专利名称：一种乙肝核酸疫苗、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程DNA疫苗领域，具体地说是一种具有治疗性作用的乙型肝炎核酸疫苗，本发明还涉及该疫苗作为治疗乙肝的药物制剂的应用。
背景技术：
乙型肝炎病毒是一种具有很强传染性的病毒，全球目前约有3亿5千万人口感染乙型肝炎病毒，每年大约有1百万感染者死于乙型肝炎及由乙型肝炎诱发的肝硬化，肝坏死和肝癌。乙型肝炎可以分为急性及慢性两种，95％左右急性乙肝患者可以通过治疗而痊愈；5％左右转变成慢性乙型肝炎。绝大多数的慢性乙肝患者成为终生病毒携带者。
中国是世界上罹患慢性乙肝最严重的国家。全国乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带率平均10％(表面抗原携带者约1亿人)。全国人群乙型肝炎感染率高达60％(约有6亿多人已被乙肝病毒感染过)。若不及时有效地清除乙型肝炎病毒(HBV)，约25％的乙肝病毒携带者会发展为肝硬化，5-10％的患者会演变成肝癌。目前人们对乙型病毒性肝炎主要采取预防手段，即接种乙型肝炎疫苗进行预防。预防疫苗主要用于从未感染过的机体，因此天然结构的病毒蛋白可直接作为疫苗抗原。但是已经开发出应用的乙型肝炎病毒疫苗，虽然能对HBV感染起到良好的预防作用，但对感染HBV的机体，却难以发挥治疗和清除病毒的作用。主要原因在于机体对乙肝病毒产生了特异性免疫耐受，免疫系统不能有效地清除病毒。对乙型肝炎的病毒携带者和感染者，尤其是慢性乙肝病毒肝炎这样的的患者，目前，得到世界公认的有效治疗慢性乙型肝炎的药物有两种一种是α-干扰素，另一种是核酸的类似物拉米夫啶。虽然这两种抗病毒药物在临床上均有一定的降低病毒水平的作用，但是同时具有不可忽视的缺点毒性高，而且副作用大。另外，α-干扰素需要长期皮下或肌肉注射；拉米夫啶仅对1/3左右的慢性乙肝病人有效。停药后，患者病毒水平回升是以上两种药物的共同缺点。两种药物之所以有以上缺点是因为药物本身仅仅抑制了病毒复制，却不能彻底清除被病毒感染的细胞，因而会出现停药后，病毒水平回升的现象。因此，开发一种安全、有效地治疗慢性乙肝的疫苗对人类的健康具有很重要的意义。
目前临床上应用的乙肝疫苗主要有以下几种1.血源性乙肝疫苗。血源疫苗曾在全世界范围内广泛使用多年，但它毕竟是用乙型肝炎携带者的血浆来制备的，从理论上讲其安全性并不能达到100％的标准，而且携带者血浆的来源受到限制，对乙肝疫苗的产量和成本都会造成潜在的问题。同时，这种疫苗仅能作为预防疫苗，对已感染病毒的机体不能起到治疗作用。
2.基因工程亚单位疫苗。利用真核细胞做短期或长期的乙型肝炎表面抗原的表达来生产HBV疫苗是一种可行的途径。酵母是一种单细胞真核生物，常用来制备基因工程亚单位疫苗。用酵母制备的重组DNA乙型肝炎表面抗原代表了疫苗的第二次革命。临床试验证明基因工程乙肝表面抗原是安全和有效的，在中国也已经用它取代了以前使用的乙肝血源疫苗。尽管它含酵母蛋白不超过1％，但对其产生变态反应的担忧尚未完全排除。同时，这种亚单位疫苗也只是作为预防疫苗。
3.人工合成多肽乙型肝炎亚单位疫苗。有文献报道可以根据乙型肝炎表面抗原的序列来合成具免疫原性的短肽。但一般来说，这些短肽的免疫原性都很有限，不能导致免疫记忆。这些微弱的免疫反应可能与缺乏T细胞抗原表位有关。
4.乙型肝炎DNA疫苗。DNA疫苗是近年来迅猛发展的一门新技术。它是指将含有编码外原性蛋白基因的真核表达质粒DNA直接接种机体后，在细胞内表达外源蛋白，以激发机体产生特异性细胞和体液免疫应答的一种新型的免疫策略，具有易于构建、制备简单及稳定性好等优点，同时能诱发机体持久的特异性细胞及体液免疫应答，可兼做预防和治疗性疫苗。在Nature，1992，356152-154中，Tang DC等人公开了DNA疫苗技术。1993年Davis等人把含HBV表面抗原(HBsAg)编码基因的表达质粒经肌肉免疫小鼠，成功地诱发了针对HBsAg的细胞与体液免疫(Davis HLet al，Vaccine，1996，14910-915)。之后基因疫苗治疗乙型肝炎成为人们争相研究的热点。Mancini M等将HBV DNA疫苗免疫HBV转基因小鼠发现，小鼠对HBV的免疫耐受状态得以逆转，产生了HBsAg抗体，清除了血液中游离的病毒颗粒，肝内HBV的复制也得以抑制，进一步表明DNA疫苗有可能成为乙型肝炎防治的新手段(Proc Natl Acad Sci USA，1996，9312496-12501)。
目前文献所报道的以激活免疫系统为基础的乙肝疫苗都集中于选用HBV包膜蛋白，HBV核心抗原或HBV多聚酶抗原全蛋白，或单个T细胞抗原决定簇多肽片段，这些制剂虽然对动物模型或急性乙肝患者显示出一定的疗效，但对慢性乙型肝炎患者没有明显的疗效。如何打破机体慢性感染所形成的免疫耐受状态，是抗HBV治疗研究的重要课题。
发明内容本发明的目的就是为了克服目前乙肝疫苗的缺点，提供一种具有强细胞免疫原性可以作为治疗用的、不易产生HBV感染免疫耐受、使用安全的疫苗；同时，本发明还提供一种制备简单、易于构建、稳定性好的乙肝疫苗的制备方法，本发明还涉及这种乙肝疫苗作为治疗乙肝的药物制剂的应用。
抗原表位是抗原诱生特异性免疫应答的最小的结构和功能单位，包括B细胞抗原表位、T辅助细胞表位和杀伤性T细胞表位。由于不同类型免疫应答的下调、缺乏及紊乱是许多疾病的病因，因此以抗原表位为基础的疫苗设计日益受到重视。在表位水平上对抗原性的认识已促成这样一种趋势基于抗原分子的免疫干预手段已不再停留于病原体或天然抗原整体分子水平而开始向表位水平过度。以表位为基础的疫苗包括多肽疫苗和以表位为基础的基因疫苗及多表位疫苗等。其中以多表位为基础的基因疫苗最富有潜力。
本发明正是以多表位基因疫苗的方式入手，构建HBV基因疫苗。本发明首先筛选T细胞抗原决定簇和B细胞抗原决定簇，已知HBV基因中的Pre-S1区和S基因分别编码Pre-S1抗原、Pre-S2抗原和S抗原，组合HBV包膜三种蛋白，此三种抗原均含有诱导机体产生抗HBV中和抗体的抗原决定簇，由于Pre-S1抗原、Pre-S2抗原在HBV与肝细胞相应受体的粘附中起重要作用，而且在自然感染状态下，抗Pre-S2抗体的产生早于抗S抗体，可能与病毒清除密切相关，因此本发明选取编码Pre-S2抗原决定簇的基因序列插入到表达载体上；另外，HBcAg与杀伤性T细胞之间有紧密的关系，本发明在构建HBV核酸疫苗时，也将编码HBcAg T细胞抗原决定簇插入到同一个重组表达载体上；因此本发明在构建HBV核酸疫苗时，将编码T和B细胞抗原决定簇的序列和Pre-S2序列插入到同一个重组表达载体上，同时诱导机体产生特异性体液免疫和杀伤性T细胞激活介导的细胞免疫。
本发明的构建核酸疫苗的真核表达质粒载体采用药学上可以接受的真核质粒载体，可以选用本技术领域的通用载体，包括但不限于pVAX1(美国Invitrogene公司生产)，也可以采用其它真核表达质粒载体pIRESIneo，pCDNA3、pCI、pCMV；本发明还可以加入佐剂，如阳离子脂质体，白细胞介素IL-12，GM-CSF，γ-干扰素等，也可以不加佐剂。所述的药物组合物可以通过常规的免疫途径应用于人类，从而引发免疫应答。所述应用途径包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射、基因枪轰击和鼻粘膜滴注等。
在确定了抗原决定簇以后，进一步确定将抗原决定簇组合后的含有T细胞抗原决定簇和B细胞抗原决定簇的氨基酸顺序，进一步设计出相应的核苷酸片段，并用化学合成方法合成后，用T4 DNA连接酶(美国NEB公司生产)连接，拼接得到重组目的基因片段；用限制性内切酶EcoRI和AlfII消化(美国NEB公司生产)真核表达质粒，消化产物与拼接产物进行琼脂糖凝胶电泳并纯化，将两种纯化的产物用T4 DNA连接酶进行连接，得到重组质粒。其具体步骤为1)选取多个抗原决定簇，设计出多价抗原决定簇多肽；2)用化学合成法合成单链寡核苷酸片段，和T4DNA连接酶连接，得到重组目的基因片段；3)用限制性内切酶消化质粒载体，消化产物与重组目的基因片段用连接酶连接；4)将质粒转化到大肠杆菌中，用发酵培养的方法，生产出含有DNA疫苗的工程菌；5)用商业化的层析柱通过亲和层析的方法，分离纯化4)中的细菌裂解液，得到浓缩的质粒。
本发明的基因疫苗可以有效地诱导HBV特异性杀伤性T细胞的产生，因此可作为慢性乙型肝炎治疗性DNA疫苗，用于打破HBV感染的免疫耐受，对慢性乙型肝炎进行治疗。通过本发明后续的实施例表明，用本发明构建的基因疫苗免疫HLA-A2转基因小鼠产生了小鼠T细胞，能特异性的识别并清除带有HBV多肽以及被乙肝表面蛋白DNA转化的靶细胞。本发明的实施例还表明HBV核酸疫苗能特异性诱导IFN-γ的分泌。
以下将结合附图和实施例详细说明本发明，应当说明的是，实施例是对本发明的技术方案的进一步说明，但并不表明本发明仅限于这些实施例。
图1是本发明乙肝核酸疫苗的结构示意图；图2是本发明的pUV-3质粒的酶切电泳图和插入片断测序图，其中图左为经酶切后的电泳图，P1、P2为DNA疫苗的亚克隆，M1、M2为DNA标准；图右为插入片段的核苷酸序列分析；图3杀伤性T细胞抗原决定簇的免疫原性分析，其中T2+HBV-C18为核心抗原决定簇C18组，T2+HBV-S371为表面抗原决定簇S371组(实施例2的实验组)，T2+Control peptide为非特异性多肽对照组。结果显示当效应细胞与靶细胞比值分别为10∶1，30∶1和100∶1时，实验组即T2+HBV-C18组和T2+HBV-S371组与对照组相比，具有明显的杀伤效应。
图4是本发明的HBV核酸疫苗诱导的针对S371表位的特异性杀伤性T细胞特异性清除含HBV多肽的靶细胞的结果。其中M1为用低浓度的碳氧荧光标记物CFSE标记的细胞，M2为加入了S371多肽的用高浓度的CFSE标记的细胞，C-Mice为对照组的小鼠、I-Mice为免疫组的小鼠(实施例2的实验组)，结果说明核酸疫苗诱导的特异性杀伤性T细胞特异性清除含HBV多肽的靶细胞。
图5是本发明的HBV核酸疫苗诱导的T细胞在体内特异性识别HBV-表面蛋白DNA转化细胞的结果，其中MEM+pGFP为对照组转化细胞，MEM+pHBV-GFP为HBV表面蛋白DNA转化的细胞(实施例2的实验组)，结果说明核酸疫苗诱导的杀伤性T细胞特异性清除HBV表面蛋白转化的细胞。
图6是本发明的HBV核酸疫苗特异性诱导IFN-γ(γ-干扰素)的分泌的示意图，图中，C-peptide为对照多肽组，HBV-S371为乙肝疫苗S371多肽组(实施例2的实验组)，结果显示乙肝疫苗S371多肽组能特异性的诱导IFN-γ的分泌，而对照多肽组却不能。
具体实施方式实施例1 T细胞抗原决定簇和B细胞抗原决定簇的筛选本发明是基于表位的疫苗设计(英文译名为EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN，EBVD)。首先筛选靶抗原，通过高分辨率的免疫识别研究获得表位图谱。以多种杀伤性T细胞实验进行功能筛选，选取具有较强免疫原性的一组表位的组合。辅以一定的旁侧顺序连接这些表位以保证在真核细胞中能加工分解成有效的多肽片段。通过化学合成的方法得到该分子。
本发明选用的抗原决定簇为Pre-S2 B细胞抗原决定簇S26-Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe(SEQ ID NO.2)杀伤性T细胞抗原决定簇1、核心抗原HBcAg杀伤性T细胞抗原决定簇C18-Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val(SEQ ID NO.3)2、表面抗原HBsAg杀伤性T细胞抗原决定簇①S183-Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile(SEQ ID NO.4)②S177-Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu(SEQ ID NO.5)③S348-Gly Lue Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser(SEQ ID NO.6)④S371-Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu(SEQ ID NO.7)以上抗原决定簇通过动物实验表明，具有很强的免疫原性，设计的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，根据多肽的氨基酸序列，设计出其核苷酸序列为SEQ IDNO.9。
实施例2 重组质粒的构建本实施例的构建核酸疫苗的真核表达质粒载体pVAX1购自于美国Invitrogene公司。本发明采用RT-PCR、酶切、连接、转化和序列测定等分子生物学实验方法，参考美国萨姆布鲁克著《分子克隆》第二版。
1.目的基因的制备1)用化学合成法合成单链寡核苷酸片段，其序列为S1.
TTAAGCCACCATGGATAAGGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTTCCTGS2.
CCTAGCGATTTCTTTCCTAGCGTGAAGATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTAAAGTTCTTGTTGACAAG
S3.
AATCCTCACAATAAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAGAGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGS4.
ACAAGAATCCTCACAATACCGCAGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCATTATAAGAATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTTATTATTGA1.
AGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAGGCAGCCACGAACTTGGCCTTATCCATGGTGGCA2.
AACAAGAACTTTAATAGAGGTAAAAAGGGACTCAAGATCTTCACGCTAGGAAAGAAATCGCTAGGCAGGAAA3.
AAAAACCCCGCCTGTAACACTCTGAAGTCCCAATCTGGATTGTTTGAGTTTATTGTGAGGATTCTTGTCA4.
AATTCATAATAGAGGTAAAAAGGGACTCAAGATTCTTATAACTGAAAGCCAAACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAACTGCGGTTATTGTGAGGATTCTTGTCAACAAG2)将上述四对两条互补的寡核苷酸(S1+A1，S2+A2，S3+A3和S4+A4)按常规方法分别退火。然后将四种纯化后的退火产物用T4 DNA连接酶(美国NEB公司产品)进行连接，得到重组目的基因片段。
DNA连接反应的组分包括退火后的DNA片段 14ul5×DNA连接酶缓冲液 4ulT4 DNA连接酶2ul混匀后，置37℃水浴1.5h(小时)，然后加入无水乙醇50ul(微升)，置-70℃中过夜，以最大离心力为12000g(重力加速度)离心15min(分钟)，取沉淀，再加入预冷的70％乙醇200μl，混匀，同上法离心，取沉淀悬浮于20μl pH8.0的TE(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))缓冲液中。
2.真核表达质粒载体pVAX1用限制性核酸内切酶EcoRI和AlfII消化(美国NEB公司产品)，消化产物与拼接产物进行琼脂糖凝胶电泳并纯化。然后将两种纯化的产物用T4 DNA连接酶(美国NEB公司产品)进行连接，得到重组质粒。
DNA连接反应的组分包括pVAX1/EcoRI+AlfII 1ul拼接产物 7ul10×DNA连接酶缓冲液 1ulT4 DNA连接酶 1ul3.重组质粒的转化及鉴定CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，具体实施方案为先将宿主菌加入5mlLB培养液(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0)中，37℃振荡培养至OD600值为0.4时，4℃ 5000rpm(转每分)离心，收集宿主菌；用40ml冰预制的100mmol/L(毫摩尔/升)的CaCl2溶液重悬，冰浴30分钟；再以5000rpm的转速4℃下离心，收集宿主菌；用1-2ml冰预冷的100mmol/L的CaCl2溶液重悬，制成感受态细胞备用。取200μl感受态细胞与2μl连接产物混匀后，冰浴30分钟，42℃热处理45秒，冰浴2分钟，加入800μl的LB培养液，于37℃培养1小时，取200μl转化产物涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃培养12-16小时，筛选获得重组质粒pUV-3所在的细菌克隆。将该菌株扩增后，用经典的碱裂解法抽提纯化，可获得重组质粒pUV-3。对重组质粒进行酶切鉴定和插入片段进行序列分析，结果显示经纯化后的DNA疫苗为3.2k左右大小，经EcoRI和AlfII双酶切后，为0.3及2.9k大小的两条带；测序结果与设计要求完全符合，表明PUV-3质粒构建成功(见图2)。其DNA序列为SEQ ID NO.1。
4.发酵培养含有慢性乙型肝炎治疗性DNA疫苗的工程菌用接种环将待培养细菌划至含有卡那霉素的LB琼脂平板上，于37℃培养过夜。从固体培养基中挑取单菌接种于5ml含有卡那霉素的LB培养液中，于37℃空气摇床中震荡培养(250r/min)过夜；次日，将400ml含有卡那霉素的LB培养液放入2L的三角烧瓶中，加入1.2ml上述过夜菌，于37℃震荡培养5-8h后作为种子液接种于发酵罐中，发酵培养基为基础培养基加入微量元素的溶液，发酵温度37℃，pH值7.0，控制溶氧不低于30％，菌体OD值上升至平台期后停止发酵(12-16h)。收获培养液，离心收集菌体。
5.纯化分离得到慢性乙型肝炎治疗性DNA疫苗用Amersham Biosciences公司的PlasmidSelect进行纯化。碱裂解破菌后，先用Sepharose6 FF层析柱去除RNA，更换缓冲液。再用PlasimdSelect特异吸附超螺旋DNA(ccc).PlasimdSelect是一种以Sepharose 6FF为基架的凝胶，在Sepharose 6FF上共价结合2硫基嘧啶。这种凝胶在2M硫酸铵条件下，特异结合ccc，不与oc结合。从而提高ccc的纯度。第三步采用Source 30Q层析柱去除内毒素以及浓缩质粒。
将经浓缩的质粒经1×PBS(磷酸缓冲液)加工成注射用质粒。
实施例3 抗原决定簇的免疫原性分析(见图3)将S371多肽与C18多肽溶于PBS缓冲液中，使其浓度为1mg/ml。用加入0.5mg/ml聚肌胞作为佐剂的多肽免疫HLA-A2转基因小鼠三次，8-10周龄，每次50μg，隔两周一次，末次注射后十天取小鼠脾细胞，通过体外4小时铬释放杀伤性实验测定其免疫原性。实验结果证实S371多肽组和C18多肽组免疫的小鼠T细胞能特异性的识别并杀伤带有相应多肽的靶细胞，而对照组多肽却不能(见图3)。
实施例4 核酸疫苗的免疫原性分析(见图4和图5)将实施例1的重组质粒免疫HLA-A2转基因小鼠三次，8-10周龄，每次50μg，，隔两周一次，末次注射后十天取小鼠脾细胞，通过酶标分析检测，体外4小时铬释放实验和体内CFSE(碳氧荧光)标记杀伤性实验测定其核酸疫苗的免疫原性。试验结果证实核酸疫苗免疫的小鼠T细胞能特异性的识别并清除带有HBV多肽以及被乙肝表面蛋白DNA转化的靶细胞。将重组质粒p-UV3免疫HLA-A2转基因小鼠，14天后取其脾细胞经细胞因子释放实验测定发现p-UV3能特意性的诱导IFN-γ的分泌(见图6)。
实施例5 乙肝核酸疫苗的体外表达用高度特异性和灵敏性的实验检测转染了质粒DNA的细胞在mRNA水平的表达，即用RT-PCR实验定量转染至HEK 293T细胞的质粒DNA中的mRNA以测定质粒DNA的表达产物。
先用转染试剂盒Lipofectamine 2000(Invitrogen)转纯化的PUV-3质粒样品至HEK 293T细胞中(ATCC)，48小时后停止转染，收获细胞。细胞溶解产物用Qiagen’s Oligotex mini-kit分离纯化mRNA。用Superscript III反转录酶(Invitrogen)转录得到mRNA样品。取10μg总RNA，于50μl体积中作反转录，反转录引物01ig-dT12-18.5μg/ml，dNTP 500mM，10,000U/ml M-MLV，37℃1小时，75℃15分钟灭活翻转录酶，取1μl转录得到的cDNA反转录产物作模板在50μl的体积中作PCR。引物序列如下上游引物(RT 5’)CGTTTAAACTTAAGCCAC和ATGGATAAGGCCAAGTTC下游引物(RT3’)AGAGGTAAAAAGGGACTCPCR反应体系DEPC水39μl，10XPCR缓冲液条件5μl，MgCl21μl(50mM)，dNTP 10mM，1μl，上下游引物各1μl，taq DNA聚合酶1μl，共50μlPCR反应条件cDNA 1μl 94℃-2min预变性，94℃-15sec；57℃-30sec；72℃-30sec循环31次；72℃-5min退火；4℃存放。
取10μl反应样品做电泳鉴定。
表1.多价抗原决定簇的乙肝核酸疫苗的转然细胞的体外表达
以上结果表明，我们设计和构建的核酸疫苗能有效地诱导细胞免疫应答。由于疫苗含有B细胞抗原决定簇，该疫苗可产生中和性抗体，诱导一定的体液免疫。因此，它在临床有重要的潜在应用价值。
本发明的乙肝基因疫苗，具有以下特点1.以肌肉注射、皮内注射等途径接种核酸疫苗，是方便的免疫方法，能诱生抗HBV多个抗原的T细胞免疫应答和中和抗体。
2.以合成的融合基因为基础，再进行适当的修饰、改造，能对不同病程阶段的乙型肝炎患者进行针对性免疫治疗。
3.以上免疫方法在预防HBV感染方面能超过目前的重组乙型肝炎疫苗，克服部分人群对重组乙型肝炎疫苗的无反应和低反应性，在这些人群有极大的应用价值。
4.将HBV抗原融合基因进行原核或真核表达，将纯化的重组抗原作为重组疫苗，其免疫保护作用将超过目前已经使用的重组乙型肝炎疫苗并能在慢性乙型肝炎患者诱导强的T细胞免疫应答。
5.以在淋巴结附近注射的途径接种核酸疫苗，是一种很有效的免疫方法，能高效地诱生抗HBV多个抗原的T细胞免疫应答中和抗体本发明的乙肝核酸疫苗，可以用于制备乙肝预防、治疗乙肝疫苗的制剂。如可以用于制备治疗慢性乙型肝炎疫苗的制剂。
<110>珠海联邦制药股份有限公司<120>一种乙肝核酸疫苗、其制备方法及其应用<160>9<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>2955<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>
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agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 2340aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 2400ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 2460gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 2520aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 2580aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 2640gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 2700aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 2760aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 2820cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 2880cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctgggctttt gctggccttt 2940tgctcacatg ttctt 2955<210>2<211>9<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe15<210>3<211>10<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>Gly Lue Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>乙型肝炎病毒
<400>Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu15<210>8<211>94<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc-feature<400>
Met Asp Lys Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10 15Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Lys Ile Leu Ser Pro Phe20 25 30Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Asn Ser35 40 45Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Arg Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu50 55 60Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Val Gly Lue Ser Pro Thr Val65 70 75 80Trp Leu Ser Val Ile Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu81 85 90<210>9<211>294<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc-feature<400>
ttaagccacc atggataagg ccaagttcgt ggctgcctgg accctgaagg ctgccgcttt 60cctgcctagc gatttctttc ctagcgtgaa gatcttgagt ccctttttac ctctattaaa 120gttcttgttg acaagaatcc tcacaataaa ctcaaacaat ccagattggg acttcagagt 180gttacaggcg gggtttttct tgttgacaag aatcctcaca ataccgcagg tagggctttc 240ccccactgtt tggctttcag ttataatctt gagtcccttt ttacctctat tatg 29权利要求
1.一种乙肝核酸疫苗，为采用药学上可以接受的真核表达质粒载体，选用编码多个抗原决定簇的基因序列，构建的多表位基因疫苗，其特征在于选用的抗原决定簇是SEQ ID NO.2～7。
2.根据权利要求1所述的一种乙肝核酸疫苗，其特征在于所说的编码多个抗原决定簇的基因序列为SEQ ID NO.9。
3.根据权利要求1所述的一种乙肝核酸疫苗，其特征在于所说的真核表达质粒载体为pVAX1，构建的核酸疫苗为pUV-3，其基因序列为SEQ ID NO.1。
4.根据利要求1所述的乙肝核酸疫苗的制备方法，包括以下步骤1)选取多个抗原决定簇，设计出多价抗原决定簇多肽；2)用化学合成法合成单链寡核苷酸片段，和T4DNA连接酶连接，得到重组目的基因片段；3)用限制性内切酶消化质粒载体，消化产物与重组目的基因片段用连接酶连接；4)将质粒转化到大肠杆菌中，用发酵培养的方法，生产出含有DNA疫苗的工程菌；5)用商业化的层析柱通过亲和层析的方法，分离纯化4)中的细菌裂解液，得到浓缩的质粒。
5.根据权利要求1所述的乙肝核酸疫苗用于制备治疗乙肝疫苗的制剂。
6.根据权利要求5所述的乙肝核酸疫苗用于制备治疗乙肝疫苗的制剂，其特征在于该疫苗用于制备治疗慢性乙肝疫苗制剂。
全文摘要
一种乙肝核酸疫苗、其制备方法及其应用，采用药学上可以接受的真核表达质粒载体，选用编码多个T细胞抗原决定簇和B细胞抗原决定簇的基因序列，构建多表位基因疫苗。本发明的乙肝核酸疫苗可用于制备预防、治疗乙肝疫苗的制剂。
文档编号A61K48/00GK1686565SQ200510033869
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者邬世娟, 彭韪, 肖拥军, 郭妍 申请人:珠海联邦制药股份有限公司