专利名称：：先前的疗法失败的患者中自身免疫病的抗血管发生疗法的制作方法先前的疗法失败的患者中自身免疫病的抗血管发生疗法相关申请这是依据37CFR§1.53(b)提交的非临时申请，依据35U.S.C.§119(e)要求2004年12月17日提交的美国临时申请流水号60/637,169的优先权，在此收入其完整内容作为参考。发明领域本发明关注使用血管发生抑制剂诸如抗VEGF抗体的疗法。具体而言，本发明关注此类拮抗剂用于治疗自身免疫病的用途，特别是在先前的治疗失败的患者中治疗自身免疫病的用途。发明背景自身免疫病，诸如类风湿性关节炎、多发性硬化、脉管炎和狼疮等，仍然是人类临床上的重要疾病。总的来说，自身免疫病影响约5%的北美和欧洲人群，其中三分之二是女性。自身免疫病，顾名思义，是通过机体自身免疫系统施行其破坏作用。在正常时有效防御来自微生物世界的外来威胁的免疫系统有时将其强有力的武器指向机体的自身成分，引起自身免疫。尽管病理学机制在各个类型的自身免疫病间不同，但一种通常的机制涉及存在的某些抗体(在本文中称为自身反应性抗体或自身抗体)的结合。疾病常常涉及截然不同的解剖区域。例如，免疫系统在类风湿性关节炎(RA)中攻击关节的滑膜内表面(lining),在曱状腺炎中攻击曱状腺，在1型糖尿病(T1DM)中攻击分泌胰岛素的胰P细胞，而在多发性硬化(MS)中攻击脑和脊髓的髓鞘。在系统性红斑狼疮(SLE)中有变化多端的表现，涉及皮肤、肾、关节和脑。类风湿性关节炎(RA)是病因未知的慢性自身免疫性紊乱，典型特征为手和脚小关节的对称疼痛和肿胀。事实上，身体的任何其它关节也可受到炎症的侵袭，包括大关节，诸如肩、膝、臀、颚/颌和颈推棘突。持久的关节炎症常常造成关节软骨和骨破坏以及永久变形。疾病的自然史以数年描述，但关节损伤可能早在发作后3-6个月发生。尽管RA主要影响关节，然而它是一种全身疾病且可引起疲劳、低热、和累及其它器官系统，包括眼、肺和血管。例如，RA可引起巩膜炎(炎性眼病)、胸膜炎/肋膜炎、间质性肺纤维化和脉管炎。RA显著影响患者的生活质量，引起疼痛和功能残疾，及对家务、家庭和娱乐活动的相关限制。工作能力受到限制和有些情况下失业可对个人和社会都造成实质性的经济后果。RA的诊断基于临床表现和所选实验室测试的结果。约75%的患者将对类风湿因子(对免疫球蛋白G(IgG)的Fc部分有反应性的一种自身抗体)测试呈阳性，但这一发现在患病的第一年可能不存在。此外，类风湿因子不是对类风湿性关节炎特异的，在5°/。的健康个体中也有发现。红血球沉降速率在大多数RA患者中升高，且C反应性蛋白质(另一种急性期反应物)典型地在疾病活跃患者中升高。手和脚或可能的其它关节的X射线检查可能在有些情况中有用，证明关节周围骨去矿化(periarticularbonydemineralization)、关节腔变窄和骨侵蚀(bonyerosion)。当前无法治愈RA。由于不知道疾病的起因，当前的疗法针对遏制炎性应答。像大多数慢性关节病(arthritides)—样，治疗的目标是保持关节功能和限制疾病进展。RA活跃患者的用药表可包括非类固醇抗炎药(NSAID)、低剂量泼尼松、和一种或多种减轻疾病的抗风湿药(DMARD)。参见"Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis"Arthritis&Rheumatism46(2):328-346,February,2002。大多数新诊断的RA患者在诊断3个月内由减轻疾病的抗风湿药(DMARD)疗法开始。常用于RA的DMARD有羟氯会、柳氮磺吡啶、甲氨喋呤(MTX)、来氟米特、硫唑噤呤、D-青霉胺、金(口服)、金(肌肉内)、米诺环素、环孢菌素和葡萄球菌蛋白A免疫吸附。最近的研究指出RA活跃患者在患病的前几年形成重大关节损伤。这一认识导致了联合使用DMARD的更具攻击性的治疗方法。然而，联合使用DMARD的疗法不能完全消除疾病活动性且可能导致严重的药物相关并发症。此外，尽管有攻击性的治疗方法，大多数患者仍然形成关节侵蚀。已经将细胞因子肺瘤坏死因子(TNF)的过度活性(ovemctivity)与滑膜细胞增殖、新血管发生、炎症细胞的募集和降解酶的生成联系起来。这些发现激励了抗细胞因子疗法的发展。进一步的调查显示，RA的体征和症状可在某些促炎细胞因子诸如TNF和IL-1得到单克隆抗体、天然存在细胞因子拮抗剂或细胞因子受体阻断剂中和时消除。Etanercept(依那西普(etanercept)，ENBREL⑧)是在美国批准用于活跃的RA的疗法的可注射药物。依那西普结合TNFa并承担从关节和血液中除去大部分TNFa，由此阻止TNFa促进炎症和类风湿性关节炎其它症状的作用。依那西普是"免疫粘附素"融合蛋白，由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分相连的人IgGl的Fc部分组成。已经将该药与负面副作用联系起来，包括严重的感染和脓毒症、神经系统紊乱诸如多发性硬化(MS)。Infliximab(英夫利昔单抗)，以商品名REMICADE⑧销售，是治疗RA和克罗恩氏病(Crohn，sdisease)的免疫抑制处方药。英夫利昔单抗(Infliximab)是结合TNFa的嵌合单克隆抗体，在机体中通过靶向并结合引起炎症的TNFa来减轻炎症。已经将英夫利昔单抗与致死性反应联系起来，诸如心力衰竭和感染，包括结核病，以及导致MS的脱髓鞘。在2002年12月，Abbott实验室收到FDA的批准，销售Adalimumab(阿达木单抗，HUMIRAtm)，先前称为D2E7。阿达木单抗(Adalimumab)是结合TNFa的人单克隆抗体，证实在患有中度至严重活跃RA且对一种或多种传统的减轻疾病的DMARD响应不充分(insufficientresponse)的成人中减轻体征和症状并抑制结构损伤的进展。血管发生是重要的细胞事件，其中血管内皮细胞增殖、消减和重新组织，从而从现有的血管网络形成新血管。有令人信服的证据表明血管供应的发展对于正常和病理的增殖过程是至关重要的(FolkmanandKlagsbrun(1987)Science235:442-447)。运送氧和养分，以及清除异化产物，代表了多细胞生物体中发生的大多数生长过程的限速步骤。如此，普遍假定血管区室不仅是胚胎发生过程中的器官发育和分化而且是成人中的伤口愈合和生殖功能所必需的，虽然不是充分的。血管发生还巻入了多种紊乱的发病机理中，包括但不限于增殖性视网膜病、年龄相关黄斑变性、肿瘤、自身免疫病诸如类风湿性关节炎(RA)、和银屑病。血管发生是由l)蛋白酶释放后局部胞外基质的降解，2)毛细管内皮细胞的增殖，和3)毛细管向血管发生性刺激物的迁移组成的级联过程。Ferraraetal.(1992)EndocrineRev.13:18-32。考虑到血管发生在生理学和病理学上的突出重要性，许多工作关注于能够调节此过程的因子的阐述。有人^^出血管发生过程受到促血管发生和抗血管发生分子间平衡的调节，而且在多种疾病中这种平衡失调，尤其是在癌症中。Ca誕lietandJain(2000)Nature407:249-257。血管内皮细胞生长因子(VEGF),血管内皮细胞的有力促分裂原，据报道是正常和异常血管发生二者的关键调节物。FerraraandDavis-Smyth(1997)EndocrineRev.18:4-25;Ferrara(1999)J.Mol.Med.77:527-543。与促成血管形成过程的其它生长因子相比，VEGF在其对血管系统内的内皮细胞的高特异性方面是独特的。最近的证据表明VEGF对于胚胎的脉管发生(vasculogenesis)和血管发生(angiogenesis)是至关重要的。Carmelietetal.(1996)Nature380:435-439;Ferraraetal.(1996)Nature380:439-442。此外，VEGF是女性生殖道中的周期性血管增殖及骨生长和软骨形成所要求的。Ferraraetal.(1998)NatureMed.4:336-340;Gerberetal.(1999)NatureMed.5:623-628。在血管发生和脉管发生中作为血管发生因子之外，VEGF，作为多效性生长因子，还在其它生理过程中展现出多种生物学效应，诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钓内流。FerraraandDavis-Smyth(1997)，见上文。此外，最近的研究报道了VEGF对少数非内皮细胞类型的促有丝分裂效应，诸如视网膜色素上皮细胞、胰导管细胞和许旺氏(Schwann)细月包。Guerrinetal.(1995)J.CellPhysiol.164:385-394;Oberg-Welshetal.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126:125-132;Sondelletal.(1999)J.Neurosci.19:5731-5740。有充分的证据表明VEGF在累及病理性血管发生的疾患或疾病形成中其有至关重要的作用。VEGFmRNA由大多数检验的人肿瘤过表达(Berkmanetal.JClinInvest91:153-159(1993);Brownetal.HumanPathol.26:86-91(1995);Brownetal.CancerRes.53:4727-4735(1993);Matternetal.Brit.J.Cancer.73:931-934(1996);Dvoraketal.AmJ.Pathol.146:1029-1039(1995))。还有，在糖尿病和其它缺血相关一见网膜病的患者中，VEGF在眼液中的浓度与活跃血管增殖的存在高度相关(Aielloetal.N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994))。此外，最近的研究证实了VEGF在受到AMD影响的患者脉络膜新血管膜中的定位(Lopezetal.Invest.Ophtalmo.Vis,Sci.37:855-868(1996))。性的众多尝试。抑制性抗VEGF受体抗体、可溶性受体构建物、反义策略、针对VEGF的RNA适体和低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂都已经建议干预VEGF信号传导(Siemeisteretal.CancerMetastasisRev.17:241-248(1998))。事实上，抗VEGF中和性抗体已经显示出在棵鼠中抑制多种人肺瘤细胞系的生长(Kimetal.Nature362:841-844(1993);Warrenetal.J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995);Borgstr6metal.CancerRes.56:4032-4039(1996);Melnyketal.CancerRes.56:921-924(1996))，而且还在缺血性^L网膜紊乱模型中抑制眼内血管发生(Adamisetal.Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996))。因此，抗VEGF单克隆抗体或其它VEGF作用抑制剂是治疗实体瘤和多种眼内新血管紊乱的有希望候选物。虽然VEGF分子在肿瘤细胞中上调，而且它的受体在肿瘤浸润的血管内皮细胞中上调，但是VEGF及其受体的表达在与血管发生无关的正常细胞中保持低水平。如此，此类正常细胞将不会受到阻断VEGF及其受体间相互作用以抑制肿瘤血管发生及因此肿瘤生长和癌转移的影响。单克隆抗体现在常常使用重组DNA技术来制造。单克隆抗体得到了广泛的使用，特别是那些衍生自啮齿类动物的单克隆抗体。然而，非人抗体在人体中常常是抗原性的。技术上试图通过构建"嵌合"抗体来克服这个问题，其中非人抗原结合结构域与人恒定结构域偶联(Cabilly等，美国专利第4,816,567号)。可选择人恒定区的同种型以使所述嵌合抗体适于参与抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用。在试图解决抗体的抗原结合功能并将人抗体中异源序列的使用降至最低的进一步努力中，对多种抗原制备了人源化抗体，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代，即用啮齿类(CDR)残基替代人抗体的相应区段。在实践中，(FR)残基用来自啮齿类抗体中的类似位点的残基替代的人抗体。Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Riechmannetal.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyenetal.,Science239:1534-1536(1988)。已经成功制备了数种人源化抗人VEGF(hVEGF)抗体，而且已经在体外和在体内都显示出显著的hVEGF抑制性活性。Prestaetal.(1997)CancerResearch57:4593-4599;Chenetal.(1999)J.Mol.Biol.293:865-881。一种具体的人源化抗VEGF抗体，贝伐单抗(贝伐单抗(bevacizumab),Avastin,Genentech,Inc.),在美国已经批准与化疗剂耳关合用于治疗转移性结肠直肠癌(CRC)。该药目前在多项临床试验中用于治疗多种其它癌症。人源化抗VEGF抗体的另一种高亲和力变体目前在经历治疗年龄相关黄斑变性(AMD)的临床测试。越来越多的证据表明VEGF与炎性关节病诸如RA的发病机理有关。已经在RA患者炎症关节的滑膜组织中鉴定到VEGF，诸如滑膜内层(synoviallining)细胞、滑膜内层巨噬细胞、血管周围成纤维细胞和血管平滑肌细胞。Nagashimaetal(1995)J.Rheumatol.22:1624-1630。发现滑液和血清中的VEGF水平在成人和青少年RA中都显著升高且与疾病活动性有关。Kochetal.(1994)J.Immunol.152:4149-4156。最近，已经证明中和VEGF可在小鼠中预防胶原诱发的关节炎和改善已形成的RA。Soneetal.(2001)Bioch.Bioph.Res.Comm.281:562-568。尽管有这些进展，仍然需要自身免疫病的有效疗法，尤其是使用抗血管发生拮抗剂的疗法。发明概述在第一个方面，本发明提供了治疗先前的治疗失败的哺乳动物中的自身免疫病的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的血管发生拮抗剂。例如，本发明提供了治疗DMARD疗法诸如MTX或TNFa抑制剂失败了或响应不当的(inad叫uateresponse)哺乳动物中的类风湿性关节炎的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的结合并阻断VEGF的抗体。本发明还关注降低选自感染、心力衰竭和脱髓鞘的负面副作用的风险的方法，包括对患有自身免疫病的哺乳动物施用治疗有效量的血管发生拮抗剂。还提供了血管发生拮抗剂诸如抗VEGF抗体在制备用于治疗先前的疗法失败的患者中的自身免疫病诸如RA的药物中的用途。优选实施方案的详述I.定义为了本发明的目的，"血管发生拮抗剂(angiogenesisantagonist)"指能够物。已经鉴定了且本领域知道许多血管发生拮抗剂，包括CarmelietandJain(2000)所列。通常，JE及王^ja》L^'j疋丰^r口j^^疋贝^及玉g丁^Xj亚、径的组合物。在某些方面，血管发生拮抗剂是蛋白质组合物，诸如靶向血管发生因子的抗体。最为公认的血管发生因子之一是VEGF，而最有效的血管发生拮抗剂之一是中和性抗VEGF抗体。术语"VEGF，，和"VEGF-A，，可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leungetal"Science246:1306(1989)和Houcketal"Mol.Endocrin.5:1806(1991)所述，及其天然存在的等位形式和加工形式。术语"VEGF"还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请涉及任何此类形式的VEGF,例如"VEGF(8-109)"、"VEGF(1-109)"或"VEGF165"。"截短的"天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(曱硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(曱硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-l受体的结合亲和力。"VEGF抗体"指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。优选的是，用作治疗剂。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C,也不会结合其它生长因子，诸如P1GF、PDGF或bFGF。优选的抗VEGF抗体是与杂交瘤ATCCHB10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体。更优选的是，抗VEGF抗体是依照Prestaetal.,CancerRes.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为贝伐单抗(贝伐单抗(bevacizumab);BV;Avastin⑧)的抗体。抗VEGF抗体"贝伐单抗(Bevacizumab,BV)"，也称为"rhuMabVEGF"或"Avastin"，是依照Prestaetal.，CancerRes.57:4593-4599(1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgGl框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗(Bevacizumab)大约93%的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgGl,而大约7%的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗(Bevacizumab)具有约149,000道尔顿的分子量且是糖基化的。"VEGF拮抗剂，，指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括其与一种或多种VEGF受体的结合的分子。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、受体分子及特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。"自身免疫病"在本文中指源自且针对个体自身组织的疾病或病症或其共分离(co-segregate)或表现或由其导致的疾患。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎、幼发型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎)、银屑病、皮炎包括特应性皮炎、慢性特发性荨麻渗包拾f曼性自身免疫性荨麻渗、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、硬皮病(包括系统性硬皮病)、硬化诸如进行性系统性硬化、炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病、溃疡性结肠炎、自身免疫性炎性肠病)、坏疽性脓皮症、结节性红斑、原发性硬化性胆管炎、巩膜外层炎)、呼吸窘迫综合征包括成人型呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎、脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎、葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、结肠炎诸如微观结肠炎(microscopiccolitis)和胶原性结肠炎、肾小球肾炎(GN)诸如膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN、膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急进性GN、变应性疾患、变应性反应、湿渗、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾患、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)(诸如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑狼疮、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发)、幼发型(I型)糖尿病包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成年型糖尿病(II型糖尿病)、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超^:感性有关的免疫应答、结核病、结节病、肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病、粒细胞缺乏、血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎)、CNS血管炎、系统性坏死性血管炎、及ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS))、颞动脉炎、再生障碍性贫血、库姆斯(Coombs)阳性贫血、戴-布二氏(DiamondBlackfan)贫血、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、CNS炎性病症、多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂抗体综合征、变应性神经炎、贝切特氏(Behcet)病、卡斯尔曼氏(Castleman)综合征、古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征、雷诺氏(Reynaud)综合征、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征、类天疱痴诸如大疱性类天疱裔、天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮和粘膜类天疱疮型天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺病、莱特氏(Reiter)病、免疫复合物肾炎、慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病、血小板减少症(如例如心肌梗死患者形成的)包括血栓性血小板减少性紫癥(TTP)和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫瘋(ITP)包括慢性或急性ITP、睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性曱状腺功能减退症、曱状旁腺功能减退症、自身免疫性内分泌病包括曱状腺炎诸如自身免疫性曱状腺炎、慢性曱状腺炎(桥本氏(Hashimoto)曱状腺炎)、或亚急性曱状腺炎、自身免疫性曱状腺病、特发性曱状腺功能减退症、阿狄森氏(Addison)病、格雷夫斯氏(Graves)病、多腺体综合征诸如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、瘤外综合征(paraneoplasticsyndrome),包括神经系统的瘤外综合征诸如兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Eaton-Lambert)综合征、僵体(stiff-man)或僵人(stiff-person)综合征、脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎、重症肌无力、小脑变性、边缘叶和/或脑干脑炎、神经性肌强直、视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、和感觉神经病、席汉氏(Sheehan)综合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎、淋巴样间质性肺炎、梗阻性细支气管炎(非移植)对NSIP、格-巴二氏(Guillain-Barr6)综合征、贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)、原发性胆汁性肝^5更化、口炎性腹泻(,夫质肠病)、顽固性口炎性腹泻、疱渗样皮炎、冷球蛋白血症、肌萎缩性侧索硬化(ALS;卢格里克氏(LouGehrig)病)、冠状动脉病、自身免疫性内耳病(AIED)、或自身免疫性听力损失、视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、多软骨炎诸如顽固性多软骨炎、肺泡蛋白质沉积症、淀粉样变、巨细胞性肝炎、巩膜炎、非癌性淋巴细胞增多、原发性淋巴细胞增多，包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病，MGUS)、周围神经病、瘤外综合征、通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪、和CNS的通道病、孤独症、炎性肌病、病灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、内分泌性眼病、葡萄膜视网膜炎、自身免疫性肝脏病学病症、纤维肌痛、多发性内分泌衰竭、施密特氏(Schmidt)综合征、肾上腺炎、胃萎缩、早老性痴呆、脱髓鞘病、德雷斯勒氏(Dressler)综合征、斑壳、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化、和毛细管扩张)、男性和女性自身免疫性不孕不育、强直性脊柱炎、混合型结締组织病、恰加斯氏(Chagas)病、风湿热、习惯性流产、农民肺、多形红斑、心切开术后综合征、柯兴氏(Cushing)综合征、鸟爱好者肺、阿尔波特氏(Alport)综合征、肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎、间质性肺病、llr血反应、麻风、痴疾、利什曼病、锥虫病(kypanosomiasis)、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter氏综合征、卡普兰氏(Caplan)综合征、登革热、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、目艮内炎、持久隆起性红斑、胎儿成红细胞增多症、嗜曙红筋膜炎(eosinophilicfaciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征、费耳提氏(Fdty)综合征、丝虫病、睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、或福克斯氏(Fuch)睫状体炎、亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜、人免疫缺陷病毒(fflV)感染、艾柯病毒感染、心肌病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、细小病毒感染、风渗病毒感染、疫苗接种后综合征、先天性风渗感染、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎、埃文斯(Evan)综合征、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病、链球菌后肾炎、闭塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、曱状腺毒症、脊髓痨、和巨细胞性多肌痛。"肿瘤坏死因子cc(TNFa)"指包含如Pe皿icaetal.,Nature312:721(1984)或Aggarwaletal.，JBC260:2345(l兆》中所述氨基酸序列的人TNFa分子。"TNFa抑制剂"在本文中指通常经由结合TNFa并中和其活性来降低、抑制、阻断、消除或干扰TNFa生物学功能的药剂。本文中明确包括的TNF抑制剂的例子有依那西普(Etanercept)(依那西普(Etanercept)，ENBREL)、Infliximab(英夫利昔单抗，REMICADE⑧)和Adalimumab(阿达木单抗，HUMIRAtm)。术语"对TNFa抑制剂的不当响应(inad叫uateresponse)"指由于毒性和/或功效不足(inadequatee伍cacy)而对使用TNFa抑制剂的先前或当前治疗的不当响应(inadequateresponse)。不当响应可在治疗所"i寸-沦疾病时由熟练临床医师评估。经受来自使用TNFa抑制剂的先前或当前治疗的"毒性"的哺乳动物经受与之有关的一种或多种负面副作用，诸如感染(尤其是严重感染)、充血性心力衰竭、脱髓鞘(导致多发性硬化)、超敏反应、神经系统事件、自身免疫性、非何杰金氏淋巴瘤、结核(TB)、自身抗体等。"先前的治疗失败的，，或经受"不足功效的(inadequateefficacy)"哺乳动物在使用诸如DMARD或TNFa抑制剂等药物的先前或当前治疗后疾病继续活跃。例如，患者可在使用DMARD(诸如MTX)或TNFa抑制剂的疗法1个月或3个月后具有活跃的疾病活性。"B细胞表面标志"在本文中指在B细胞表面上表达、可用结合它的拮抗剂耙向它的抗原。例示性B细胞表面标志包括CDIO、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、C画、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86白细胞表面标志。特别感兴趣的B细胞表面标志在B细胞上较之哺乳动物的其它非B细胞组织优先表达，而且可在前体B细胞和成熟B细胞二者上表达。在一个实施方案中，标志是，像CD20和CD19一样，贯穿自干细胞阶段直至恰好在终末分化成浆细胞前的点的谱系分化整个过程中在B细胞上发现的标志。本文中优选的B细胞表面标志是CD20。"CD20"抗原是在超过90%来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现的约35kDa非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并保留至浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上。CD20在文献中的其它名称包括"B淋巴细胞限制抗原"和"Bp35"。CD20抗原记载于例如Clark^a/.,/W^SYOS^82:1766(1985)。"生长抑制性"拮抗剂指那些阻止或降低表达拮抗剂所结合的抗原的细胞增殖的拮抗剂。例如，抗体可在体外和/或在体内阻止或降低B细胞增殖。术语"抗体，，在本文中以最广义使用，明确覆盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。"天然抗体"指通常由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变区(VH),接着是多个恒定区(Ch)。每条轻链在一端具有一个可变区(VO，而另一端是一个恒定区(CO。轻链的恒定区与重链的第一恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。术语"可变的"指可变区中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取P-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成(3-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原、纟吉合4立点的形成(参见Kabat等人,《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)中抗体的参与。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作"Fab"片段，各自具有一个抗原结合位点，和残余的"Fc"片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。"Fv"是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构象中，各可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片^:的其它化学偶联。根据其恒定区氨基酸序列，来自任何脊推动物物种的抗体(免疫球蛋白)的"轻链"可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(k)和拉姆达(X)。根据其重链恒定区氨基酸序列，抗体可归入不同的类。完整抗体有五种主要的类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。将与抗体的不同类对应的重链恒定区分别称作a、S、e、y和p。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。"单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在Vh和V^结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pliickthun，在《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》中,第113巻，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag,NewYork,第269-315页,1994。术语"双抗体"指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-Vt)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(vo。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP404,097;WO93/11161;Hollinger"o/.，尸rac.Ato/.^cad90:6444-6448(1993)。术语"单克隆抗体，，在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语"单克隆"指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler"a/.，A^we256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制^(参见例如美国专利第4,816，567号)。"单克隆抗体，，还可使用例如Clacksonda/.，A^wre352:624-628(1991)和Marksd"/.，■/Mo/.历o/.222:581-597(1991)中记载的技术从噬菌体抗体库分离。单克隆抗体在本文中明确包括"嵌合"抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类別或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrisonwa/.，尸rac.A^/.t/S481:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴类(OldWorldMonkey)，诸如狒狒、恒河猴或猕猴)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列的"灵长类化"抗体。非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个可变区，在该可变区中，整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones"Atoww321:522-525(1986);Riechmannd淑騰332:323-329(1988);Presta,C匿Op.飾/.2:593-596(1992)。术语"高变区"在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链可变区中的残基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的残基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD，1991)和/或那些来自"高变环"的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(Ll)、50_52(L"和91-%(L3)及重链可变区中的残基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk,Mo/.说o/.196:901-917(1987))。"框架区，，或"FR"残基指可变区中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。"结合，，目的抗原例如VEGF的拮抗剂指能够以足够亲和力和/或亲合力结合该抗原，使得该拮抗剂可作为治疗剂用于靶向该抗原或表达该抗原的细胞的拮抗剂。"分离的"拮抗剂指已经鉴定且与其天然环境成分分开和/或回收的拮抗剂。其天然环境的污染性成分指会干扰该拮抗剂的"^断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将拮抗剂纯化至(1)根据Lowry法的测定，拮抗剂重量超过95%，最优选重量超过99%,(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE,达到同质。既然拮抗剂天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的拮抗剂包括重组细胞内的原位拮抗剂。然而，分离的拮抗剂通常将通过至少一个纯化步骤来制备。为了治疗的目的，"哺乳动物"指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺乳动物指人。"处置，，和"治疗"(treatment)指治疗性处置和预防性措施二者。需要治疗的(哺乳动物)包括那些早就患有疾病或病症的以及要预防疾病或病症的。因此，哺乳动物可能已经诊断为患有疾病或病症或者可能有患上疾病的倾向性或易感性。表述"治疗有效量"指拮抗剂有效预防、緩解或治疗所讨论自身免疫病的量。术语"免疫抑制剂"在本文中用于辅助疗法时指作用于抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利第4,665,077号，在此收入其公开内容作为参考)；非类固醇抗炎药(NSAID);硫唑。票呤(azathioprine);环磷酰胺(cyclophosphamide);澳隐亭(bromocryptine);达扎峻(danazol);氛笨石风(dapsone);戊二醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利第4，120，649号中记载的)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A;类固醇，诸如糖皮质类固醇，例如泼尼爭〉(prednisone)、曱泼尼龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone);曱氨±莱呤(methotrexate)(口月l或皮下)；羟氯口奎(hydroxycloroquine);杉卩氮石黄p比口定(sulfasalazine);来氟米净争(leflunomide);细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-Y、-J3或-a抗体、抗肿瘤坏死因子-a抗体(英夫利昔单抗(infliximab)或阿达木单抗(adalimumab))、抗TNFa免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-P抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD1la和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T(pan-T)抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(90年7月26日/^开的WO90/08187);链激酶；TGF-P;链道酶；来自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(mpamycin);T细胞受体(Cohen等人，美国专利第5,114,721号)；T细胞受体片段(Offneretal.,Science251:430-432(1991);WO90/11294;Ianeway，Nature341:482(1989);WO91/01133);及T细胞受体抗体(EP340,109),诸如T10B9。术语"细胞毒剂"在用于本文时指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9G、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段。"化疗剂"指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents)，i者i口塞替》泉(thiotepa)和玉不石舞酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN);磺酸烷基酯类(alkylsulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和口底泊舒凡(piposulfan);氮丙-定类(aziridines),i者长o苯佐替派(benzodepa)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代石粦酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三鞋甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥类(nitrogenmustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯齐胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲石岸胺(trofosfamide)、尿口密口定氮芥(uracilmustard);亚石肖脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司'汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如阿克4立霉素(aclacinomycin)、》文线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、calicheamicin、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6画二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、portfiromycin、噪呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类，诸如曱氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，诸如二曱叶酸(denopterin)、曱氨。莱p令(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌《f类合乂物，i者如氟达4立滨(fludarabine)、6國巯基噪"令(mercaptopurine)、石克咪噤呤(thiamiprine)、石克鸟噤呤(thioguanine);嘧咬类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖月包苦(cytarabine)、双脱氧尿苦(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依i若4也滨(enocitabine)、氟尿香(floxuridine)、5-FU;左,;敫素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈4也力,西同(dromostanolonepropionate)、表石危雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酉旨(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛石粦酰胺冲唐苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉吏(aminolevulinicacid);安口丫口定(amsacrine);bestrabucil;t匕生群(bisantrene);依达曲沙、(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptiniumacetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);米4乇胍腙(mitoguazone);米4乇蒽醌(mitoxantrone);莫旅达醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮齐(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);鬼臼酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西索菲兰(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);纟田交链孑包菌酉同酸(tenuazonicacid);三亚胺酉昆(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露酉事氮芥(mannomustine);二;臭甘露醇(mitobronitol);二;臭卫矛醇(mitolactol);咪泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞香(arabinoside)("Ara-C");环磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids),例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE,Rh6ne-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine);6-石克鸟噤p令(thioguanine);3克基噪p令(mercaptopurine);甲氨喋呤(methotrexate);铂类如乂4勿，i者长口力顷4白(cisplatin)和卡4白(carboplatin);长春石威(vinblastine);4白；依4乇泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);丝裂霉素(mitomycin)C;米4乇蒽、酉昆(mitoxantrone);长春一斤石威(vincristine);长春瑞;宾(vinorelbine);i若纟,本(navelbine);能灭瘤(novantrone);替尼泊苦(teniposide);道i若霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊本膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(DMFO);视黄酸(retinoicacid);esperamicins;卡培他滨(capecitabine);及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。此定义还包括起调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司S同(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston);抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserdin);及任何上述物质的药学可接受盐、酸或书t生物。术语"细胞因子，，是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；曱状旁腺素；曱状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促曱状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-a和-P;穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子，诸如NGF-(3;血小板衍生的生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-a和TGF-P;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductivefactor);干扰素，诸如干扰素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF);白介素(IL),诸如IL-1、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL國8、IL-9、IL-ll、IL-12、IL-15;肿瘤坏死因子，诸如TNF-a或TNF-J3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。术语"前体药物"在用于本申请时指与母药(parentdrug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体和书f生物形式。参见例如Wilman,"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14，pp.375-382，615thMeetingBelfast(1986)禾口Stellaetal.,"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",DirectedDrugDelivery,Borchardtetal.，(ed.)，pp.247-267,HumanaPress(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酉旨前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/S旨前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸》务饰前体药物、糖基化前体药物、含(3-内酰胺前体药物、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代的苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。"脂质体"指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如本文中所公开的拮抗剂和任选的化疗剂)的小嚢泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。术语"静脉内输注"指以超过约5分钟的一段时间，优选约30-90分钟，将药物导入动物或人患者的静脉，尽管依照本发明，静脉内输注或可施用10小时或更短时间。术语"静月永内4,注(intravenousbolus)"或"静月永内快速注射(intravenouspush)"指在约15分钟内或更短时间内，优选5分钟或更短时间内，将药物施用到动物或人的静脉中使得机体接受药物。术语"皮下施用"指通过自药物容器的相对较慢的、持续递送，将药物导入动物或人患者的皮肤下，优选在皮肤和皮下组织间的袋内。所述袋可通过夹起或拉起皮肤并远离皮下组织来创建。术语"皮下输注，，指以一段时间，包括但不限于30分钟或更短，或者90分钟或更短，通过自药物容器的相对较慢的、持续递送，将药物导入动物或人患者的皮肤下，优选在皮肤和皮下组织间的袋内。任选的是，所述输注可通过植入动物或人患者皮肤下的皮下植入药物递送泵来进行，其中所述泵以预定的一段时间，诸如30分钟、90分钟、或跨越治疗方案持续时间的一段时间，递送预定量的药物。术语"皮下推注(subcutaneousbolus)"指将药物施用至动物或人患者的皮肤下，其中推注药物投递优选短于约15分钟，更优选短于5分钟，最优选短于60秒。施用到优选皮肤和皮下组织间的袋内，其中所述袋可通过例如夹起或拉起皮肤并远离皮下组织来创建。II.拮抗剂的生成本发明的方法和制品使用或掺入了血管发生拮抗剂。因此，现在将描述用于生成此类拮抗剂的方法。血管发生拮抗剂可以是血管发生因子的蛋白质拮抗剂。优选的是，所述拮抗剂是VEGF拮抗剂。在抗VEGF抗体(它是用于本发明目的的优选VEGF拮抗剂)夕卜，其它VEGF拮抗剂包括VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、及VEGFR酪氨酸激酶的低分子量抑制剂。多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯曱酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCb或WNONR,其中R和W是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔虫威血蓝蛋白、血清清蛋白、牛曱状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。通过将例如100吗或5吗蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到稳定的高水平(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(aggregatingagent)诸如明石凡来增强免疫应答。6》卓义鏖在傳单克隆抗体从一群基本上同质的抗体获得，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。如此，修饰语"单克隆"指示抗体不是各抗体混合物的性质。例如，单克隆抗体可使用最初由Kohlerda/.,A^w^256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制备。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》,第59-103页，AcademicPress,1986)。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄噤呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嗓呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定地高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiege,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-ll小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的骨髓瘤细胞系。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生成人单克隆抗体也已有记载(Kozbor，//www"o/.133:3001(1984);Brodeur等人，《MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications》,第51-63页，MarcelDekker，Inc.，NewYork,1987)。可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munsona/.，Jwa/.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》，第59-103页，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另夕卜，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerrada/"Cwrr(9;/m'o"/"//www"o/.5:256-262(1993)及Pliickthun,/mm柳o/.130:151-188(1992)。在另一个实施方案中，可从使用McCafferty"a/.,A^/ww348:552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体库中分离抗体或抗体片段。ClacksonAtowe352:624-628(1991)及Marksd"/.,JMo/.222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marksefa/.,&o/rec^o/ogy10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse"a/.，M/c.Jc/AT仏21:2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠序列(美国专利第4,816,567号；Morrison"a/.,Prac.Ato/.^ca^.5W.81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价接合。典型地，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。"人源必戎沐本领域已经记载了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作"输入，，残基，它们典型的取自"输入"可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones"A^ww321:522-525(1986);Riechmanna/.，胸騰332:323-327(1988);Verhoeyen"a/"Scfe廳239:1534-1536(1988)),通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类"人源化，，抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。用于构建人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的"最适"(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims/附mw"o/.151:2296(1993);Chothiada/"/Mo/.編.196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter""/.，尸rac.A^/.5W."SL489:4285(1992);Presta"a/"//画歸/.151:2623(1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。(7v,乂在#作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits"a/"尸亂淑/.Jcad.固90:2551(1993);Jakobovitsefa/,，7Vafwre362:255-258(1993);Bruggermann&"/，7wmwwa7:33(1993);及美国专利第5,591,669号、第5,589,369号和第5，545，807号。或者，噬菌体展示技术(McCafferty"7V加w348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区(V)基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson,KevinS.andChiswell，DavidJ,,CW酒fOp/w'ow浙w"調/B油gy3:564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。ClacksonWa/.,Atowre352:624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗口恶唑酮抗体。可本质上遵循Marks&"/.,Mo/.说'o/.222:581-597(1991)或Griffithda/.,五MBOJ:12:725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号)。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片l殳(参见例如MorimotoWa/.，Jow朋/0/5/oc/2e脂'ca/aw/所o/一/ca/她Acxis24:107-117(1992);Brennanefa/"5Wewce229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(CarterWa/.,说o/Tec/^o/ogv10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见W093/16185;美国专利第5,571,894号;美国专利第5,587,458号。抗体片段还可以是"线性抗体",例如如美国专利第5,641,870号中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。"双###絲双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。用于构建双特异性抗体的方法是本领域知道的。全长双特异性抗体的传统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein"a/.,A^^wre305:537-539(1983))。由于免疫3求蛋白重《连和轻链的随才几分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成IO种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。WO93/08829及Trauneckerda/.，五M5(9/10:3655-3659(1991)中公开了类似的流程。依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中，第一重链恒定区(CH1)包含轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个表达载体。在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构^使于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh&a/.,M"/zo^￡wz_ymo/ogy121:210(1986)。依照美国专利第5,731,168号中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少抗体恒定区部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性"空腔"。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联或"异源偶联"抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)，及用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。可4吏用任何1更利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利第4,676,980号。文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan"a/.，5We"ce229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二疏键的形成。然后将产生的Fab，片段转变为硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。最新的进展便于从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby"a/.，《/175:217-225(1992)记载了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子。每个Fab'片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。还记载了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny"a/.,//wm柳o/.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollingerd尸rac.A^/.Jc"d<SW.L^490:6444-6448(1993)描述的"双抗体"技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(vo，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的Vh和Vl結枸域与另一个片段上的互补V^和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber^a/"//顯画/.152:5368(1994)。设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuttda/.,J/画画/.147:60(1991)。III.拮抗剂的偶联物和其它修饰本文方法中所使用的和制品中所包含的拮抗剂任选偶联细胞毒剂。上文已经描述了可用于生成此类拮抗剂-细胞毒剂偶联物的化疗剂。本文还设想了拮抗剂与一种或多种小分子毒素的偶联物，诸如加利车霉素、美登素(美国专利第5,208,020号)、单端孢菌毒素和CC1065。在本发明的一个实施方案中，将拮抗剂与一个或多个美登素分子偶联(例如每个拮抗剂分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如，可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰拮抗剂反应(CharidC"wc^We^"rc/252:127-131(1992))以生成美登木素生物碱-拮抗剂偶联物。或者，拮抗剂偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于lV、ci21、(X31、N-乙酰基-Yi1、PSAG和e、(Hinmanefa/.,Cawceri&sea尸c/753:3336-3342(1993)和Lodeefa/.，CawcerWesearc/z58:2925-2928(1998))。可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(尸^M(iomowayaen/g/"cwa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、a-帚曲毒素(sarcin)、油4同(」/ewr"as/0/r/Z/)毒蛋白、香石冲十(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(尸/zyto/aca爿wen'ca"a)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草(sapaonariaofficinalis)才中制物、白初于毒素(gelonin)、丝4木霉素(mitogellin)、局卩艮曲菌素(restrictocin)、盼霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)禾口单端孑包菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。本发明还设想了与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)偶联的拮抗剂。有多种放射性同位素可用于生成放射偶联的拮抗剂。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备拮抗剂和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡咬基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(1^-马来酰亚胺曱基)环己胺-l-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚胺二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯曱酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitettae/a/.,5We"ce238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的l-异硫氰酸苯曱基-3-曱基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核酸与拮抗剂偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的"可切割接头"。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二曱基接头或含二硫化物接头(Chari"《Qwcwie化wc/752:127-131(1992))。或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含拮抗剂和细胞毒剂的融合蛋白。本发明的拮抗剂还可与前体药物活化酶偶联，所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO88/07378和美国专利第4,975,278号。此类偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酉旨的前体药物转变为游离药物的芳基>5危酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧咬脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L);可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如(3-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将用p-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的(3-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作"抗体酶"，将本发明的前体药物4争变为游离活性药物(参见例如Massey,Nature328:457-458(1987))。可通过本领域众所周知的技术将本发明的酶与拮抗剂共价结合，诸如使用上文所讨论的异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶的至少功能活性部分连接的本发明拮抗剂的至少4元原、纟吉^区的鬲虫H白(参见仿Ji口Neubergeretal.,Nature312:604-608(1984))。本文还设想了拮抗剂的其它修饰。例如，可将拮抗剂与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。本文公开的拮抗剂还可配制成脂质体。可通过本领域知道的方法来制备包含拮抗剂的脂质体，诸如EpsteinW7V^/.v4cadOS^82:3688(1985);Hwang&a/"Ato/.爿cad5W.77:4030(1980);美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；1997年10月23日公开的WO97/38731中所记载的。美国专利第5,013,556号中公开了循环时间延长的脂质体。特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质組合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可如Martin"a/.，J所o/.C/2em.257:286-288(1982)中所记载的，将本发明抗体的Fab，片段经二碌"匕物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见GabizonW/A^"o""/O"cw/"W.81(19):1484(1989)。设想了本文所述蛋白质或肽拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸改变引入拮抗剂核酸或者通过肽合成来制备拮抗剂的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如拮抗剂氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有期望特性，可进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变拮抗剂的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。可用于鉴定拮抗剂中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作"丙氨酸扫描突变"，如CunninghamandWells,5Wwce244:1081-1085(1989)所述。这里，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机突变，并对所表达的拮抗剂变体筛选期望活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端曱硫氨酰残基的拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括在拮抗剂的N-或C-末端融合酶或提高拮抗剂血清半衰期的多肽。另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在拮抗剂分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。抗体拮抗剂中最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守替代在表l中显示在标题"优选替代"下。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表l中称为"例示替代"的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>Ser(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr;PheTyrTyr(Y)Tip;Phe;Thr;SerPheVal(V)lie;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸Leu对拮抗剂生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，天然存在残基如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、He;(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威'f生的Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基Gly、Pro;及(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员替换另一个类别的。任何不涉及保持拮抗剂正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向拮抗剂中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当拮抗剂是抗体片段诸如Fv片段时)。特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。拮抗剂的另一类氨基酸变体改变了拮抗剂的原始糖基化样式。改变意味着删除在拮抗剂中发现的一个或多个碳水化合物模块(moiety),和/或添加拮抗剂中不存在的一个或多个糖基化位点。多肽的糖基化典型地或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识別序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向拮抗剂中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始拮抗剂的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。编码拮抗剂氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于自天然来源分离(在天然存在氛基酸序列变体的情况中)，或者通过较早制备的变体或非变体型式的拮抗剂进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。可能希望在效应器功能方面修饰本发明的拮抗剂，例如增强拮抗剂的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。这可通过在抗体拮抗剂Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二碌u键。如此产生的同二聚体抗体可具有改进的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。参见Caron"a/.,JExp.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.，J/mmw"o/.148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可^f吏用如Wolff"a/.,Owe"i&searc/z53:2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson&a/.，^wd-CawcerZ>wg3:219-230(1989)。为了延长拮抗剂的血清半衰期，可如例如美国专利第5,739,277号中所述将补救受体结合表位掺入拮抗剂(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语"补救受体结合表位"指IgG分子(例如IgGpIgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。IV.药用配制剂通过将具有期望纯度的拮抗剂与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.编，1980)混合，以冻干剂型或水溶液的形式，制备农照本发明使用的拮抗剂的治疗用配制剂供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括緩沖剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二曱基千基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；对羟基苯曱酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二朌；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(少于约IO个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN、PLUROMCStm或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801中记载了适应皮下施用的冻干配制剂。此类冻干配制剂可用合适的稀释剂重建至高蛋白质浓度且重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。本文中的配制剂还可含有治疗具体适应症所必需的一种或一种以上活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。例如，可能希望进一步提供细胞毒剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的免疫抑制剂，诸如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的拮抗剂的量、疾病或病症或者治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常以与先前所用相同的剂量和施用路径使用，或者以先前所采用的剂量的大约1-99%。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶嚢)、在胶状药物递送系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.编，1980。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶嚢。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-幾乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。V.使用拮抗剂的治疗本发明关注对患有或易患自身免疫病但先前或当前的治疗失败了或响应不当的哺乳动物，尤其是人的疗法。通常，本文中待治疗的哺乳动物鉴定为在使用一种或多种DMARD或者一种或多种TNFa抑制剂的一次或多次处置的疗法后，由于毒性和/或不当功效(inadequateefficacy)而对先前或当前的治疗响应不当的哺乳动物。然而，本发明不限于使用此类治疗的先前疗法步骤；例如，在开始使用DMARD或TNFa抑制剂的疗法前可认为患者倾向于经受所述药剂的毒性，例如心脏毒性，或者可判定患者为不太可能响应此类疗法的患者。本文中待治疗的各种自身免疫病列在上文定义部分中。本文中优选的适应症是类风湿性关节炎、狼疮、银屑病关节炎(psoriaticarthritis)、多发性硬4t(multiplesclerosis)或克罗恩氏病(Crohn，sdisease)。对于疾病的预防或治疗，拮抗剂的适当剂量将取决于如上定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、施用拮抗剂是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对拮抗剂的响应、及主治医师的判断。适当的在某一时间或者通过一系列治疗对患者施用拮抗剂。在联合治疗方案中，以治疗有效量或协同量施用本发明的组合物。在用于本文时，治疗有效量指拮抗剂和一种或多种其它治疗剂的联合施用或者本发明组合物的施用导致对靶疾病或疾患的减轻或抑制时的量。治疗协同量指拮抗剂和一种或多种其它治疗剂协同或显著减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的量。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量是约ljLlg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)拮抗剂，无i仑是通过例如一次或多次分开的施用，或者通过连续输注。典型日剂量的范围可以是约l吗/kg至约100mg/kg或更高，取决于上文所述因素。对于持续数天或更长时间的重复施用，取决于所述疾患，所述治疗持续至出现对疾病症状的期望抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。在一个优选的方面，每两至三周施用拮抗剂，剂量范围是约1.5mg/kg至约15mg/kg。更优选的是，此类剂量给药方案联合自身免疫病的另一种治疗剂使用。本发明疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。如上所述，然而，拮抗剂的这些推荐量受制于大量的治疗判断。选择适当剂量和时序安排的关键因素是如上所述获得的结果。例如，发作中的和急性病最初可能需要相对较高剂量。为了获得最有效的结果，取决于疾病或病症，尽可能接近疾病或病症的第一体征、诊断、出现或发作或者在疾病或病症消退过程中施用拮抗剂。通过任何合适的手段来施用拮抗剂，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，及在期望用于局部免疫抑制治疗时的损伤部位内施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，拮抗剂可合适的通过脉冲输注来施用，例如以逐渐减少剂量的拮抗剂。优选的是，通过注射给药，最优选静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是筒短的还是长时间的。可以与本文中的拮抗剂一起施用其它化合物，诸如细胞毒剂、化疗剂、免疫抑制剂和/或细胞因子。联合施用包括以分开的配制剂或单一药用配制剂的形式进行联合施用，以及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。对于RA和其它自身免疫病，拮抗剂(例如抗VEGF抗体)可联合任何一种或多种减轻疾病的抗风湿药(DMARD)，诸如羟氯喹、柳氮磺吡啶、甲氨喋呤、来氟米特、碌u唑嘌呤、D-青霉胺、金(Gold)(口服)、金(肌肉内)、米诺环素、环孢菌素和葡萄球菌蛋白A免疫吸附；静脉内免疫球蛋白(IVIG);非类固醇抗炎药(NSAID);糖皮质素(例如经关节注射)；皮质类固醇(例如曱泼尼龙和/或泼尼松)；叶酸等。最优选的DMARD是MTX。每周施用低剂量MTX疗法抑制DNA和RNA合成，说明了它的抗增殖效果，且刺激腺苷释放，腺苷是具有抗炎活性的介质。MTX的不利作用包括恶心、腹泻、疲劳、口腔溃疡和对血液系统的抑制(hematologicsuppression)。罕见的是，患者可形成肺炎样反应或硬化。曱氨喋呤经常以每周7.5-10mg的剂量开始。若耐受，则剂量在接下来的数月里提高，可高到每周20-25mg。然而，给老年人和那些患有轻度肾功能不全的患者的处方应当是较低的MTX剂量；MTX不应给予血清肌酸酐水平高于2.5mg/dL的患者。ACR为监测接受MTX的患者建立了指导方针，推荐以4-8周间隔评估血细胞计数和肝酶。在另一个实施方案中，血管发生拮抗剂与有效治疗自身免疫病的其它拮抗剂生物制品联合使用。例如，血管发生拮抗剂可以与TNFa抑制剂、B细胞拮抗剂或二者联合使用。TNFa抑制剂可以是降低、抑制、阻断、消除或干扰TNFa生物学功能的任何药剂。优选的是，TNFa抑制剂结合TNFa并中和其活性。本文尤其考虑的TNF抑制剂的例子有Etanercept(依那西普，ENBREL)、Infliximab(英夫利昔单抗，REMICADE⑧)和Adalimumab(阿达木单抗，HUMIRAtm)。B细胞拮抗剂可以是结合B细胞表面标志诸如CD20、CD22、CD19和CD40的拮抗剂抗体。结合CD20抗原的抗体的例子包括"C2B8",现在称作"Rituximab"(利妥昔单抗，"RITUXAN")(美国专利第5,736,137号，在此明确收入作为参考)；钇[90]标记的2B8鼠抗体，称作"Y2B8"(美国专利第5,736,137号，在此明确收入作为参考)；鼠IgG2a"Bl"，任选用1311标记以产生'""I-B1"抗体(BEXXARTM)(美国专利第5,595,721号，在此明确收入作为参考)；鼠单克隆抗体"1F5"(Pressetal.,Blood,69(2):584-591(1987));"嵌合2H7抗体"(美国专利第5,677,180号，在此明确收入作为参考)；"人源化2H7v16，，(见下文)；huMax-CD20(Genmab,丹麦)；AME隱133(AppliedMolecularEvolution);及单克隆抗体L27、G28-2、93-lB3、B-C1或NU-B2,可/人国际白细胞分类研究组(InternationalLeukocyteTypingWorkshop)获得(Valentine等人，《LeukocyteTypingIII》，McMichael编，第440页，OxfordUniversityPress,1987)。结合CD19抗原的抗体的例子包括Hekmanetal.CancerImmunol.Immunother,32:364-372(1991)和Vlasveldetal.CancerImmunol.Immunother.40:37-47(1995)中的抗CD19抗体；及Kieseletal.LeukemiaResearchII，12:1119(1987)中的B4抗体。在对患者施用蛋白质拮抗剂之外，本申请涉及通过基因疗法来施用拮抗剂。编码拮抗剂的核酸的此类施用涵盖在表述"施用治疗有效量的拮抗剂"内。参见例如1996年3月14日公布的WO96/07321，它涉及使用基因疗法来生成胞内抗体。有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内和回体(exWvo)。对于体内投递，通常在需要拮抗剂的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利第4,892,538号和第5，283，187号)。有多种技术可用于将核酸导入存活细胞。这些技术根据是将核酸转移至体外培养细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸4丐沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱瘆病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中，希望与把向把细胞的试剂一起提供核酸源，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、耙细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如WueM/.,J所o/.C/zem.262:4429-4432(1987);Wagnerd尸rac.腐.加d5W.脂87:3410-3414(1990)中记载了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson"a/.，Sde"ce256:808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其引用的参考文献。下文非限制性实施例例示了本发明的进一步详情。在此明确收入说明书中所有引文的公开内容作为参考。实施例1用抗hVEGF单克隆抗体诸如Avastin⑧治疗先前的疗法失败了且当前对MTX响应不当的患有活动性类风湿性关节炎的患者。依照此实施例的疗法的候选者包括那些依照经过修订的1987ACR标准诊断患有RA达至少6个月的(患者)。患者必须已经经口服或肠胃外(路径)以10-25mg/周的剂量接受MTX达至少12周，且筛选之前最后4周以恒定剂量接受MTX。还有，患者必须已经对不超过5种DMARD或生物制剂(包括MTX)的治疗失败了(缺乏功效或耐受性)。患者可在筛选和随机化时肿胀关节计数(swollenjointcount,SJC)不高于6(关节计数66)及触痛关节计数(tenderjointcount,TJC)不高于6(关节计数68);或是CRP不高于1.2mg/dl(12mg/L)或是ESR不高于28mm/h。患者优选在18和64岁之间(含)，且自RA诊断不足5年。有生殖能力的男性优选使用可靠的避孕手段(例如物理屏障)，而女性优选绝经后的或手术绝育的。主要的排除标准基于对整体安全性的关注，诸如重大、不受控制的杂并症的证据，包括但不限于心血管疾病、神经系统、肺、肾、肝、内分泌或胃肠病症。同样，具有血栓栓塞性疾病史(包括PE、DVT或CVA)、糖尿病史、不受控制的高血压史或蛋白尿史的患者应当排除在治疗以外。用于治疗的抗VEGF抗体优选贝伐单抗(Bevacizumab)(Avastin，可从Genentech公司购买)或其具有改良的结合亲和力、抑制性功效或药动学特性的变体。用治疗有效剂量的抗体，例如每两周静脉内单剂l-2.5mg/kg(1.0mg/kg/wk)治疗患者。患者还可接受伴随的MTX(10-25mg/周，经口服或肠胃外)，连同如下组成的皮质类固醇方案输注抗VEGF抗体前30分钟静脉内100mg曱泼尼龙(methylprednisolone)和第2-7天口服60mg泼尼松(prednisone),第8-14天口服30mg，到第16天恢复至基线剂量。患者还可接受叶酸(5mg/周)，或是作为单剂或是作为分开的每日剂量给予。患者任选在整个治疗期间继续接受任何背景皮质类固醇(10mg/天泼尼松或等效物)。主要终点(primaryendpoint)是在24周有ACR20响应的患者的比例，使用为类风湿因子和区域进行了调整的Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)检验来比较组差异。另夕卜的次要终点(secondaryendpoint)包4舌1.在24周有ACR50和70响应的患者的比例。这些可以如为主要终点所规定的那些来分析。2.疾病活动性得分(DiseaseActivityScore,DAS)自筛选至24周的变化。这些可使用ANOVA模型来评估，以基线DAS、类风湿因子和治疗方法作为该模型中的项(term)。3.24周时的分类DAS响应物(categoricalDASresponder)(EULAR响应)。这些可使用为类风湿因子进行了调整的CMH4企验来评估。4.ACR核心组(SJC、TJC、患者和医生的整体评估、HAQ、疼痛、CRP和ESR)自筛选时的变化。可以对这些参数报告描述统计学。5.SF-36自筛选时的变化。根据8领域得分(8domainscore)及精神和肉体要素得分(mentalandphysicalcomponentscore)报告描述统计学。另外，将精神和肉体要素得分进一步分类和分析。6.改良的Sharp射线照相总得分(modifiedSharpradiographictotalscore)、偵二t虫4寻分(erosionscore)禾口关节月空变窄4寻分(jointspacenarrowingscore)的变4b。这些在适当时使用连续或分类方法学来分析。探索性终点(exploratoryendpoint)和分析可包括8、12、16、20、24周及以后的ACR(20/50〃0和ACRn)和DAS响应的变化，在适当时，使用二元或连续重复测量模型来评估。探索性射线照相分析，包括没有侵蚀性进展的患者的比例，可在24周及以后评估。对进一步的探索性终点(例如完全临床响应，无疾病期)作为延长的观察期的一部分进行描述性分析。以描述统计学(descriptivestatistics)来分析FACIT-F疲劳中的筛选的变化(ChangesfromScreen)。4艮据任一项或多项上文所述终点，对如上所述DMARD或TNFa抑制剂疗法响应不当的患者4吏用抗VEGF抗体的RA疗法取得有益的临床响应。权利要求1.血管发生拮抗剂在制备用于治疗先前的疗法失败的哺乳动物中的自身免疫病的药物中的用途。2.权利要求l的用途，其中所述血管发生拮抗剂是VEGF拮抗剂。3.权利要求1的用途，其中所述拮抗剂包括抗体。4.权利要求3的用途，其中所述抗体是抗VEGF抗体。5.权利要求4的用途，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗。6.权利要求l的用途，其中所述哺乳动物是人。7.权利要求l的用途，其中所述自身免疫病选自类风湿性关节炎、幼发型类风湿性关节炎、骨关节炎、4艮屑病关节炎和强直性脊柱炎。8.权利要求1的用途，其中所述先前的疗法包括施用至少一种DMARD药剂。9.权利要求8的用途，其中所述先前的疗法包括施用MTX。10.权利要求l的用途，其中所述先前的疗法包括施用至少一种TNFa抑制剂。11.权利要求1的用途，其中所述血管发生拮抗剂与DMARD药剂联合或序贯施用。12.权利要求ll的用途，其中所述DMARD药剂是MTX。13.权利要求1的用途，其中所述血管发生拮抗剂与TNFa抑制剂联合或序贯施用。14.权利要求13的用途，其中所述TNFa抑制剂选自依那西普、英夫利昔单抗和阿达木单抗。15.权利要求1的用途，其中所述血管发生拮抗剂与结合B细胞表面抗原的B细胞拮抗剂联合或序贯施用。16.权利要求15的用途，其中所述B细胞表面抗原选自CDIO、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85和CD86。17.权利要求15的用途，其中所述B细胞拮抗剂包括针对CD20的抗体。18.权利要求17的用途，其中所述针对CD20的抗体是英夫利昔单抗。19.权利要求17的用途，其中所述针对CD20的抗体是人源化2H7v16。20.抗VEGF抗体在制备用于治疗先前的DMARD或TNFa抑制剂疗法失败了且当前对MTX响应不当的患者中的类风湿性关节炎的药物中的用途。全文摘要本申请描述了使用血管发生抑制剂诸如抗VEGF抗体的疗法。具体而言，本申请描述了此类拮抗剂用于在先前的治疗诸如使用DMARD或TNFα抑制剂的治疗失败的患者中治疗自身免疫病的用途。文档编号A61K39/395GK101120020SQ200580048104公开日2008年2月6日申请日期2005年12月16日优先权日2004年12月17日发明者苏尼尔·阿加沃尔申请人:健泰科生物技术公司