培养液(含有DMSO，但没有PARP-1酶或化合物)和样品(含有PARP-1酶和溶解在DMSO中的化合物)的试验。将所有测试的化合物溶解，最终进一步在DMSO中稀释。在第一种情况下，化合物在10-5M浓度下测试，当化合物在10-5M显示活性时，得到其中化合物在10-5M至10-8M浓度下测试的剂量响应曲线。在每次试验中，空白数值将由对照组和样品组数值中减去，对照样品代表最大PARP-1酶活性。对于每个样品，cpm数值表示为对照组的平均cpm值百分数。如果需要，在恰高于或低于50％水平的实验点之间用线性插入法计算IC50值(将PARP-1酶活性降低至对照组的50％所需的药物浓度)。本文中，试验化合物的效果用pIC50(IC50值的负log值)表示。包括了4-氨基-1，8-萘酰亚胺作用参考化合物以验证渗滤试验，试验化合物在10-5M的初始试验浓度下显示抑制活性(参见表2)
表2
化合物可进一步在细胞化学-和/或放射致敏试验，在癌细胞系中测量内源PARP-1活性的抑制，并最终在体内放射致敏试验中的试验中评价。
权利要求
1.式(I)化合物 其N-氧化物形式、加成盐和立体化学异构体形式，其中n是0、1或2；X是N或CR5，其中R5是H或与R1一起可形成式-CH＝CH-CH＝CH-的二价基团；R1是C1-6烷基或噻吩基；R2是H或羟基或与R3或R4一起形成＝O；R3是选自如下的基团-(CH2)s-NR6R7(a-1)，-O-H (a-2)，-O-R8(a-3)，-S-R9(a-4)，或-C≡N (a-5)其中s是0、1、2或3；R6是-CHO、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、哌啶基、哌啶基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、C1-6烷氧基、噻吩基C1-6烷基、吡咯基C1-6烷基、芳基C1-6烷基哌啶基、芳基羰基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基、卤代吲唑基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R7是H或C1-6烷基；R8是C1-6烷基、C1-6烷基羰基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；和R9是二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；或R3是下式的基团-Z- (b-1)，其中Z是选自如下的杂环环系 其中每个R10分别是H、C1-6烷基、氨基羰基、羟基、 C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基氨基、芳基C1-6烷基、二(苯基C2-6烯基)、哌啶基C1-6烷基、C3-10环烷基、C3-10环烷基C1-6烷基、芳氧基(羟基)C1-6烷基、卤代吲唑基、芳基C1-6烷基、芳基C2-6烯基、吗啉基、C1-6烷基咪唑基，或吡啶基C1-6烷基氨基；R4是H、C1-6烷基、呋喃基、吡啶基、芳基C1-6烷基或 芳基是苯基或被卤素、C1-6烷基或C1-6烷氧基取代的苯基；其前提是当n是0、X是N、R2是H、R3是式(b-1)的基团、Z是杂环环系(c-2)或(c-4)，其中所述杂环环系Z是用氮原子连接于分子的其余基团，和R10是H时，则R4不是C1-6烷基或吡啶基。
2.权利要求1的化合物，其中其中n是0或1；X是N或CR5，其中R5是H；R3是选自(a-1)、(a-2)或(a-3)的基团或式(b-1)的基团，即-Z-；s是0、1或2；R6是-CHO、C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R8是C1-6烷基；当R3是式(b-1)基团时，则Z是选自(c-2)或(c-4)的杂环环系；和每个R10分别是H、C1-6烷基或C1-6烷氧基C1-6烷基氨基。
3.权利要求1和2的化合物，其中n是0；X是N或CR5，其中R5是H；R1是C1-6烷基；R2是H或羟基或与R4一起可形成＝O；R3是选自(a-1)或(a-2)的基团；s是0或1；R6是-CHO或C1-6烷基；和R4是H、C1-6烷基或
4.权利要求1、2和3的化合物，其中化合物选自化合物No 1、化合物No 5、化合物No 7、化合物No 3和化合物No.17。
5.用作药物的权利要求1-4的任一的化合物。
6.药物组合物，含有可药用的载体和作为活性成分的权利要求1-4中的治疗有效量的化合物。
7.制备权利要求6的药物组合物的方法，其中将可药用的载体和权利要求1-4的化合物均匀混合。
8.化合物在制备用于治疗PARP传递的疾病的药物中的用途，其中所述化合物是式(I)化合物 其N-氧化物形式、可药用的加成盐和立体化学异构体形式，其中n是0、1或2；X是N或CR5，其中R5是H或与R1一起可形成式-CH＝CH-CH＝CH-的二价基团；R1是C1-6烷基或噻吩基；R2是H或羟基或与R3或R4一起形成＝O；R3是选自如下的基团-(CH2)s-NR6R7(a-1)，-O-H (a-2)，-O-R8(a-3)，-S-R9(a-4)，或-C≡N(a-5)其中s是0、1、2或3；R6是-CHO、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、哌啶基、哌啶基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、C1-6烷氧基、噻吩基C1-6烷基、吡咯基C1-6烷基、芳基C1-6烷基哌啶基、芳基羰基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基、卤代吲唑基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R7是H或C1-6烷基；R8是C1-6烷基、C1-6烷基羰基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；和R9是二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；或R3是下式的基团-Z-(b-1)，其中Z是选自如下的杂环环系 其中每个R10分别是H、C1-6烷基、氨基羰基、羟基、 C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基氨基、芳基C1-6烷基、二(苯基C2-6烯基)、哌啶基C1-6烷基、C3-10环烷基、C3-10环烷基C1-6烷基、芳氧基(羟基)C1-6烷基、卤代吲唑基、芳基C1-6烷基、芳基C2-6烯基、吗啉基、C1-6烷基咪唑基，或吡啶基C1-6烷基氨基；R4是H、C1-6烷基、呋喃基、吡啶基、芳基C1-6烷基或 芳基是苯基或被卤素、C1-6烷基或C1-6烷氧基取代的苯基。
9.权利要求8的式(I)化合物用于制备用于治疗PARP-1传递的疾病的药物的PARP抑制剂的用途。
10.权利要求8和9的用途，其中治疗包括化学致敏。
11.权利要求8和9的用途，其中治疗包括放射致敏。
12.化合物与化学治疗药物的结合，其中所述化合物是式(I)化合物 其N-氧化物形式、可药用的加成盐和立体化学异构体形式，其中n是0、1或2；X是N或CR5，其中R5是H或与R1一起可形成式-CH＝CH-CH＝CH-的二价基团；R1是C1-6烷基或噻吩基；R2是H或羟基或与R3或R4一起形成＝O；R3是选自如下的基团-(CH2)s-NR6R7(a-1)，-O-H (a-2)，-O-R8(a-3)，-S-R9(a-4)，或-C≡N(a-5)其中s是0、1、2或3；R6是-CHO、C1-6烷基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基羰基、二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、哌啶基、哌啶基C1-6烷基、哌啶基C1-6烷基氨基羰基、C1-6烷氧基、噻吩基C1-6烷基、吡咯基C1-6烷基、芳基C1-6烷基哌啶基、芳基羰基C1-6烷基、芳基羰基哌啶基C1-6烷基、卤代吲唑基哌啶基C1-6烷基或芳基C1-6烷基(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；R7是H或C1-6烷基；R8是C1-6烷基、C1-6烷基羰基或二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；和R9是二(C1-6烷基)氨基C1-6烷基；或R3是下式的基团-Z- (b-1)，其中Z是选自如下的杂环环系 其中每个R10分别是H、C1-6烷基、氨基羰基、羟基、 C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基氨基、芳基C1-6烷基、二(苯基C2-6烯基)、哌啶基C1-6烷基、C3-10环烷基、C3-10环烷基C1-6烷基、芳氧基(羟基)C1-6烷基、卤代吲唑基、芳基C1-6烷基、芳基C2-6烯基、吗啉基、C1-6烷基咪唑基，或吡啶基C1-6烷基氨基；R4是H、C1-6烷基、呋喃基、吡啶基、芳基C1-6烷基或 芳基是苯基或被卤素、C1-6烷基或C1-6烷氧基取代的苯基。
13.制备权利要求1的化合物的方法，其特征在于a)根据已知的方法，通过将式(VIII)中间体与合适的试剂，例如氯化锡、乙酸和盐酸在反应惰性溶剂，例如四氢呋喃存在下接触，水解式(VIII)中间体 b)根据已知环化方法，环化式(X)中间体得到其中X是CH的式(I)化合物，本文称为式(I-j)化合物，反应优选在合适的路易斯酸，例如氯化铝存在下，无溶剂或在合适溶剂，例如芳香烃，例如苯、氯苯、甲苯等；卤代烃，例如三氯甲烷、四氯甲烷等；醚，例如四氢呋喃、1，4-二氧六环等或这些溶剂的混合物中进行。 c)式(XI)的合适邻苯二胺与其中Rh是C1-6烷基的式(XII)的酯的缩合反应得到式(I)化合物，其中X是N，本文称为式(I-I)化合物，反应在羧酸，例如乙酸等；无机酸，例如盐酸、硫酸或磺酸，例如甲磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸等存在下进行。
全文摘要
本发明提供式(I)的化合物和式(I)、它们作为PARP抑制剂的用途以及含有所述式(I)化合物的药物组合物，其中n、R
文档编号A61P43/00GK1890224SQ200480035857
公开日2007年1月3日 申请日期2004年11月18日 优先权日2003年12月5日
发明者D·J·-P·马比雷, J·E·G·吉耶蒙特, J·A·J·范登, M·V·F·索默斯, W·B·L·沃特斯 申请人:詹森药业有限公司