专利名称：新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法
技术领域：
本发明涉及感染性疾病和分子生物学领域。
背景技术：
Escherichia coli(E.coli)是引起新生儿脑膜炎的最常见的革兰氏阴性菌[Huang SH etal.，(2002).Microbes and Infection.21137-44；Huang and Jong(2001)Cellular Microbiology 3277-87]。这种疾病的致病过程尚未被完全确定。在微生物致病的演化过程中，基因的获得是导致微生物病原体产生和演变的主要途径之一，因此那些导致感染症的微生物病原体所具有的特征或一系列特征通常有别于非疾病或共生菌株。包括E.coli在内的胃肠内微生物群体是出生后迅速获得的，并在人体的整个一生中保持着相对稳定性。这些非病毒性(益生性)细菌对于人类的体内平衡是必需的[Huang，S.H.etal.，(2002)，Func Integr Genomics 1331-44]导致脑膜炎的菌株其特点不同于E.coli的共生菌株，也不同于其他致病菌株，例如不同于那些引起腹泻和尿道感染(UTI)的菌株。E.coli的脑膜炎菌株具有如下鉴别特征这些菌株构成数目有限的一组O型血型簇群(O1，O2，O7，O18，O83)，均能形成S型纤毛(S fimbriac)，携带ibeA遗传(GimA)且携带大量K1囊状体(高于84％)。这些特征的出现提示脑膜炎菌株具有一组特定的致病因子，由此才可能允许细菌穿越血脑屏障进入中枢神经系统。这样的一组潜在的致病基因(基于序列信息)，被称为遗传岛，已被建议称为脑膜炎病原体N.MeningitiS，E.coli K-1和H.influenzae，但还需要通过离体或在体实验方法来加以确定[Bloch，C.H.et al.，(1996)FEMSMicrobiol.Lett.，144171-176；Bonacoorsi SP et al.，(2000)InfectImmun.682096-2101；Chang CC et al.，(2000)Infect Immun.67230-236]。这种遗传岛，例如GimA，携带有致病因子，而这些致病因子可能会使非致病性的E.coli转变为脑膜炎致病菌株。
尽管抗微生物化疗取得进展，但与新生儿革兰氏阴性bacillary性脑膜炎相关的死亡率和发病率依然很高。因此，对细菌性脑膜炎发病过程(例如由细菌病原体导致的血脑屏障的突破，对人类内皮和神经细胞的细胞凋亡过程的诱导)相关的细菌基因和细菌蛋白的进一步了解，将有助于发展出针对这种疾病的新的治疗、预防和诊断工具。
发明内容
本发明涉及到调整E.coli菌，特别是E.coli的脑膜炎菌株的基因和蛋白质。更特别的是，本发明涉及到对ibeA基因簇(GimA)基因及由这些基因，特别是ibeA基因所编码的蛋白质的特征所进行的鉴定，也涉及到相同的基因组成以及涉及到申请利用这些基因组成。
本发明的目的之一是提供分离或纯化的核酸序列，该序列编码ibeA基因簇中的基因。
本发明的另一目的是为由ibeA基因簇基因编码的蛋白质提供氨基酸。
本发明的另一目的是提供一种重组分子，这种重组分子由一种载体和ibeA基因簇的一个或多个基因的全部或部分核酸序列。
本发明的另一目的是生产有ibeA基因簇编码的重组蛋白质。
本发明的另一目的是提供诊断E.coli脑膜炎的方法。
本发明的另一目的是提升我们对亲生物学及其在感染性疾病的管理，尤其是对新生儿细菌性脑膜炎管理方面的应用的理解。
本发明的另一目的也是要提供疫苗和抗微生物制剂，以此来特异性攻击脑膜炎细菌但同时又能保护益生性微生物。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它提供一种完整核酸序列的方法，该核酸序列编码一种ibeA基因簇中的某一基因，包括以下步骤(a)鉴定出大肠杆菌(Escherichia Coli)中与侵入BMEC相关的结构为一种ibeA；(b)从大肠杆菌中提取和纯化的ibeA进行分析；和(c)确定ibeA的完整核酸序列。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种提供完整核酸序列的方法，进一步包括以下步骤(e)制备一种发生框架内缺失的ibeA的突变体；(f)将ibeA的框架内缺失突变体一种ibeA组合从而形成一种转化体；和(g)进行互补性分析以测试是否具备对BMEC的某种侵入能力。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它提供一种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌(probiotic)，该益生菌包括本身具有抑制性脑膜炎致病因子的活体微生物。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该脑膜炎致病因子包括GimA。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该脑膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli K1和B组链球菌(GBS)在内的一组微生物。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该脑膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli K1和B组链球菌(GBS)在内的一组微生物。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli菌素，GBS菌素，单核细胞增多性李斯特菌属(steria monocytogenes)，假单胞菌属(Pseudomonas species)，肺炎链球菌属(StreptococcusPueumoniae)，脑膜炎李瑟菌属(Neissria meningitides)，流感嗜血杆菌属(Haemophilus influenzae)，柠檬杆菌属(itronacterspecies)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌类，肠道病毒(enteroviruses)单纯疱疹病毒，和兔弓形虫(Toxoplasma gondii)寄生虫在内的一组微生物。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli菌素，GBS菌素，单核细胞增多性李斯特菌属(steria monocytogenes)，假单胞菌属(Pseudomonas species)，肺炎链球菌属(StreptococcusPueumoniae)，脑膜炎李瑟菌属(Neissria meningitides)，流感嗜血杆菌属(Haemophilus influenzae)，柠檬杆菌属(itronacterspecies)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌类，肠道病毒(enteroviruses)单纯疱疹病毒，和兔弓形虫(Toxoplasma gondii)寄生虫在内的一组微生物。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该活体微生物包括乳酸杆菌属(Lactobacillusspecies)，双叉杆菌属(Bifidobacterium species)，E.coli Nissle1917，和携带针对包括GimA在内的一或多个致病因子的抗原的Probiotic菌。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该活体微生物包括本身能抑制包括GimA在内的一或多种脑膜炎致病因子的酵母菌。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它包括一种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法，其包括施用一种具有疗效的益生菌制剂，以次来增进益生菌生物的有益作用，同时又对一种或多种脑膜炎致病因子产生抑制。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的脑膜炎致病因子是指GimA。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制剂选自一组寡糖，它们包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制剂选自一组寡糖，它们包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法中，该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制剂包括的细菌选自下列一组细菌Lactobacillus species，Bifidobacterium species，E.coli Nissle1917，和携带有针对包括GimA在内的一种或多种致病因子的抗原的Probiotic菌类。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中，该益生菌(Probiotic)制剂是非消化性的食物，这些食是通过促进有益细菌的生长或活性和抑制包括GimA在内的所说的脑膜炎致病因子来改善健康的。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它包括一种治疗由脑膜炎病原微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌(Probiotic)方法，其包括施用一种具有治疗效果的益生菌(Probiotic)制剂来增强益生菌(Probiotic)生物的有益作用，同时对一种或多种脑膜炎致病因子产生抑制。
本发明一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其优点和达到的功效是尽管抗微生物化疗取得进展，但与新生儿革兰氏阴性bacillary性脑膜炎相关的死亡率和发病率依然很高。因此，对细菌性脑膜炎发病过程和相关的细菌基因和细菌蛋白的进一步了解，有助于发展出针对这种疾病的新的治疗、预防和诊断工具，这有助减低死亡率和发病率。所以，本发明涉及一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，提供一种完整核酸序列的方法，对细菌性脑膜炎发病过程和相关的细菌基因和细菌蛋白的进一步了解，有助于发展出针对这种疾病的新的治疗、预防和诊断工具。
本发明涉及到调整E.coli菌，特别是E.coli的脑膜炎菌株的基因和蛋白质。并对ibeA基因簇(GimA)基因及由这些基因，特别是ibeA基因所编码的蛋白质的特征所进行的鉴定，和相同的基因组成以及利用这些基因组成，提供分离或纯化的核酸序列，序列编码ibeA基因簇中的基因，为由ibeA基因簇基因编码的蛋白质提供氨基酸，提供一种重组分子，而这种重组分子由一种载体和ibeA基因簇的一个或多个基因的全部或部分核酸序列，并生产有ibeA基因簇编码的重组蛋白质，提供诊断E.coli脑膜炎的方法，所以，提升我们对亲生物学及其在感染性疾病的管理，尤其是对新生儿细菌性脑膜炎管理方面的应用的理解，并提供疫苗和抗微生物制剂，以此来特异性攻击脑膜炎细菌但同时又能保护益生性微生物。
本发明也涉及一种细菌性脑膜炎的治疗发，特别是用益生菌/益生素方法和细菌通透性增强蛋白来治疗新生儿脑膜炎的方法。益生菌/益生素能通补充被抑制的非致病性细菌和抑制病原微生物的生长来增加正常微生物菌落，并提供一种筛选测定方法，用来评估候选制剂的治疗潜力，即评估该制剂是否能抑制IBEA蛋白诱导的细胞凋亡。
本发明的证据提示微生物对血脑屏障的穿透和进入中枢神经系统是多种微生物与BMEC-BBB的一种主要成分之间的特异性相互作用的结果，并查明了有几种大肠杆菌K1的效应物在细菌对BMEC的侵入中起作用。
本发明证明与父本菌株相比ibeA(10A-23)的突变型TnphoA在体外对BMEC及在血源性脑膜炎的新生大鼠模型中的侵入性均明显低下。由部分ibeA基因编码的一种小的重组蛋白片段(8.2kDa)能阻断大肠杆菌K1对人类BMEC的侵入。对ibeA基因特点的进一步坚定中，我们获得了多方面的证据来表明全长ibeA基因编码产物是一种5kDa的蛋白质，推断的蛋白质序列提示IbeA是一种含有三个跨膜区结构的潜在的膜结合蛋白。由此，本发明测定了完整的50kDa的IbeA重组蛋白更能有效地阻断大肠杆菌K1对BMEC的侵入，仅1μg的剂量就能达到相同的抑制程度，即IbeA的8.2kDa的片段代表了该蛋白与IbeAR相互作用的部分结合区，而IbeA的其他结构则需要用来完成细菌与BMEC之间优化的相互作用。相对已存技术曾证明IbeA的部分片段抑制大肠杆菌K1对BMEC的侵入，需要高剂量(50μg)才能达到大约80％的抑制效应。
本发明的数据进一步支持，ibeA是大肠杆菌侵入BMEC的一种主要的效应物，而这种侵入是脑膜丧性大肠杆菌致病的一个必要步骤。本发明的研究是要阐明ibeA位点在协助大肠杆菌侵入血脑屏障过程中的作用机制。
本发明的数据标明，在E44中，IbeA是诱导人的EC发生细胞凋亡的一个主要的凋亡诱导因子，但该因子的作用可被抗内毒素蛋白的BPI所抑制。在很多大脑疾病包括细菌性脑膜炎中，神经原的损伤和坏死均归因于细胞凋亡。因而用BPI这样的抗凋亡制剂来阻断IbeA对凋亡过程的诱导将会是预防和治疗新生儿大肠杆菌脑膜炎的一种新方法。
本发明涉及一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法的一种新方法，提供一种完整核酸序列的方法，对细菌性脑膜炎发病过程和相关的细菌基因和细菌蛋白的进一步了解，有助于发展出针对这种疾病的新的治疗、预防和诊断工具。
图1 表示大肠杆菌K1菌株中ibeA基因的完整核酸序列和推断的氨基酸序列。该蛋白质的全长片段的计算分子量为50-KDa。黑体标注的核酸序列包含潜在的核糖体结合部位(RBS)和-10及-35启动子区。N一端的前15个氨基酸残基(意大利字体)与分离的50-KDa蛋白质的N一端序列的衍生序列完全相同，这种分离的蛋白质为携带有ibeA基因(图2B中纵列)的E.coli BL21(DE3)菌种所表达产生。画有底线的部分为三个有争议的跨膜区域。黑体标注氨基酸序列表示前述ibeA的部分开放阅读框架(ORF)[Huang SH.et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。箭头分别指示ibeA中的TnphoA插入部分(nt 506和nt 507之间的垂直箭头)和ZD1的缺失(右向箭头，起始于nt 151；左向箭头，起始于nt 1455)。
图2 表示IbeA蛋白质在体外和体内的生物合成。在A组中，两个在E.coli T7S30提取测是系统中的两个体外相连的转录/翻译的产物在同一十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(10％的聚丙烯酰胺)中平行电泳。右边指出分子量标示物的大小。后面的模版被加到反应混合物中纵列1，是携有ibeA一个2.3kb位点的pFN23A；纵列2是Pfn476(载体)。一种50-Kda的蛋白质产生于pFN23A(纵列1)而不是在pFN476(纵列2)。在B组中，是在IPTG-诱导下，用载体pFN476转化的E.coli BL21(DE3)的总蛋白提取物的SDS-PAGE图谱(纵列1)，和用携有ibeA基因全部ORF衍生于pFN476的质粒pFN23A的总蛋白提取物的SDS-PAGE图谱(纵列2)蛋白质标准品的混合物(低分子标示物)走胶于纵列3，其分子量数值(用Kda)已被标示出。纵列1(图2A)和纵列2(图2B)中多出的蛋白条带可能来源于IbA蛋白质过分表达时产生的残缺蛋白。
图3 表示IbA蛋白的表达和纯化。A组中，显示了用IPTG诱导，用载体Pff28a(t)转化的E.coli BL21(DE3)的总蛋白抽提物的SDS-PAGE(10％pOlyacrylamide)图谱(纵列1)，和用携有ibeA基因(1.7kb)完整ORF的，由pET28a(t)衍生而来的质粒pET12A转化的E.coli BL21(DE3)的可溶性蛋白质(纵列2)和不可溶蛋白质(纵列3)的SDS-PAGE图谱。标准蛋白混合物(低分子标示物)走胶于纵列4，其分子量用Kda标出。可溶性(纵列2)和非可溶(纵列3)部分的不同方式的蛋白分离区带中，显示一种53-Kda的蛋白质显著存在于包含体中(纵列3)，在B组中可以看出，一种在N-端带有组胺酸标记的53-Kda的重组IbeA蛋白质在1PTG诱导后表达于PET17A的BL21(DE3)菌株中，这种蛋白质经由Ni-NTA琼脂糖凝胶茶和柱纯化，然后按材料和方法里叙述的序列分析法再折叠。这些蛋白质经SDS-Polyacrylamide凝胶分离，后经柯玛氏亮兰染色。纵列1纯化和再折叠的IbeA；纵列2分子量标示物。
图4 表示亲和纯化和再折叠的IbeA蛋白质对E.coli K1侵入BMEC的抑制。人类BMEC单层伸展培养时加入BSA(对照)(μg/well)，或IbeA蛋白质(μg/well)，37℃，1小时后，再加入细菌。侵入测定按实例中材料和方法中叙述的方法进行。每一测定值代表至少4次三复管实验的平均值，误差柱表示标准误差。
图5 表示E44非侵入性突变体菌株与PUC23A和含有ibeA位点的PUC1030的互补性。E.coli E44是表达IbeA的RS218的一种自发的rifampin-抗体突变竹。10A-23和ZD1分别为TnphoA插入和isogenic缺失性突变株，其ibeA均衍生自E44。侵入性测定按实例中材料和方法中叙述的方法进行。图中显示突变株相较于亲代株E44的相对侵入性。也显示出TnphoA突变株10A-23(A)和ibeA的等基因缺失突变株(B)之间的互补性。结果为4次不同实验的平均数；短柱代表标准误差(SD)。
图6 显示了涵盖20.3kb gimA的重叠DNA克隆和通过引物行走(Primer-Walking)方法来进行的DNA测序结果。通过筛选Lanbda GEM-12/RS218基因组DNA文库(A10-8和A10-30)和PCR克隆方法，鉴定出3个重叠的克隆。图中表示A10-8和A10-3两者之间ibeA的共同区域，以及L7和A10-8之间的重叠区域。30TT(a-f)，30TT(1-3)，8T3(a-c)8T3(1-6)，10A5-(2-11)，10A3-(1-7)，和L7SP1表示用来进行DNA序列分析的引物。
图7 显示了遗传岛gimA的相关遗传位点和操纵子结构。开放的长方形表示GimA的ORFS及其在E.coli K12基因中的定位。转录方向用箭头朝向来表示。该GimA由4个Operous构成(GimA 1，2，3，4)。
图8 通过序列比较来展示ORF注解。在E.coli K-1菌株RS218中15个由遗传岛GimA编码的ORFs中有13个ORFs显示出与E.coli K-12菌株的相应的共生同源性体有明显的序列同源性。
图9 表示基于与ClustalW的多种组合而产生的GimA的12种基因产物的系谱树。
ECOK1E.coli K1株；ECOK12aE.coli K12株；ECOK12bE.coli K12株；ECOK12cE.coli K12株；CORGLBACSUMYCTUHAEIMHaemophilusinfluenzae；SYNY3AISCMAVLMYCLALCEURalstonia eutropha；CAEELCaenorhabditis elegans；DROMEDrosophila melanoguster；STRCOStreptomyces coelicolor；TRYBBVIBPAPAEPUBACIPSEPUBACIPSEUCITFRPICPAPichia pastoris；SCHPOSchizosaccharomyces Pambe；PICANPichia angusta；PSEAECBK12GARK12RHOCARhodobacter capsalatus；SALTYLACSKLISMOSTAAUMYCPNMCYGELYCEXANCPXanthomohascampestris PV.Campestris。
图10 表示Na(+)H(+)反向转运体的4种序列的多种组合，如同在CLUSTALW和DIALIGN中见到的情况。在序列中有高于52％的相同或相似残基分别用黑色和阴影背景画出。按从、上排至下排顺序，序列名称分别为来自E.coli K-1(ECOK1)的IbgT；来自H.influenzae(HAEIN)(Q57007)的Na(+)H(+)反向转运体来自B.firmas(BACF1)(P27611)和B.subtilis(BACSU)(P54571)的Na(+)H(+)反向转运体。
图11A-11D(即序列表)表示ibeA基因簇的核酸序列。其中各种基因的起始位点在表4的第4栏中给出。例如PptE的起始位点是在其互补链上的第1694位点。由gimA1和gimA！操纵子编码的蛋白质是由图11A-D上核酸序列的一条互补核酸序列编码的。
图12表示的氨基酸序列是下列基因的产物，分别为PgdK(GimA1)；PptE(GimA1)；PmpT(GimA1)；PdaK(GimA1)；CgrD(GimA2)；CgrD GimA2)；gxT(GimA2)；CdlD(GimA2)；Cnit(GimA2)；GcxK(GimA2)；GcxR(GimA3)；GclA(GimA3)；GhyI(GimA3)；IbgR(GimA4)；IbgT(GimA4)。
图13 表示IbeA蛋白对细胞凋亡的诱导(右上格)及细菌通透性增强蛋白(BPI)对这种诱导活性的抑制(右下格，IbeA与BPI之间的比率为1∶1)。左上格表示内皮细胞孵育中同时加有BSA和IbeB蛋白。左下格表示在内皮细胞孵育仅单独加有BPI。
具体实施例方式
“核酸序列”一词在本发明中用来表示脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，也表示cDNA。这里所说的基本同源是指IbeA基因簇中某些核酸的基因序列之间基本上是相符合的(图1；图11)。基本上同源是指大约30％至100％的同源，优先为大约60至67到100％的同源。更优先为大约80-100％的同源性，这种同源性是指某一IbeA基因簇序列和另一任何一种其他种类核酸序列之间的同源。另外，本文也用基本同源来表示IBEA基因簇的某一氨基酸序列(图1和图11所示)和另一种其他类型的氨基酸序列之间的基本相符。
“调整(modulation)”用来表示某种基因转录或蛋白质表达，或蛋白质活性的增加或减少。
“可特异性杂交”一词用来表示互补或精确配对的充分程度，即是否能在某种核酸序列和目标DNA或RNA之间发生稳定和特异的结合。从文献中已了解到要获得特异的杂交并不需要某一核酸序列与目标核酸序列之间要达到100％的互补。
“相应于(corresponds to)”一词用来表示与设定序列之间的同源和基本相同或功能上的相同性。
本发明提供ibeA基因簇基因的核酸序列(图1；图11)，这些序列编码15种蛋白质(图2，图12)，这些蛋白质可调整脑膜炎性E.coli的毒性及由此产生的致病力，如在新生儿中发生的细菌性脑膜炎。例如，IbeA基因可调整脑膜炎性E.coli穿越血脑屏障(BBB)的能力，并诱生细胞调亡。图1和图11(表4)中所示的IbeA基因簇的核酸序列代表本发明优选的具体实施例范。然而，对于本技术领域的熟练人员来说，这一点是可以理解的，即由于图1和图11所示的基因序列的遗传编码变异中的简并仍将导致一种DNA序列，该序列有可能编码相应于那种基因序列的IBEA蛋白质。这种DNA序列因而在功能上相同于图1和图11中提出的序列，因而来发明有意将其包含在其中。另外，在本技术领域的熟练人员也将理解，将会有自然发生的等位基因变异会出现在图1和图11显示的某一特定种类的核酸序列中，因而这些变异也将为本发明有意包含在内。
本发明进一步包括在功能上与本发明的IbeA的操纵下蛋白或基因簇蛋白基因相同的蛋白质或多肽或它们的类似物。这些蛋白质或多肽包括但不限于一种蛋白质的片段，或某一种蛋白质的替换添加或缺失突变体。本发明也包括那些与IbeA基因簇产生的任何一种蛋白质基本同源的蛋白质或肽类。基本同源是指本发明的任何一种蛋白质与其他任何一种氨基酸序列或蛋白质或肽类之间70～100％的同源，优选80～100％的同源，最优选90～100％的同源。
“类似物(analog)”一词包括与本文特别显示(图1和12)的任何一种氨基酸序列相比其氨基酸残基基因相同的多肽，在这种多肽中，其一种或多个残基已被一种功能上相似的残基进行了保守性地替换，同时这种多肽也展现了本文描述的任何一种蛋白质的功能。保守性替换的例证包括一个非极性(疏水性)残基的替换，如异亮、缬亮或蛋氨酸被另一个非极性残基和极性(亲水性)残基之间的替换，如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酸和天冬氨酸之间，甘氨酸和绿氨酸之间，一种碱性残基的替换，如赖、精或组氨酸被其他残基替换，或一种酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸被其他残基所替换。
词组“保守性替换”也包括用一种化学派生的残基赖替一种非派生性残基。“化学派生”表示已主体多肽含有一个或多个化学派生性残基，这种化学派生是通过一种旁侧功能团反应赖进行的。例如这种派生分子包括这样的分子，即在这些分子中，自由胺基功能团被诱导行程盐酸胺，对一甲苯磺酰基(p-toluene sulfonyl groups)碳苯甲酰基(carbobenzoxy groups)，t-butyloxy carboxyl groups，氯化乙酰基(chloroacetyl groups)或甲酰基(formylgroups)，自由羧基(carboxyl groups)可能被诱导行程盐类，甲基(methyl)和乙醚，或其他类型的醚类(esters)或酰？类(hydrazides)。自由化氢氧基可被诱生成氧-酰基(O-acyl)或氧-烷基(O-alkyl)衍生物。组氨酸的咪唑氮(imidazole nitrogen)有可能被诱导形成氮-咪唑-苯甲基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。其他化学派生物也包括那些含有一个或多个在20个标准氨基酸基础上自然发生氨基酸派生的蛋白质或肽类。例如4-羟脯氨酸有可能用来替换脯氨酸，5-羟脯氨酸有可能取代赖氨酸；3-甲基组氨酸有可能取代组氨酸；α-氨基-Y-羟丁酸(homoserine)可能取代绿氨酸；另外鸟氨酸可能取代赖氨酸。本发明的蛋白质或多肽也包括任何蛋白质和多肽，只要这种蛋白质和多肽含有一个或多个添加和/或缺失或残基与IbeA基因簇的某一核酸序列编码的一种序列相关。
本发明也提供了一种重组分子，该重组分子的组成一个或多个核酸序列(图1和图11)的全部或部分及一个载体。表达载体和制备表达载体的方法已可通过文献广泛被了解，适合本发明采用的表达载体至少包含一个与核酸序列可操控性连接的表达控制元件。该表达控制原件被插入到载体中，以便能控制和调节核酸序列的表达。可被熟悉该技术的人员所理解的是，获得正确的重组或获得优选的表达控制原件将取决于所选择的宿主体统。
可被进一步理解的是，表达载体应该含有额外的原件，而这些多出的原件对于含有核酸序列的表达载体在宿主中的转染和随后的复制是必要的。例如这些原件包括但并不限于复制起点和选择用标志物。对该技术熟悉的人员也会建议部理解这种载体可以采用传统方法(見Ausubel et al，(1987)于Current Protocols in Molecular Biology”一书，John Wiley and Sons，New York，N.Y.)中介绍的常规方法赖容易地构建而成，或已知商业方法。
本发明另一方面也设计重组表达载体导入的某种宿主体或细胞。有可能被采用的宿主细胞的实例包括但并不限于真核细胞，例如动物(内皮细胞、上皮细胞)、植物、昆虫和酵母细胞，及原核细胞如大肠杆菌。将携有基因的载体有可能导入细胞的方法包括但不仅限于微量注射，电穿孔，转导或利用DEAE-葡聚核，Iipofection，磷酸钙或为本专业熟练人员在Sambrook et al，(1989)于”Molecular Cloning.A Laboratory Manual”(Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.)一书的专述中所了解到的其他方法。在某种优选的实际应用中，在真核细胞中有限的真核细胞表达载体被采用。这种载体的例子包括但并不局限于逆病毒载体，牛痘病毒载体，胰病毒载体，疱疹病毒载体，禽痘病毒载体，细菌表达载体，质粒或杆状病毒转染载体。优选的载体包括但并不限于pET28a核pCMV-HA。优选的真核细胞株包括但并不限于内皮或上皮细胞。
进一步的具体实用中，有宿主细胞表达的重组蛋白可通过粗制水解方法获得，或能通过文献中了解的标准蛋白纯化步骤加以纯化，这些步骤中包括差别性沉淀，分子筛层折，离子交换层析，等电聚焦，凝胶电泳，亲和或免疫亲和层析等等[Ausubel et al(1987)见”Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。当进行免疫亲和层析时，重组蛋白的纯化有可能要通过一种结合有针对本发明蛋白的特异抗体的树脂柱来进行[Ausubel et al(1987)见”Current Protocols in Molecular Biology”，John Wileyand Sons，New York，N.Y.]。
本发明的核酸序列或其部分序列可作为探针来检测IbeA基因簇的任何一种基因，或检测例如生物样品中的任何一种基因产物(如信使核糖核酸(mRNAs))。从生物样品中分离核酸可按标准方法进行[Ausubel et al(1987)见”Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。检测则可按不同的常规方法学中的标准方法来进行，这包括当并不限于Northern Blot分析，PCR等[Ausubel et al(1987)见”Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。本发明的探针是为进行检测而优选标记和提供，标记的实例包括当并不限于放射性标记，荧光标记，光化学标记[Ausubel et al(1987)见”Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，New York，N.Y.]。在一个优选的具体实施中一种生物样品被用来检测其中是否存在IbeA或IbeB基因或其基因产物，本发明的核酸序列(图1和图11)也可用作探针来检测其他物种的同源性。
本发明的核酸序列或其部分序列对于脑膜炎性大肠杆菌特别是新生儿脑膜炎性大肠杆菌的诊断检测是有用的。这种诊断性检测按上述方法进行，即从生物样品中检测核酸序列，这种被检测的核酸序列与本发明的核酸序列是互补性的。例如在一种生物样品中，该诊断检测方法可能由本发明的一系列核酸附着到一种支持物(例如半点印迹到尼龙杂交膜，参见Sambrook et al.)上，这种支持物再与从生物样品尼龙中分离出的核酸相接触。该诊断检测的一个优选实例体现在用本发明的核酸构成一种微阵列(microarray)。
本发明的核酸序列可被用作微阵列的探针，构成微阵列的表面固相，即将本发明的一系列核酸固定到微阵列的表面。微阵列可通过多种方式制备产生。儿探针可被连接到固定支持物或膜表面，这种支持物或其表面可用不同物质来制成，例如玻璃，塑料(如聚丙烯、尼龙)，聚丙烯？胺，硝酸纤维素或其他物品将核酸连接到固相表面的方法包括当并不限于在玻璃板上印刷(Schena et al，1995 Science 270467-470；DeRisi et al，1996，NatureGenetics 14457-460；Shalon et al，1995，Proc Natl，Acad，Sci，U.S.A.9310539-11286)；或喷墨打印机；或寡核苷酸合成(美国专利申请号09/1008,120，申请日1998年1月16日)。
上述微阵列也可能是寡核苷酸的高密度阵列。已知的技术在用来制备这样列阵时包含由上千中寡核苷酸，这些寡核苷酸与一确定的序列互补(见Fodor et al，1991，Science 251767-773；Pease et al，1994，Proc Natl，Acad，Sci.U.S.A.915022-502b；Lockhart et al.，1996，Nature Bietechnology 141675；U.S.Pat.Nos.5,578,832；5,556,752；和5,510,270；Blanchard et al.，Biosensors &Bioelectronics 11687-690)。其他制备微阵列的方法也可能被采用(Maskosand Soathern，1992，Nuc.Acids.Res.201679-1684；美国专利6136592；WO200054883；WO 200055363；WO 200053812；WO 200014273)。该微阵列可被用作生物芯片、多孔或其他装置，或被整合进生物芯片，多孔或其他装置。
本发明优选的微阵列除采用本发明的一种或多种接酸外，还包括用作对照的非脑膜炎性大肠杆菌菌株的核酸。一个优选的实例是在微阵列中包含了全部的IbeA基因簇。
熟悉本技术的人员将会了解到杂交和洗脱条件要进行选择，由此本发明分析的核酸序列(如从生物样品中分离的核酸)才能“特异性结合”或“特异性杂交”到核酸序列列阵中。优化的杂交条件将取决于探针的长度(例如寡聚体与多达200个碱基的多聚核苷酸)核类型(如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)及靶向核酸。核酸的特异(即严格的)杂交条件的常规参数已有人加以描述(Sambrook et al.，(Supra)；Ausubel et al.，1987，Current Protocols in Molecolar Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。
可被用于上述检测方法的生物样品的案例包括，但并不限于脑脊髓液，血液，尿液，活检标本，病理标本，和尸检标本。本发明的核酸序列(图1和图11)液能用来分析其他物种的同源性。
本发明进一步包括与IBEA蛋白活其多肽或其一部分发生反应的一种或多种抗体。本发明的一个具体实例是这些抗体是起源于单克隆或多克隆的抗体，可通过常规方法来制备(Kohler and Milstein(1975)Nature 256 495-497，Campell“Monoclonal Autibody Technology，the Production and Characterization ofRodent and Human Hybridomas”in Burdon et al<eds.>(1985)“LaloratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology.”Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam；PCT Patent opplications Pullication number WO 901443，WO 901443 and WO 9014424 and in Huse et al.，(1989)Science 2461275-1281)。用来产生抗体的蛋白质或其一部分可从脑膜炎性大肠杆菌K1菌株中分离出，也可重组性制备，或化学合成(Merrifield，R B(1963)J.Amer.soc.852149)。假如选用来制备抗体的蛋白片段太短而缺乏抗原性，可将该片段连接到载体分子上以便增强肽片段的抗原性。载体分子的例子包括但不限于人白大奶，牛白蛋白和钥孔虫戚血羊素(”Basic and ClinicalImmunology”(1991)Stites，D.P.and Terr A.I.(eds)Appleton and Lange，Nor WalkConn.，San Mateo；Calif)。
本发明的抗体也可用于免疫测定以便能检测省去样品中的新的蛋白质。可能采用的免疫测定方法暴客但不限于放射免疫测定，Western Blot测定，免疫组化测定，免疫荧光测定，酶联免疫测定，化学发光测定，等(In“Principles and Practice of Immunoassay”(1991)Christopher P.Price and David J.Neoman(eds)，Stocktom Press，New York，N.Y.；Ausubel et al.，(eds)(1987)in“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons，New York，N.Y.)。适用于这些检测方法的生物样品包括但不限于血液样品，脑脊髓液，尿样，活检标本，病理标本，尸检标本。蛋白质可按常规方法(见Ausubel etal.，(eds)(1987)in“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons，NewYork，N.Y.)。从生物样品中分离提取。
本发明的蛋白或其部分片段可能被用于制成疫苗。该疫苗首先用作任何一种细菌性脑膜炎的临床指征，或在感染期用于增强兵刃自身针对携带致病性蛋白的脑膜炎病原体而不是益生性细菌的免疫反应。
作为一种免疫原，该疫苗可包括本发明的一种或多种蛋白质或其部分片段。疫苗的应用可按创规方法进行。例如，免疫原可用于一种适合的稀释液如盐水或水，或完全佐剂，或不完全的佐剂。此外，免疫原可以或者也不必与一种载体结合从而成为免疫原性蛋白。这些载体分子的例证包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)，钥孔嘁血兰素(KLH)，破伤风类酶素(tetanus toxoid)，等。这些免疫原也可与脂蛋白偶联或制成脂质体形成或与佐剂相联。这些免疫原的实施可通过任一适宜的途径进行，例如经由静脉，腹腔，肌肉内，皮下等。该免疫原可一次施用或周期性间隔施用，直到抗-GIMA的免疫细胞或抗体的效价显著产生时为止。此外，本发明的表达载体也可能被用来制作疫苗。例如一种包含GimA及ibeA基因的全部或部分基因序列的表达载体，其表达的蛋白质已表明是具有棉衣原性的致病因子。该GimA基因能被克隆进一种质粒载体例如pVR1020(Vical，Inc.，SanDiego，Calif)该疫苗可用小鼠这样的动物模型来加以测试。这种DNA疫苗能通过皮内接种导入小鼠，并可通过酶联免疫吸附测定来检测免疫小鼠血清中的抗体效价。被诱导产生的抗体也可通过GimA及ibeA蛋白质免疫印迹来测定。在完成了初次免疫和间隔2周的多次加强免疫后，就可在大肠杆菌脑膜炎的新生小鼠模型中测试免疫菌的保护性。
本发明的抗体亦可作为一种抗脑膜炎性细菌的制剂用于某一研究对象。优选将这种抗体的使用过程作出这样的设计，从而降低该抗体在使用过程产生的针对其自身的逆免疫反应。(如嵌合抗体，具有人类属性的抗体；Robinson et al.，International Patent Application 148，187；Taniguchi.M.，Eurpoean Patent Application 171，496；Morrison et al.，European Patent Application173，494；Neuberger et al.，PCT Application WO 86/01533；Cabilly et al.，1987 PNASUSA 843439；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47999；Wood et al.，1985 Nature314446；shaw et al.，1988 J.Natl Cancer Inst.8015553；Morrison S.，1985 Science2291202 and Oi et al.，1986 BioTechnigues 42147)。
尽管采用纯化或基本纯化的方法来施用上述疫苗或抗体是可能的，但还是优选采用药物学特性的制剂、配方或制备物。为适宜用于兽医和人类，本发明的配方同时含有本发明的一种或多种疫苗或抗体及一种或多种药物学上可接受的载体和选择性地采用其他活化剂(如，添加抗原以便形成多价疫苗，抗生素，细菌通透性增强蛋白(BPI)等或治疗性成分。这些载体必须是可接受的，即在与本配方的其他成分的相容性方面讲是“可被接受的”，同时对于接受者来说的无害的。载体的特性将取决于实施途径。这种制剂也可能含有其他额外的载体；稀释剂；填充物；盐类；缓冲剂；稳定剂；溶解剂及其他在文献中了解到的物质。配方的制备可按药物学文献中普遍了解的任一方法来进行。
设计到配方时，溶液将被采用一种与剂量配方，有效剂量和不同剂型相适应的方式。例如，本发明的一种有效浓度的制剂，可能用于口服，外服，眼睛内，非肠道的，鼻腔内，静脉内，肌肉内，皮下，皮内；或任何其他有效的途径。这些独特的水溶液特别适用于静脉内，肌肉内，皮下，腹腔，口服，脑腔内，，脑脊髓液，胸腔内，眼睛，或外服(皮肤抹液)。对于配方来说，溶液将被采用一种与剂量配方、有效剂量和多种不同剂型相适应的方式。
本发明也涉及一种细菌性脑膜炎的治疗发，特别是用益生菌/益生素方法和细菌通透性增强蛋白(BPI)来治疗新生儿脑膜炎的方法。益生菌/益生素(probiotics/prebiotics)能通补充被抑制的非致病性细菌和抑制病原微生物的生长来增加正常微生物菌落。例如干酪乳酸杆菌(Lactobacillas Casei GG(LGG))被用于多种婴幼儿肠道紊乱，包括腹泻，养料吸收障碍(malabsorption)和艰难梭菌性结肠炎(Clostridium difficile colitis)[Matter，A.F.et al.，(2002)，pediater Sura Iut.18586-90]的治疗。有建议指出母乳能增加胃肠道内双叉杆菌(Bifidobacterium)，由此，相对于配方食品喂养来讲，母乳喂养对婴儿的健康更为有利。益生性细菌(Probiotic bacteria)如乳酸杆菌素(Lactobacillus)，双叉杆菌素(Bifidobacterium)和多形拟杆菌素(Bacteroidesthetaiotaomicron)可能会抑制脑膜炎病原菌的生长。益生菌方法治疗可用脑膜炎大肠杆菌的新生鼠模型来进行测试。BPI能与内毒素高亲和性结合(见实例13所示)并阻断IbeA诱导的细胞凋亡。用BPI来进行的治疗可首先用脑膜炎大肠杆菌的新生鼠模型来进行测试。人类临床实验的剂量基于BPI逐渐加量的临床试验来决定。本专业的熟练人员将知道剂量的选择需要因人而异，以便对某一施用主体达到最大效应。这些熟练人员也会进一步理解剂量的采用对一个正在进行治疗的个体来讲也会依据该个体的年龄，感染的严重程度或阶段，及对此治疗过程的发扬而有所变化。这些熟练技术人员也会知道通过本文陈述的方法来评估临床参数，从而为正接受治疗的主体决定适宜的剂量。这种剂量将可由医生决定有必要施用的次数和时段。
本发明也涉及一种筛选测定方法，该方法用来评估候选制剂的治疗潜力，即评估该制剂是否能抑制IBEA蛋白诱导的细胞凋亡。在实例中，一种候选制剂的治疗潜力可通过实例13叙述的方法来紧张测定。多种不同的细胞(例如内皮或上皮细胞)。适用于本主体申请的测定方法的候选制剂可以是例如来源于化学、营养或生物成分的任何类型的分子。这些候选制剂可能包括多种不同的化学分类物质，尽管典型的化学物质是有机化学分子，然而优选的则是小分子有机化合物，而这些化合物的分子量介于50-2,500道尔顿(Daltons)之间。这些分子可能包含某些功能基因，而这些功能团是与蛋白或核酸发生结构上的相互作用所必要的。在实例中，化学制剂可能是新的，未经过试验的化合物，类似物，拮抗物，或已知治疗制剂的改型剂。
上述制剂也可以从生物分子中找到，这些分子包括，但不限于肽类，多糖类，脂肪酸，抗体，类固醇，嘌呤，嘧啶，与毒素偶联的细胞因子，以及这些分子的衍生物或结构类似物；或人工制剂的与一种生物反应修饰因子的功能相仿的分子。营养物来源的该类制剂的例子包括，但不限于植物或动物的提取物，或这些提取物的提取物。制剂也包括反义寡核苷酸，包括反义肽段的核酸(Good et al.，(2001)Nature Biotechology 19360)。
上述制剂可获得很多种来源包括人工合成或天然化合物文库。此外，以细菌，真菌，植物和动物提取物形式存在的天然化合物文库已可获得或容易产生，天然或人工合成产生的文库或化合物也容易通过常规化学、物理和生物方法来加以修饰，并可能用来产生组合性文库。已知的药物学制剂有可能被用来加以随机的或指定的化学修饰，如酰基化，烷基化，脂化，酰胺化等，由此生成结构类似物。
也提供了进行本发明测定的试剂盒(如诊断测定)。这些试剂盒包括本发明的微阵列。这种微阵列可能被体现为一种生物芯片或多孔构造或任一其他形式的构造。这些试剂盒进一步可能包括一个或多个添加剂，例如缓冲剂，引物，酶，标记物等，以便于进行检测。这些试剂盒进一步有可能包括或被共同包装于一种仪器，以便于检测的实施或分析。这种仪器可能是一种抽吸器，注射器，加样器，镊子，量匙，眼滴管或任何一种在医学上被认可的输送器。本发明的试剂盒也包括一张说明书，该说明书明确解释了反义寡核苷酸的使用方法。本发明的试剂盒内将典型地包括一种装置，该装置，例如注射或吹气成型的塑料容器，能紧密填装理想的试管以便市售。其他仪器包括能进行阅读或监控反应的装置。
本文参阅的所有书籍、文献和专利已标示于参阅引述处。以下应用实例将说明本发明的不同方面，但这绝不是有意要将本发明局限于这些范围之内。
实施例1-6为了查明大肠杆菌涉及侵入大脑微血管内皮细胞(BMEC)的结构成分，先前曾采用转座子TnphoA的突变发生来生产一组非侵入性的突变株。有4个非侵入性突变体10A-23，TA-33；23A-20和27A-6均各自含有一个单独的TnphoA插入片段分别位于ibeA，ibeB，yijP和aslP，而这4个菌株对体外单层培养的大脑微细血管内皮细胞的侵入性显著降低，对hematogenous脑膜炎性大肠杆菌的新生大鼠模型的侵入性也明显降低(Hoffman JA，et al.，InfectImmun(2000)685062-7；Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5，HnangSH et al，Infect Immun(1999)；672103-9，Wang Y et al，Infect Immun(1999)；6674751-6)。
IbeA(ibe10)基因的部分内部序列编码一朝8.2-kDa的蛋白区域，通过PCR技术将该部分序列已被克隆，该克隆编码产生的重组蛋白能抑制大肠杆菌K1菌株(如C5和RS218)对单层培养的BEMC的其如。IbeA基因普遍发现存在于脑脊髓液(CSF)中分离到的大肠杆菌K12(如DH5α和HB101)的实验室菌株及非侵入性大肠杆菌株K1(如E412)则缺乏ibeA[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5；Bingen E，et al，J Infect Dis(1998)；177642-50；Bonacorsi Sp，et al，Infect Immun(2000)；682096-101]。此外，我们已在BMEC的便帽鉴定到一种约为55-kDa的受提蛋白(IbeAR)，该受体蛋白能与大肠杆菌的侵入性蛋白IbeA发生相互作用，对该受体蛋白的鉴定是采用IbeA-Ni-琼脂糖和层析方法进行的[Prasadarao NV，et al，Infect Immun(1999)；671131-8]，提示IbeA参与大肠杆菌K1株侵入BEMC的过程是通过配体-受体相互作用进行的。
为评估IbeA介导的侵入在穿越血脑屏障中的重要性，应该测试ibeA的全长基因和其等基因突变体编码的侵入性蛋白的生物活性。在这种工作中，我们进一步通过染色体基因的置换，互补，体外翻译和体内蛋白表达方法对ibeA基因及其侵入性蛋白质的特性作了鉴定。
实施例1-6的材料和方法菌株，质粒和培养基菌株，质粒载体，及它们的相关特性在表1中述及。本研究采用的突变株衍生自E44，一种自发的利福平抗性突变株，起源于脑脊髓液中的K1囊状大肠杆菌RS218(018K1H7)，该菌株的特性已被鉴定[Kim，KS，et al，J CIM Invest(1992)；90897-905；Huang SH，et al，InfectImmun(1995)；634470-5，Silver RP，et al，Infect Immun(1980)；29”200-6].DH5α被用来作为宿主菌株，用于亚克隆和质粒制备，以便于DNA序列的确定。BL21(DE3)携有T7 RNA聚合酶基因，因而被用作IbeA蛋白表达的宿主菌。SM10(λpir)和DH5α(λpir)被用来制备ibeA的等基因突变株[Donnenberg MS，et al，Infect Immun(1990)，581565-71；Donnenberg MS，et al，Infect Immun(1991)，594310-7]。将含有质粒的菌株培养于37℃的L broth(肉汤)(每升含有10克tryptone(胰冻)，5克氯化纳(NaCl)和5克酵母粉(yeast extract)，L broth中还含有氨苄青霉素(ampicillin)(100μg/ml)，卡那霉素(Kanamycin)(50μg/ml)和利福平(rifampin)(100μg/ml)，以用作质粒或菌株的阳性选择(见表1)。细菌培养于L broth，并在-70℃中冻存于加有20％在甘油(glycerol)的L broth中。
化学物品和酶限制性内切酶，T4 DNA连接酶，和其他酶类均购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs，Beverly，MA)，除非另有说明。化学物品均购自西格玛公司(Sigma，St.Louis，Mo)。所有同位素均获自新英格兰原子能公司(New England Nuclear Corp.，Boston，MA)。用于制备DNA测序胶的试剂均为超纯品质，均来自国立诊断品公司(National Diagnostics，Atlanta，GA)。用于DNA测序反应中与测序酶一起采用的试剂和其他化学品均购联邦生化公司(United States Biochemical Corp.，Cleveland，OH)。DNA测序试剂盒及染料终止剂均获自PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystem，Foster City，CA)。
质粒的提取，处理和亚克隆所有遗传物质的操作均按标准方法进行[Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T，Molecular cloninga laboratory manual，2nded.Cold Spring Harbor，New York；Cold Spring Harbor Laboratory Press，19891.1-18.57]。质粒DNA的提取采用一种Plasmid Mini Kit C Qiagen Inc.，Chatsuorth，CA)。DNA片段的纯化和琼脂糖凝胶采用Geneclean来进行(Biolol，La Jolla，CA)。大肠杆菌的反应潜能细胞在10％的甘油中制备，然后按前述电穿孔方法进行转化[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；672103-9]。
侵入活性的测定侵入活性的测定按前述方法在人类BMEC中进行[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5，Huang SH，et al，Infect Immun(1999)；672103-9；Kim KS，et al，Subcell Biochem(2000)；3347-59；Stins MF，et al，Am J Pathol，(1994)；1451228-36；Stins MF，et al，J Neuroimmunol(1997)；7681-90]。大约107细菌加入到BMEC的汇合单层细胞中，感染复数为100。侵入百分率的计算公式为100×(细胞中细菌的回收数)/(细菌的接种数)。结果表示为相对侵入性(相对于亲本大肠杆菌K1株的侵入性的百分比率)。
大肠杆菌RS218基因组文库的构建和筛选按前述方法从大肠杆菌K1菌株中纯化出高分子量的染色体DNA[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]。用Sau3Al(NEW Englang Birlabs，Beverly，MA)将基因组DNA做部分消化(15-23kb)然后用dGTP和dATP做部分添加。突种在5’端突出的悬挂部分(5’-GA-3’)被连接到LambdaGEMTM-12臂的相容性Xhol半位是(5’-TC-3’)上。Lambdu噬菌体的连接和包装按厂家说明书进行(PromeguMadison，WI)。大肠杆菌的基因组难用DNA杂交方法来筛选[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]，从而鉴定出含有ibeA的噬菌体克隆。含于pCIB10B的一种0.58-kb号的ibeA DNA后段[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]在EcoRI作用下释放出来，经制备性琼脂糖凝胶电泳和Geneclean(Biolol，Lo Jolla，CA)方法纯化，再用寡核荷酸标记试剂盒将[α32P]dCTP对其标记(Pharmacia，Peapack，NJ)，即可用作筛选探针(＞1×108cpm/μg)。噬菌斑被复制到尼龙滤膜上，紫外光连接和杂交均按前述方法进行[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5；Huang etal，DNA Cell Biol(1994)；13461-71]。噬菌体与探针的杂交通过放射自显影来鉴定，然后被纯化。
体外转录和翻译为了确定ibeA ORF的长度，用含有ibeA基因的DNA片段在体外进行转录和翻译，实验中采用了大肠杆菌T7S30提取物测定系统，按厂家说明书进行操作(Promega，Madison，WI)。反应在50μl的反应混合物中进行，反应中要补充20μCi的[35S]蛋氨酸，和2μg的纯化pFN476或重组的pFN23A，在30℃反应2小时，取5μl含有35S-标记蛋白的反应液体作10％SDS-分析，待胶干燥后在Kodak X-Omat胶片上显影过夜。
体内蛋白表达和胺基端测序将含有ibeA的2.3kb的Sphl DNA片段克隆和表达于一种低拷贝数的质粒载体pFN476上，该载体已成功用于十多种大肠杆菌K12的染色体基因克隆的表达分析，以制作出一种明确的表达图谱[21]。重组质粒pFN23A及其载体(pFN47b)被用来转化一种大肠杆菌株BL21(DE3)，后者含有一种整体的T7 RNA聚合酶基因。这种载体中的大肠杆菌基因能优先利用其T7启动子来进行表达[Studier FW，et al，methodsEnzymol(1990)；18560-89]。为排除染色体基因的表达，利福平被用来阻断大肠杆菌聚合酶的作用，然后加入IPTG。全部蛋白质被用来进行10％ SDS-PAGE分析。待蛋白被电泳分离后，转移到PVDF膜上。用pFN23A转化后过度表达的50kDa蛋白相应的区带剪下后作胺基端氨基酸序列的分析。
DNA测序和分析ibeA的完整核酸序列的测定采用Sanger等人的双脱氧终端法进行[Sanger F，et al，PNAS USA(1977)；745463-7]，同时采用了Sequenase Version 2.0Kit，该试剂盒购自U.S.Biochemicals Corp(Cleveland，OH)，及购自Du Pont NEN Research Products(Boston，MA)。采用primer-walking技术来分析部分ibeA基因的旁侧DNA的序列。DNA的两条链均重复测序，采用荧光标记核苷酸进行全动测序(373A ABI自动测序仪)，以确保测序的准确性，而序列测定数据则经由威斯康辛大学遗传学计算机小组研发的DNA分析程式来进行分析。DNA和推断的蛋白质序列被用来搜寻国立生物技术倍息中心的DNA和蛋白质数据[国立医学图书馆，(National Library ofMedicine)，Washiagton，D.C.]，进行此项工作时采用了BLAST规则系统(algorithm)。
等基因框架内缺失突变株的构建为了查明脑膜炎性大肠杆菌在致病过程中其ibeA基的作用，通过重组体自灭性质粒pVZD的整合生成了ibeA的框架内缺失突变体。pVZD的构建如下将两个PCR产生的DNA片段，Z(0.9-kb)和D(1.2-kb)；邻近一个1.3kb的区域，该区域在采用两种引物(10A5-4a/10ZM6为Z和10A5M/10D3为D)后产生缺失，然后通过连接作用产生一个2.1kb的片段(ZD)，该片段携有的ibeA存有着内确实(表2)。用Smal将该ZD片段亚克隆到pVZD422重[17]。然后将携有pVZD的SM10λpir与E44结合，即可获得突变株，该突变株的选择在含有ampicillin和利福平的LB琼脂上进行。将单个形成的这种突变株克隆挑出后培养在LBbroth(肉汤培基)上，不加选择地让其生长到对数生长的后期。然后将稀释夜铺在LB培养板上，这种培养板不含氯化钠，但含有5％的蔗糖。蔗糖抗性克隆被测试其是否丧失了ampicillin抗性，由此测知其载体序列是否丢失。PCR和DNA测序用来查证pVZD中的内缺失，并确认该突变体中确定存在所需的染色体基因ibeA，这项工作需用引物10A5-3 Sa和10B3-4a(表2)。DNA扩增按以下循环程序进行35个循环；94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，和70℃ 1.5分钟[Kolmodin LA，et al，Methods Mol Biol(1997)；671-15]。
互补性分析在一个2.3-kb的Sphl片段中含有完整的ibeA ORF，该片段是在Sphl作用下从含有18Kb DNA片段的pUC1030中分离出来，在亚克隆pUC13。该结构设定为pUC23A。E44菌株和ZD1突变株均由载体pUC13和重组质粒pUC23A和pUC1030进行转化。将E44用pUC13进行转化。然后检测这些突变株对BMEC的侵入能力。
构建产生在N端带有组氨酸标记的重组ibeA蛋白下列重组结构的制备按先前方法进行[Huang SH，etal，Infect Immun(1995)；634470-5]。来自pCR17A的BamHI-EcoRI片段含有IbeA编码，将其消化后在1％琼脂糖凝胶上分离，洗脱纯化后连接到pET28a(+)的相同限制性位点上(Novagen)。这种构建体(pET17A)的表达导致了一种融合蛋白的产生，即一种33个氨基酸肽链(包含T7-标记和6X组氨酸标记融合到IbeA的N端。该融合蛋白的分子量为53-kDa。含有T7RNA聚合酶基因的BL21(DE3)被用来作为pET17A转化的宿主菌株。转化体通过予测表型来鉴定(卡那霉素抗性)。蛋白表达的诱导通过0.5mM的IPTG在37℃时进行。
IbeA蛋白的纯化按厂家说明书来进行重组蛋白的小规模表达和纯化(Novagen，Madison，WI)。蛋白制备物分离自离心上清和沉淀，然后将此蛋白制备进行10％的SDS-PAGE分离。带有组氨酸标记的非溶性IbeA蛋白氨厂家说明在8M脲素条件下通过结合到Ni-NTA树脂上来进行纯化(Novagen，Madison，WI)。含有8M脲素的洗脱蛋白质按先前方法再行折叠[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。终产物的纯度按Laemmli步骤来进行评估，即将指定量的蛋白质作10％SDS-PAGE分析[Sambrook J，Fritsch EF，Mahiatis T.Molecular Cloninga Laboratory Manuol，znd ed.Cold Spring Harbor，New York；Cold Spring Harbor Laboratory Press，19891.1-18.57]。蛋白浓度则按厂家说明采用BioRad蛋白标准检测剂来进行测定。蛋白质对E44菌株侵入BMEC的影响将被检测。简单来讲，是将纯化的IbeA蛋白或牛血清白蛋白(用作阴性对照)在室温条件下与BMEC共同培养1小时(0.125至1.5μg/孔)，然后加入细菌，侵入性实验测定按上述方法进行。
实施例1含有全长ibeA基因的大片段DNA的分离和亚克隆大肠杆菌K1株RS218用来作为克隆实验的DNA来源。已证明该菌株能侵入BMEC并在新生大鼠中诱发脑膜炎[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。为了克隆来自RS218的侵入性决定子，用LambdaGEM-12来构建了该菌株的基因组文库。采用ibeA的部分序列(0.58kb)作为探针。从大约5×105个重组噬菌体中筛选出2株克隆，被确定含有ibeA。该重组噬菌体的DNA被纯化后再用Notl进行消化。插入片段的查过度介于16-18kb。一种含有ibeA的18kb片段被用来亚克隆进pUC13(pUV1030)和pWKS30(pWKS1030)。
实施例2ibeA的序列分析为进一步确认全长片段的ibeA基因，对含有全长ibeA基因的2.3kb Sphl片段碱性了测序。在这个区域中只鉴定到一个单独ORF。如图1所示，一个由1,368个核苷酸组成的指定为ibeA基因编码的开放阅读框架中含有456个氨基酸的蛋白质，该蛋白质的计算分子量为50kDa(图1)。部分基因的少数测序误差已被纠正。在Genbank中进行DNA和蛋白质数据的搜寻后，没有观察到ibeA和其他已知基因之间有明显的序列同源性。潜在的-10(CTTATA)和-35(GTTAAT)启动子区域存在于ibeA的5’端非编码区。
实施例3核酸序列的存取编号(accession no.)ibeA的完整核酸序列已被存入基因库的核酸序列数据文库(GenBank Nucleotide Sequence Data Library)，其在GenBank中的进入序号为AF289032。
实施例4体外转录/翻译和体内蛋白质表达系统产生的IbeA其分子量的确认IbeA蛋白的大小在一种大肠杆菌T7 S30提取检测系统中通过蛋白表达实验来甲乙查证。在这种系统中，含有ibeA基因的DNA片段的体外转录和翻译是偶联进行的。首先用这种系统检测含有18kb ibeA位点的pWKS1030和从pWKS1030衍生而来的几个限制性片段。一种50kDa的蛋白质仅在pWKS1030中合成(未显示数据)和在携有2.3kb Sphl片段的pFN23A中合成，提示全长ibeA基因很可能位于这个区域。如图2A所示，含有全长ibeA基因的重组质粒pFN23A在上述反应混合系统中合成了一种50kDa的蛋白质。这种通过ibeA结构在体外翻译系统中进行的50kDa蛋白质的合成提示IbeA蛋白的大小为50kDa。为进一步明确ibeA的分子大小，pFN23A被用来进行体内蛋白质表达[Sanker P，et al，J Bacteriol(1993)；1755145-52]。这种表达系统在T7 RNA聚合酶的适时控制条件下可减弱毒性基因的作用。同样大小(50kDa)的蛋白产物也出现在SDS-PAGE分析的凝胶中(见图2B)。该蛋白区带被分离出来用于N-端序列分析。IbeA N-端的氨基酸序列在图1中表示。体内外表达蛋白的大小和N-端序列正好与分子量和N-端序列相吻合(图1)。
实施例5用纯化的IbeA来阻断大肠杆菌K1对BMEC的侵入，本工作克隆的DNA片段的IbeA的ORF被用来在大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a的表达系统中进行表达，以便检测这种蛋白的功能。这种结构表达了一种功能性蛋白质(组氨酸6-IbeA)，该蛋白由一种组氨酸6标记物和全部ibeA ORF(50kDa)构成。但这种可被鉴定的组氨酸6-IbeA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达时，一种53kDa的蛋白质便出现在包含体中(图3A)。用Ni-NTA亲和层析方法可以从非溶性部分将组氨酸6-IbeA蛋白纯化出来(图3A)。重新折叠导致一种可溶性IbeA的迁移，也形成一个相同大小的单个区带(图3B)。对这种蛋白的功能进行了测试，即对这种纯化的重组性IbeA蛋白是否能抑制E44菌种对BMEC的侵入进行了测试。测试用0.125至1.5μg的纯化IbeA在室温条件下与BMEC一起予孵1小时。然后在BMEC汇合生长的单层细胞中加入细菌以便检测其侵入性。如图4所示，这种IbeA蛋白能有效地抑制大肠杆菌K1对BMEC的侵入，并呈现剂量反应方式，而对照蛋白BSA(牛血清白蛋白)则无此抑制作用。IbeA和BSA在这种实验条件下对细菌的存活性均无影响。更重要的是，完整的重组性IbeA蛋白相对于其部分蛋白片段来，对于大肠杆菌K1对BMEC的侵入显示出更高效率的阻断作用(50倍)[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。表明完整蛋白质更具有更高的功能活性。
实施例6ibeA-缺失突变株ZD1的结构和互补性为了阐明TnphoA突变株10A-23的非侵入性表型是否与一种极性效应有关，我们构建了一种ZD1突变株，该突变株携有的ibeA ORF缺失了95％。IbeA的缺失已通过PCR和DNA测序加以证实。在图5中显示了10A-23和ZD1的非侵入性表型。然而用携有ibeA基因全部编码区的pUC23A和带有大部分ibeA区域的pUC1030均可完全恢复非侵入性突变株ZD1的侵入能力(图5B)。pUC1030能完全互补TnphoA插入性突变体10A-23，而pUC23A能部分逆转10A-23的非侵入性表型(图5A)，提示添加的下游基因可能受入TnphoA插入片段的影响。然而，pUC1030并不能充分地互补非致病性大肠杆菌K12菌株HB101(未显示数据)。这些数据提供了进一步的证据来表明ibeA基因是涉及大肠杆菌K1侵入BMEC的主要效应物之一。
表1大肠杆菌K1(脑膜炎相交的)或K12(非病原性的菌性和本研究所用的质粒)
表1的参考文献(1)Hiffman JA，ct al，Infect Immun(2000)；Huang SH，et al.Infect Immum(1995)；634470-5；Huang SH，et al，Infect Immun(1999)672103-9；(2)Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；63；4470-5；(3)Donnenberg MS，et al，Infect Imman(1991)；594310-7；(4)Donnenberg MS，et al，Infect Imman(1990)；581565-71；Donnenberg MS，et al，Infect Imumun(1991)；594310-7；(5)Sankar P，et al，J Bacteriol(1993)；1755145-52；(6)Wang Y.et al，Infect Immum(1999)；67475 1-6；(7)Wang RF，et al，Gene(1991)；100195-9表2用来对ibeA基因进行克隆，测序和造成缺失突变的寡核苷酸
讨论目前的证据提示微生物对血脑屏障(BBB)的穿透和进入中枢神经系统是多种微生物与BMEC-BBB的一种主要成分之间的特异性相互作用的结果[Huang SH，et al，Microbes and Infection(2000)；21237-44；Kim KS，et al，SubcellBiochem 2000)；3347-59]。
我们在大肠杆菌上对这个问题的研究表明大肠杆菌要成功地穿越BBB需要细菌和BMEC之间两个互为独立的相互作用，即大肠杆菌要先与BMEC结合，然后再侵入BMEC。我们先前已证明S fimbriae在大肠杆菌与BMEC的结合中发挥作用[Stins MF，et al，Am J Pathol.(1994)；1451228-36]；但通过SFimbriae与BMEC的结合并不伴随对BMEC的侵入。随后我们查明了有几种大肠杆菌K1的效应物在细菌对BMEC的侵入中起作用，这些效应物即为IbeA，IbeB，YijP，AstA，和OmpA[Hoffman IJA；et al，Infect Immun(2000)；685062-7；Huang.SH，et al，Infect Immun(2000)；685062-7；Huang.SH，et al，Infect Immun(1995)；6344470-5；Huang.SH，et al，Infect Immun(1999)；672103-9；Wang Y，et al，Infect Immun(1999)；674751-6；Prasadaro NV.et al，Infect Immun(1996)；64146-51]。
IbeB，yijP，asiA，和ompA在大肠杆菌K12的基因组中存在同源性，但从脑脊髓液呈分离出的大肠杆菌长1菌株中，仅有ibeA基因被发现是一种特异的致病因子[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5；Bingen E，et al，J Infect Dis(1998)；177642-50；Bonacorsi SP，et al，Infect Immun(2000)；682096-101]。
我们先前曾证明与父本菌株相比ibeA(10A-23)的突变型TnphoA在体外对BMEC及在血源性脑膜炎的新生大鼠模型中的侵入性均明显低下。由部分ibeA基因编码的一种小的重组蛋白片段(8.2kDa)能阻断大肠杆菌K1对人类BMEC的侵入[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。对ibeA基因特点的进一步坚定中，我们获得了多方面的证据来表明全长ibeA基因编码产物是一种5kDa的蛋白质。第一个证据来自一种在大肠杆菌T7S30提取测试系统中进行的转录/翻译实验，表明ibeA的合成产物是一种50kDa的蛋白质。该数据得到进一步支持，即测出体内蛋白表达系统中表达和纯化的IbeA蛋白与上述基因产物具有相同的分子量。且这种纯化蛋白的前20个N-端氨基酸与根据DNA序列数列推断的ORF的氨基酸序列的情况完全吻合。这些结果说明IbeA蛋白的分子量为50kDa。推断的蛋白质序列提示IbeA是一种含有三个跨膜区结构的潜在的膜结合蛋白(图1)。但是，未发现该基因与已知基因，包括其他任何一种已鉴定出的侵入蛋白基因之间的明显同源性，因而建议IbeA是一种已知的但却是独特的微生物致病蛋白。
如前所述，ibeA基因最初是通过TnphoA的突变发生而得以鉴定到的[Huang SH，et al，Infect Immun(1995)；634470-5]。
为了排除一种可能性，即10A-23的非侵入特性可能涉及TnphoA的一种极性效应，该效应可能作用于其他涉及侵入特性的基因发生作用，因而建立了ibeA的一种等基因缺失突变体ZD1，并测试其对BMEC的侵入性表型特征。与Tnpho A突变型10A-23相同，ZD1对BMEC的侵入性也低。而ibeA基因编码的50kDa的IbeA蛋白质却能部分或全部恢复10A-23和ZD-1突变体的侵入特性，达到其父本菌株E44的水平，由此提示下游部分增加的基因可能会受到ibeA基因中TnphoA插入片段的影响。此外，大肠杆菌K12菌株HB101不被pUC1030(未显示数据)互补，提示这些增加的效应物可能有利于大肠杆菌在BMEC中的内化过程和细胞内存活。但仍需进一步查明大肠杆菌K1的多种不同的侵入性效应物是如何协助细菌穿越的脑屏障的。
最近我们从BMEC中发现一种55kDa的膜蛋白，该蛋白与IbeA的部分片段(8.2kDa)相结合。这种IbeA变体(IbeAR)的可溶性形式和一种针对IbeAR的多克隆抗体能阻断大肠杆菌K1对BMEC的侵入[Prasadarao NV，etal；Infect immun(1999)；671131-8]。
我们以前曾证明IbeA的部分片段抑制大肠杆菌K1对BMEC的侵入，但需要高剂量(50μg)才能达到大约80％的抑制效应[Huang SH，et al InfectImmun(1995)；634470-5]。
但如同本报告所示，完整的50kDa的IbeA重组蛋白更能有效地阻断大肠杆菌K1对BMEC的侵入，仅1μg的剂量就能达到相同的抑制程度。总之，这些发现建议以前报道的IbeA的8.2kDa的片段代表了该蛋白与IbeAR相互作用的部分结合区，而IbeA的其他结构则需要用来完成细菌与BMEC之间优化的相互作用。
由此可以得出这样的结论，我们的数据进一步支持，ibeA是大肠杆菌侵入BMEC的一种主要的效应物，而这种侵入是脑膜丧性大肠杆菌致病的一个必要步骤。正在进行的研究是要阐明ibeA位点在协助大肠杆菌侵入血脑屏障过程中的作用机制。
实施例7-12为了查明E.coli中与侵入血脑屏障(BBB)相关的结构，我们采用转座子TnphoA的突变诱发(transposon TnphoA mutagenesis)来产生了一组非侵入性的突变体。其中有4个非侵入性突变体即10A-23，7A-33，23A-20和27A-6中均各只含一个单独的TnphoA插入片段，也不具有任何其他的表型和遗传型特征的变化，它们在体外对BMEC单层细胞和在血源性脑膜炎型E.coli的新生大鼠模型中对中枢神经系统的侵入性均显著降低(Huang et al，(2000)，Microbes and Infection.21137-44；Huang and Jong(2001)CellularMicrobiology；Huang et al.，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8；Hoffman，J.A.et al2000)Infect.Immun.685062 5067)。此外，与E.coli侵入BBB相关的4个遗传决定子ibeA，ibeB，yijp和aslA都已准鉴定。IbeB，yijp和aslA也同源性地存在于非被性E.coli K-12的基因组中。只有编码一种50kDa蛋白质的ibeA基因存在与脑脊髓液中分离出的E.coli K12(如C5和RS218)中；然后在E.coli K-12的实验室菌株和非致密性与E.coli(如E412)中，无ibeA(HuangSH，et al.(1995)Infect Immun，634470-4475；Huang SH，et al.，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8；Johnson，JR et al，(2001)J Infect Dis。183425-34)。IbeA位点能完全互补TnphoA插入片段和等基因缺失突变体10A-23和ZD1(Huang et al.)(2001)J.Infect Dis.1831071-8。
在此我们报告了一种20.3-kb的位点，该位点喊有的ibeA基因被发现在E.coli菌株中是独特的。该基因位于yijD和yijE之间，与fim操纵从子相邻接，但在非致病性E.coli菌株中缺如。该基因的G+C含量在某些区域与其他基因组不同，说明这种基因簇是一种含有ibeA的脑膜炎性E.coli的遗传岛(genetic island of meningitic E.coli containing ibeA(gimA))。此外，14个新的开放阅读框架(ORF)已被鉴定。
实例7-12的材料和方法细菌株，质粒和培养基，E.coli菌株(O18:K1:H7)是治疗以上患有脑膜炎的新生片的脑脊髓液本分离得到[Huang SH.et al，(1995)Infect Immun，634470-4475]。E44是RS218的自发性利福平抗性突变株。该菌株的特性已被鉴定(Huang，S.H.et al，(1995)Infect.Immun，634470-4475；Huang，S.H.et al，(1999)(Infect.Immun，672183-2189；Huang，SH et al.，(2001)J.Infect.Dis，1831071-8)。DH52作为宿主菌株，用于DNA序列测定时受需的亚克隆和质粒的制备。含有质粒的菌株在37℃条件培养于含有氨苄青霉素(100pg/ml)。卡那霉素(50pg/ml)的L肉汤以丽质粒的阳性筛选。细菌在L肉汤中培养，细菌的保存则用含有20％甘油的上肉汤，冻存于-70℃。
化学品和酶、限制性地酶，T4 DNA连接酶和其他酶类均购自NewEngland Biolabs(Beverly，mass.)除非另有说明。化学品则购自Sigma(St.Louis，A10)。所有同位素产品获自New England Nuclear Corp.(Baston，Mass.)DNA测序胶制备试剂均为超纯品质，购自National Diagnostics(Atlanta，Georgia)。用于与测序酶一起进行DNA测序反应的试剂和及其化学品均购自United States Biochemical Corp.(Cleveland，Ohio)。DNA测序试剂盒及染料终止物(dye terminators)均购自PE Applied Biosystem(GreatBritain)。
质粒的提取，处理和亚克隆；所有遗传常处理均按标准方法进行(Sambrool，J，et al，(1929)Molecular Cloning a Laboratory Mannal，2nd ed.ColdSpring)。质粒DNA的提取采用Plasmid mini kit(Qiagen Inc.Chatsworth，Calif)。DNA片段的纯化和从琼脂糖凝胶茶带中提取采用GeuecleanTM(Bio101，Lajolla，Calif)。E coli的反应潜能细胞在10％的甘油中制备，并用电穿孔方法进行转化(Huang SH，et al，(1999)Infect，Immun.672103-2109；Huang SH，et al，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8)。基因组DNA采用SauA3I来进行部分消化(New England Biolabs)，该DNA也相溶于Bam HI。部分消化的基因组DNA(15至23kb)用dGTP和dATP来进行部分填充。该DNA被连接到带有Xhol Half-Site的LambdaGEMTM一次臂上。重组入噬菌体的连接和包装按厂家说明进行(Promega)。用DNA杂交方法来对E.coli基因文库进行筛选(Huang et al，1999，2001)以便鉴定出含有ibeA的噬菌体克隆。采用EcoRI将pCIB10B中的一个8.58-kb的ibeA DNA片段释放出来，用制备性琼脂糖凝胶电泳和Geneclean(Bio101)进行纯化，然后用oligolabeling kit(Pharmacia)将[α32P]dCTP标记该纯化片段，该标记的片段即可在筛选时用作探针(＞1×108cpm/μg)。将噬菌斑复制到尼龙滤膜上进行UV-连接和杂交，方法照前述(Huang et al，1999，2001)。与探针杂交的菌斑用放射自显影进行鉴定，然后进行纯化。
用DNA杂交方法对E.coli RS218基因组文库进行筛选按前述方法构建E.coli RS218的基因组文库(Huang，SH et al.，(2001)J.Infect.Dis.1831071-8)。用DNA杂交方法从该E.coli基因组文库中筛选并分离出含有ibeA基因座的噬菌体克隆。0.58kb的ibeA DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和GenecleanTM(Bio101)进行纯化，用Oligolabeling Kit(Pharmocia)来进行[α32P]dCTP标记，然后用作筛选探针(＞1×108cpm/μg)。按前述方法将噬菌斑复制到尼龙滤膜上进行UV-连接和杂交。与探针杂交的噬菌斑用放射自显影进行鉴定，然后进行纯化。
PCRPCR按标准方法进行。左侧邻接区的扩增采用引物YjD1(5’-AATGCT GTA CCA CGA CG-3’)和8T3a(5’-TCAT A6T CTA CGT CTC GCC GAC-3’)，循环30次，每次循环包括94℃ 1分钟，58℃ 1分钟和70℃ 3分钟。
核酸测序模版的制备采用Primer-Walking方法进行测序，被测序的克隆有3个，即2个相互重叠的基因组克隆(10-8和10-30)和一个PCR克隆，后者是用E.coli RS218的基因组DNA来制备，并在先前被发现带有E.coli K1菌株的特异DNA序列。
DNA的测序和分析首先对gimA的部分DNA序列进行测定，方法是Sanger等人的双脱氧链终止方法；同时结合使用U.S.Biochemicals Corp.的Sequenase Version 2.0 kit(Cleveland，Ohio)和Taq DNA聚合酶。DNA序列分析用人工进行，采用Du Pont NEN Research Products(Bosten，Mass.)的[35S]dATP(1,000至1,500Ci/mmol)。然后换为DNA自动测序方法，该方法采用荧光标记核苷酸(373 ABI automated sequencer)，因此更为快速，低成本，并避免了高含量G+C衍生的人为电泳性压缩。全部ibeA基因簇均通过Primer-Walking来进行测序，DNA的两条链均被测序以确保测序的正确无误。
生物信息学方法采用科教软件公司(Scientific & Education Software，Durhan，NC)开发的DNA分析软件来对测序资料进行分析。DNA和推测的蛋白序列用来进行DNA和蛋白质数据库的搜寻，该数据库建立于National Centerfer BiotechnologyInformation(National Library of midicine，Washington，D.C)搜寻时要采用BLAST规则系统。ClustalW(Thompson JD et al(1994)Nucleic Acids Res.224673-4680)和Boxhade(Hofmann K et al，1999)Nucleac Acids Res.27215-9)，被用来进行蛋白序列的多重调准。对遗传离子的A基因的注释采用了两种不同概念的方法。首先将序列与已有序列进行比较，而这些已知序列的蛋白质功能已经知道。由此以便能坚定出同源区域，然后予测新基因的功能性。其次，一种统一的希顿马可夫模型(Hidden Markov Model)，该模型被用来注释原核生物基因，在这里被用推测gimA的未致基因(Shmatkov AM et al，(1999)Bioinformatics 15874-86)由于紧密包装的原核基因常常相互重选，因而BioNavigator容易通过耙向基因起点和重选基因来检测翻译的起始位点，因而也就能准确预测原核生物基因。将比较性分析和“框架连框架”规则系统”(Frame-by-frame)的结合应用。从而导致对指定的新基因作出注释。种系发生分析则通过生物技术导航器(BioNavigator)(http//www bionavigator.com)来进行。
实施例子E.coli RS218的ibeA基因簇的克隆和亚克隆E.coli K1 RS218菌株用作克隆实验的DNA来源。这种CSF分离菌株能侵入人和牛的大脑微血管内皮细胞(BMEC)，而且能在新生大鼠的菌血症之后诱发脑膜炎。为了从RS218中克隆ibeA决定子，一种基因组文库物构建于Lambda GEM-12为构建这种文库，在载体中采用了Xhol的半位点，在基因组插入部分采用SauA3I酶切位点，载体和基因组序列的自身连接被排除，因为只有含有适宜长度(15-23kb)的单个插入片段的重组噬菌体才有可能被包装。用一种ibeA片段(0.58kb)作为探针对大约5×105个重组噬菌体进行了筛选。三个相互重叠的ibeA克隆被鉴定出。对这种重组噬菌体进行纯化和用Notl进行消化。两个重叠的插入片段其大小分别为17.3(A10-8)何等18(A10-30)kb。这些含有ibeA基因簇的插入片段亚克隆进pBluescript KS(pKS108和pKS1030)的Notl位点。
实施例8衔接区域的鉴定右边衔接区(这里“右边”定义为在E.coli K12的连接图谱中与数字较高的部分相连的序列)通过T3引物在A10-30进行鉴定。一个530bp序列的伸展区被确定。对GenBank的搜寻显示该区域与E.colik12中yjiD(12bp)和yjiE(518bp)的C-端编码序列相同。该gimA插入位点位于yjiD ORF之内，在yjiD终止密码子的上游第9个bp处，并处于yjiE ORF之外，位于yjiE终止密码子的上游第4个bp。18kb的序列获自A10-8和A10-30克隆。按物理学图谱法(Bloch et al，1996)，gimA的长度约为20kb。为了鉴定这个基因缺口，分别从yjiD终止密码子的上游第62个bp和已知的gimA序列的5’区域排除5’-引物(10YiD1)和3’-引物(8T3a)。为了分离和查证(verify)gimA的左边junction，这两种引物用于PCR，以便直接从E44基因组DNA中扩增该区域。一个2.4kb的DNA被分离出来并亚克隆到pGEM-T简易载体(E44L7)。对该PCR克隆进行序列分析后确定了它的左侧junction，同时显示2.3kb的序列是E.coli K1的特有序列，而且该序列与gimA序列有30个bp的重叠区。因此gimA的长度为20.3kb。
实施例9gimA的核酸序列ibeA基因簇的DNA序列通过Primer-walking方法来确定，这里所用的引物与S10-8，A10-30和E44L7中gimA基因的两条链互补。对该DNA序列书记的分析结果表明gimA位于98微区(min)两个噬菌体克隆(A10-8和A10-30)之间有一个重叠区域，在该区域中，这两个克隆具有相同的ibeA和下游区域(图6)。开放阅读框架ORF的分析结果和gimA的特征概述于图7和图8及表4。
实施例10gimA内的新基因为了查明gimA内的ORF，对全部基因簇作了核苷酸序列测定。在这个区域中明显含有一个20.3-kb的gimA，同时在这个区域中鉴定出15个ORF，其中包括已知的ibeA基因(图9)。已进行测序的ORF的基因可能与碳氧化合物的代谢，转运系统，蛋白结合及转录的调控有关。
实施例11插入序列和转座子尚未从gimA及其衔接区内鉴定到已知的插入序列。但对GenBank的搜寻结果指出有一个57kp的区域(5358-5414)与Pseudomonas Putida中的转座子Tn5542有显著同源性(85％)。
实施例12gimA的其他特征RS218菌株的gimA作为一组致病基因表现出两个共同特征。首先，其GC在序列中的含量，不包括K12来源的GC含量是46.2％。其次是，gimA序列仅为E.coli K1株所特有，它与K-12来源的序列并无明显同源性。
讨论E.coli RS218是从感染了脑膜炎性大肠杆菌的新生儿的CSF中分离到的，通过分离重叠性噬菌体，PCR克隆，限制性酶地图谱制造，亚克隆和DNA序列测定(图7)，最终对来自菌株的一个20.3kb的DNA区域的特征进行了鉴定。在这个区域中，我们鉴定了一个包括15个ORF的称之为遗传岛的结构(表4和图9)。和相邻的DNA片段相比，该遗传岛或致病岛的GC含量特征性地降低，而且其基因簇的各个基因之间处于相互邻接的位置，共同组成一种单一的致病特性。RS218的gimA的长度为20.3kb，GC含量为46.2％(相对应的，K-12的基因组DNA的GC含量为50.2％)。
RS218的20.3kb的gimA的核酸序列中含有14个新描述的基因。在脑膜性E.coli中必然性发现存在ibeA基因，同时明显多地在Sfa/foc操纵子阳性，而不是阴性菌株中测到。因此，我们推测这些新描述的基因以及ibeA基因可能共同组成了一个遗传岛(孤立的结构区域)并由其介导了E.coli诱导的新生儿脑膜炎发病过程。IbeA基因的插入和缺失均能在体内外导致RS218出现非侵入性表型，由此建议这个致病决定子与E.coli对血脑屏障的侵入油光(Huang，SH，et al(1995)Infect Immun，634470-4475；Huang，SH，et al，(2001)J，Infect，Dis，1831071-8)。当我们对RS218的遗传岛作进一步研究时，我们将选用更多的突变体进行研究，这些突变体的表型可能与致病性有关，例如代谢物的摄取和转录的调节。我们将通过特异基因的等位交换来诱发突变，同时在体外通过BMEC侵入性试验和在体内通过脑膜炎的新生大鼠模型来测试这些等基因突变。通过这些突变，我们希望找出更多的脑膜炎性E.coli的致病表型有关的gimA基因。但是，可能在脑膜炎性E.coli的RS218菌株中已包含有额外的遗传岛。在最近研究的两个尿道致病性菌536和J96中发现，每一个菌株均含有两个分离的病原岛(PAT)。在536菌株中，190和70kb的病原岛分别位于97微区(min)(leu×内)和82min(Sel.C内)。而在J96菌株中，110和大于170kb的PAI则分别位于94min(pheR内)和64min(pheV内)。从非侵入性TnphoA突变性的图谱中可发现至少两个有争议的遗传岛，即包括gimA和在一个120kb的RS218-特异的染色体片段中的12个TnphoA，这些均出现在RS218的基因组中(Bloch，CA，et al.，(1996)FEMS Microbiol.Lett.，144171-176)。最近实验室(Rode CK，etal.，(1999)Infect Immun，67230-236)和Bingench组(BonacorsiSP et al.，(2000)Infect Immun.682096-2011)分别通过比较性宏观限制性图谱和表观性差异分析方法在RS218的基因组中探测到R个新的遗传岛。由于RS218中新的遗传岛的长度尚不明确，因而有可能存在与gimA以外的若干种其他致病基因也与该菌株的致病性有关。
表3Oligonucleotides used for cloning and sequencing
表4Gene annotation of the ibeA gene cluster(gimA)
C＝complememary strand实施例13IbeA对细胞凋亡的诱导一些研究工作认为脑内海马的凋亡是人类细菌性脑膜炎和多种脑膜炎动物模型的一种典型特征(Nau R et al.，J Neuropathol Exp Neurol.1999，58(3)265-74；Loeffler JM et al.，J Infect Dis.2001，183(2)247-252；Bottcher Tet al.，J Infect Dis.2000，181(6)2095-8；Braun JS et al.，Nat Med 1999，5(3)298-302；Leib SL et al.，J Clin Invest.1996，98(11)2639-9)。如我们先前的工作所示，IbeA依赖的E.coli K1的侵入性在肠上皮细胞和大脑内皮细胞中均能观察到。由于细胞凋亡是细菌性脑膜炎的一个主要特征，因此我们建议细胞凋亡有可能与E44的侵入相关。为查明细胞凋亡是否在E.coli脑膜炎菌株的致病中产生作用，我们测试了IbeA和IbeB蛋白的凋亡诱导活性。人类的EC培养于胶原蛋白包被的8-孔室载玻片上。当这些细胞达到汇含生长时，用5μg的蛋白质[纯化的E.coli蛋白IbeA，IbeB，BPI或BSA(IbeB和BSA用作对照)]进行处理，并在37℃中孵育6小时。然后用实验培养液将人的EC洗3遍，在4℃条件下固定于含1％多聚甲醛paraformaldchyde的Pbs中(Stins，M.F et al.，J.Neurovirol.待出版)。凋亡细胞的检测用ApopTag in situ apoptosis detection kit来进行(Intergen，digoxigenin Diaminobenzidine Purchase，NY)，按厂家说明进行操作。简单讲，先将DNA片段的3’端羟基变成为终端脱氧核苷酸酰基转移酶(TdT)的底物，然后通过催化作用异羟基洋地黄毒元标记的(digoxingamin)核苷酸加到凋亡过程中产生的DNA终端上。这些核苷酸的检测采用连接有过氧化氢酶的抗-digoxigenin抗体来进行。二氨基联苯胺(Diaminonbenzidine)用来与过氧化氢霉反应并产生非溶性棕色产物，这些产物堆积在DNA断片出现的凋亡体中。然后在显微镜对这些载玻片进行观察和拍照(Stins，M.F.et al.，J Neuro-Wirol.出版中)。所图13所示，仅IbeA能在人的EC中诱导出细胞凋亡，而BPI，BSA和IbeB均不能，但BPI能阻断IbeA对凋亡的诱导。在相同的条件下，另外纯化的侵入性蛋白IbeB(Huang SH et al.，1999)也不能在人的内皮细胞(EC)中诱生细胞凋亡。综上所述，我们的数据标明，在E44中，IbeA是诱导人的EC发生细胞凋亡的一个主要的凋亡诱导因子，但该因子的作用可被抗内毒素蛋白的BPI所抑制(Arditi，m.et al.，Infect Immun.1994，623930-6)。在很多大脑疾病包括细菌性脑膜炎中，神经原的损伤和坏死均归因于细胞凋亡。因而用BPI这样的抗凋亡制剂来阻断IbeA对凋亡过程的诱导将会是预防和治疗新生儿大肠杆菌脑膜炎的一种新方法。
熟识该项技术的人将明白上述本发明图式中的实施例及实体均系例子说明及不会因此而产生规限性。而本发明的目的将系完全及有效地达到。上述所示实施例系以说明功能及结构的原理，及系于不离本发明的原理下有所变更。故此，本发明系包括所有权利要求书中的精神及范围及依其为根据的变化。
权利要求
1.一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它提供一种完整核酸序列的方法，该核酸序列编码一种ibeA基因簇中的某一基因，包括以下步骤(a)鉴定出大肠杆菌(Escherichia Coli)中与侵入BMEC相关的结构为一种ibeA；(b)从大肠杆菌中提取和纯化的ibeA进行分析；和(c)确定ibeA的完整核酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种提供完整核酸序列的方法，进一步包括以下步骤(e)制备一种发生框架内缺失的ibeA的突变体；(f)将ibeA的框架内缺失突变体一种ibeA组合从而形成一种转化体；和(g)进行互补性分析以测试是否具备对BMEC的某种侵入能力。
3.一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它提供一种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌(probiotic)，该益生菌包括本身具有抑制性脑膜炎致病因子的活体微生物。
4.根据权利要求3所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该脑膜炎致病因子包括GimA。
5.根据权利要求3所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该脑膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli K1和B组链球菌(GBS)在内的一组微生物。
6.根据权利要求4所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该脑膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli K1和B组链球菌(GBS)在内的一组微生物。
7.根据权利要求3所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli菌素，GBS菌素，单核细胞增多性李斯特菌属(steria monocytogenes)，假单胞菌属(Pseudomonas species)，肺炎链球菌属(StreptococcusPueumoniae)，脑膜炎李瑟菌属(Neissria meningitides)，流感嗜血杆菌属(Haemophilus influenzae)，柠檬杆菌属(itronacter species)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌类，肠道病毒(enteroviruses)单纯疱疹病毒，和兔弓形虫(Toxoplasma gondii)寄生虫在内的一组微生物。
8.根据权利要求4所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该膜炎致病微生物选自包括携带GimA的E，coli菌素，GBS菌素，单核细胞增多性李斯特菌属(steria monocytogenes)，假单胞菌属(Pseudomonas species)，肺炎链球菌属(StreptococcusPueumoniae)，脑膜炎李瑟菌属(Neissria meningitides)，流感嗜血杆菌属(Haemophilus influenzae)，柠檬杆菌属(itronacter species)，白色念球菌(Candia abbicans)，真菌类，肠道病毒(enteroviruses)单纯疱疹病毒，和兔弓形虫(Toxoplasma gondii)寄生虫在内的一组微生物。
9.根据权利要求3所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该活体微生物包括乳酸杆菌属(Lactobacillusspecies)，双叉杆菌属(Bifidobacterium species)，E.coli Nissle1917，和携带针对包括GimA在内的一或多个致病因子的抗原的Probiotic菌。
10.根据权利要求3所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎性微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌中，该活体微生物包括本身能抑制包括GimA在内的一或多种脑膜炎致病因子的酵母菌。
11.一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它包括一种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法，其包括施用一种具有疗效的益生菌制剂，以次来增进益生菌生物的有益作用，同时又对一种或多种脑膜炎致病因子产生抑制。
12，根据权利要求11所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的脑膜炎致病因子是指GimA。
13.根据权利要求11所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制剂选自一组寡糖，它们包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
14.根据权利要求12所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制剂选自一组寡糖，它们包括果糖寡糖(fructooligosaccharides(FOS))，菌粉(mulin)，乳果糖(Lactulose)和半乳糖寡糖(galacta oligosaccharides)。
15.根据权利要求11所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法中，该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中的益生菌(Probiotic)制剂包括的细菌选自下列一组细菌Lactobacillus species，Bifidobacterium species，E.coli Nissle1917，和携带有针对包括GimA在内的一种或多种致病因子的抗原的Probiotic菌类。
16.根据权利要求11所述的一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于该种预防和治疗由脑膜炎病原微生物引起的新生儿脑膜炎的益生菌方法中，该益生菌(Probiotic)制剂是非消化性的食物，这些食是通过促进有益细菌的生长或活性和抑制包括GimA在内的所说的脑膜炎致病因子来改善健康的。
17.一种新生儿脑膜炎的益生性治疗和大肠杆菌致病因子的应用方法，其特征在于它包括一种治疗由脑膜炎病原微生物导致的新生儿脑膜炎的益生菌(Probiotic)方法，其包括施用一种具有治疗效果的益生菌(Probiotic)制剂来增强益生菌(Probiotic)生物的有益作用，同时对一种或多种脑膜炎致病因子产生抑制。
全文摘要
本发明公布了脑膜炎性大肠杆菌，特别是导致新生儿脑膜炎的大肠杆菌菌株的致病力的调整基因和蛋白。本文还特别提供了lbeA基因簇(GimA)基因的序列及由这些基因编码的蛋白质的序列。还提供了利用这些序列资料来产生的制剂和诊断检测。
文档编号A61K35/74GK1695638SQ20051000539
公开日2005年11月16日 申请日期2005年2月5日 优先权日2004年2月13日
发明者黄胜和 申请人:黄胜和