制备微晶的方法

专利名称：制备微晶的方法
技术领域：
本发明通常涉及包含一个或多个水溶性晶体的微米或亚微米的颗粒，其中所述晶体具有包含一个或多个生物活性分子的表面涂层，以及形成这些颗粒的有效方法和筛选形成这些颗粒的优选条件的快速方法。所述颗粒适合于药物制剂。
背景技术：
被结合到本文中作为参考的WO00/69887是本发明人以前的申请，其涉及蛋白质包被的微晶(PCMCs)。在WO00/69887中公开的包被的晶体通常通过添加水可混溶溶剂从水性混合物中共沉淀出来，所述水性混合物包含共沉淀剂和生物活性分子的饱和溶液。然而，没有关于使用未饱和溶液(less than saturated solution)是有利的公开内容。
在WO00/69887中，描述了通过添加共沉淀剂和生物活性分子的饱和水溶液到过量溶剂中产生PCMCs。获得有效混合的在WO00/69887中的优选方法是将水溶液逐滴添加到过量有机可混溶溶剂中，同时剧烈混合。然而，这种间歇式方法具有许多缺陷a)因为溶剂的水含量在整个过程中不断增加，沉淀条件持续变化。已经发现不同的起始的水含量导致晶体的不同大小和形状以及生物活性的变化；b)在其中已经包含不断增加量的晶体的混悬液中进行沉淀。这将增加新生晶体融合到已经形成的晶体上的可能性。
c)如果需要大规模的批量，难以用搅拌式间歇式反应器获得无过分剪切力的高效搅拌。通常需要高效搅拌产生更小的晶体并阻止晶体“粘合”成团聚体。然若，高剪切力可以造成对生物活性分子的损害诸如蛋白质变性或核酸的“切口形成”。快速混合的备选方法诸如雾化水性流入物以提供非常小的液滴也具有来自剪切力和界面的变性过程的潜在问题；d)生物活性分子和共沉淀剂需要作为混合物进行制备和贮存直到被添加到溶剂中。如果，例如生物分子在混合物或其它中是不稳定的，其需要例如防止聚集，沉淀或化学改性的添加剂或稳定剂的存在，这可能会导致问题。如果这些需要以阈值浓度以上的浓度存在，它们可能会干扰共沉淀过程；e)获得确定进行共沉淀方法的最佳条件的自动筛选方法从而产生具有理想的物理性质和优化的生物活性的生物活性分子包被的微晶是困难的。这个问题的出现是因为一旦共沉淀剂和生物活性分子混合在一起，影响共沉淀过程的许多参数达到固定值并且不能相对于彼此变化。例如，在没有首先制备其它的水性混合物的情况下，在颗粒中的水-溶剂比率，所用的共沉淀剂的浓度和生物活性分子负载不能相对于彼此来变化。这是耗时的，无效的并且可能引入误差。此外，如果只能够以低量获得生物活性分子和/或生产它们花费巨大，那么制备许多不同的水溶液可能变得不可能或不经济。需要被筛选的相关物理性质包括大小，形状，结晶性，ζ电势，空气动力学性质，溶解性和流动性。影响生物活性的因素包括在微晶上的生物活性分子的产量和负载，水含量和生物活性分子结构、组成和聚集状态的变化。大量可变参数意味着存在对于容许筛选产生颗粒的最佳条件的新的有效方法的明显需要，所述颗粒理想的物理性质，具有优化的生物活性。例如，这将使药物制剂更迅速地被优化。
尽管已经公开了使用超临界流体制备干蛋白质粉末的连续方法，这些方法没有提供蛋白质包被的微晶，并具有不利之处，即它们需要使用专用的高压泵系统。此外，因为超临界二氧化碳和水仅在窄范围内是可混溶的，必要的是应用第三溶剂，并使用能够利用超临界流体的低粘性和高扩散性的采用先进技术的混合装置。一个另外的严重问题是，在存在水的时候，超临界二氧化碳变成酸性，因此该方法不是很适合于处理对低pH敏感的许多生物活性分子。
因此显而易见的是，存在对于开发制备蛋白质粉末的备选连续方法的需要，其a)可以应用于更宽范围的生物活性分子；b)可以应用于常用溶剂；c)操作更容易并且更廉价；和d)可以用于蛋白质包被的微晶的产生。
本发明的至少一个方面的目的是消除或减少前述至少一个或多个不利之处。
发明简述按照本发明的第一个方面，提供形成生物活性分子包被的微晶的连续方法，其包括下列步骤(a)提供包含共沉淀剂分子的第一水溶液；(b)提供包含生物活性分子的第二水溶液；(c)提供包含水可混溶溶剂的第三溶液；(d)基本上同时混合所述第一水溶液，所述第二水溶液和所述第三溶液；或将第一和第二水溶液的任一种与第三溶液混合并随后混合以余下的第一水溶液和第二水溶液的任一种；从而使共沉淀剂和生物活性分子的共沉淀开始，导致所述微晶的形成；和(e)收集微晶的混悬液。
令人惊奇地发现，提供包含共沉淀剂分子的第一水溶液，包含生物活性分子的第二水溶液，和包含水可混溶溶剂的第三溶液的分开的溶液是高度有利的。例如，作为两个单独的溶液提供共沉淀剂分子和生物活性分子有利地使这些成分能够被贮存和被引入从包含不同添加剂和/或pH的溶液中的共沉淀过程，并且对于所述溶液能够在不同的温度和压力上进行保存。
至于在本文中的连续法，意味着其中制备的溶液被连续混合的方法。所述溶液可以被持续混合，例如通过将分别的溶液泵送到混合装置或混合装置中。可以将至少三种单独的溶液基本上同时在一个装置中混合在一起。
备选地，连续的过程可以发生，其中可以在第一个步骤中，将包含共沉淀剂分子的第一水溶液加入包含水可混溶溶剂的第三溶液，并在随后，在第二个步骤中，将包含生物活性分子的第二水溶液加入。在备选的实施例中，可以在第一个步骤中将包含生物活性分子的第二水溶液加入包含水可混溶溶剂的第三溶液，并在随后在第二个步骤中加入包含共沉淀剂分子的第一水溶液。
可以同时将合并的混合物泵出混合装置直到已经形成足够量的微晶。
在制备具有表面涂层的包含一个或多个生物活性分子的微晶的制剂的递增过程中，使结合于载体晶体的生物活性分子的产量最大化可能是理想的。这是因为，制备和纯化，例如治疗性蛋白可能是非常昂贵的。因此，使在固定到载体晶体上的过程中损失的生物活性分子的量最少化可以是理想的。这种损失可能是来自仍存在于可混溶溶剂中的以亚微米颗粒形式存在的未结合的生物活性分子，或来自结合的生物活性分子的生物活性的损失。通过在固定的时期内进行共沉淀过程，可以测试结合方法的效率，从而引入已知量的生物活性分子，接着通过过滤从沉淀的溶剂中分离形成的微晶，并测量结合在形成的微晶中的被引入的生物活性分子的百分比。典型地，将生物活性分子结合到载体晶体上的效率可以大于约20％，大于约50％，大于约80％，更优选地大于约90％。
令人惊奇地发现生物活性分子诸如蛋白质在共沉淀过程中的结合效率对于水溶液的pH和被引入的盐或缓冲液可以是特别敏感的。在低盐浓度诸如少于0.1M或优选地少于0.01M，通常可以发现结合效率提高，如果用在共沉淀中的水溶液中的pH更接近于生物活性分子诸如蛋白质的pI。不希望被理论所束缚，可能的是具有减少的总电荷的生物活性分子可以更能够集簇成纳米颗粒，并且这些还可以接着更好地包装在一起来包被载体晶体的表面。
还发现pH还可以影响结合的生物活性分子的量，其可以成功地，例如，与抗体诸如IgG重构。在这些情形中，优化共沉淀pH也可以是理想的。
不幸的是，当使用在WO00/69887中描述的先前公开的两管路连续法进行共沉淀过程时，那么改变水溶液的pH可存在难度，特别是如果所用的共沉淀剂具有缓冲能力-例如氨基酸。在这些情形中，可能必要的是，引入显著量的pH控制剂诸如酸，碱或缓冲剂以将浓缩的共沉淀剂溶液调向接近于生物活性分子的pI的pH。这些高浓度的控制剂的存在可以干扰共沉淀过程并且可以导致减少量的载体物质沉淀。在最终固体制剂中的大量控制剂的存在通常也可以是不需要的。例如，在重构具有不理想张力的溶液后，可获得超过可接受的调节限度的不利的渗透压或离子强度从而使得它们不适合于肠胃外施用。因此清楚的是，尽管pH的变化可改善情况，在WO00/69887中所述的两管路方法未提供对于高效制备具有包含一种或多种生物活性分子的表面涂层的微晶的商业需求的充分路径。这对于具有远离选择的共沉淀剂的pI的pI的生物活性分子特别如此。
令人惊奇的是，现在已经发现，如果可以将不同pH的共沉淀剂和生物活性分子溶液作为单独的液流引入连续的混合装置中并迅速混合以水可混溶溶剂，与获得有效制备过程相关的困难可以被克服。可以被称为三管路方法的这种方法可以用不同pH的水性共沉淀剂和生物活性分子溶液进行操作，与在无缓冲情况下操作的两管路方法的应用相比，其可以显著改善生物活性分子结合诸如蛋白质结合的效率。所述方法还可以用于获得更高水平的，例如可溶的抗体，而不需要缓冲共沉淀剂溶液。这三种液流的混合可以基本上同时进行，或可以首先将水性液流的一种或另一种与可混溶溶剂组合，接着将该混合物迅速与其它的水性液流进行组合。观察到的这种提高的结合是令人惊奇的，因为预期在两种水性液流中的成分之间的质子的交换在混合后将是非常迅速的并且在所述液流之间的任何开始的差异将因此被迅速消除。
在本发明中，可以将包含共沉淀剂分子的第一水溶液以高于包含生物活性分子的第二水溶液的速率引入混合过程中，包含水可混溶溶剂的第三溶液可以以甚至更高的速率被引入。添加的相对速率可以按照需要改变以提供在形成的微晶的混悬液中的具体的最终组成和水含量。
可以选择包含共沉淀剂分子的第一水溶液的pH以提供充分形成的共沉淀剂微晶的快速沉淀。在两性离子化合物的情形中，最合适的pH可以通常大约是这样的pH，其中全部是中性分子存在于溶液中。对于氨基酸而言，适合的pH可以方便地通过将纯化合物的固体晶体溶解在水中制备约饱和浓度的浓缩溶液来获得。
使用例如生理可接受的缓冲剂可以将包含生物活性分子的第二水溶液缓冲到不同于包含共沉淀剂分子的第一水溶液并更接近于生物活性分子的pI的pH。缓冲液浓度可以选自少于约0.1M，少于约0.05 M，和优选地少于约0.02M中的任何。可以对pH优选地进行选择从而使生物活性分子在水溶液中保持可溶，并在沉淀前的保存阶段中仍旧保持生物活性分子的生物活性。为了使结合效率最大化，用于包含生物活性分子的第二水溶液的pH可以通常在其pI的4.5个pH单位，优选地在其pI的3个pH单位，最优选地在其pI的2个pH单位。当生物活性分子的浓度增加时，进一步离开pI以预防生物活性分子的沉淀或聚集可能是必要的。对于本领域技术人员而言清楚的是，需要保持缓冲成分的量，例如在特定pH的治疗性蛋白质溶液的量将比缓冲更大体积的浓缩的共沉淀剂溶液所需的量少的多。这对于可电离的共沉淀剂，诸如，例如氨基酸而言是特别有利的。
因此，本发明提供增加共沉淀过程的效率，同时使被引入最终形成的微晶的缓冲化合物的比例最小化的方法。相似地，与在WO00/69887中所述的两管路方法的被引入微晶的其它添加剂相比，从共沉淀剂溶液中分离生物活性分子溶液还可以降低被引入微晶的其它添加剂，诸如盐、表面活性剂、稳定剂和抗氧化剂的量。
在某些应用诸如对于沉淀后涂层，混合的共沉淀系统或交联而言，可能必要的是通过另外的入口端或通过被连续地置于共沉淀装置之前或之后的其它混合装置，在另外的溶液中进行制备，泵送和混合。相似地，对于筛选应用，另外的水性组成液流可以有利地用于使共沉淀剂和生物活性分子的起始或最终浓度以系统方式变化。还应该理解的是，尽管大部分应用指三-液流混合过程，任何超过三的液流混合过程也在本发明应用范围内。例如，可以使用四-液流，五-液流，六-液流，七-液流，八-液流，九-液流或十液流方法。
所述的连续法的优选的特征是通过混合装置的组合流速高从而使组合溶液在混合装置中的停留时间非常少。还优选的是确保在每个装置中发生基本上完全的混合。可以将停留时间计算为用每单位时间通过装置泵送的溶液的总体积除以混合室的体积。典型地，停留时间少于约5秒，优选地少于约1秒，最优选地少于约0.2秒。连续法的这种特征使溶液快速并充分地混合，同时在混合室中存在最短的时间确保微晶形成的开始在整个过程中，在相同的环境中发生。连续的起始或成核作用条件，可以导致形成具有更均一大小和形状的微晶，并且有助于使与微晶的融合最小化。具有更窄大小和形状分布的颗粒通常更易于处理，并且，例如更适合于产生药物制剂，因为其更易于制备单位剂量。
本发明人令人惊讶地发现使用高流速三-液流的连续的混合装置进行共沉淀过程，将浓缩的共沉淀剂水溶液和生物活性分子溶液通过单独连续的液流引入混合装置是可能的。在混合流动装置中，这些单独的水性流入物混合以第三更多的水可混溶溶剂的流入物，并且共沉淀起始。混合物可以流出混合装置，得到的颗粒的混悬液可以在收集容器中收集或通过例如，浓缩、过滤或离心，随后干燥立即进行进一步的处理。
三液流方法的成功应用是令人惊讶的，因为以前显示同时逐滴添加蛋白质水溶液和单独的浓缩的共沉淀剂溶液到包含过量溶剂的容器中，同时快速搅拌，没有导致蛋白质包被的微晶的形成。相反，其导致两种单独的成分，即蛋白质团聚体和未包被的共沉淀剂晶体的沉淀。因此，认为两种成分，蛋白质和共沉淀剂需要在添加到水可混溶溶剂前紧密混合。不希望被理论所束缚，似乎可以在高流速沉淀器中获得的三种流入物的有效混合导致接近稳态的条件，从而使由生物活性分子导致的共沉淀剂晶体的成核作用与自成核作用竞争，导致包被的晶体的形成，而不是预期的相分离。
令人惊讶地，三液流过程可以在延长的时期内进行操作，而不会象关于这样的共沉淀过程所预期的那样阻塞入口管。有利地，发现在整个操作周期中，通过所述方法产生的颗粒在大小，形状和产量上是高度一致的，说明共沉淀条件保持不变。另一个优点是所述流动系统可以自动运行许多小时，并且在这样进行的时候，产生大量颗粒。
存在显著的优势是因为，与其中需要引入预形成的水性混合物的两液流装置相比，可以将水溶液单独引入在三液流混合装置中的混合器中。这些优势中的一些与这样的事实相关，即每种溶液可以在不同的条件下保存并且具有不同的组成。例如，生物活性分子溶液可以保存在低温诸如少于10℃的温度，并且可以包含以某种浓度存在的稳定剂诸如表面活性剂或其它添加剂，所述浓度高于如果溶液组合时可能的浓度。当要求在微晶上的蛋白质重量百分比负载低的时，这特别如此。在三-液流过程的这种情形中，需要将比共沉淀剂溶液少的多的生物活性分子溶液引入混合器中，从而使在共沉淀过程中和在最终的颗粒中存在的添加剂和稳定剂的总量减少。
分离第一和第二水溶液具有这样的优势，即其使对形成优选形态的颗粒的最佳条件的筛选更为有效，并使需要的生物活性分子的量最少化。例如，彼此独立地改变生物活性分子与共沉淀剂的比率和水-溶剂的比率是可能的。还发现所述三管路系统可以用于提供非常有效的析因试验设计流程，其使优化产生颗粒的系统所需的分离实验和方案的数量最少化。因此，使用部分析因，有效筛选具有适合于特定应用的性质的包被的微晶是可能的。此外，关于三液流方法，所用的生物活性分子溶液可以直接从，例如厂商或下游纯化方法供应。这具有使在共沉淀和产生颗粒前的溶液操作的量最少化的优势。操作会通过，例如聚集或吸附到容器或过滤器而增加一些生物活性分子损失的风险。
因为全部系统可以被密封和灭菌并且三个液流的每个可以独立地通过灭菌过滤器进行过滤，整个过程还可以按照药物制剂生产的需要来进行灭菌。
典型地，包含共沉淀剂的第一水溶液可以作为基本上饱和的或高度浓缩的水溶液进行制备，其在制备的温度上是30-250％的平衡的饱和浓度。如果需要，所述第一水溶液可以在不同的温度或pH上贮存，并且可以包含不同的添加剂诸如来自包含生物活性分子的第二水溶液的溶剂。更高的温度诸如介于约30℃和约95℃之间的温度可以用于增加溶解在水溶液中的共沉淀剂的浓度并且溶剂的添加可以根据需要用于降低或增加溶解度。共沉淀剂的起始浓度影响可以在混合以其它溶液后获得的过饱和的程度，并且这可以影响获得的微晶的大小。对于可能，例如更好的适合于肺用制剂的更小的微晶而言，通常需要更高的起始浓度。使用约150％的室温饱和局限的浓度可导致大于20％的颗粒大小的减少。这导致提高的空气动力学性质诸如微细颗粒级分。优选地，应该对共沉淀剂进行选择从而与在水溶液中比较，在包含水可混溶溶剂的第三溶液中显示基本上更低的溶解度。
包含生物活性分子的第二水溶液可以通过从将溶解在水溶液中的固体制剂，例如作为粉末开始进行制备。备选地，所述生物活性分子或分子的混合物可以作为溶液或混悬液来提供。所述溶液还可以包含适合于在水溶液中稳定生物活性分子的赋形剂。这些赋形剂是本领域众所周知的并且可以包括表面活性剂，缓冲剂，抗氧化剂和稳定剂。第二水溶液的pH可以不同于第一水溶液。例如，可以对pH进行选择以比在第一溶液中更接近于生物活性分子的pI。制备后，溶液可以在这样的条件下进行贮存，所述条件使在添加前的时期内生物活性或完整性的损失最小。这可能需要溶液在这样的温度上贮存，所述温度不同于用于其它溶液的那些诸如例如少于10℃或在约4℃。所述溶液还可以在无菌环境下，诸如氩气、氮气、氖气和氦气中以防止化学降解。
包含共沉淀剂分子的第一水溶液和包含生物活性分子的第二水溶液可以混合以基本上包含例如，水混溶性有机溶剂或水可混溶溶剂的混合物的第三溶液，优选其中溶剂或溶剂混合物基本上与共沉淀剂溶液充分混溶的第三溶液。典型地，将水溶液添加到过量水混溶性有机溶剂中。过量的充分水混溶性有机溶剂是这样的，其使溶剂/水溶液的最终水含量通常少于约30vol％，典型地少于约10-20vol％并方便地少于约8vol％。照这样，所述有机溶剂可以优选地开始包含少于约0.5-5vol％的水或基本上是无水的，但是其不必是完全无水的。
可以将不会对生物活性分子产生不利影响的任何水可混溶溶剂用于共沉淀。典型的水混溶性有机溶剂可以，例如是短链醇类诸如甲醇；乙醇；丙-1-醇；丙-2-醇；醛或酮类诸如丙酮，酯类诸如乳酸乙酯，醚类诸如四氢呋喃，二醇诸如2-甲基-2，4-戊二醇，1，5-戊二醇，和各种大小的聚乙二醇(PEGS)和多元醇；或其任何组合或其混合物。通常，对于药物制剂的制备而言，溶剂应该是无毒的并且通常被视为是安全的(GRAS)诸如3类溶剂，但是对于其它应用而言，可以使用溶剂诸如乙腈。
在某些情形中，所述有机溶剂可以用生物活性分子和/或共沉淀剂来预饱和以确保在添加水溶液后，将两种成分一起沉淀出来。这减少了溶剂的材料损失并且控制了每个颗粒的生物活性分子负载，因此使配剂更容易。溶剂的选择可以导致具有不同大小或形状的微晶。其还可以影响蛋白质结合到晶体上的效率。
所述涂层还可以包含纳米颗粒作为佐剂，或载体或改变生物活性分子的生物利用率。纳米颗粒或它们的前体可以有利地包括在第一水溶液中和/或第三溶剂中以在共沉淀前从生物活性分子中将它们分离出来。制备自聚合物、生物分子和有机和无机材料的适合的纳米颗粒是本领域已知的应该理解术语“混合”指一种方法的步骤，其中水混溶性有机溶剂和水溶液可以非常迅速地组合或搅拌在一起。优选地，这应该提供接近均一的混合物，其在明显的微晶生长可以发生前被排出混合室。因此，结晶非常快速的共沉淀剂不适合于用在三-液流的连续流动混合装置中，因为晶体生长在混合室中可能是显著的。这可能有利于共沉淀剂和生物活性分子的颗粒融合和/或分别沉淀。快速结晶共沉淀剂可以，例如是离子盐。
典型地，包含共沉淀剂分子的第一水溶液和包含生物活性分子的第二水溶液的混合可以发生在这样的过程中，其中生物活性分子和共沉淀剂的连续的水性液流与包含水混溶性有机溶剂的更大得多的体积的第三溶液混合在一起。从混合装置中流出的合并的混合物典型地包含超过约75vol％的溶剂，优选地超过约85vol％的溶剂，最优选地介于约90和约99.5vol％的溶剂。水可混溶溶剂液流可以包含少于约5vol％的水和/或基本上用共沉淀剂饱和以协助共沉淀。
有利地，可以使用在各种压力包括大气压下的收集容器收集作为在溶剂中的混悬液的微晶。
相对于形成用于药物应用的颗粒的常规方法诸如喷干或超临界流体处理，在接近于周围环境的条件下进行连续法可以减少成本和操作费用。意欲可以以这种方式在工业规模上产生大量生物活性分子包被的颗粒。
在连续的共沉淀方法中，第一个泵可以连续递送包含共沉淀剂分子的第一水溶液，第二个泵可以连续递送包含生物活性分子的第二水溶液，第三个泵可以连续递送包含水可混溶溶剂的第三溶液。如果需要引入另外的成分诸如涂布或交联化合物或聚合物，可以使用另外的泵。可能必要的是通过连续地连接第一个的第二个混合装置将这些溶液引入从而使微晶的形成不受干扰。管的长度可以改变以确保微晶的形成完成或中断。涂布或交联可以用于改变微晶显示的溶解度，生物活性和生物利用率。备选地，生物活性分子溶液可以在第一混合装置中混合以过量溶剂，并接着将该混合物泵送到第二混合装置中并混合以共沉淀剂或共沉淀剂溶液可以在第一混合装置中混合以过量溶剂并且接着将该混合物泵送到第二混合装置中，并混合以生物活性分子溶液。这些备选的混合方式可以用于控制颗粒的大小和/或生物活性分子与形成的微晶的结合效率。所述泵可以是任何适合类型的，但是必须精确和准确地以限定的流速递送溶液并与所用的生物活性分子相容。方便地，可以使用HPLC泵等因为对于在流速范围内递送水溶液和水可混溶溶剂，这些是被优化的。优选地，所述泵显示接近无脉冲(pulse-less)的操作以确保两种水溶液的相对流速保持不变，因为这将影响负载。备选地，可以使用蠕动型或离心型泵，因为这些也可以用于精确地递送水流和溶剂流并可以具有减少费用和容易清洁的优势。因为在流速上、清洁和溶剂相容性中的差异，使用不同类型的泵来递送不同的进入流可能是有利的。
典型地，可以以介于约0.1ml/min和约1000ml/min之间的流速递送水溶液。对于筛选应用而言，水溶液将优选地以介于约0.2ml/min和约20ml/min之间的流速进行递送，对于制备，水溶液将典型地以介于约2ml/min和约1000ml/min之间或优选地介于约5ml/min和约1000ml/min之间的流速进行递送。水泵的闸首和管路可以由抗生物活性分子污垢的材料制成。所述水可混溶溶剂的递送通常可以快于水溶液约4-100倍，并且要求更少的精确性，因此可能需要更有力/有效的泵诸如离心泵。典型地，所述溶剂的可以以在约2ml/min和约20,000ml/min之间的流速递送，对于筛选应用，优选地以介于约2ml/min和约200ml/min之间的流速进行递送。对于制备，溶剂的递送可以优选地介于约20ml/min和约20,000ml/min之间，更优选地介于约500ml/min和约20,000ml/min之间。
混合装置可以提供将第一和第二水溶液的两种连续的水流与包含水可混溶溶剂流的第三溶液的连续流快速和紧密混合从而使沉淀几乎立即开始发生的方法。
混合装置可以是获得三种溶液的快速混合的任何装置。因此，其可以，例如，是通过使进入的液体流型诸如通过同轴、T形、Y形或更复杂的几何形状成形/合并或碰撞操作的静止装置，或活跃地将三股流体流搅拌在一起或合并的动态装置。在动态装置中，可以通过使用许多种方法诸如搅拌，声波振荡，摇动或相似方法来搅动三流。搅拌方法包括浆式搅拌器，螺旋和磁力搅拌器。如果使用磁力搅拌，可以使用具有不同外形的搅拌棒诸如，例如单棒条或Maltese十字管。优选地可以选择排列在混合装置内部的材料从而防止生物活性分子或颗粒显著结合在其上。适当的材料可以包括医用不锈钢，钛，玻璃，聚硅氧烷和特氟隆(已注册的商标)。
或者，混合装置可以使第一或第二水溶液与第三溶液混合，随后加入余下的第一和第二水溶液。
根据需要的生产规模，可以生产不同大小和几何形状的混合装置。需要的混合室的大小是溶剂流的流速的函数。对于大约0.025-10ml/min的水溶液和约2.5-200ml/min的溶剂的流速，适合使用约0.2ml的混合室。对于更高的流速，成比例放大的混合室或装置诸如约1.0-10.0ml可以是优选的。
典型地，在连续法中，将生物活性分子和共沉淀剂溶液加入过量水混溶性有机溶剂中。这需要将较小体积的水溶液加入较大体积的过量有机溶剂中从而使来自生物活性分子/共沉淀剂溶液中的水快速稀释到有机溶剂中，所述稀释的发生伴随生物活性分子的快速脱水和微晶的形成。
进行沉淀作用的温度可以是变化的。例如，水溶液和溶剂可以被加热或冷却。当生物活性分子是脆性时，生物活性分子溶液和有机溶剂的冷却可以是有效的。或者溶剂和水性混合物可以在不同的温度。例如，加热共沉淀剂溶液从而可以获得高共沉淀剂浓度同时将溶剂保持在室温，将生物活性分子保持在减少的温度诸如少于约10℃上可以是优选的。如果必要，溶剂可以保持在低于水性混合物凝固点的温度上。而且，压力也可以是变化的，例如，更高的压力可以用于减少溶剂的挥发性。
在将生物活性分子/共沉淀剂溶液与过量的水混溶性有机溶剂混合后，生物活性和共沉淀剂的共沉淀迅速发生。典型地，在约1-5分钟的最初时期后，在合并三股液流少于约30秒，最典型地在少于约10秒后，从混合器中流出的混合物由于微晶的存在而变得轻度的不透明。如果必要，接种方法可以用于起动混合装置。例如，流动可以暂时停止，接着重新开始。
如果需要，可以通过用新鲜有机溶剂漂洗来使沉淀的颗粒被进一步脱水，所述有机溶剂可以是无水或包含低量水的。优选地，使用0.5-8％的水含量的溶剂。在该范围内，生物活性分子通常有利地保持更高的生物活性。漂洗可以用于去除在共沉淀剂中饱和的残余溶剂。在干燥后，这种残余的共沉淀剂可将颗粒粘合在一起，导致团聚体的形成。在干燥或贮存前，用赋形剂的溶液漂洗还可以用于将其它的赋形剂引入颗粒中。
已经有利地发现可以将沉淀的微晶贮藏于有机溶剂中，并且生物活性分子在持续时间周期内显示极端良好的活性和稳定性的保留。而且，贮藏在有机溶剂中的沉淀的生物活性分子将典型地耐受细菌的侵袭，因此增加了它们的贮藏期限。
随时间推移，共沉淀物将会沉降下来，这使浓缩的微晶混悬液的回收通过滗去过量的溶剂容易地进行。但是，所述共沉淀物可以经过，例如，离心和/或过滤以更快速地回收沉淀的颗粒。可以将本领域已知的传统干燥方法诸如风干，真空干燥或流化床干燥用于蒸发任何残余溶剂以留下无溶剂的微晶。
或者，使用压缩气体诸如氢氟碳(hydrofluorocarbons)如HFA-134a或超临界流体诸如超临界CO2可以在干燥程序中将溶剂从微晶中去除溶剂。典型地，可以将在三液流连续法中制备的溶剂中的微晶装载到高压室中，伴随压缩气体或超临界流体诸如CO2流经混悬液直到溶剂(或尽可能)已经被去除。氢氟碳诸如HFA-134a或HFA-227的压缩气体将溶解在共沉淀剂溶剂中并且可以流通直到浓度已经达到需要的水平。接着，可以释放压力以提供干粉或作为混悬液的在HFA中的颗粒。在氢氟碳中的生物活性包被的微晶的混悬液可以适合于多剂量的吸入器装置(MDI)。这项技术实质上从微晶中去除所有残余溶剂。这对于药物制剂有着特别的好处，因为残余溶剂可能导致意外的生理影响。混悬液的压缩气体或超临界流体干燥的另一优势是其可以用于生产粉末和药物制剂，所述粉末和药物制剂与通过其它分离技术获得的相比，具有更低的堆积密度。典型地，可以获得低于约0.1g/ml的堆积密度。低堆积密度制剂在生物活性分子的肺传递中特别有效，因为它们通常包含更少的强结合团聚体。可以在本领域已知的许多不同方法中进行临界点干燥或压缩气体提取。
因此，建立连续共沉淀系统从而形成按照第一个方面的微晶和，事实上任何其它类型的颗粒，随后使用压缩气体或超临界流体如超临界CO2干燥这些颗粒是可能的。
对于药物应用，在使用前，可以将干燥的沉淀的颗粒(即，微晶)在灭菌条件下，典型地引入灭菌递送装置中或小瓶中。或者，可以将颗粒在灭菌条件下作为溶剂中的混悬液转移到灭菌递送装置或小瓶中。然后，可以使用例如HFA或超临界CO2干燥对它们进行任选地原位干燥。
本文所述的方法还可以将水溶液中存在的有机可溶组分从生物活性分子中分离出来。可能需要被去除的典型的组分包括缓冲剂，表面活性剂，疏水生物分子诸如脂质或脂蛋白和变性剂。例如，可以将缓冲剂诸如Tris在沉淀过程中从生物活性分子中分离出来，所述Tris其游离碱形式在有机溶剂如乙醇中是可溶的。但是，通过将另一种有机可溶碱加入水溶液或有机溶剂中来将缓冲剂转变成游离碱形式可能是必须的。因此，本发明还公开了从生物活性分子中去除不需要的组分从而使不需要的组分不与生物活性分子一起共沉淀，因此仍溶解在有机相中的有效连续方法。这可以通过在非-吸湿性包被的颗粒的生物活性分子沉淀之前将添加剂诸如酸，碱，离子配对和鳌合试剂包含在水性或有机溶剂中来实现。这些生物活性分子可以因此以高纯形式被包被。
可以在许多剂量强度上典型地产生本发明所述的制剂。剂量可以通过将每颗粒的生物活性分子的百分重量从低于约0.1wt％变化到高达约50wt％来适宜地进行变化。使用三液流连续流动沉淀器的特别的优势是可能容易地改变生物活性分子的负载。这对于在正常缓冲水溶液中可具有高溶解度但是在存在共沉淀剂的情况下溶解度较差的生物活性分子，特别如此。例如，可能的是将共沉淀剂的浓缩溶液以比生物活性分子的速率更慢的速率引入混合器中，从而可获得，与用混合物开始相比，更高的负载。载体溶解度可以提供产生在约50wt％到少于约1wt％或甚至少于约＜0.1wt％的负载上包含生物活性分子的可能性从而使药物制剂的剂量强度可以适宜地进行变化。室温下，载体在水溶液中的溶解度可以从约2到200mg/ml并且更优选地在约10-150mg/ml的范围内。
高负载的生物活性分子包被的微晶提供浓缩生物活性分子的方便的方法。因此，用低溶解度共沉淀剂制备的微晶可以以高浓度以这样的水平悬浮在水溶液中，从而使共沉淀剂的溶解度局限明显被超越。在表面上的生物活性分子可以继续溶解在水中以产生可以容易地从残余的核心微晶中分离出来的浓缩的溶液。谷氨酰胺由于其在水溶液中的低溶解度成为对于该方法而言优选的共沉淀剂。例如，如果使用5mg/ml的生物活性分子溶液制备约20wt％负载的谷氨酰胺微晶，那么约125mg的这些晶体在水溶液中的混悬液可以产生在饱和的谷氨酰胺溶液中的约25mg/ml的生物活性分子，相应于约5倍的浓缩步骤。使用这种类型的方法，可能的是获得生物活性分子的浓度的约2-20倍的增加。与其它浓缩技术诸如超滤或冻干相比，这可以提供费用或时间优势。
用高流速混合器，可以将少于约160mg/ml或优选地少于80mg/ml的共沉淀剂浓度有利地用于产生包含自由流动颗粒的药物制剂。所述颗粒典型地具有平均颗粒大小少于约50微米的窄大小分布。可以在更高的温度上使用更高的浓度。包含窄大小分布范围的包被晶体的制剂提供改善的递送再现性和因此更好的临床表现。
通过将水溶液和有机溶液在混合进容纳的(contained)灭菌环境之前经过约0.2微米滤器进行预过滤来适宜地产生无菌形式的所述药物制剂。药物制剂应该基本没有有害残余溶剂，并且本发明在常规干燥程序后典型地提供包含少于约0.5wt％的3类溶剂的粉末。通过真空干燥或风干和通过使压缩气体或超临界流体诸如CO2流经微晶在无水水混溶性和CO2可混溶溶剂中的混悬液，可以获得基本较低的溶剂水平。
使用比典型生物大分子小得多的水溶性生物活性化合物，还可以将本方法用于制备适合于药物制剂的生物活性分子包被的微晶。可以通过分批法或连续法来制备这些制剂，并且可以方便地使用非-吸湿性的载体，诸如D，L-缬氨酸。可以使用水可溶性生物活性药物包括基于氨基糖苷的抗生素诸如硫酸妥布霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素和kanomycin，或抗微生物肽诸如Novispirin，和plectasin。优选地，生物活性分子可以是极性的并且包含一个或多个在用于共沉淀的pH上可以被离子化的官能团。该生物活性分子还优选地具有最大的大小，其比由结晶体上的核心物质形成的晶胞具有更大的尺寸。这将促使生物活性分子包被的微晶的形成，并且使生物活性分子包含在晶格中的可能性最小化。
从上述描述清楚的是，可以改变可能改变包被的微晶的物理性质和生物活性分子的生物活性和生物利用率的许多不同的参数。
按照本发明的第二个方面，本发明提供包含颗粒的药物制剂，其中所述颗粒包含一个或多个微晶，所述微晶包含(b)从共沉淀剂分子形成的基本非-吸湿性的内部晶核；和(c)包含一个或多个生物活性分子的外涂层；其中通过基本上同时混合包含共沉淀剂分子的第一水溶液，包含生物活性分子的第二水溶液和包含水可混溶溶剂的第三溶液在单一连续法中形成包被的微晶；或将第一和第二水溶液中的任一混合以第三溶液，随后混合以余下的第一和第二水溶液中的任一种形成包被的微晶。
本文中的基本上非-吸湿性意为晶核不容易吸收和保留水分。典型地，在室温下曝露于大于约50％的相对湿度，优选地大于约80％相对湿度上时，所述颗粒将不会聚集，并且核心也不会在形态或结晶度上有显著改变。
就晶核来说，其意为将组成分子或离子构成重复对称的固体3-维的晶格，所述晶格可以通过粉末X-射线衍射进行鉴定。典型地，在差示扫描量热器(DSC)上加热颗粒时可以观察到清晰的熔化吸热(即，非玻璃化转变)。这是众所周知的显示结晶度的特性，并且还显示晶核可以通常基本上由固态相所组成，所述固态相在室温和环境湿度条件下是热力学稳定的。
至于连续法，指提供晶核的分子和提供外涂层的生物活性分子一起直接以包被的颗粒的形式从溶液中沉淀出来。这明显地不同于模板方法，在所述模板方法中预形成的晶体被处理，并接着暴露于包被物质。所谓一步法，其意为不需要单独的涂布或研磨步骤。还应该理解颗粒的形成不需要任何蒸发的方法诸如，例如喷雾干燥法或冷冻干燥法。其也不需要超临界流体，其中颗粒的形成发生在具有基本上相似的密度的可充分混溶的常规溶剂的混合物中。
可以将颗粒用于医学应用诸如治疗或诊断方法中诸如以试剂盒形式从而检测，例如，疾病的存在。疾病可以包括肺部的疾病诸如肺癌，肺炎，支气管炎等，其中可以将所述颗粒递送到肺部并且测试肺的容量/效率，或鉴定致病剂(disease causing agents)。可以将所述颗粒用于兽医应用中。
典型地，生物活性分子的包被可以是基本连续的。或者，使药物制剂包括具有生物活性分子的基本不连续涂层的颗粒可能是有利的。该涂层还可以在厚度上变化，并且可以在大约0.01-1000微米，大约1-100微米，大约5-50微米或大约10-20微米范围内变化。所述生物活性分子的涂层可以是连续的或不连续的。
所述药物制剂可以理想地包括具有窄大小分布的颗粒。典型地，药物制剂因此可以包括具有有效数目的颗粒的基本均一的系统，这些颗粒具有通常相同或相似的大小。
通过连续法产生的微晶和生物活性分子包被的微晶典型地显示跨度少于2，优选地少于1.8并且更优选少于1.5的窄大小分布，如通过动态激光扫射所评估。通过共沉淀产生的生物活性分子包被的微晶典型地比通过纯载体物质沉淀产生的微晶要有利地更小。这与微晶表面上生物活性分子的涂层相一致。如下计算跨度值d(0.1)(μm)＝10％的颗粒尺寸低于该颗粒大小。
d(0.5)(μm)＝50％的颗粒尺寸高于和低于该颗粒大小。
d(0.9)(μm)＝90％的颗粒尺寸低于该颗粒大小。
跨度＝d(0.9)-d(0.1)/d(0.5)。
颗粒可以具有少于约80μm，优选地少于约50μm或更优选地少于约20μm的最大截面尺寸。最大截面尺寸是指在直径上相对的点之间可以测量的最大距离。
组成晶核的分子可以典型地每个都具有少于约2kDa的分子量。优选地，组成晶核的分子可以典型地每个都具有少于约1kDa的分子量。更优选地，组成晶核的分子可以典型地每个都具有少于500道尔顿的分子量。优选的分子是可以快速被核化从而在经过沉淀作用后形成晶体的那些。提供基本由非晶状的团聚体或玻璃组成的颗粒的分子因此通常不适合作为核心物质。
典型地，在室温，形成晶核的分子在水中的溶解度少于约150mg/ml，优选地少于约80mg/ml。意外地，发明人发现溶解度低于这些值的分子倾向于产生具有改善的流动特性的晶体。通常优选自由流动的颗粒用在许多药物制备方法中，因为它们，例如有利于用精确剂量填充胶囊并且可以方便地用于进一步的操作诸如包被中。通常自由流动的颗粒具有规则的大小和尺寸，以及低静电荷。具有高长宽比的针状晶体通常是，例如不自由流动的并且因此在某些制剂中不是优选的。
组成晶核的分子可以，例如，是氨基酸，两性离子，肽，糖，缓冲成分，水溶性药物，有机和无机盐，形成强氢键晶格的化合物或它们的衍生物或任何组合。典型地，选择这些分子从而将在向受者使用后的不利生理反应减到最小。
适合于形成晶核的氨基酸是天然或非天然的，并可以以纯的对映异构体或消旋体形式存在。实例包括丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，D-缬氨酸，L-缬氨酸，D，L-缬氨酸的混合物，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸和丝氨酸，牛磺酸或任何它们的组合。特别地，优选L-谷氨酰胺，L-组氨酸，L-丝氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，牛磺酸，L-缬氨酸或D，L-缬氨酸。对于其侧链在共沉淀条件下基本电离的氨基酸来说，使用平衡离子是优选的，所述平衡离子产生具有低溶解度并且是非吸湿性的结晶盐。形成晶核的其它分子和盐的实例可以包括，但不限于α-乳糖，β-乳糖，甘露糖醇，碳酸氢铵，谷氨酸钠，磷酸精氨酸和甜菜碱。
典型地，形成晶核的分子在水中具有低溶解度，例如在约25℃，所述溶解度介于约12-150mg/ml之间和优选地约20-80mg/ml之间。还可以将溶解度超过约150mg/ml的分子用于获得自由流动的颗粒，条件是它们是从亚饱和的水溶液中共沉淀出来的。优选地，它们在约150mg/ml或更低和更优选地约80mg/ml或更低的浓度上共沉淀。对于在25℃具有高水溶解度的分子，使用较低共沉淀温度诸如约10℃或约4℃从而使它们在150mg/ml或更低的浓度上更接近饱和可能也是有利的。类似地，可以将更高的温度诸如35℃或50℃用于核心形成的分子的共沉淀，所述分子在25℃具有较差溶解度。
形成晶核的分子具有高于约90℃，诸如高于约120℃和优选地高于约150℃的熔点。具有高熔点意味着形成的晶体具有高晶格能。高晶格能增加了形成的颗粒具有在表面包被生物活性分子的晶核的可能性并且将倾向于使所述颗粒的非晶形内容物减到最少。当暴露于高湿度或温度时，包含非晶形物质的颗粒可以在物理特性上遭到不希望的改变，并且这可以导致在药物制剂中不理想的生物活性和溶解度的变化。因此，利用会形成具有高熔点的颗粒的共沉淀剂是有利的，因为这些将倾向于形成更稳定的药物制剂。高熔点共沉淀剂通常还具有减少的水溶解度并且因此可以更适合于在优选的浓度范围内进行共沉淀。
结晶非常迅速的共沉淀剂诸如例如无机盐诸如硫酸钾可能不适合于用在3管路方法中。
适宜地，在晶核上形成涂层的生物活性分子可以选自任何能产生治疗效应诸如例如活性药物成分(API)或诊断效应的分子。治疗效应意为任何这样的效应，其治愈，减轻，去除或减少人类或动物身体的任何疾病或功能失常的症状，或预防或减少人类或动物身体的感染任何疾病或功能失常的可能性，因此所述效应涵盖预防效应。
生物活性分子的涂层还可以包括常用于药物制剂中的赋形剂，诸如稳定剂，表面活性剂，等渗改性剂和pH/缓冲剂。在疫苗的情形中，生物活性分子涂层还可以包括减少水溶解度和增加免疫应答的交联剂分子和佐剂。
生物活性分子可以，例如，是任何药物，肽，多肽，蛋白质，核酸，糖，疫苗成分，或任何它们的衍生物或缀合物或任何产生治疗效应的任何组合。
生物活性分子的实例包括，但不限于药物诸如消炎药，抗癌药，抗精神病药，抗细菌药，抗真菌药；天然或非天然肽；蛋白质诸如胰岛素，α1-抗胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，白蛋白，干扰素，抗体，融合蛋白诸如Fc-融合蛋白，蛋白质-药物缀合物；核酸诸如天然来源的基因片段，质粒，DNA，RNA或RNAi或合成的诸如寡核苷酸和反义核苷酸；糖诸如任何单糖，二糖或多糖；质粒；蛋白质/肽-药物缀合物例如抗体片段(诸如Fc片段-药物缀合物)。适合的药物可以，例如是针对肺结核的活性剂诸如capreomcin。
本发明的生物活性分子还可以以蛋白质-肽-药物缀合物的形式存在，其中药物或其它适合的活性生物分子通过适合的结合方式，诸如通过例如在蛋白质/肽和药物上的反应性基团的共价结合来缀合于蛋白质/肽。本领域技术人员将充分认识到本领域已知的合成这些缀合物的技术。可以设计这些缀合物的蛋白质/肽成分以有利于进入细胞并且所述缀合物的蛋白质/肽成分可以是，例如本领域已知的TAT或charriot。其它有利于进入细胞的肽公开于例如WO01/41811，US5,807,746，和WO99/05302，将其并入本文作为参考。用于在肺的中心区域的促进活性吸收的特别优选的肽可以基于抗体分子，尤其是IgG的Fc片段，或其它抗体片段，其已经显示在中央肺(central lung)的主动运输。类似地，可以以类似方式使用缀合于纳米颗粒的生物活性分子。
一旦被引入受体，核酸可以，例如能够表达。因此核酸可以包括适合的调节控制元件(例如启动子，增强子，终止子等)以控制核酸的表达。生物活性分子还可以是天然或合成治疗试剂的化学修饰衍生物，诸如PEG-蛋白质。
可以将核酸包括在载体诸如质粒，噬菌粒或病毒载体中。可以使用任何本领域技术人员已知的适合载体。
疫苗包被成分可以，例如包括病原体，例如细菌或病毒的抗原成分，诸如白喉类毒素和/或破伤风类毒素。这些疫苗制剂的特别优势是在暴露于高温时，与常规液体制剂相比，它们通常显示大大增加的稳定性。按照本发明制备的这些制剂可以，例如，暴露于45℃以上的温度达48个小时，并且体内测试时保持它们激发(illicit)免疫应答的能力，而发现标准液体样品通常彻底失活。显示高温稳定性的疫苗不需要冷冻，因此特别是在发展中国家就贮藏和易于销售来说提供了相当可观的节省费用。疫苗在预防和/或治疗由病原微生物造成的感染中是有效的，所述感染包括病毒的感染，真菌的感染，原生动物的感染，阿米巴感染和细菌的感染等。可以按照本发明制备的疫苗制剂的实例包括亚单位的，减毒或灭活的生物疫苗，其包括，但不限于，白喉，破伤风，瘟疫，炭疽，脊髓灰质炎，百日咳(pertussus)和甲型、乙型和丙型肝炎，HIV，狂犬病和流行性感冒。
疫苗包被的微晶的制剂诸如白喉类毒素(taxoid)包被的D，L-缬氨酸或L-谷氨酰胺晶体可以在不同条件范围下贮存，并且将其重构和接种后，可以发现激发强烈的初次免疫应答反应和再次免疫应答反应。或者，可以将疫苗包被的晶体配制为干粉以通过许多其它的路径递送到受者，所述路径包括肠胃外的，肺的和鼻的施用。经过肺的递送对于非常年幼的儿童可以是特别有效的。
按照本发明的颗粒还可以应用在多糖连接的蛋白质诸如HiB(haemopholisB型流行性感冒)和肺炎球菌疫苗和活病毒疫苗，诸如流行性腮腺炎，麻疹和风疹的施用中。还可以将按照本发明的颗粒与现代流感疫苗成分诸如MV A导向(vectored)流行性感冒疫苗一起进行制备。
此外，可以将疫苗成分包被的微晶用于疫苗的制剂，所述制剂针对癌症，特别是人类癌症开发，所述癌症包括黑素瘤；皮肤癌；肺癌；乳腺癌；结肠癌和其它癌症。如本文所述，肺用的制剂可以特别适合于肺癌的治疗。应当指出，除了基于蛋白质的疫苗(即蛋白质/肽成分包被在内部基本非-吸湿的晶核上)，还可以将基于核酸的疫苗制剂按照本发明进行制备，其中将核酸分子包被在内部基本非-吸湿性的晶核上。
已经发现的具有有利特性的非-吸湿包被的颗粒的实例包括那些具有如下的颗粒具有D，L-缬氨酸晶核和胰岛素涂层；L-甘氨酸晶核和抗胰蛋白酶涂层；谷氨酸钠晶核和胰岛素涂层；L-甲硫氨酸晶核和胰岛素涂层；L-丙氨酸晶核和胰岛素涂层；L-缬氨酸晶核和胰岛素涂层；L-组氨酸晶核和胰岛素涂层；L-甘氨酸晶核和α-抗胰蛋白酶涂层；L-谷氨酰胺晶核和白蛋白涂层；D，L-缬氨酸晶核和寡核苷酸DQA-HEX涂层；D，L-缬氨酸晶核和具有另外的N-乙酰基半胱氨酸的抗氧化剂外涂层的α1-抗胰蛋白酶涂层；D，L-缬氨酸晶核和卵清蛋白涂层；L-谷氨酰胺的晶核和卵清蛋白涂层，D，L-缬氨酸晶核和白喉类毒素(diptheria taxoid)涂层；L-谷氨酰胺的晶核和白喉类毒素涂层；D，L-缬氨酸晶核和白喉类毒素涂层；L-谷氨酰胺的晶核和破伤风类毒素涂层；D，L-缬氨酸晶核和白喉类毒素和破伤风类毒素混合物涂层；L-谷氨酰胺晶核和白喉类毒素和破伤风类毒素混合物涂层。
典型地，在微细控制条件下形成的一批颗粒由基本都显示相同形态或晶体形状的并具有窄大小分布的单独微晶组成。这可以方便地在SEM图像中观察到，并通过颗粒大小测量进行证实。按照本发明的微晶典型地具有最大截面尺寸，并且最大尺寸少于约80微米。它们具有优选地少于约40微米的，更优选地少于20微米的最大截面尺寸。最优选最大截面尺寸介于约0.5和约20微米之间的颗粒。或者，可以形成相似大小的微晶的球形团聚体的自由流动的粉末，所述微晶的最大截面尺寸少于约50微米并且优选地少于约20微米。形成的具有优选共沉淀剂的颗粒的显著方面是在暴露于高湿度诸如高达80％RH时，它们的大小和形态基本保持不变。此外，在再干燥后，它们的自由流动特性和空气动力学特性可以保持。
通过在共沉淀前改变起始水溶液中生物活性分子和核心分子的比率，可以方便地改变包被在每个颗粒上的生物活性分子的数量。典型地，生物活性分子将组成介于约0.1wt％和约50wt％之间的每个包被的微晶体。更优选地，生物活性分子在颗粒中的负载将介于约1wt％和约40wt％之间。
典型地，至少一些生物活性分子，甚至在暴露于高湿度后仍旧保持高水平的活性。
典型地，在暴露于升高的温度时，非-吸湿性包被的颗粒是稳定的(即，基本保持它们的生物学活性)并且在高达约60℃可以保持稳定超过1个星期。这有助于储藏并且显示甚至在非-冷冻条件下，由非-吸湿性包被的颗粒形成的药物制剂可以期望具有延长的贮存期限。
典型地，非吸湿性包被的颗粒的核心物质在高达约80％的相对湿度上，将吸收少于约5wt％，优选地少于约0.5wt％的水。根据负载，包括生物活性分子的颗粒将典型地吸收更多数量wt％的水。
典型地，包被在晶核上的生物活性分子保持天然或近-天然的构型，即生物活性分子在生产过程中不会发生不可逆的变性。还有利地发现，晶核上的生物活性分子上的涂层在环境温度或升高的温度下导致颗粒储藏的稳定性增加。例如，在重构到水性介质后，生物活性分子典型地可以保持它的大部分生物活性。优选地，在25℃储藏6个月后，生物活性分子将保持大于约50％的其起始生物活性。更优选地，生物活性分子将保持超过约80％的其生物活性和最优选地超过95％的生物活性。
所述的微细自由流动的颗粒或混悬液典型地不粘附于玻璃瓶的壁上。颗粒典型地快速且彻底地重新溶解于水，水溶液(包含缓冲剂和盐诸如常用于重构的那些)或生理流体中。干燥粉末或混悬液的充分重新溶解将通常发生在少于约2分钟内，优选地在少于约60秒内并且最优选地在少于约30秒内。在水性缓冲液中重构的制剂典型地是低浊度，无色的溶液，其透明度好于约15FNU并且优选地好于约6FNU(FNU＝Formazine浊度单位)。或者，在母体共沉淀剂的饱和的水溶液中的微晶的混悬液可以用于减缓溶解速率。
当溶解于水溶液时，常见生物活性分子需要赋形剂或稳定剂的存在，诸如缓冲化合物，盐，糖，表面活性剂，抗聚集剂和抗氧化剂。可以将这些包括进起始水溶液中并且在共沉淀过程中掺入颗粒中。然后，它们将存在于颗粒的重构上，例如作为药物制剂出现。典型地，在所有的成分共沉淀后，赋形剂将在颗粒的外表面上被浓缩并且将渗透到生物活性分子的涂层中。典型的抗氧化剂可以，例如，是半胱氨酸诸如以N-乙酰基半胱氨酸形式存在的，而典型的表面活性剂可以是吐温。在共沉淀中，由于溶解在溶剂中，赋形剂和生物活性分子的相对比率可能变化。这可以通过预先将选择的赋形剂添加到起始水溶液，共沉淀溶剂或漂洗溶剂中进行控制，从而在干燥时，在颗粒中获得理想的比率。因此，例如，通过包含在漂洗溶剂中，可以将有机可溶的糖或聚合物包被在蛋白质包被的颗粒表面，从而提供提高的储藏稳定性。或者，可以将添加剂诸如盐或纳米颗粒包括在共沉淀或漂洗溶剂中并且包被在颗粒的外表面上从而提高颗粒的物理或治疗性能。例如，发现在干燥前，通过用在2-丙醇中的异亮氨酸的溶液来漂洗形成的微晶从而提供异亮氨酸包被的胰岛素-甘氨酸颗粒是有利的。与未包被的那些相比，这些颗粒具有改善的流动和空气动力学特性。
按照本发明的第三个方面，提供用于肺递送的药物制剂，其包括按照第一个方面形成的微晶。
为了使用吸入法来将药物分子施用到血流中，根据应用，必须将药物制作成能被递送到中枢呼吸道或深肺中的制剂。在深肺中，生物活性分子可以被被动运输到血流中，并且效率对于较大的分子倾向于更低。在其中可以发生主动运输的肺区中，例如通过受体介导的运输，那么更有效地将更大的生物活性分子递送到血流中是可能的。对于具有大于约50kDa的分子量的生物活性分子，和更优选地对于具有大于约100kDa的分子量的分子，可以优选这种主动运输路径。例如，包含具有Fc-区的抗体诸如IgG或Fc-缀合物诸如Fc-融合蛋白或Fc-药物的生物活性分子包被的微晶可以用于递送到中枢呼吸道。这可以通过FcRn介导的运输或通过其它受体进行，所述其它受体例如特定地运输其它分子诸如白蛋白。在用于递送到深肺中的干粉末的情况中，这通常需要物质平均(mass median)尺寸在约1-5微米范围内的颗粒，虽然已经证明可以使用具有特殊空气动力学特性的更大颗粒。对于递送到中枢呼吸道而言，优选具有范围在约3-30微米的物质平均空气动力学直径的更大的颗粒。这些可以通过使用如下所述的实验技术的设计，调整共沉淀条件来在3管路共沉淀过程中有利地产生。要认识到因为公开的颗粒通常是非球形的，物质平均空气动力学直径可以小于物质平均几何直径。按照本发明的颗粒的某些制剂可以适合于形成肺用的制剂，因为可以将它们用于产生微细自由流动的颗粒，其非常适合于通过吸入法进行递送。如果生物活性分子在这些非-吸湿性包被的颗粒表面上，这些颗粒通常非预期地显示低静电荷，并且应直接进行处理并将其作为干粉末用在递送装置上。或者，例如，可以将它们用作在雾化器(nebulisor)中的混悬液。
特别地，适合于形成肺用的药物制剂的生物活性分子可以包括但不局限于任何如下物质治疗用蛋白质诸如胰岛素，α1-抗胰蛋白酶，干扰素；抗体和抗体片段和衍生物；治疗用肽和激素；合成性和天然DNA，其包括基于DNA的药物；酶；疫苗成分；抗生素；止痛药(pain-killers)；水溶性药物；水敏感性药物；脂质和表面活性剂；多糖；或它们的任何组合或衍生物。可以将包括颗粒的肺用的药剂直接用在吸入器装置上以提供高度发散的剂量和高度微细的颗粒部分。因此在MSLI(工作台(stage)1-5)上测量发散剂量典型地大于约70％，且更优选地大于约90％。在MSLI(工作台3-5)上测量的微细颗粒级分典型地大于约20％，并且优选地大于约40％，更优选地大约约55％。通常将微细颗粒级分定义为在多-工作台液体碰撞取样器(Multi-Stage Liquid Impinger，MSLI)的下游工作台收集的部分，并且其对应具有适合于通过吸入施用到深肺的空气动力学特性，即少于约3.3微米的颗粒。还可以制备靶向中枢呼吸道的肺用制剂。这些也类似地具有高度发散的剂量，但是倾向于在具有低FPF的MLSI的工作台1-2中收集。这些可以有利地用调控权利部门批准的赋形剂诸如乳糖进行制备。肺用的制剂可以不与任何另外的制剂一起在干燥粉末递送装置中使用，所述另外的制剂具有例如，更大的载体颗粒诸如乳糖。
对于靶向深肺的肺用的制剂，质量中位数气动粒径(mass medianaerodynamic diameters)少于约10微米，更优选地少于约5微米的颗粒是优选的。对于递送到中枢呼吸道中，优选质量中位数气动粒径在约4-20微米范围内并且更优选地在约5-10微米范围内的颗粒。这些将典型地具有与它们的质量中位数气动粒径相似的质量中位数直径。典型地优选对于深肺，最大截面直径在约1-5微米范围内或对于中枢呼吸道，最大截面直径在5-10微米范围内的自由流动的、非吸湿性低静电的颗粒。通过使用氨基酸诸如例如，L-谷氨酰胺来形成晶核可以获得这些。但是，发明者已经令人惊讶地发现，以高长宽比薄片形式存在的生物活性分子包被的微晶可以有利地具有比它们的最大截面直径小的质量中位数气动粒径。适合的形状可以是，例如，叶状的或瓦状的。关于这些颗粒，对于深肺，最大截面直径的优选范围可以大于约1-5微米并且可以例如是约1-10微米。类似地，具有超过约5-10微米诸如约5-30微米的最大截面直径的颗粒可以用于递送到中枢呼吸道中。典型地形成这种形状的生物活性分子包被的结晶颗粒的共沉淀剂包括组氨酸和D，L-缬氨酸。因此，对于干粉肺用制剂，还优选用产生高长宽比薄片的共沉淀剂制备的颗粒。
特别地，可以对可吸入的或肺用的制剂优选地进行选择使其具有包括氨基酸的晶核，所述氨基酸诸如缬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，甘氨酸或谷氨酰胺，并且其，例如，包括缬氨酸的晶核和治疗用蛋白质诸如胰岛素的涂层；组氨酸的晶核和酶的涂层；缬氨酸的晶核和酶抑制剂诸如α-抗胰蛋白酶的涂层；缬氨酸的晶核和DNA的涂层；缬氨酸的晶核和疫苗涂层；谷氨酰胺的晶核和疫苗涂层；谷氨酰胺的晶核和白蛋白涂层。当形成用于制备制剂的颗粒时，优选使用产生在暴露于高湿度时不会聚集的离散颗粒的共沉淀剂。此外，优选共沉淀剂在施用后不会在患者口里留下令人不快的味道。因此，高度优选谷氨酰胺因为其可以暴露于高湿度，并具有温和的味道。
按照本发明的第四个方面，提供肠胃外的制剂，所述制剂包括按照第一个方面形成的微晶或微晶的混悬液。
这些制剂可以通过多种方法包括静脉内的，皮下的或肌内的注射来进行递送，或可以使用在持续释放剂或缓释剂中。可以以经济有效的方法来有利地生产这些微晶从而提供在环境温度下显示延长的贮存寿命的灭菌肠胃外制剂。可以优选地将以粉末或混悬液形式存在的制剂在少于60秒内重构于水溶液中，从而提供适合于注射的低浊度溶液。当生物活性分子特别地有毒或烈性因此难于作为干粉形式进行制备或操作时，可以优选混悬液的重构。或者，可以将在溶剂诸如，例如乙醇或氢氟碳中浓缩的微晶的混悬液不经重构直接用于肠胃外施用。这可以为需要以极高剂型递送从而提供治疗效果的生物活性分子提供便利。这些生物活性分子可以包括治疗用抗体及其衍生物。在重构后，这些可以聚集或可以形成难于施用的高度粘性的溶液。因此可以将包含高剂量生物活性分子的颗粒的浓缩混悬液用于提供递送这些分子的备选的更方便的和在治疗上有效的方法。混悬液可以在溶剂中或可以在用于制备微晶的共沉淀剂的饱和水溶液中制备。因为其低饱和浓度，谷氨酰胺是对于该应用优选的共沉淀剂。生物活性分子包被的颗粒特别地适合于这种施用，因为在稀释后，它们非常快速地重构并且显示生物活性分子的最小限度的聚集。团聚体的施用是不理想的，因为它可以起始不利免疫应答。
适合于通过肠胃外递送施用的生物活性分子包括在本发明第三个方面所述的那些。此外，肠胃外施用可以用于递送更大的生物分子诸如疫苗或抗体，所述疫苗或抗体因为较差的系统生物利用率而不适合于经过肺施用到受试者的血流中。优选的晶核物质包括常用于肠胃外制剂的赋形剂诸如甘露糖醇和蔗糖。还优选天然氨基酸诸如L-谷氨酰胺，它们可以用于形成快速重构的颗粒，甚至在高温时也是稳定的，并且易于进行处理和操作。还优选L-谷氨酰胺，因为已经将它以高剂量向患者施用而没有不利的副作用。
按照本发明的第五个方面，提供持续释放或缓释的药物制剂(或长效制剂)，其包括按照第一个方面的微晶或微晶的混悬液。
对于某些施用，优选产生在施用后，提供持续或延长治疗效应的肠胃外制剂或肺用的制剂或其它制剂。这可以，例如，用于限制在受试者血流中获得的生物活性分子的最大浓度或用于延长重复施用之间需要的周期。或者，可能需要改变微晶的表面特性或溶解度以改善生物利用率或增加或减少免疫原性。可以将生物活性分子包被的微晶方便地用于制备持续释放或缓释的制剂。这可以通过包被微晶或将它们掺入另一种基质物质诸如凝胶或聚合物中或通过将它们固定在递送装置内来实现。
例如，使用本领域已知技术，可以用改变微晶成分的释放或递送的物质来对每个微晶进行均匀地包被。
可以用于包被微晶的物质，可以例如，是难水溶性的可生物降解的聚合物诸如，例如，聚丙交酯或聚乙交酯及其共聚物；聚氨基酸；水凝胶；和其它本领域已知的物质，所述物质在响应对生理条件的暴露时改变它们的溶解性或交联的程度。例如，通过使颗粒的混悬液与包被物质的溶液接触，然后干燥得到的颗粒，可以进行涂层的施用。如果需要，可以重复该过程以延长释放模式。发现包被的微晶可以提供生物活性分子向溶液释放的基本不变的速率。或者，通过例如，粘合剂可以将多种颗粒结合入，例如，单片剂形式。粘合剂可以溶解在溶液中，随后当将片剂结合在一起的粘合剂逐渐溶解时，颗粒可以持续释放到溶液中。
那些本领域技术人员将理解使用上面教导的组合，可能提供其它药物制剂诸如例如鼻用制剂，口服制剂和局部用制剂。鼻用制剂和口服制剂可以需要使用备选物质来包被颗粒，所述备选物质提供对例如黏膜的粘附。
按照本发明第六个方面，提供包括微晶的吸入递药装置，所述微晶按照第一个方面形成。
吸入可以通过肺或鼻进行。
肺递药装置可以，例如是液体雾化器，基于气溶胶的定量吸入器或干粉分散装置。
按照本发明的第七个方面，提供确定制备生物活性分子包被的微晶的最佳条件的方法，其包括下列步骤制备第一批按照第一组变量参数的生物活性分子包被的微晶并量化所述生物活性分子包被的微晶的至少一个特性；通过改变至少一个变量参数制备第二批生物活性分子包被的微晶，并量化所述至少一个性质从而能够确定所述至少一个变化对于所述至少一个性质具有有益还是有害的效果；任选地，可以将所述方法按照需要重复多次从而寻求获得显示优化性质的微晶。
该方法可以方便地用于筛选分批或连续法以发现生产生物活性分子包被的微晶的最佳条件。发现三-液流连续流动沉淀器提供进行这样的筛选过程的特别方便和有效的方法。筛选目标通常是提供对于具体应用最具吸引力的物理性质，同时保持最大的生物活性的颗粒，但是其它的筛选也是可能的。
筛选过程可以基本上由下列步骤组成a)确定生物活性分子包被的微晶的哪些性质对于特定应用是最理想的，并确保这些性质可以通过一些类型的测量精确量化；b)确定预期对需要被优化的性质影响最大的那些参数并确保这些性质可以被某种类型的测量准确量化；c)确定被鉴定的参数在那些范围内变化以及在实践中获得这些变化存在那些限制；d)确定有效筛选选择的参数对需要的性质的影响的实验的矩阵；e)进行由实验设计过程确定的共沉淀，并测量由产生的包被的微晶显示的性质；f)分析获得的结果，并且如果必要，设计进一步的实验来发现优化的条件；g)任选地重复a)-f)直到制备符合确定目的的微晶。
可以被筛选的物理性质的实例包括平均大小，平均形状，大小分布，结晶度，溶解时间，平均空气动力学直径，总的发散剂量，微细颗粒级分和其它可与药物制剂相关的可测量的参数。与生物活性的保留相关的性质的实例包括保留在晶体上的生物活性分子的产率，生物活性分子的负载或剂量，浊度，聚集的程度，体外生物活性，无裂解产物，体外生物利用率，杂质的水平，结构的保留和其它可与治疗应用相关的参数。可以在制备生物活性分子包被的微晶后或在贮存时期后，立即进行与需要的物理性质或生物活性相关的测量，在所述贮存时期中，样品可通过暴露于例如升高的温度或湿度而受到有意(deliberately)的压力。
令人惊奇的是，发现一般用三管路连续流动沉淀器可以最有效地进行筛选过程。
已经发现使用具体的共沉淀剂/溶剂组合在连续法中成功地共沉淀生物活性分子包被的微晶取决于一些过程的参数，并且在大多数情形中，可能必要的是筛选和优化这些因素。可以存在应该优先进行筛选和优化的至少三个主要的参数，这些可以是· 蛋白质负载(％w/w)25·最终水含量(％v/v)·共沉淀剂浓度(mg/ml)发现蛋白质负载和最终水含量可影响颗粒大小和保留的生物活性的水平。发现起始的共沉淀剂的浓度影响可获得的过饱和和成核作用模式，发现其又可以影响颗粒大小和形状和颗粒聚集。因此，如果对于具体应用需要生物活性分子包被的微晶，发现这些参数的筛选可能能提供达到开始制剂的快速路径。
发现也可以影响生物活性和/或颗粒特性的其它参数包括·pH·温度(试剂溶液；混合室；产生的溶液)·添加剂/稳定剂·混合效率使用这些参数进行的优化可以例如在第二轮筛选过程中进行。该参数列表不是穷尽性的，而是举例说明一些另外的可能被研究的参数。
研究这些参数的影响可以通过至少两种方式来进行。首先，存在单独筛选每个参数，保持所有其它的参数不变的简单方法。这种反复的方法，尽管是可接受的，经常在资金方面效率低下并且通常非常耗时。此外，长期研究可能易于发生系统和随机误差。
第二种方法使用更有效的统计手段，其中可以首先筛选大多数参数，随后对最有影响的参数进行仔细优化。通常将该方法称为实验设计(DoE)并发现其提供显著的优势。在典型的研究中，可以鉴定5个参数。例如，如果需要具有特定特性的颗粒，使用目标生物活性分子/共沉淀剂/溶剂组合，那么第一个步骤可以针对以前确定的三个基本因素进行筛选，诸如例如蛋白质负载，最终水含量和共沉淀剂浓度。此外，以前的知识可能显示生物活性分子(例如，蛋白质)可能对pH和温度是敏感的。因此，在开始的筛选中，可以研究5个参数。
对于每个参数，可以确定敏感的实验范围。这通常依赖于获自以前类似研究的知识，但是其可能要求估计实际的可接受的水平。典型地，例如，用于测试制剂的合理的蛋白质负载范围可以是约0.25-10％w/w。类似地，典型的最终水含量范围可以是约0.5-10％vv，并且典型的赋形剂浓度范围可以是约75-90％的饱和浓度。例如，如果DL-缬氨酸在特定温度具有约66mg/ml的饱和浓度，那么75％等价于50mg/ml；90％等价于60mg/ml。以相同的方式，可以选择合理的pH和温度范围。可能优选的是试验和预期将给出可评估的反应变化范围。通常，可能必要的是以相当宽的范围诸如跨越数量级的范围开始。此外，以前的知识将有助于该选择过程。此外，选定的参数范围需要在随后的样品分析中给出可测量的反应。因此，如果分析技术是非常敏感的，能够报告样品间的非常小的变化，那么可能可接受的是选择窄的参数范围。另一方面，如果分析技术不够敏感或被高水平的噪声所干扰，可以选择宽的参数范围。
在选择参数和适合的范围后，可能必须的是将选择的因子输入DoE软件。最近，存在可获得的DoE软件的量的显著增加，并且可在线获得许多用于试验目的。本发明人已经回顾了一些实例，并得出结论对于简单的参数研究，所有的都是可接受的。所有的软件包具有类似的DoE输入标准，其仅在实验后数据分析中是多样化的。
在本发明应用的范围内，使用由Umetrics提供的DoE软件包MCDDE6。该软件包因为其基本使用是非常简单的而具有吸引力。实验者可以被提示输入选择的实验参数(在软件中被称为因子)，和被测量的分析量度(在软件中被称为反应)。其后，实验者可能被提问目标研究是筛选研究还是优化研究。根据作出的选择，可以建议选择可能的统计学研究，并且科学工作者可以被提示选择最适合的那个。最终，可以产生实验和分析的矩阵，提供工作的系统框架。
实验者现在可以准备进行实验，优选地以随机方式进行，因为这种方式可以使随机误差在最终的统计分析中的影响最小。
按照本发明的第八个方面，提供形成用于递送到肺的特定区域的生物活性分子包被的微晶的可调节的方法，其包括(a)提供包含共沉淀剂分子的第一水溶液；(b)提供包含生物活性分子的第二水溶液；(c)提供包含水可混溶溶剂的第三溶液；(d)基本上同时混合所述第一水溶液，所述第二水溶液和所述第三溶液；或将第一水溶液和第二水溶液的任一与第三溶液混合，随后混合以余下的第一水溶液和第二水溶液的任一；从而使共沉淀剂和生物活性分子的共沉淀被起始，导致所述微晶的形成；(e)收集所述微晶的混悬液；和(f)检测微晶的平均大小并确定这些微晶是否适合于递送到肺的特定区域，如果微晶的平均颗粒大小不适合，改变在可调节方法中的变量参数。
可影响形成颗粒的大小的参数包括共沉淀剂的浓度，pH，溶剂，水含量，生物活性分子负载，温度，添加剂浓度和混合效率。如果将第一和第二水溶液顺序添加到溶剂中，溶液从第一混合器传递到第二混合器的时间也可以变化。在一些系统中，可能必须固定这些值中的一个或多个，但是可以将DoE用于进行余下的变量参数的有效筛选。其可以用于鉴定最影响大小和介于它们之间的任何相互作用的那些参数。可以接着将该信息用于通过反应表面建模进一步精选参数以产生在目标范围内的颗粒大小，同时还优化生物活性和结合的效率。
按照本发明的第九个方面，提供接受形成按照任何前面的方面的生物活性分子包被的微晶的要求的方法，其包括(a)消费者限定对生物活性分子包被的微晶的要求，其包括生物活性、剂量、负载、大小、形状和共沉淀剂的要求；(b)调节共沉淀条件以获得如在部分(a)中限定的微晶；(c)精选共沉淀条件以获得具有适合条件的微晶；和(d)确定适合的条件来形成需要的微晶。
典型地，可以从溶剂、pH、温度、混合速率和浓度的任何中选择可被改变的共沉淀条件。
在精选方法中，还可以在微晶的生物活性和完整性上进行稳定性研究。
如果获得的微晶不适合，可以重复步骤(b)和(c)。
按照本发明的第十个方面，提供这样的方法，所述方法提供与形成按照任何前面的方面的生物活性分子包被的微晶的方法相关的服务，所述方法包括接受消费者形成这样的生物活性分子包被的微晶的请求，所述生物活性分子包被的微晶符合特定的要求，包括对大小和生物活性的要求；确定形成所述生物活性分子包被的微晶的方法；和接受为向消费者提供形成生物活性分子包被的微晶的所述方法的服务的报酬。


现在参考附图，仅通过实施例的方式描述本发明的实施方案，其中
图1是这样的图表，其表示对于由生产商提供的新鲜胰蛋白酶和胰蛋白酶PCMCs的bicinchoninic acid(BCA)测试的结果，所述胰蛋白酶PCMCs通过两管路连续的流动共沉淀器和三管路连续的流动共沉淀器产生；图2是这样的图表，其显示对于新鲜胰蛋白酶和胰蛋白酶PCMCs的N-p-甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯(TAME)测定的结果，所述胰蛋白酶PCMCs通过两管路连续的共沉淀器和三管路连续的共沉淀器产生；图3是对于新鲜胰蛋白酶和PCMCs的BCA/TAME校正活性数据的图表，所述PCMCs通过两管路连续流动共沉淀器和三管路连续流动共沉淀器产生；图4显示获自胰蛋白酶包被的和未包被的缬氨酸微晶的动态光散射(DLS)的颗粒大小，其通过两管路连续流动共沉淀器和三管路连续流动共沉淀器产生；图5是这样的图表，其显示对于PCMCs和新鲜胰蛋白酶的范围的bicinchoninic acid (BCA)蛋白质负载分析的结果；图6是显示相对于新鲜胰蛋白酶，针对胰蛋白酶/DL-缬氨酸PCMCs的保留的酶活性的TAME结果的图表；图7是显示对于胰蛋白酶/D，L-缬氨酸微晶的BCA校正保留活性的图表；图8显示获自胰蛋白酶包被的和未包被的缬氨酸微晶的动态光散射(DLS)的颗粒大小，其通过使用不同的共沉淀剂浓度获得。
图9是显示在两管路连续流动共沉淀器和三管路连续流动共沉淀器中形成的PCMCs的沉积的不同速率的图示；图10显示在两管路连续流动共沉淀器中形成的PCMCs的颗粒大小范围；图11显示在三管路连续流动共沉淀器中形成的PCMCs的颗粒大小范围；图12是按照本发明形成的牛IgG包被的微晶的SEM图像；和图13是显示肺的不同部分的图像。
实验结果实施例1使用三管路连续流动共沉淀器(CFCP)，共沉淀蛋白质包被的微晶(PCMCs)综述在被并入本文作为参考的PCT/GB2004/000044中，使用利用两管路系统的PCMCs的连续流动共沉淀，其中蛋白质和赋形剂的水溶液连续与可混溶溶剂混合。在本发明中，PCMCs通过三管路系统产生，其中PCMCs的三种组分，即蛋白质、共沉淀剂和可混溶溶剂每种独立地进行递送。泵A递送蛋白质的缓冲水溶液，泵B递送共沉淀剂的水溶液，泵C递送可混溶溶剂。
实验方法和获得的结果在下面进行描述。将实验标记为JV714。
该实验的目标是比较首先通过两管路系统，第二通过三管路系统制备的在理论上相同的PCMCs。
对于两管路系统，使用如前在PCT/GB2004/001J044中报道的CFCP。将所有的泵在使用前进行校准。对于三管路系统，对CFCP进行改进以包括另一个泵，所述泵通过另一个进入口到达混合室的底部。如在下面报道的，相应调节流速，但是所有其它的参数保持不变。
从前面的研究中可知，确定使用胰蛋白酶DL-缬氨酸PCMCs作为模型系统。制备理论上2.5％w/w负载的在DL-缬氨酸上的胰蛋白酶。将PCMCs的水含量固定在4.0％v/v。将总流速固定在100ml min-1上。胰蛋白酶(批号＞81K7653)和DL-缬氨酸(批号55H1252)获自Sigma Aldrich Co.UK。丙-2-醇(批号K32707146347)和氯化钙(批号9930948 389)获自BDH，Poole，UK。发现氯化钙提高了胰蛋白酶在PCMC晶体表面上的停留，因此包括在该实验中。其可以通过水性或有机溶剂引入，但是在该实验中被包含在水性共沉淀剂混合物中。
下面的表详述所用的每个泵递送的流速，蛋白质和/或共沉淀剂的浓度。
表1

必要的是确保每单位时间，确切地相同量的PCMC成分进入混合室。
对于两管路和三管路实验而言，如下制备单批的可混溶溶剂。将过量的DL-缬氨酸加入约2升的丙-2-醇，并在室温下搅拌该溶液约2小时。随后，通过0.45μm的膜滤器立即对所述溶液进行过滤。将该溶液称为溶液4。
对于两管路实验，如下制备胰蛋白酶-DL-缬氨酸溶液。制备在去离子水中的2.19mg/ml CaCl2的贮存溶液。使用该贮存溶液，制备包含60mg/ml的DL-缬氨酸的溶液。最终，将胰蛋白酶加入得到1.538mg/ml的浓度。将该溶液称为溶液1。
对于三管路实验，制备两种溶液。制备在去离子水中的2.5mg/mlCaCl2的贮存溶液。使用该贮存溶液，制备包含68.571mg/ml DL-缬氨酸的溶液。将该溶液称为溶液2。
此外，制备在去离子水中的胰蛋白酶溶液，浓度为12.304mg/ml。将该溶液称为溶液3。
如下制备两管路PCMCs。将溶液1分别在4和96ml min-1混合以溶液4。收集25ml的PCMC。在共沉淀后约5-10分钟，立即将PCMCs通过0.45μm的膜滤器进行过滤，并将其在温箱中于30℃干燥约1小时。
如下制备三管路PCMCs。将溶液2，3分别以0.5，3.5和96ml min-1的流速混合以溶液4。收集25ml的PCMC。在共沉淀后约5-10分钟，立即将PCMCs通过0.45μm的膜滤器进行过滤，并将其在温箱中于30℃干燥约1小时。
分析使用三项分析技术来分析制备的样品。首先使用bicinchoninic acid(BOA)比色测定法来测量在DL-缬氨酸上的胰蛋白酶的蛋白质负载。第二，使用已知的胰蛋白酶测定法-N-p-甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯(TAME)盐酸盐水解测定法来确定活性。第三，使用动态光散射(DLS)分析仪，即MalvemMastersizer测量PCMC颗粒群。
BCA测定法将约5mg的干燥物质精确称重到25ml的小瓶中。在理论上，蛋白质负载应该是2.5％w/w，因此称重的重量增加2.5％w/w。得到的值表示胰蛋白酶在PCMC样品中的胰蛋白酶的理论上的量。用0.015mg/ml(测试浓度)除该值得到需要的稀释度(dilution)。将PCMCs溶解在测试缓冲液(0.046MTris；0.0115M CaCl2pH8.1@25℃)。接着，如下分析每种溶液。将0.5ml的蛋白质标准加入1.5ml的Eppendorf管中。将0.5ml的BCA工作缓冲液加入到每个Eppendorf管中。(沉淀物可以形成)。在12,000rpm离心2分钟。在60℃的加热模块中放置正好15分钟。在12,000rpm离心2分钟。
将0.75ml吸移到微型比色槽中，并立即在562nm读数。
TAME测试将约5mg的干燥物质精确称重到25ml的小瓶中。在理论上，蛋白质负载应该是2.5％w/w，因此称重的重量乘以2.5％w/w。得到的值表示胰蛋白酶在PCMC样品中的胰蛋白酶的理论上的量。用0.015mg/ml(测试浓度)除该值得到需要的稀释度(dilution)。将PCMCs溶解在水中。如下分析每种溶液。向干净的UV石英比色杯中加入1.3ml的测试缓冲液，和150μl的0.01MTAME溶液。在25℃温育5-10分钟。加入50μl的PCMC稀释液，搅拌并在247nm测试10分钟。
动态光散射分析(DLS)分析作为PCMC混悬液和干粉的样品，所述干粉已经在DL-缬氨酸饱和的抗-溶剂中进行重构。首先将仪器用反溶剂调零(blank)。随后，将约500μl的PCMC混悬液加入以得到约12％的激光遮蔽(obscuration)。对每个样品进行5次重复测量。
BCA测试图1是这样的图表，其显示对于由生产商提供的新鲜胰蛋白酶和分别通过两管路CFCP和三管路CFCP产生的胰蛋白酶PCMCs的BCA测试的结果。
图1的BCA结果显示，在实验误差内，两管路和三管路方法没有明显差异。
图2是显示对于由生长商提供的新鲜胰蛋白酶；分别通过两管路CFCP和三管路CFCP产生的胰蛋白酶PCMCs的的TAME测试结果的图表。
如前面的BCA测试，所述TAME结果还显示，在实验误差中，两管路和三管路系统没有明显差异。图3显示PCMCs的蛋白质负载(如通过BCA测试所确定)校正PCMCs的活性(如通过TAME测试所确定)的作用。
动态光散射(DLS)图4显示动态光散射(DLS)结果，其显示由三管路系统产生的微晶在大小和跨度上显著更小。
结论胰蛋白酶-DL-缬氨酸PCMCs由两管路和三管路共沉淀方法产生。保持所有其它的参数保持不变。测量PCMCs的蛋白质负载，活性，大小和跨度。从获得的生物活性结果，两管路和三管路系统没有显著不同，但是发现获得的颗粒更小。这对于药物制剂可以是有利的。
实施例2在该实施例中，将三管路用于使用保存在不同温度的共沉淀剂溶液沉淀胰蛋白酶/DL-缬氨酸PCMCs。理论蛋白质负载是2.5％w/w；水含量是4.0％v/v；总流速是100ml/min。在一个实验[JV790]中，加热DL-缬氨酸水溶液，其浓度是90mg/ml，在另一个[JV675]中，将DL-缬氨酸溶液保持在室温，浓度是68.571mg/ml。没有将氯化钙包含在这些实验中。为了将90mg/ml DL-缬氨酸溶解在去离子水中，必要的是加热溶液，并将其维持在～90℃。使用Techne Dri-Block DB-3加热模块加热溶液。该装置被恒温控制，维持不变的温度。
理论蛋白质负载是2.5％w/w，赋形剂浓度是90mg/ml。在其中所有的管路保持在室温的竞争性实验中，理论蛋白质负载是2.5％w/w，但是赋形剂浓度是60mg/ml。结果，必要的是调节溶液浓度，如在下表2中所显示表2

表2详细描述了使用三管路系统，产生胰蛋白酶/DL-缬氨酸PCMCs所需的胰蛋白酶和赋形剂的浓度。
*这些数字指在未混合的溶液中的共沉淀剂浓度。当三种溶液混合时，有效的水溶液浓度或[共沉淀剂]aq将取决于相对流速。溶液2和3的组成流量分别是3.5和0.5ml min-1。溶液2和3的总的水流速是4.0ml min-1。因此，在混合点，下面的计算给出[共沉淀剂]aq；

因此在JV675中，D，L-缬氨酸，[共沉淀剂]aq，的有效水性浓度是60mg/ml，并且在JV790中，其是78.75mg/ml。
因此，简言之，这种另外的实验研究了有效DL-缬氨酸的浓度从60mg/ml增加到78.75 mg/ml的作用。所有其它的参数保持不变，并且对所有的样品进行关于如前所述的蛋白质负载(BCA)，酶活性(TAME)和颗粒大小(DLS)的分析。
以与前面的三管路样品类似的方式制备样品，但是因为将赋形剂溶液在90℃进行恒温控制，必须尝试并维持该温度直到混合点。在90℃用去离子水来预冲洗所述室，希望确保由在金属活塞中的电导引起的温度降低被最小化。在该实验中，没有经历泵的阻塞事件。
将样品进行共沉淀，并将约10-15ml的混悬液通过微孔Durapore过滤器进行过滤。在过滤后，立即将样品在温室中干燥不少于16小时。样品的制备和分析显示在表3中。
表3

图5是显示对于包括由生产商提供的新鲜的胰蛋白酶的JV790/2，JV790/4的BCA蛋白质负载分析的结果的图表。在共沉淀过程中明显有一些胰蛋白酶的损失，如当氯化钙不存在时所预期的。
图6是显示包括由生产商提供的新鲜胰蛋白酶的JV790/2和JV790/4的酶活性的图表。对于JV790/4保留的生物活性的损失主要是由于蛋白质的损失。
图7是在JV790中获得的生物活性的图表，其已经关于使用BCA测定法测量的真实蛋白质负载进行了校正。可以观察到存在的胰蛋白酶具有高保留活性。
图8是显示Malvem Mastersizer分析的结果的图表。对于JV675和JV790实验，可以观察到的是用胰蛋白酶制备的样品比不用胰蛋白酶制备的样品要小得多。比较JV675和JV790的结果，在JV790中增加的共沉淀剂的浓度导致了颗粒大小的减少。这在用存在的生物活性分子、胰蛋白酶制备的样品中是最显而易见的。与在更低浓度制备的那些(JV675)相比，在更高的共沉淀剂上制备的样品(JV790)要25％更小。该结果证实从生物活性分子溶液中分离共沉淀剂水溶液的优势。在该情形中，D，L-缬氨酸溶液可以被加热到90℃，而没有使胰蛋白酶变性的危险。
结论通常，与使用可比较的室温条件获得的那些相比，在90℃的温度下，使用90mg/ml的赋形剂浓度产生的胰蛋白酶/DL-缬氨酸PCMCs没有改变蛋白质负载和酶活性特性。这显示在图7中。实验假设提议高共沉淀剂浓度将诱导更高的过饱和，和因此更小的PCMCs。当蛋白质存在时，发现情形如此，并且使用加热的，更高浓度的共沉淀剂溶液观察到颗粒大小的25％的大小减少。
实施例3比较用于胰蛋白酶/K2SO4在异丙醇中共沉淀的2管路或3管路CFCP系统[实验JV818]。
设计该实施例来确定使用前面所述的3管路混合方法的优势是否也可以用已知共沉淀非常迅速的共沉淀剂来获得。
K2SO4是无机盐，其在添加到适合的反溶剂诸如丙-2-醇中后从浓缩的水溶液中沉淀。在文献中可知无机盐迅速沉淀，并且在许多情形中沉淀是这样迅速，甚至使测量过程难以进行。以前，我们已经证实可以使用分批系统或两管路连续方法，用硫酸钾制备生物活性分子包被的微晶。此外，一直发现(用K2SO4和许多其它的材料)该共沉淀过程导致形成这样的晶体，所述晶体小于在缺乏蛋白质时沉淀获得的那些晶体。因此，颗粒大小提供方便的诊断工具来确定生物活性分子是否在共沉淀过程中对晶体的形成具有影响。
在实施例1中，显示对于通过两管路或3管路方法，与胰蛋白酶共沉淀的DL-缬氨酸，相对于纯的DL-缬氨酸的沉淀，颗粒大小显著减少。在该实施例中，将3管路混合系统用于生物活性分子胰蛋白酶与硫酸钾(K2SO4)的共沉淀，晶体大小的变化用于确定是否产物不同于用两管路系统获得的产物。
实验方法.
制备下列系列的样品，如表4中所显示。
表4

对于该实验，必要的是计算必需的流速和需要的试剂，如在表5中所显示。
表5


选择2.5％w/w的理论蛋白质负载。将PCMC混悬液的水含量固定在4.0％v/v。将总流速固定在100ml min-1。胰蛋白酶(批号121K7692)和K2SO4(批号121K0043)获自Sigma Aldrich Co.UK。丙-2-醇(批号K32883646)获自BDH，Poole，UK。
如在前面的实验中，必要的是制备对于3管路系统的胰蛋白酶和K2SO4的更浓缩的溶液以确保在每个单位时间相同量的物质进入流动室。还对流速进行改变以确保水含量固定在4％v/v。搅拌速度固定在1500rpm。
在共沉淀进行之前，校准CFCP系统。对每个泵进行独立地校准，发现所述泵是令人满意地精确。
将样品1-4进行共沉淀并立即转移到电冰箱中进行贮存。
结果在共沉淀后几乎立即发现在2管路和3管路系统之间存在可观察到的差异。比较样品2和4，观察到随着沉淀的速率明显不同，样品2中的颗粒显著小于样品4的颗粒。事实上，样品4基本类似于不包含胰蛋白酶的样品1&3。图9显示，在共沉淀后约10分钟沉淀的程度。
显而易见的是，样品3明显不同于其它的，这显示只有在样品2中，具有与K2SO4的相互作用以产生PCMCs。
在共沉淀后约4小时，使用Malvern Mastersizer分析所有的混悬液样品，所述Malvern Mastersizer使用激光衍射技术来确定产生的颗粒的大小和跨度。将结果显示在表6中。
表6

基本上，样品1，3和4在实验误差内是相同。然而，样品2主要由明显更小的颗粒组成，这与所述样品需要更长的时间来沉淀的观察是一致的。图10和11分别显示对于样品2和4的Mastersizer结果。
图10证实在提供应用适合的混合方案的条件下，具有亚微米大小的生物活性分子包被的微晶是可获得的。图11显示尽管在3管路系统中混合太慢而不能在起始沉淀过程中提供蛋白质的相互作用，但所有的颗粒都具有类似大小。可能的是在pI为9时，胰蛋白酶与具有负的ζ电势的沉淀的K2SO4晶体静电结合。这提供获得具有窄大小分布的更大的包被颗粒的途径，所述颗粒可以用于产生缓慢释放的制剂。
结论这些结果清楚显示对于与K2SO4共沉淀的胰蛋白酶，在三管路系统中获得的颗粒在大小上与通过纯的K2SO4沉淀获得的颗粒相同。另一方面，在2管路系统中，在蛋白质不存在时获得小得多的颗粒。在本文获得的结果和用DL-缬氨酸获得的结果之间的差异是显著的并且可与沉淀的相对速率相关。在沉淀发生之前，在3管路系统中用缬氨酸可获得接近完全的混合。这使生物活性分子干预了颗粒的成核作用的过程。在该情形中，在3管路系统中制备的颗粒比在2管路系统中获得的那些显著更小并且比在无蛋白质情况下获得的那些显著更小。
在用K2SO4的情况中，沉淀非常快，因此如果将两股水流单独引入，那么颗粒形成发生在彻底混合发生前，而且蛋白质的添加没有作用。这证实生物活性分子在控制颗粒的大小上具有重要活性作用。其还证实要能够在保持两种水性成分分离的情况下，获得3管路系统的优势，必要的是选择共沉淀剂诸如氨基酸或糖，其在与获得优质混合所需要的时间范围相比更慢的时间范围共沉淀。
实施例4通过2管路和3管路方法制备抗体包被的微晶使用在实施例1中所述的设备和在表7中所述的条件，通过2管路和3管路方法制备牛IgG-包被的缬氨酸微晶。在0.01M磷酸钠，0.15M NaCl(PBS)，pH 7.4(防腐剂0.1％的叠氮化钠)中的10mg/ml的牛IgG(批号052742366)的供应商是Lampire Biologicals，PO Box 270，Pipersville，PA 18947。对于2管路和3管路实验，设计实验条件来在沉淀过程中产生7.5wt％的相同的制剂中的理论蛋白质负载，4％v/v的混悬液中的最终水含量，和相同的缬氨酸的过饱和。在两个实验之间的关键差异是在3管路实验中，将蛋白质引入在pH 7.4的PBS缓冲液中共沉淀，而在两管路实验中，其混合以缬氨酸共沉淀剂，并且在约6.2的pH。
表7


表8显示在于室温作为干粉贮存1天和6天后，可以从制剂中回收的可溶性蛋白的量之间的差异。清楚的是所述3管路方法提供在蛋白质完整性保留方面的明显的优势-在处理后没有可检测到的蛋白质聚集并且所述制剂在室温的贮存更稳定。
表8

图12显示通过3管路系统制备的牛IgG包被的微晶的SEM图像。观察到的薄片具有5-15微米的直径。在以前发现这种类型的薄片适合于通过干粉吸入器进行递送并且显示小于几何学直径的空气动力学质量中位数直径(组合物专利)。因此，预期这些制剂将充分适合于将抗体和Fc-融合蛋白和Fc-药物缀合物递送到中枢呼吸道从而通过主动运输进行全身性递送。
实施例5使用在实施例1中所述的设备和厂商以及在表x中所述的条件，(胰蛋白酶(Sigma Cat#T1426，批号104K7575)，L-谷氨酰胺(Sigma Cat#G8540，批号072K03651)，通过2管路方法和3管路方法制备胰蛋白酶包被的谷氨酰胺微晶。
因此，包含蛋白质的水溶液是在2管路系统中通过谷氨酰胺所设定的pH6.3，或在3管路系统中通过磷酸缓冲液设定的pH9.2。pH9.2接近于胰蛋白酶的pI。在3管路系统中，谷氨酰胺溶液的pH还是pH6.3。收集产生的晶体，用溶剂漂洗，干燥并使用在实施例1中所述的水解测定法来测定胰蛋白酶的生物活性。
将结果显示于表9。
表9

相对于假设所有的蛋白质被固定所预期的最大值来计算保留的生物活性的百分比。
如在表10中所显示，与在2管路系统中的相比，通过3管路系统(用接近于胰蛋白酶的pI的蛋白质的pH)制备的样品导致显著更高的生物活性胰蛋白酶的保留。RP-HPLC证实这种差异与在结合于微晶的蛋白质的量的变化有关。因此3管路系统提供在引入更低量的缓冲剂到产物中的情况下，获得提高的结合效率的方法。
表10

实施例6图13是显示具有区域1-6的肺的不同部分的图像。
区域5和6已知是肺中的肺泡空间。还可以通过肺用装置，将约1微米的颗粒大小的微晶递送到区域6。可以通过肺用装置将具有约1-5微米颗粒大小的微晶递送到区域5。
已知区域3和4是肺中的大的有纤毛的呼吸道空间。可以通过肺用装置将具有约5-10微米的颗粒大小的微晶递送到区域3和4。
已知区域1和2是上呼吸道，并且在大多数情形中，由于不吸收而不适合于在该区域中提供微晶。
通过采用制备生物活性分子包被的微晶的方法，可以对所述微晶进行改造从而使它们优先结合在区域1-6中的任一个或其组合中，如在图13中所显示。
可以影响颗粒大小的参数包括共沉淀剂的浓度，pH，溶剂，水含量，生物活性分子负载，温度，添加剂浓度和混合效率。如果将第一和第二水溶液顺序添加到溶剂中，溶液从第一混合器传递到第二混合器的时间也可以变化。在一些系统中，可能必须将这些值中的一个或多个固定，但是可以用DoE来进行剩余变量参数的有效筛选。其可以用于鉴定最影响大小和它们之间任何相互作用的那些。接着，可以使用该信息来通过反应表面建模进一步精选参数从而产生具有目标范围的颗粒大小，而同时还优化生物活性和结合效率。
权利要求
1.一种形成生物活性分子包被的微晶的连续法，其包括下列步骤(a)提供包含共沉淀剂分子的第一水溶液；(b)提供包含生物活性分子的第二水溶液；(c)提供包含水可混溶溶剂的第三溶液；(d)基本上同时混合所述第一水溶液，所述第二水溶液和所述第三溶液；或将第一和第二水溶液的任一种与第三溶液混合并随后混合以余下的第一水溶液和第二水溶液的任一种；从而使所述共沉淀剂和所述生物活性分子的共沉淀开始，导致所述微晶的形成；和(e)收集微晶的混悬液。
2.按照权利要求1的方法，其中所述水可混溶溶剂是短链醇类诸如甲醇；乙醇；丙-1-醇；丙-2-醇；醛或酮类诸如丙酮，酯类诸如乳酸乙酯，醚类诸如四氢呋喃，二醇类诸如2-甲基-2，4-戊二醇，1，5-戊二醇，和各种大小的聚乙二醇(PEGS)和多元醇类；或其任何组合或其混合物。
3.按照权利要求1或2的任一项的方法，其中第一个泵连续递送包含共沉淀剂分子的第一水溶液，第二个泵连续递送包含生物活性分子的第二水溶液，和第三个泵连续递送包含水可混溶溶剂的第三溶液。
4.按照权利要求1或2的任一项的方法，其中第一个泵连续将第一和第二水溶液的任一种递送到通过第二个泵连续递送到第三溶液中，随后第三个泵连续递送余下的第一和第二水溶液中的任一种。
5.按照前述权利要求任一项的方法，其中所述水溶液以介于约0.2ml/min和约1000ml/min之间的流速进行递送。
6.一种药物制剂，其包含具有一个或多个微晶的颗粒，其中所述微晶包含(a)从共沉淀剂分子形成的基本非-吸湿性的内部晶核；和(b)包含一个或多个生物活性分子的外涂层；其中所述包被的微晶通过如下方式在单一连续法中形成基本上混合包含共沉淀剂分子的第一水溶液，包含生物活性分子的第二溶液和包含水可混溶溶剂的第三溶液；或将所述第一和第二水溶液中的任一混合以所述第三溶液，随后混合以余下的第一和第二水溶液中的任一种。
7.按照权利要求6的药物制剂，其中所述外涂层的厚度的范围在约0.01-1000微米，约1-100微米，约5-50微米或约10-20微米。
8.按照权利要求6或7中任一项的药物制剂，其中所述颗粒具有少于约80μm，少于约50μm或少于约20μm的最大截面尺寸。
9.按照权利要求6-8中任一项的药物制剂，其中组成所述晶核的分子具有少于约2kDa的分子量。
10.按照权利要求6-9中任一项的药物制剂，其中组成所述晶核的所述分子选自下列各项氨基酸，两性离子，肽，糖，缓冲成分，水溶性药物，有机和无机盐，形成强氢键晶格的化合物或其衍生物或任意组合。
11.按照权利要求6-10中任一项的药物制剂，其包含药物诸如消炎药；抗癌药；抗精神病药；抗细菌药；抗真菌药；天然或非天然肽；蛋白质诸如胰岛素，α1-抗胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，白蛋白；干扰素；抗体；融合蛋白诸如Fc-融合蛋白；蛋白质-药物缀合物；核酸诸如天然来源的基因片段，DNA，RNA或RNAi或合成的寡核苷酸和反义核苷酸；糖类诸如任何单糖，二糖或多糖；质粒；和蛋白质/肽-药物缀合物。
12.按照权利要求6-11中任一项的药物制剂，其中所述颗粒包括那些下面的颗粒具有D，L-缬氨酸晶核和胰岛素涂层；具有L-甘氨酸晶核和抗胰蛋白酶涂层；具有谷氨酸钠晶核和胰岛素涂层；具有L-甲硫氨酸晶核和胰岛素涂层；具有L-丙氨酸晶核和胰岛素涂层；具有L-缬氨酸晶核和胰岛素涂层；具有L-组氨酸晶核和胰岛素涂层；具有L-甘氨酸晶核和α-抗胰蛋白酶涂层；具有L-谷氨酰胺晶核和白蛋白涂层；具有D，L-缬氨酸晶核和寡核苷酸DQA-HEX涂层；具有D，L-缬氨酸晶核和具有另外的N-乙酰基半胱氨酸的抗氧化剂外涂层的α1-抗胰蛋白酶涂层；具有D，L-缬氨酸晶核和卵清蛋白涂层；具有L-谷氨酰胺的晶核和卵清蛋白涂层，具有D，L-缬氨酸晶核和白喉类毒素涂层；具有L-谷氨酰胺的晶核和白喉类毒素涂层；具有D，L-缬氨酸晶核和白喉类毒素涂层；具有L-谷氨酰胺的晶核和破伤风类毒素涂层；具有L-缬氨酸晶核和白喉类毒素和破伤风类毒素混合物涂层；具有L-谷氨酰胺晶核和白喉类毒素和破伤风类毒素混合物涂层。
13.一种用于肺递送的药物制剂，其包含按照权利要求1-5中任一项形成的微晶。
14.按照权利要求13的药物制剂，其中用于形成肺用药物制剂的生物活性分子选自下列各项中的任一项治疗用蛋白质诸如胰岛素，α1-抗胰蛋白酶，干扰素；抗体和抗体片段和衍生物；治疗用肽和激素；合成性和天然DNA，其包括基于DNA的药物；酶；疫苗成分；抗生素；止痛药；水溶性药物；水敏感性药物；脂质和表面活性剂；多糖；或其任何组合或衍生物。
15.按照权利要求13或14任一项的药物制剂，其中所述肺用制剂包含质量中位数气动粒径少于约10微米或少于约5微米的颗粒。
16.按照权利要求13-15中任一项的药物制剂，其中所述肺用制剂具有包含氨基酸诸如缬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，甘氨酸或谷氨酰胺的晶核，并且其例如，包括缬氨酸的晶核和治疗用蛋白质诸如胰岛素的涂层；组氨酸的晶核和酶的涂层；缬氨酸的晶核和酶抑制剂诸如α-抗胰蛋白酶的涂层；缬氨酸的晶核和DNA的涂层；缬氨酸的晶核和疫苗涂层；谷氨酰胺的晶核和疫苗涂层；谷氨酰胺的晶核和白蛋白涂层。
17.一种肠胃外制剂，其包含按照权利要求1-5中任一项形成的微晶或微晶的混悬液。
18.一种持续释放或缓释的药物制剂(或长效制剂(depot))，其包括按照权利要求1-5中任一项形成的微晶或微晶的混悬液
19.一种用于吸入的药物递送装置，其包含按照权利要求1-5中任一项形成的微晶。
20.一种确定制备生物活性分子包被的微晶的最佳条件的方法，所述方法包括下列步骤制备第一批按照第一组变量参数的生物活性分子包被的微晶并量化所述生物活性分子包被的微晶的至少一个性质；通过改变至少一个所述的变量参数制备第二批生物活性分子包被的微晶，并量化所述至少一个性质从而能够确定所述至少一个变化对于所述至少一个性质具有有益还是有害的效果。
21.一种接受请求形成按照权利要求1-5中任一项形成的生物活性分子包被的微晶的方法，其包括(a)消费者限定对生物活性分子包被的微晶的要求，其包括对生物活性、剂量、负载、大小、形状和共沉淀剂的要求；(b)调节所述共沉淀条件以获得如在部分(a)中限定的微晶；(c)精选所述共沉淀条件以获得具有适合条件的微晶；和(d)确定适合的条件来形成所述需要的微晶。
22.一种提供与形成按照权利要求1-5中任一项的生物活性分子包被的微晶的方法相关的服务的方法，所述方法包括接受消费者形成具有特定要求的生物活性分子包被的微晶的请求，所述要求包括对大小和生物活性的要求；确定形成所述生物活性分子包被的微晶的方法；和接受为向消费者提供形成生物活性分子包被的微晶的所述方法的服务的报酬。
全文摘要
本发明一般涉及包含一个或多个水溶性晶体的微米或亚微米颗粒，其中所述晶体具有包含一个或多个生物活性分子的表面涂层，以及形成这些颗粒的方法和快速筛选形成这些颗粒的优选条件的方法。所述颗粒可适合用于药物制剂。
文档编号A61K9/14GK101018544SQ200580025180
公开日2007年8月15日 申请日期2005年7月27日 优先权日2004年7月27日
发明者B·D·穆尔, J·沃斯 申请人:斯特拉斯克莱德大学