专利名称：从绿茶茶叶分离儿茶素的方法
技术领域：
本发明涉及从绿茶茶叶分离儿茶素的方法。
背景技术：
绿茶含有许多成分，包括通常已知为儿茶素的多酚。认为儿茶素 是茶叶的许多生物学作用的原因。绿茶多酚的一些主要成分是(-)-表掊
儿茶素-3-掊酸酯(EGCG)、(-)-表掊儿茶素(EGC)、表儿茶素-3-掊酸酯 (ECG)和(-)-表儿茶素(EC)。特别是，(-)-EGCG,作为最丰富的儿茶素， 己经发现其具有抗癌、抗菌、抗病毒作用，并且对血液中的胆固醇水 平具有有益的作用。尽管发现绿茶中的其它儿茶素在上述应用中的有 效性低于EGCG，但是它们也可具有其它生物活性，并且提高它们的可 用性可帮助发现这些活性。绿茶还含有其它组分如咖啡因、原花色素、 碳水化物、氨基酸、和可溶性矿物质，它们在绿茶输液中与儿茶素一 起可溶于水中。
已有许多关于从绿茶分离(-)-EGCG的报道。然而，许多水溶性与 儿茶素相似并且结构与儿茶素类似的组分的存在使得分离纯(-)-EGCG 变得困难。美国专利6，210，679描述了四步骤过程，包括三个柱色谱分 离过程从而最终得到95-98。/。纯的(-)-EGCG。因为需要使用昂贵的反相 柱添充，该方法耗时且不经济。美国专利公开20030083270描述了通 过在大孔极性树脂上在加压下使用极性洗脱溶剂对绿茶提取物进行色 谱分离提供(-)-EGCG的方法。该方法提供了 75。/。-97。/。纯的(-)-EGCG。 然而，从绿茶提取物获得(-)-EGCG的收率仅为约73%，因此认为该方 法不是有效方法。缺少简单、有效和廉价的获得纯T(-)-EGCG的方法 妨碍了在动物和人的临床研究中对(-)-EGCG进行评估。本发明目的
因此，本发明的目的是提供从绿茶提取物分离儿茶素的方法，该 方法包括相对简单的步骤，并且优选更有效。本发明的另一目的是解 决了现有技术中所述的至少一个或多个问题。至少，本发明的目的是 为公众提供了一种有用的选择方案。
发明概述
因此，本发明提供从绿茶茶叶分离儿茶素的方法。首先将儿茶素 转化成相应的酯形式，形成酯混合物，然后通过适当的方法进行分离。
优选地，将儿茶素转化成它们各自的全乙酸酯形式。更优选地， 通过乙酸酐将儿茶素转化成相应的全乙酸酯形式。
转化的儿茶素可通过柱色谱法进行分离，优选通过包含己烷和乙
酸乙酯的混合物在硅胶上洗脱。更优选地，己烷和乙酸乙酯的比为1:2 的体积比。
任选地，在分离转化的儿茶素之前可首先过滤酯混合物得到滤液。 更优选地，在分离转化的儿茶素之前滤液可用水洗涤，干燥，然后浓縮。
转化的儿茶素被分离后，可将它们变回到儿茶素，优选通过乙酸 铵的甲醇溶液进行。
可通过本发明方法分离的儿茶素可包括(-)-表掊儿茶素-3-掊酸 酯、(-)-表掊儿茶素、表儿茶素-3-掊酸酯和(-)-表儿茶素。
本发明的优选方案将以附图作为例子并参考附图进行说明，其中 图1表示本发明的分离方法的优选方案的反应路线图；和图2表示(-)-EGC六乙酸酯(2)的X射线衍射晶体结构。
优选实施方案的详述
现在参考附图在下文中描述本发明。
本发明的目的、特征和各方面在以下描述中被公开或者是显而易 见的。本领域的普通技术人员可以理解的是，本发明的讨论仅用于描 述示例性实施方案，其并非意在对本发明的广泛方面进行限制，本发 明的广泛方面以示例性构造被概括。
根据本发明，令人惊讶地发现，绿茶粗提取物中的儿茶素可在儿 茶素被转化成它们各自的酯形式之后相对容易地分离。然后分离转化 的儿茶素。柱色谱法是广泛使用的分离方法之一。虽然在目前没有任 何证据，但是据信将儿茶素转化成它们各自的酯形式可增强儿茶素对 例如色谱分离期间所用的固定载体的物理性质的区别。
儿茶素可被转化成多种不同的酯形式。虽然有可能仅仅将儿茶素 上的一部分羟基转化为酯形式，但是优选将所有的羟基转化成单一类 型的酯基。首先，这减少了后续分离的复杂性。另外，其更加经济。 在以下的实施例中，通过过量的乙酸酐将儿茶素转化成它们各自的全 乙酸酯形式。应当注意到，可使用其它的酯形式如过苯甲酸酯形式。 当然可使用任何适当的方法将儿茶素转化成它们各自的全乙酸酯形 式，例如使用乙酰氯代替乙酸酐。
虽然还可将儿茶素转化成醚形式，但不希望如此，因为将儿茶素 转化成酯形式或将酯再变回到儿茶素时所涉及的剧烈的反应条件可能 破坏儿茶素本身。
图1表示本发明的分离方法的优选方案的反应路线图。如图1所 示，绿茶茶叶中的儿茶素首先被转化成它们的全乙酸酯形式。直接对绿茶茶叶施用酯化剂如乙酸酐可实现这一目的。或者，通过将绿茶茶 叶置于热水中首先获得绿茶粗提取物，可将热水提取物干燥然后与酯 化剂反应。然而，这可能是较不希望的，因为这一额外提取步骤可降 低总提取效率。然后通过常规的柱色谱法分离转化的儿茶素。洗脱液
可以是包含己烷和乙酸乙酯的混合物，己烷和乙酸乙酯的优选比为1:2
的体积比。
为了进一步增强本发明的分离方法的效率，在通过色谱法分离转 化的儿茶素之前可首先过滤全乙酸酯混合物。然后滤液可用水洗涤， 干燥，然后通过蒸发进行浓縮。
将儿茶素分离成它们各自的酯形式后，可通过例如使用乙酸铵的 甲醇溶液将它们转化成儿茶素。
根据本发明的方法，可从绿茶提取物分离包括以下的儿茶素类
(-)-表掊儿茶素-3-掊酸酯、(-)-表掊儿茶素、表儿茶素-3-掊酸酯和(-)-表
儿茶素。
实施例 一般概括
绿茶包装购自SEIYU,商标为OSK，或者，ShouMee绿茶茶叶购 自Hong Kong的Ying Kee Tea House。除非另作说明，所有试剂和溶剂 购自商业供应商并且无需另外纯化即可使用。在使用前将乙酸铵进行 减压干燥。HPLC中使用的水是双重去离子水。使用Varian-500核磁共 振波谱仪测定&和nC光谱。在Finnigan型Mat 95 ST质谱仪上，使 用阳离子电喷射离子化技术记录低分辨率质谱和高分辨率质谱。在 Biichi熔点B-545仪上记录熔点测定并且该测定值未经校正。在Merck 预涂覆硅胶60 F254板上进行薄层色谱法，并且在254 nm灯下进行观 察。硅胶(Merck， 230-400目)用于柱色谱法。在装备有C-18反相柱 (CAPCELLPAKC18UG 120， 4.6 mm i.d. x 250 mm)的HP 1100液相色谱仪上进行HPLC。
从得自SEIYU的绿茶茶叶分离单独的儿茶素
将吡啶(12 mL)和乙酸酐(8 mL)添加到在圆底烧瓶中的绿茶茶叶 (4.55 g，购自SEIYU)中，混合物在室温下搅拌过夜，然后将其真空干 燥，反应混合物用乙酸乙酯(20mLx4)洗涤并过滤，滤液用水(20mLx 4)洗涤。滤液用硫酸钠干燥并蒸发，粗产物通过硅胶柱色谱法使用正己 垸:乙酸乙酯(体积比为l:2)作为洗脱液进行纯化，得到粗的(-)-EGCG全 乙酸酯l(Rf值为0.3，绿色)，将粗产物1溶于乙酸乙酯中并通过活性 炭层(l cm宽x 3 cm长)过滤，蒸发后得到纯的(-)-EGCG全乙酸酯(l)， 为白色固体(0.19g，4.3。/o收率)。除1之外，还从柱色谱法(己烷:乙酸乙 酯为1:2， Rf值为0.6)并通过活性炭层过滤分离了(-)-EGC六乙酸酯(2)。 粗化合物2从二氯甲垸:乙醚:己烷(1:2:0.5)重结晶，得到纯的EGC六乙 酸酯2，为白色固体(0.07g， 1.5%收率)。
(-)-EGCG全乙酸酯(l): Mp 112.4-113.8。C(与从市售的(-)-EGCG合 成的全乙酸酯115。C相比较)；[a]D-67.7(c 1.0, CHC13); NMR(CDC13, 500MHz):S7.62(s, 2H)， 7.23(s， 2H)， 6.73(d， J=2.5 Hz， 1H)， 6.61(d, J=2.5 Hz, 1H)， 5.63(br s， 1H)， 5.18(s， 1H)， 3.02(m, 2H)， 2.28(s, 3H), 2.27(s, 9H)， 2.26(s, 3H), 2.24(s， 3H)， 2.22(s， 6H); 13C NMR(125 MHz, CDC13):5 168.89， 168.40, 167.59， 167.43, 166.72， 166.20, 163.51， 154.71， 149.72， 149.64， 143.38, 143.29， 138.93， 135.06， 134.34， 127.41 , 122.34, 118.79， 109.42， 109.00， 108.06, 76.46， 67.98， 25.85, 21.06， 20.75， 20.54, 20.11; LRMS m/z(ESI)817 [M+Na]+; HRMS:C38H34019Na的计算值817.1592; 实测值817.1586。
(-)-EGC六乙酸酯(2): Mp 189.5-191.2°C; [a]D-14.6(c=1.0, CHC13); 'H NMR(CDC13, 500MHz):57.22(s， 2H)， 6.67(d， J=2.0 Hz, 1H), 6.57(d， J=2.0 Hz, IH)， 5.38(br s, 1H), 5.08(s， 1H), 2.93(m， 2H)， 2.29(s， 6H)， 2.28(s, 6H), 2.28(s， 3H), 1.94(s， 3H); 13C NMR(CDC13, 120MHz):S 170.58169.06， 168.50， 167.72, 166.90, 154.80， 149.73， 149.69， 143.26, 135.48, 134.28, 119.01, 109.56, 108.86, 108.08， 76.49, 66.44, 25.95, 21.10， 20.80， 20.77, 20.69， 20.19:LRMS m/z(ESI):581 [M+Na]+; HRMS:C27H26013Na的 计算值581.1271 ;实测值581.1252。
从得自SEIYU的绿茶茶叶大规模分离儿茶素乙酸酯。 将绿茶茶叶(83.2g，购自SElYU)添加到吡啶(160mL)和乙酸酐(80 mL)的混合物中，得到的混合物在室温下搅拌过夜，减压除去溶剂，然 后将混合物通过烧结玻璃漏斗过滤并用乙酸乙酯(IOO mL x 5)洗涤，滤 液用水(IOO mL x 5)和盐水溶液(20 mL)洗涤，有机相用MgS04干燥， 过滤并通过旋转蒸发仪蒸发，粗产物通过硅胶柱色谱法使用正己烷/乙 酸乙酯(体积比为l:2)作为洗脱液进行纯化，使用三个柱(分别是25 x 6 cm i. d.， 25 x 6 cm i.d.禾口 24 x 3.5 cm i.d.，在第三个柱的顶端装载3 cm 的活性炭)，粗产物通过这三个柱进行色谱分离，使用TLC分析，用正 己垸/乙酸乙酯(体积比为l:2)作为洗脱液收集级份。Rf值为0.32的含有 化合物的级份经合并和蒸发得到(-)-EGCG全乙酸酯(l)，为白色固体 (2.83 g， 3.4%收率)。Rf值为0.46的含有化合物的级份经合并和蒸发得 到(-)-ECG七乙酸酯(4)。然后是Rf值为0.58的含化合物的级份，将其 蒸发得到(-)-EGC六乙酸酯(2)(0.92 g， 1.1%收率)。最后，还将Rf值为 0.68的含化合物的级份合并和蒸发得到(-)-EC五乙酸酯(3)。化合物3 和4的收率低于0.01%。
EC五乙酸酯(3):'H NMR(CDC13， 500MHz):57.22(m， 3H), 6.67(s， 1H), 6.57(s, 1H), 5.38(br s. 1H), 5.08(s， 1H), 2.94(m, 2H), 2.29(m, 15H); HRMS(ESI):C2sH240uNa(M+Na)+计算值523,1216，实测值523.1198。
ECG七乙酸酯(4):111 NMR(CDC13， 500MHz):S7.62(s， 2H), 7.25(m, 3H), 6.73(s， 1H)， 6.60(s， 1H), 5.63(br s， 1H)， 5.20(s， 1H)， 3.06(m, 2H)， 2.27(m， 21H); HRMS(ESI):C36H320"Na(M+Na)+的计算值759.1537，实 测值759.1515。从Shou Mee绿茶茶叶分离单独的儿茶素。
将绿茶茶叶(26.9g)(Shou Mee)研磨成粉末，将粉末添加到在冰-水 浴中的乙酸酐(30mL)和吡啶(40mL)中，得到的混合物在室温下搅拌12 小时。然后减压(20mmHg)除去过量的吡啶和乙酸酐，混合物用硅胶层 过滤，滤饼用乙酸乙酯(5x 100mL)洗涤，滤液用0.1MHC1(5 x 100mL)、 饱和碳酸氢钠溶液(3 x 100mL)和盐水溶液(200 mL)洗涤。有机相用 MgS04干燥并过滤，滤液( 40mL)通过旋转蒸发仪蒸发。粗产物为暗 绿色的泡沫状物质，粗产物通过柱色谱法(硅胶，10 g)，使用正己烷/ 乙酸乙酯(1:2的体积比)作为洗脱液进行纯化。
收集含有(-)-EGCG全乙酸酯(l)的级份并蒸发溶剂得到(-)-EGCG 全乙酸酯(1.25g，4.6X)，其物理性质和光谱性质与真实样品相同。
收集含(-)-ECG七乙酸酯(4)的级份并蒸发溶剂得到(-)-ECG七乙酸 酯(0.24g， 0.88%): Mp 104-110°C ; [a]D20-57.6(c = 0.60， CHC13); 'H NMR(CDC13, 400MHz)S 7.62(s, 2H), 7.29-7.33(m, 2H), 7.2l(s， 1H), 6.73(d， J= 2.2Hz, 1H), 6.60(d, J= 2,1Hz， IH)， 5.63(s， 1H), 5.20(s, 1H), 3.08(dd， J = 17.9, 4.6Hz, 1H), 2.98(dd, J = 17.9, 2.0Hz， 1H), 2.14-2.29(m, 21H); 13C NMR(CDC13， lOOMHz)S 168.9, 168.4, 168.0, 167.9， 167.4, 166,2， 163.5， 154.9， 149.7, 143.3, 142.1 ， 142.0, 138.9, 135.4， 127.4, 124.4 123.5， 122.3， 121.8， 118.7, 109.5， 108.9， 108.0， 76.7， 68.1, 25.9， 21.1， 20.7 20.5， 20.1; LRMS(ESI)m/z 759([M+Na]+， 66), 737([M+H〗+, 42); HRMS C36H320 Na的计算值759.1537，实测值759.1508。
收集含(-)-EGC六乙酸酯(2)的级份并蒸发溶剂得到(-)-EGC六乙酸 酯，其物理性质与真实样品相同。
收集含(-)-EC五乙酸酯(3)的级份并蒸发溶剂得到(-)-EC五乙酸酯， 其物理性质与真实样品相同。2和3的合并收率低于0.5 %。从(-)-EGCG全乙酸酯(l)合成(-)-EGCG的过程
在室温下，将 NH4OAc(4.3 g， 56 mmol)添力B至lj在 MeOH:H2O(4:l)(20 mL)中的(-)-EGCG全乙酸酯1(350 mg， 0.42 mmol) 和维生素C(35 mg)中，得到的混合物在4(TC搅拌直到1消失并且形成 EGCG(反应过程通过HPLC监控C-18反相柱；流速，1 mL/min;检 测，UV 280 mn;流动相，0-8分钟(20%的乙腈水溶液和0.016% TFA)， 8-13分钟(从含0.016% TFA的20%的乙腈水溶液到含0.008% TFA的 60%的乙腈水溶液变化)。反应混合物经真空干燥，添加水，混合物用 乙酸乙酯(8mLx3)提取，然后滤液用硫酸钠干燥并蒸发，粗产物通过 硅胶柱色谱法(乙酸乙酯，Rf值为0.5)进行纯化，得到EGCG(180 mg， 90% 收率)，为浅白色固体。其与(-)-EGCG真实样品的一致性通过NMR共 振光谱数据和其它物理数据得以证实。
晶体结构的测定
在Bmker CCD区域检测器衍射仪上，使用从在50KV， 30mA条 件下操作的发生器产生的MoK (^辐射=0.71073 A)，通过直接法测定 化合物2的晶体结构。使用了一部分非氢原子位置和随后的差值傅里 叶合成对所有在最初结构中未显示的残留的非氢原子进行定位。限定 了所有的非氢原子的各向异性。基于差值傅里叶合成并结合几何分析 对氢原子进行定位。所有的实验和计算在使用Bruker Smart程序和 Bruker Shelxtl包的个人电脑上进行。化合物2的晶体结构如图2所示。
结果和讨论
绿茶茶叶用乙酸酐和吡啶直接在室温下进行处理。假定所有的儿 茶素，包括(-)-EGCG，被转化成相应的乙酸酯(图1)，因为使用过量的 乙酸酐。然后将反应混合物用乙酸乙酯提取并过滤。然后通过简单的 硅胶柱色谱法，使用己烷:乙酸乙酯(1:2的体积比)将儿茶素乙酸酯彼此 分开，得到纯的结晶EGCG全乙酸酯(1)作为主要产物，其占绿茶茶叶 干重的3.4-4.6%。还得到了 EGC六乙酸酯(2)，其作为结晶形式，为1.1-1.5干重％。由此分离的化合物1在各个方面与先前合成的样品一
致。除了与光谱数据一致之外，通过x射线衍射进行结晶测定证实了 化合物2的结构(图2)。除了分离1和2之外，还分离了少量的(-)-EC 五乙酸酯(3)和(-)-ECG七乙酸酯(4)。在使用正相硅胶色谱法分离不同的 儿茶素乙酸酯1-4的容易性与分离具有游离酚基的儿茶素的困难性之 间形成鲜明对比。
准备好可被使用的化合物1可使用在甲醇水溶液中的乙酸铵被转 化成前体(-)-EGCG，以90。/。收率得到(-)-EGCG，为白色晶体，其与真 实样品具有相同的NM R光谱。
描述了(-)-EGCG全乙酸酯(l)和其它儿茶素乙酸酯作为人癌细胞 的蛋白酶体抑制和细胞程序死亡诱导物的前药的用途[D. Kuhn， W. H. Lam, A. Kazi, K. G. Daniel, S. Song, L M. C. Chow, T. H. Chan, Q. P. Dou, Synthetic peracetate polyphenols as potent proteasome inhibitors and apoptosis inducers in human cancer cells, Frontiers in Bioscience, 10， 1010-1023(2005); W. H. Lam， A. Kazi, D. J. Kuhn， L. M. C. Chow, A. S. C. Chan， Q. P. Dou， T. H. Chan, A potential prodrug for a green tea polyphenol proteasome inhibitor:evaluation of the peracetate ester of(-)-epigallocatechin gallatc [(-)-EGCG], Bioorg. Med. Chem., 12， 5587-5593(2004)]。这些酯衍生物通常从纯的(-)-EGCG或其它儿茶素的 酯化制得。缺少简单、有效和廉价的获得纯的(-)-EGCG或其它儿茶素 的方法还妨碍了(-)-EGCG全乙酸酯(l)的制备和在动物和人的临床研究中对1或其它儿茶素酯衍生物进行评估。使用本发明的方法，从绿茶 提取物中获得儿茶素可变得容易，这促进了对该类化合物进行生物可 行性研究。
尽管已经参考实施例详细描述了本发明的优选方案，但是显然可 由本领域技术人员对本发明进行修改和改变。另外，本发明的实施方 案将不被解释为仅仅由实施例或附图进行限定。然而，可明显地理解 的是，这些修改和修改在本发明的范围内，并且如权利要求所述。例 如，作为一个实施方案的一部分进行说明或描述的特征可用于另外的 实施方案，从而获得更进一步的实施方案。因此，本发明覆盖了在本 发明的权利要求及其等价物的范围内的这些修改和变体。
权利要求
1.从绿茶茶叶分离儿茶素的方法，该方法包括以下步骤将儿茶素转化成相应的酯形式，形成酯混合物；分离酯混合物中的转化的儿茶素。
2. 权利要求l的方法，其中儿茶素被转化成它们各自的全乙酸酯 形式。
3. 权利要求2的方法，其中儿茶素通过乙酸酐被转化成相应的全 乙酸酯形式。
4. 权利要求l的方法，其中转化的儿茶素通过柱色谱法被分离。
5. 权利要求4的方法，其中转化的儿茶素在硅胶上通过包含己垸 和乙酸乙酯的混合物被洗脱。
6. 权利要求5的方法，其中己垸和乙酸乙酯的比为l:2的体积比。
7. 权利要求1的方法，另外包括在分离转化的儿茶素之前过滤酯 混合物得到滤液的步骤。
8. 权利要求7的方法，另外包括在分离转化的儿茶素之前用水洗 涤滤液、干燥滤液、然后浓縮滤液的步骤。
9. 权利要求1的方法，另外包括在分离转化的儿茶素之后将转化 的儿茶素变回到儿茶素的步骤。
10. 权利要求9的方法，其中转化的儿茶素通过乙酸铵的甲醇溶 液被变回到儿茶素。
11.权利要求l的方法，其中儿茶素选自(-)-表掊儿茶素-3-掊酸 酯、(-)-表掊儿茶素、表儿茶素-3-掊酸酯和(-)-表儿茶素。
全文摘要
已有许多关于从绿茶分离(-)-EGCG的报道。然而，许多水溶性与儿茶素相似并且结构与儿茶素类似的组分的存在使得分离纯(-)-EGCG变得困难。缺少简单、有效和廉价的获得纯(-)-EGCG的方法妨碍了在动物和人的临床研究中对(-)-EGCG进行评估。本发明提供了分离儿茶素(包括(-)-EGCG)的方法首先将儿茶素转化成它们各自的酯形式，然后通过色谱法分离酯化的儿茶素，并将其变回到儿茶素。本发明的方法相对简单，并且可获得大量的儿茶素。
文档编号A61K125/00GK101316830SQ200580052013
公开日2008年12月3日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者林惠霞, 陈德恒 申请人:香港理工大学;麦吉尔大学