专利名称：中性硫酸小檗碱用于制备防治内毒素性疾病的药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中性硫酸小檗碱的新用途，尤其是涉及中性硫酸小檗碱用于制备防治内毒素性疾病的药物的用途。
背景技术：
由于细菌耐药性的产生、侵入性治疗措施的应用、恶性交通事故、烧伤和老年病人的增加，脓毒症的发生率仍在升高。尽管在过去50年中抗生素的应用和临床治疗措施取得了长足的进步，但是脓毒症、感染性休克患者的死亡率仍高达40％-60％。感染性休克(顽固性低血压)和随后发生的多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是脓毒症患者死亡的主要原因。降低感染性多器官功能衰竭患者的死亡率是目前医学面临的一大难题。研究表明，45％-60％的脓毒症是由革兰氏阴性细菌感染引起，内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在这种感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)中发挥重要的作用。而且，充血性心力衰竭、肝炎与其他肝脏病大多并发肠源性内毒素血症，内毒素血症在这些疾病的发展过程中发挥重要作用。因此，寻找新的药物防治内毒素性多器官功能衰竭，对降低脓毒症患者的死亡率、治疗心力衰竭和肝脏疾病具有重大意义。
80年代以来，内毒素性休克和MODS发生的分子机制的研究已取得了许多新的进展，特别是LPS信号转导通路的深入研究，致炎细胞因子和细胞黏附分子的分子克隆、内皮素(endothelin，ET)和一氧化氮(nitric oxide，NO)介导作用的发现，导致了一系列阻断LPS信号通路和对抗各种单一介质的治疗制剂的产生，如抗LPS抗体、IL-1受体拮抗剂、抗肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor，TNF)抗体、脂质体前列腺素E1(liposomal PGE1)、缓激肽拮抗剂、血小板活化因子拮抗剂、抗凝血酶III、激活蛋白C、一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)抑制剂、内皮素拮抗剂等。这些制剂在动物实验研究中都显示出一定的疗效，但迄今为止，多中心临床研究发现，还没有一种制剂能够显著降低死亡率。另一方面，肠源性内毒素血症是加速心力衰竭和肝脏疾病发展的重要危险因素，目前尚没有制剂能防治内毒素性心功能障碍。因此，如何防治内毒素性多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)一直是医学面临的重要课题。
一般情况下，一些抗生素在杀灭革兰氏阴性细菌的同时，会促进内毒素的释放，这往往是某些抗生素在治疗革兰氏阴性细菌感染时的不足之处。小檗碱作为抗菌药物用于肠道感染的治疗已应用多年，但小檗碱能否防治内毒素性疾病尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供中性硫酸小檗碱(neutral sulfate berberine，hemisulfate berberine)用于制备防治内毒素性疾病的药物的用途。
本发明以雄性昆明小鼠为实验对象，观察中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠多器官功能和死亡率的影响。结果证明，腹腔注射内毒素前5天灌胃给予中性硫酸小檗碱(每天1次，每次25，50或100mg/kg)或内毒素攻击后1h灌胃给予中性硫酸小檗碱(50mg/kg)均能减轻内毒素引起的肺、肝、肾器官功能损伤，降低内毒素血症小鼠的死亡率(内毒素血症小鼠7天死亡率为78％，50mg/kg中性硫酸小檗碱5天预防组小鼠死亡率为21％、50mg/kg中性硫酸小檗碱治疗组小鼠死亡率为47％)。利用离体大鼠心脏灌流模型，发现中性硫酸小檗碱能抑制内毒素引起的心肌细胞内钙稳态的异常和肿瘤坏死因子生成增多，减轻内毒素性心功能损伤。基于上述研究结果，本发明证实了中性硫酸小檗碱具有防治内毒素性多器官功能衰竭、防治内毒素性心功能障碍，降低内毒素血症的死亡率的新用途，可用于内毒素血症的治疗制剂，并作为心力衰竭和肝脏疾病的辅助治疗药物。用中性硫酸小檗碱制备的药物对提高内毒素血症小鼠生存率、防治内毒素性心功能损伤有较好的预防和治疗效果。
本发明提供了用于防治内毒素性疾病的药物组合物，包括有效治疗剂量的作为活性成分的中性硫酸小檗碱，以及药物学上可接受的载体。由于中性硫酸小檗碱通常用于口服，因此所述的药物组合物可配制成口服制剂。上述药物组合物用于感染引起的内毒素血症的治疗，也可用于严重创伤、烧伤、肝脏疾病的辅助治疗药物。
本发明的有益效果在于中性硫酸小檗碱能防治内毒素性多器官功能衰竭，特别是防治内毒素性心功能障碍，提高内毒素血症小鼠的长期生存率。将中性硫酸小檗碱用于制备防治内毒素性疾病的药物，可用于内毒素血症的治疗，并作为心力衰竭、严重创伤、烧伤、肝脏疾病的辅助药物，具有广泛的应用前景。
图1描述中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响。
图2描述不同剂量的中性硫酸小檗碱灌胃5天对内毒素血症小鼠死亡率的影响。
图3描述各组小鼠肺的组织学改变(A，B，C，D12h，E，F24h，光镜×250)，其中，A图、E图HB+LPS；B图、F图H2O+LPS；C图H2O+NS；D图HB+NS；A，B，C，D图12小时；E，F图24小时。A，EHB+LPS(中性硫酸小檗治疗组)，中性硫酸小檗碱能明显减轻LPS所致的肺损伤；B，FH2O+LPS(内毒素血症组)，LPS注射后12小时和24小时，可见肺间质水肿，大量炎症细胞浸润和肺出血；CH2O+NS(正常对照组)；DHB+NS(中性硫酸小檗对照组)，未见异常结构改变。
图4各组小鼠肝的组织学改变(24h，光镜×250)。
AHB+LPS(中性硫酸小檗治疗组)，中性硫酸小檗碱能明显减轻LPS所致的肝损伤；BH2O+LPS(内毒素血症组)，LPS注射后24小时，可见肝细胞变性、水肿、坏死和淤血；CH2O+NS(正常对照组)；DHB+NS(中性硫酸小檗对照组)，未见异常改变。
图5各组小鼠肾的组织学改变(24h，光镜×250)AHB+LPS(中性硫酸小檗治疗组)，中性硫酸小檗碱能明显减轻LPS所致的肾损伤；BH2O+LPS(内毒素血症组)，LPS注射后24小时，可见肾小管上皮细胞水肿、变性和间质出血；CH2O+NS(正常对照组)；DHB+NS(中性硫酸小檗对照组)，未见异常改变。
具体实施例方式
1、实验材料和方法(1)观察不同时间给药的中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响将健康雄性昆明小鼠(体重20-25g)随机分成7组分别做如下处理，对照组(H2O+InjN.S)提前5天用水灌胃(0.2ml/10g，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射生理盐水；中性硫酸小檗碱组[HB(5)+InjN.S]提前5天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射生理盐水；LPS组(H2O+LPS)提前5天用水灌胃(0.2ml/10g，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，O55B5，Sigma，28mg/kg)；提前5天给予中性硫酸小檗碱防治组[HB(5)+LPS]提前5天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；提前3天给予中性硫酸小檗碱防治组[HB(3)+LPS]提前3天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；提前1小时给予中性硫酸小檗碱防治组[HB(1)+LPS]用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，50mg/kg，灌胃1次)，灌胃后1小时，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；中性硫酸小檗碱治疗组[LPS+HB(1)]腹腔注射LPS(28mg/kg，ip)后1h，再灌胃给予中性硫酸小檗碱(50mg/kg，1次)。
于内毒素注射后不同时间，观察各组小鼠的死亡率。
(2)观察提前5天给予不同剂量的中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响将健康雄性昆明小鼠(体重20-25g)随机分成6组分别做如下处理，对照组(H2O+NS)提前5天用水灌胃(0.2ml/10g，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射生理盐水；提前5天给予25mg/kg中性硫酸小檗碱防治组[HB(25)+LPS]提前5天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，25mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；
提前5天给予50mg/kg中性硫酸小檗碱防治组[HB(50)+LPS]提前5天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；提前5天给予100mg/kg中性硫酸小檗碱防治组[HB(100)+LPS]提前5天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，100mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；LPS组(LPS)提前5天用水灌胃(0.2ml/10g，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；于内毒素注射后不同时间，观察各组小鼠的死亡率。
(3)观察提前5天给予50mg/kg中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠器官组织结构的影响将健康雄性昆明小鼠(体重20-25g)随机分成4组分别做如下处理，对照组(H2O+NS)提前5天用水灌胃(0.2ml/10g，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射生理盐水(NS)；LPS组(H2O+LPS)提前5天用水灌胃(0.2ml/10g，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；提前5天给予50mg/kg中性硫酸小檗碱防治组(HB+LPS)提前5天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射内毒素(LPS，28mg/kg)；提前5天给予50mg/kg中性硫酸小檗碱组(HB+NS)提前5天用中性硫酸小檗碱灌胃(0.2ml/10g，50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射生理盐水(NS)；于内毒素注射后12小时和24小时，观察各组小鼠器官组织结构改变2.实验结果(1)不同时间给药的中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响如图1和表1所示中性硫酸小檗碱能明显降低内毒素血症小鼠的死亡率，LPS攻击前5天给药效果非常明显，有意义的是，即使在LPS攻击后1h给药也能降低内毒素血症小鼠的死亡率。
表1不同给药时间的中性硫酸小檗碱(HB)对内毒素血症小鼠死亡率(％)的影响
表一中，*P＜0.01，#P＜0.05 vs H2O+LPS组。HB(5)+LPS，HB(3)+LPS，HB(1)+LPS分别表示提前5、3天或1小时给予中性硫酸小檗碱(50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射LPS(28mg/kg，ip)；LPS+HB(1)表示腹腔注射LPS(28mg/kg，ip)后1h，再灌胃给予中性硫酸小檗碱(50mg/kg，1次)。
图1描述中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响。图1中，*P＜0.01，#P＜0.05 vs H2O(水)+LPS组。
HB(5)+LPS，HB(3)+LPS，HB(1)+LPS分别表示提前5、3、1天给予中性硫酸小檗碱(50mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射LPS(28mg/kg)；LPS+HB(1)表示腹腔注射LPS(28mg/kg)后1h，再灌胃给予中性硫酸小檗碱(50mg/kg，1次)。
单纯用中性硫酸小檗碱组和对照组在实验观察期间均无小鼠死亡。
图1表明中性硫酸小檗碱能明显降低内毒素血症小鼠的死亡率，LPS攻击前5天给药效果非常明显，有意义的是，即使在LPS攻击后1h给药也能降低内毒素血症小鼠的死亡率。
(2)提前5天给予不同剂量的中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响图2描述不同剂量的中性硫酸小檗碱灌胃5天对内毒素血症小鼠死亡率的影响。HB(25)+LPS，HB(50)+LPS，HB(100)+LPS分别表示提前5天分别给予中性硫酸小檗碱(25，50，100mg/kg，每天灌胃1次)，最后1天灌胃后1h，腹腔注射LPS(28mg/kg)；LPS组表示提前5天用水灌胃，每天灌胃1次，最后1天灌胃后1h，腹腔注射LPS(28mg/kg)。
图2显示50mg/kg的中性硫酸小檗碱灌胃5天(每天1次)能显著地降低内毒素血症小鼠的死亡率，为最佳有效剂量。对照组在实验观察期间均无小鼠死亡。
(3)提前5天给予50mg/kg中性硫酸小檗碱对内毒素血症小鼠器官组织结构的影响LPS注射后12小时和24小时，可见肺间质水肿，大量炎症细胞浸润和肺出血(如图3所示)；LPS注射后24小时，可见肝细胞变性、水肿、坏死和淤血(图4)；肾小管上皮细胞水肿、变性和间质出血(图5)。而中性硫酸小檗碱能明显减轻LPS所致的器官组织结构损伤(图3，4，5)。
图3描述各组小鼠肺的组织学改变(A、B、C、D12h；E，F24h；光镜×250)，其中，A图、E图HB+LPS(中性硫酸小檗治疗组)，中性硫酸小檗碱能明显减轻LPS所致的肺损伤；B图、F图H2O+LPS(内毒素血症组)，LPS注射后12小时和24小时，可见肺间质水肿，大量炎症细胞浸润和肺出血；C图H2O+NS(正常对照组)；D图HB+NS(中性硫酸小檗对照组)，未见异常结构改变。
图4各组小鼠肝的组织学改变(24h，光镜×250)。
其中，A图HB+LPS(中性硫酸小檗治疗组)，中性硫酸小檗碱能明显减轻LPS所致的肝损伤；B图H2O+LPS(内毒素血症组)，LPS注射后24小时，可见肝细胞变性、水肿、坏死和淤血；C图H2O+NS(正常对照组)；D图HB+NS(中性硫酸小檗对照组)，未见异常改变。
图5各组小鼠肾的组织学改变(24h，光镜×250)。
其中，A图HB+LPS(中性硫酸小檗治疗组)，中性硫酸小檗碱能明显减轻LPS所致的肾损伤；B图H2O+LPS(内毒素血症组)，LPS注射后24小时，可见肾小管上皮细胞水肿、变性和间质出血；C图H2O+NS(正常对照组)；D图HB+NS(中性硫酸小檗对照组)，未见异常改变。
权利要求
1.中性硫酸小檗碱用于制备防治内毒素性疾病的药物的用途。
2.用于防治内毒素性疾病的药物组合物，其特征在于包括有效治疗剂量的作为活性成分的中性硫酸小檗碱，以及药物学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物配制成口服制剂。
全文摘要
本发明涉及中性硫酸小檗碱的新用途，尤其是涉及中性硫酸小檗碱用于制备防治内毒素性疾病的药物的用途。本发明所述的用于内毒素血症的治疗，并作为心力衰竭、严重创伤、烧伤、肝脏疾病的辅助药物的组合物，包括有效治疗剂量的作为活性成分的中性硫酸小檗碱，以及药物学上可接受的载体。所述的药物组合物可以配制成口服制剂。本发明将中性硫酸小檗碱用于制备防治内毒素性疾病的药物，可用于内毒素血症的治疗，并作为心力衰竭、肝脏疾病的辅助药物，具有广泛的应用前景。
文档编号A61P31/00GK1757391SQ200510033828
公开日2006年4月12日 申请日期2005年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者王华东, 陆大祥, 李飞, 王彦平, 戚仁斌, 李楚杰 申请人:暨南大学