专利名称：一种多肽生长因子共聚物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域的生长因子共聚物及其制备方法与应用，特别是涉及长半衰期多肽生长因子共聚物及其制备方法与应用。
背景技术：
组织工程是应用工程学和生命科学的原理和方法，形成和再生有生命的组织，以重建人体病变及缺损组织或器官的科学。组织工程依靠生物医用材料提供组织再生的构架，生物医用材料则通过组织工程的应用而具有生命力。两者结合为实现有生命的人体“部件”的构建，进而设计和构建完整的人体器官提供了可能性。
多肽生长因子是生物体胚胎发生、发育、分化以及人体各种组织损伤后再生修复过程中起重要作用的一系列具有生物活性的多肽。人体组织损伤后的修复依赖于多肽生长因子群体的营养和支持作用。一般地说，多肽生长因子与细胞相互作用时，生长因子作为配体与相应的受体相结合形成复合体。该复合体凝聚在细胞膜表面，而后囊泡化进入细胞内，因溶酶体的存在而分解，因而造成细胞因子在体内半衰期极短。目前，一般是将游离的多肽生长因子埋入高分子凝胶等材料中，使之呈缓释状态，以延长其作用时间。
人体各种组织损伤造成局部缺损的组织再生或组织与器官的克隆形成均需要载体支架的支持。特别表现在再生能力较差的组织器官，例如，中枢神经系统的脑和脊髓等。因此如何解决载体支架的问题是医学上的一个难点。
发明内容
本发明的目的是提供一类多肽生长因子共聚物，这类物质在提供长半衰期多肽生长因子的同时，还为缺损组织的再生提供必要的载体支架。
本发明所提供的多肽生长因子共聚物，是多肽生长因子通过共价键或烃链与生物医用高分子载体物质连接在一起而形成的共聚物。
本发明中，所述生物医用高分子载体物质为带有羟基或氨基或既带羟基又带氨基的物质，其中优选的是壳聚糖、层粘连蛋白(laminin)、L-多聚赖氨酸、聚乙烯醇、胶元、明胶、聚乳酸、透明质酸；所述烃链为甲叉二胺或乙叉二胺。
本发明中，所述多肽生长因子可以是神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)、神经营养素-4(NT-4)、神经营养素-5(NT-5)、神经营养素-6(NT-6)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、酸性成纤维细胞生长因子(a-FGF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(EPO)、胶质细胞株源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、运动神经元营养因子-1(MNTF-1)、运动神经元营养因子-2(MNTF-2)、骨形成蛋白(MBP)、Nogo的抗体和硫酸软骨素的抗体。
这种长半衰期多肽生长因子共聚物中的多肽生长因子通过共价键或烃链与生物医用高分子载体物质连接在一起。
本发明的另一个目的是提供制备上述长半衰期多肽生长因子共聚物的方法。
本发明的这一目的，可以通过四种方法实现，其中，制备多肽生长因子通过共价键与生物医用高分子载体物质连接在一起形成长半衰期多肽生长因子共聚物的方法，可以是以下3种，第一种方法基本上包括以下步骤(1)活化高分子载体向表面含有羟基的生物医用高分子材料中加入氧化剂，优选的是加入溴化氰，在pH7-10条件下，反应5-15分钟；(2)向上述溶液中加入多肽生长因子；(3)室温轻度振荡30-60分钟，0-8℃过夜；(4)用缓冲液冲洗所得产物，并用封闭液封闭未交联的高分子材料中的活化基团；(5)离心冲洗、抽干，得到产品，优选用抽滤漏斗抽干。
该种方法的反应机理如下式 第二种方法基本上包括以下步骤(1)向表面含有氨基的生物医用高分子材料中加入双活性试剂，优选的是加入0.5％-15％的戊二醛或0.5-10％的多聚甲醛，2-8℃充分振荡混匀22-26小时；(2)向上述溶液中加入多肽生长因子；(3)2-8℃下振荡30-120分钟，0-4℃过夜；(4)缓冲液冲洗数次，优选为磷酸缓冲液；(5)抽干、得到产品。
该种方法的反应机理如下式 第3种方法基本上包括以下步骤，利用这种方法可以制备含有糖链的长半衰期多肽生长因子共聚物(1)在酸性条件下，含有糖链的多肽生长因子与过碘酸盐反应，其中优选的是过碘酸纳；(2)加入含有氨基的生物医用高分子材料；(3)加入还原剂，优选的是NaBH4；(4)抽干、得到产品，优选用抽滤漏斗抽干。
该种方法的反应机理如下式 制备多肽生长因子通过烃链与生物医用高分子材料载体物质连接在一起形成长半衰期多肽生长因子共聚物的方法，基本上包括以下步骤；(1)活化高分子载体向表面含有羟基的生物医用高分子材料中加入氧化剂，优选的是加入溴化氰，在pH7-10条件下，反应5-15分钟；(2)在弱碱性条件下，向上述溶液中加入烃链物质，其中优选的是甲叉二胺或乙叉二胺；(3)加入多肽生长因子，脱水反应；(4)抽干、得到产品，优选用抽滤漏斗抽干。
该种方法的反应机理如下式
本发明对使用的生物材料的表面进行分子设计，将一种或多种多肽生长因子以共价键的形式固定在生物医用高分子材料的表面。多肽生长因子与细胞表面的受体结合后，不随血液或组织液流走，并且由于共聚物体积较大，不易被细胞吞嗜和消化，稳定地在局部起作用，使其半衰期延长，制成有特殊功能的“智能”材料。以此充当种子细胞、基质或可容性因子的配体或受体，使表面形成一个能与生物活性相适应的过渡层。同时生物医用高分子材料还起到了用于诱导组织或器官再生的基本活性基质载体的作用，为再生物质提供了据以附着的骨架。从理论上来说，无论哪种多肽生长因子都可以用本发明的方法与生物医用高分子材料载体物质进行连接。
由于有时发生多肽生长因子与生物医用高分子材料结合后，多肽生长因子受生物医用高分子材料的空间位阻影响，不能与细胞的受体充分结合，影响多肽生长因子的作用。在多肽生长因子与生物医用高分子材料载体之间增设一烃链“手臂”，解决了由于载体的空间位阻关系，使细胞的受体不能直接接触到多肽生长因子，而造成的结合在载体表面的小分子蛋白质或肽类/激素等可能产生的无效作用，“手臂”可以减少空间位阻、增加配基的活动度。如图2所示，载体4上结合的多肽生长因子配基5当加上“手臂”6后，活动度明显增强，使配基5能够有效克服空间位阻，与靶细胞7的受体部位8有效结合。
本发明的长半衰期多肽生长因子共聚物可以在重建动物体病变或缺损组织或器官，制造重建动物体病变或缺损组织或器官的药物中得到广泛应用。
图1为鸡胚背根神经节(DRG)在结合有神经生长因子(NGF)生物医用材料载体的作用下生长的神经纤维(显微镜照片)图2为共聚物引入“手臂”原理示意3为大鼠脑损伤的修复图4为猴神经损伤的修复，示新生的脊髓神经纤维具体实施方式
实施例1神经生长因子与壳聚糖结合形成的长半衰期神经生长因子共聚物神经生长因子(NGF)是神经系统最重要的生物活性物质之一，也是最早发现和最典型的神经营养因子。它影响外周和中枢神经系统某些神经元的存活和分化。近年来的实验证明，成年人或动物中枢神经系统(大脑皮层和脊髓)的细胞损伤后可以再生。将本发明具有神经营养活性的共聚物应用于中枢神经系统损伤局部的活性基质，起到再生支架和促进再生作用。例如，脑外伤及脊髓损伤。
长半衰期神经生长因子共聚物的生产方法，包括以下步骤
1、向100ml 20％壳聚糖中加入5％的溴化氰溶液10ml，在pH7条件下反应15分钟，使壳聚糖表面的羟基活化；2、向上述溶液中加入300ug神经生长因子(NGF)；3、室温轻度振荡40分钟，4℃过液；4、0.1M交联缓冲液(0.1MNaHCO3及0.5MNaCl)冲洗掉未交联的多肽生长因子；5、在pH8.0条件下，用0.1MTris-HCl(或1M elhanolamint)封闭液封闭未交联的被活化了的壳聚糖的羟基；6、冲洗掉封闭液，用抽滤漏斗抽干，得到产品。
在该实施例中，可使用的生物医用材料载体还可以是聚乙烯醇、聚乳酸、层粘连蛋白(laminin)、明胶、胶元、L-多聚赖氨酸和透明质酸等表面具有羟基的物质。而神经营养素类的脑源性神经营养因子、神经营养素-3等均可用上述方法进行共聚偶联。
实施例2碱性成纤维细胞生长因子与壳聚糖结合形成的带有“手臂”的长半衰期碱性成纤维细胞生长因子共聚物碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可促进创面愈合，用于烧伤创面、慢性创面、体表溃疡、褥疮、和新鲜创面(包括外伤，供皮区创面，手术创伤等)。并且已经作为基因工程药物在临床应用。
带“手臂”的长半衰期碱性成纤维细胞生长因子共聚物的生产方法，包括以下步骤1、在pH8.5的条件下，向100ml 20％壳聚糖溶液中加入5％的溴化氰溶液10ml，反应10分钟，使壳聚糖的羟基活化；2、在pH8.5的条件下，向上述溶液中加入10％甲叉二胺3ml，使之进行脱水反应，甲叉二胺即为所要连接的“手臂”；3、加入500ug碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，使之进行脱水反应。
4、用抽滤漏斗抽干，得到产品。
在该实施例中，可以用加入脂族二胺分子的烃链长短来控制插入“手臂”的长短，可以用乙叉二胺等多种物质。
实施例3表皮生长因子与壳聚糖结合形成的长半衰期表皮生长因子共聚物表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)的生物学作用十分广泛，它对多种组织来源的上皮细胞都有很强的促分裂作用。提示它可能会作为一种创伤愈合因子。另外，EGF还刺激各种间质细胞的增殖，包括，角膜内皮细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和软骨细胞等，这又为上皮细胞，包括整个表皮的生长提供了所需的物质基础。例如，Brown等人的实验证明了其在切割伤和烧伤愈合中的作用。
长半衰期表皮生长因子共聚物的生产方法，包括以下步骤1、向表面含有氨基的100ml 30％壳聚糖溶液中加入1ml 15％的戊二醛，反应23小时；2、蒸馏水多次冲洗后，加入500ug表皮生长因子(EGF)；3、4℃下振荡60分钟，4℃过夜；4、磷酸缓冲液冲洗3次；5、抽滤漏斗抽干、得到产品。
在该实施例中，只要是表面含有氨基的生物医用材料即可用此法，所偶联的多肽生长因子是多样的。
实施例4、红细胞生成素与胶元结合形成的长半衰期共聚物红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白质。临床治疗部分贫血有较好的疗效。现已作为药物用于临床。
长半衰期红细胞生成素共聚物的生产方法，包括以下步骤1、在pH6.0条件下，向含有糖链的300ug红细胞生成素中加入5％过碘酸钠100ml；2、向上述溶液中加入含有氨基的胶元0.1mg，反应2小时；3、加入2％NaBH45ml，生成稳定的终产物；4、抽滤漏斗抽干，得到产品。
在该实施例中，只要是多肽生长因子含有糖链，生物医用材料含有氨基，即可用该法。
实施例5本发明长半衰期共聚物的功能验证1、采用体外细胞培养的方法检测实施例1产品诱导鸡胚背根神经节(DRG)神经纤维生长的作用。
用实施例1的产品进行重复细胞培养实验取鸡胚背根神经节(DRG)置于含有无血清培养基的培养皿中，将上述共聚物加入到培养皿中，12-72小时后，可见DRG周围有大量的神经纤维长出，重复上述实验，将第一次培养皿中的共聚物无菌操作取出，放入第二次含有DRG的培养皿中，对照组则采用相同剂量的NGF(10-30ng/ml)。结果表明，没有偶联载体的神经生长因子在重复培养中失效，而本产品作用时间大大延长，可重复培养3-5次。如图1所示，培养12-72小时后，鸡胚背根神经节(DRG)3在含有神经生长因子(NGF)的载体2的作用下，DRG的神经纤维1己沿着载体2所搭建的支架为依托生长。
2、实施例1的产品对大鼠脑损伤的修复以wistar大鼠制作的脑损伤模型进行修复实验，将大鼠大脑皮层运动区制作成为直径1mm，深1mm的损伤区，将生物活性载体移植并填满损伤区。手术后1、3、6、12个月进行病理切片观察。结果表明，加入本发明神经生长因子(NGF)与壳聚糖或胶元结合形成的共聚物，6周后融合，无明显排斥反应，载体支架内部有神经纤维长入并形成网络联系，而对照组仍为空洞(如图3所示)。
3、实施例1的产品对大鼠和猴脊髓损伤的修复以wistar大鼠和高等灵长类动物-猴制作的脊髓损伤模型，将生物活性载体装入人工神经导管并移植到损伤局部，实验结果表明依据本发明制作的长半衰期多肽生长因子共聚物可以诱导脊髓组织结构的再生、生理机能的重建和行为障碍的恢复。移植12个月后，实验组动物的脊髓损伤部位已经有新生的脊髓神经纤维形成(如图4所示)，而对照组单纯的人工神经导管和单纯损伤组则无神经纤维束的再生。
4、实施例2的产品对烧伤的治疗作用利用该产品以不与载体相偶联的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为对照在人和动物模型的烧伤和褥疮上证明了其对创面愈合的速度快于对照组。临床试验II度烧伤病人10例，含有100AU/CM2载体细颗粒涂在患处，用纱布覆盖，7日后基本愈合；最终使用量为100AU，而相同条件下，对照组病人使用bFGF粉剂，每日1次换药，100AU/CM2，用纱布涂于患处，最终使用量为700AU，而愈合程度却低于实验组。说明bFGF与材料载体结合后有效期延长，减少了bFGF的用量。
5、实施例3的产品对褥疮的治疗作用利用该产品以不与载体相偶联的表皮生长因子(EGF)为对照，在皮肤损伤人和动物模型上证明了其对创面愈合的速度快于对照组。临床试验褥疮病人6例，将含有300AU/CM2载体细颗粒涂在患处，用纱布覆盖，15日后基本愈合，中间换药1次。最终使用量为600AU，而相同条件下，对照组病人使用EGF粉剂，每日1次换药，300AU/CM2，用纱布涂于患处，最终使用药量为2100AU，而愈合程度低于实验组。说明EGF与材料载体结合后有效期延长，并减少了EGF的用量。
6、实施例4的产品对贫血动物模型的治疗作用将实施例4的产品按照常规方法制成注射液。以苯肼诱发的贫血小鼠为模型(贫血小鼠模型的血红蛋白，Hb≤30g/L血液)，实验组和对照组各10只。经尾静脉给药十日，每日的用量为0.5％EPO(0.2ml)。取血化验证明，实验组被检测血样Hb的量升高至120g/L)，而对照组每日给予同样剂量，被检测血样Hb的量升高至80g/L。说明胶元与EPO连接后其在体内的半衰期已经延长，提高了疗效。
权利要求
1.长半衰期多肽生长因子共聚物，是多肽生长因子通过共价键或烃链与生物医用高分子载体物质连在一起而形成的共聚物。
2.根据权利要求1所述的多肽生长因子共聚物，其特征在于所述生物医用高分子材料载体物质为带有羟基或氨基或既带羟基又带氨基的物质。
3.根据权利要求2所述的多肽生长因子共聚物，其特征在于所述生物医用高分子材料载体物质为壳聚糖、层粘连蛋白、L-多聚赖氨酸、聚乙烯醇、胶元、明胶、聚乳酸或透明质酸；所述烃链为甲叉二胺或乙叉二胺。
4.根据权利要求1或2所述的多肽生长因子共聚物，其特征在于所述多肽生长因子为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5、神经营养素-6、碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、红细胞生成素、胶质细胞株源性神经营养因子、睫状神经营养因子、运动神经元营养因子-1、运动神经元营养因子-2、骨形成蛋白(MBP)、Nogo的抗体和硫酸软骨素的抗体。
5.一种制备多肽生长因子通过共价键与生物医用高分子材料载体物质连在一起形成的共聚物的方法，基本上包括以下步骤(1)活化高分子载体向表面含有羟基的生物医用高分子材料载体中加入氧化剂，优选的是加入溴化氰，在pH7-10条件下，反应5-15分钟；(2)向上述溶液中加入多肽生长因子；(3)室温轻度振荡30-60分钟，0-8℃过夜；(4)用缓冲液冲洗所得物，并用封闭液封闭未交联的高分子材料中的活化基团；(5)离心冲洗、抽干，得到产品。
6.一种制备多肽生长因子通过共价键与生物医用高分子材料载体物质连接在一起形成的共聚物的方法，基本上包括以下步骤(1)向表面含有氨基的生物医用高分子材料中加入双活性试剂，优选的是加入0.5％-15％的戊二醛或0.5-10％的多聚甲醛，2-8℃充分振荡混匀22-26小时；(2)向上述溶液中加入多肽生长因子；(3)2-8℃下振荡30-120分钟，0-4℃过夜；(4)缓冲液冲洗数次，优选为磷酸缓冲液；(5)抽干、得到产品。
7.一种制备多肽生长因子共聚物通过共价键与生物医用高分子材料载体物质连接在一起形成含有糖链的多肽生长因子共聚物的方法，基本上包括以下步骤(1)在酸性条件下，含有糖链的多肽细胞因子与过碘酸盐反应，其中优选的是过碘酸纳；(2)加入含有氨基的生物医用高分子材料；(3)加入还原剂，优选的是NaBH4；(4)抽干、得到产品。
8.一种制备多肽生长因子通过烃链与生物医用高分子材料载体物质连在一起形成的共聚物的方法，基本上包括以下步骤(1)活化高分子载体向表面含有羟基的生物医用高分子材料中加入氧化剂，优选的是加入溴化氰，在pH7-10条件下，反应5-15分钟；(2)在弱碱性条件下，向上述溶液中加入烃链物质，其中优选的是甲叉二胺或乙叉二胺；(3)加入多肽生长因子，脱水反应；(4)抽干、得到产品。
9.权利要求1-4所述的多肽生长因子共聚物在制造重建动物体病变或缺损组织或器官的药物中的应用。
10.权利要求1-4所述的多肽生长因子共聚物在体外重建动物体病变或缺损组织或器官中的应用。
全文摘要
本发明公开了长半衰期多肽生长因子共聚物及其制备方法与应用，以解决现有多肽生长因子半衰期短，再生组织或器官缺乏支架的问题；本发明共聚物是多肽生长因子通过共价键或烃链与生物医用高分子载体物质连接在一起而形成的共聚物，制备上述物质的方法有四种。本发明共聚物在制造重建动物体病变或缺损组织或器官的药物、新型医用材料以及组织工程产品中可以得到广泛的应用。
文档编号A61K38/03GK1837239SQ20051005645
公开日2006年9月27日 申请日期2005年3月23日 优先权日2005年3月23日
发明者李晓光 申请人:李晓光