神经变性病症的治疗的制作方法

专利名称：神经变性病症的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包括三肽的化合物及其衍生物，并且涉及这样的化合 物在治疗神经变性病症中的应用。
背景技术：
阿尔茨海默病是一种退行性脑疾病，其特征在于，在数年的时间阶段 中，以不可逆的方式渐进性丧失记忆的和随后的大部分其它认知功能。它 代表一种基本上健康的问题，特别是在老年群体中，并且目前仅在英国就
影响大约800,000人。
直到近来，用于阿尔茨海默病的治疗方法已经致力于稳定乙酰胆碱的 浓度。使用乙酰胆碱酯酶抑制剂导致暂时的改善，其不适于终止或者逆转 所述退行性。这些药物的功效已经受到NICE (英国临床优点国家研究院 (UK's National Institute for Clinical Excellence))，并且对于更有效的方法 存在紧急需求，所述方法基于对该疾病特有的神经元细胞死亡的潜在的生 物化学机制的更好的理解。
已经注意在患有阿尔茨海默病的患者的脑部发生的两种作用是在脑 神经细胞的外部构建蛋白的缠结实体(斑)，和在脑细胞内部构建不同的 蛋白(神经原纤维缠结)。己知细胞外的蛋白是具有与淀粉状前体蛋白APP 的卩-淀粉状蛋白部分相对应的氨基酸序列的多肽的聚集体。这些蛋白的缠 结的实体称为淀粉状蛋白斑。所述细胞内蛋白已知为神经原纤维和tau蛋 白。然而，还不知道淀粉状蛋白斑的细胞外积聚和神经原纤维蛋白的细胞 内积聚中的一种或两种都是阿尔茨海默和阿尔茨海默型相关的神经变性 病的症状的起因。
APP家族由通过交错剪接产生的8种同种型组成，所述8种同种型由 770， 752, 751, 733, 714, 696， 695和677个氨基酸残基组成(参见，Selkoe, Annu Rev Neurosci (神经科学综述年刊)17,489-517,1994)。已知在神经
元中存在的同种型由己知序列的695个氨基酸残基组成[(参见，Kang等, Nature (自然)325， 733-736 (1987),和Carrodeguas等，Neuroscience (神经 科学)134, 1285-1300 (2005),其内容通过引用结合于此]。在Carrodeguas 的

图1中比较了鸡和人的APP-751序列。
APP是一种多功能跨膜蛋白，并且己知其在正常的脑组织中包括神经 炎外生长中具有重要的功能。在良好建立的关于参与小鸡记忆形成， 一种 试验性被动回避任务的分子过程的研究的动物模型系统中，下调APP合成 或者使用抗体封闭其细胞外N端结构域防止长期记忆的形成(参见， Mileusnic等，2000)。
己知小鸡形式的APP由与人形式的APP相同数目的氨基酸残基组成， 并且与人形式的APP非常相似，它们之间有大约95%的同源性。在人和 小鸡形式的APP中，APP氨基酸360-460的氮基酸序列是相同的(参见， Kang等，1997, Carrodeguas等，2005,禾卩Barnes等，J Neurosci (神经科学 杂志)，18 (15) 5869-5880 (1998),它们的内容也通过引用结合于此)。
国际专利申请W002/083729，其内容通过引用结合于此，报道了在小 鸡中通过阻断APP合成或功能，或者通过注射P-淀粉状蛋白而诱导的遗 忘症，可以通过注射与APP的生长促进结构域片段(氨基酸残基375-392) 同源的小肽而预防。据报道特别优选的肽是Arg-Glu-Arg (以下为RER)， 其与在WO02/083729中提供的人APP序列的328-330残基同源。
本发明是基于对其它优选的肽的鉴定。
发明概述
氨基酸可以以天然存在的L-形式(以使用大些字母的单个字母氨基酸 密码表示)或它们的光学异构体D-形式(使用小写字母表示)存在。本发 明人己经确定序列rER的肽(即，D隱Arg-L-Glu-L-Arg)，和衍生物，是特 别有生物活性的。另夕卜，序列ReR的肽(L-Arg-D-Glu-L-Arg)也似乎是生物 活性的，尽管比肽rER的活性程度较低。
按照本发明的第一方面，提供包括具有序列rER的肽或具有序列ReR 的肽的化合物。特别优选的肽具有序列rER。所述肽可以包括一个或多个 保护基团，优选N端保护基团。在一个优选的实施方案中，所述保护基团
是酰基基团，优选是乙酰基团(Ac-rER)。其它酰基保护基团可以具有式
，其中R表示直链或支链的垸基基团，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙 基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基或己基，取代的或未取代的 环垸基基团，例如，甲基环己基或环己基基团，取代的或未取代的直链或 支链的芳烷基基团，例如，苄基基团，或取代的或未取代的芳基基团，例 如苯基或甲苯基基团。上文提及的在取代基团中的取代基的实例是也在上 文提及的垸基基团。可以使用其它适当的保护基团(例如，Fmoc， Boc, Alloc )。
Ae-rER具有结构式
在其它实施方案中，所述保护基团可以是C-端保护基团。
优选地，所述化合物基本上由具有序列rER的三肽组成，所述三肽任 选地具有保护基团。备选地，所述化合物可以基本上由具有序列ReR的三 肽组成。然而，在某些实施方案中，所述肽可以包括额外的氨基酸残基。 所述肽优选地包括不多于1, 2, 5, 10, 15, 20, 25,或30个额外的氨基酸残 基。在优选的实施方案中，所述肽可以包含邻近人APP328-330氨基酸残 基找到的RER序列的残基，如在WO02/083729中所述。特别优选的额外 的残基如在WO02/083729中所述。例如，所述肽可以由序列rER,rERM,和 rERMS中的任一种组成或包括序列rER， rERM，和rERMS中的任一种； 或者由序列ReR, ReRM，禾B ReRMS中的任一种组成或者包括序列ReR,
ReRM，和ReRMS中的任一种。备选地，或者另外地，所述肽可以包含额 外的非标准氨基酸，例如，其它D-氨基酸，或不在哺乳动物中天然存在的 氨基酸。所述肽可以包括具有序列rER (或序列ReR)的三肽，其任选地 具有保护基团，与和人APP无关的另一种肽序列，例如免疫球蛋白序列、 靶序列等缀合。所述化合物可以包括与非肽分子，例如荧光、放射活性或 其它标记缀合的具有序列rER (或序列ReR)的三肽。
本发明还提供包括肽rER的衍生物或肽ReR的衍生物的化合物。衍 生物可以包括盐；修饰的氨基酸，特别是通过甲基化、酰胺化、乙酰化、 或用其它化学基团取代而修饰的氨基酸。优选地，选择修饰，以改变肽的 循环半衰期，而没有不利地影响活性。衍生物可以包括肽模拟物，例如， 其中肽主链被取代或替换的肽模拟物。在某些实施方案中，所述肽主链可 以被修饰，以包含甲基基团，例如，产生肽Ac-rE-(Me)R。可以使用其它 的修饰，以提高肽或衍生物的稳定性。本发明的肽或衍生物可以被标记； 例如，通过与可检测的标记缀合。适当的标记包括金或荧光标记、具有酶 活性的标记等。
本发明还提供包括具有序列rER或序列ReR的肽、或所述肽的衍生 物的化合物，所述化合物用作药物。本发明还提供包括具有序列rER或序 列ReR的肽、或所述肽的衍生物的化合物在制备用于治疗神经变性病症的 药物中的应用。优选地，所述病症是阿尔茨海默病。本发明还提供包括具 有序列rER或序列ReR的肽、或所述肽的衍生物的化合物在制备用于增 强认知功能的药物中的应用。
本发明的其它方面涉及用于治疗神经变性病症，优选阿尔茨海默病的 方法；或者涉及用于提高认知功能的方法。所述方法包括给受试者施用包 括具有序列rER或序列ReR的肽、或所述肽的衍生物的化合物。优选地， 所述受试者是人。所述肽可以以任何便利的方式施用；例如，通过皮下注 射、静脉内施用、口服、透皮、鼻、直肠、肠胃外、或通过肺部施用。除 了其它因素外，适当的剂量水平将取决于待治疗的病症的性质和严重性； 受试者的年龄、体重和性别；施用途径；和与受试者正在采用的任何其它 治疗的潜在的相互作用。优选的剂量水平可以是0.1-100 mg活性物质/kg 受试者体重；优选地0.5-50 mg/kg;并且更优选地1-25 mg/kg。按照本发明的另一个方面，提供一种药物制剂，其包括包含具有序列
rER或序列ReR的肽、或所述肽的衍生物的化合物。所述制剂可以包括药 用载体。可以用于本发明的递送系统包括，例如，水性和非水性凝胶、乳 膏、复乳、微乳、脂质体、油膏、水和非水溶液、洗液、气雾剂、烃基质 和粉剂，并且可以包含赋形剂，如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、 脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和亲水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯 吡咯烷酮)。
本发明的药物制剂是以适合施用如系统、局部或区域性(local)施用 到细胞或受试者的形式存在，所述受试者包括例如人。适当的形式部分取 决于用途或进入途径，例如，口服、透皮或者通过注射。其它因素是本领 域已知的，并且包括诸如防止所述组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式 的考虑。
本发明还包括为储存或施用制备的组合物，其包括在药用载体或稀释 剂中的需要的肽或衍生物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是制药 领域公知的。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括 苯甲酸钠、山梨酸和对-羟基苯甲酸的酯。另外，可以使用抗氧化剂和悬浮 剂。
本发明的制剂可以以包含常规无毒药用载体、佐剂和/或赋形剂的单位 剂量制剂进行施用。制剂可以以适于口服使用的形式，例如，作为片剂、 药片、锭剂、水性或油性混悬液、分散的粉剂或粒剂、乳液、硬或软胶囊、 或糖浆或酏剂存在。可以按照关于药物组合物的制备的领域内己知的任何 方法制备用于口服应用的组合物，并且所述组合物可以包含一种或多种这 样的甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以提供药学上美观可口的制剂。 片剂包含与适用于制备片剂的无毒药用赋形剂混合的活性成分。
这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂；诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、 磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如，玉米淀粉、或藻酸；粘合剂，例 如，淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑 石。所述片剂可以是不包被的，或者它们可以通过已知的技术包被。在一 些情形中，这样的涂层可以通过己知技术制备，以延缓在胃肠道中的崩解 和吸收，并且由此在更长的时间阶段中提供缓释作用。例如，可以使用时
间延缓物质，诸如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服使用的制剂还可以以硬的明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固 体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者以软的明胶胶囊存在，其 中活性成分与水或油基质混合，所述油基质例如花生油、液体石蜡或橄禾览 油。
水性混悬液包含与适用于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性物质。 这样的赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基 纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和阿拉伯树胶；分散或湿润 剂可以是天然存在的磷脂，例如，磷脂酰胆碱，或烯化氧与脂肪酸的缩合 产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或烯化氧与长链脂肪醇的缩合产物，例如， 十七碳乙烯氧十六醇，或烯化氧与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合产 物，诸如聚氧乙烯山梨糖醇一油酸酯，或烯化氧与来源于脂肪酸和己糖醇 酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。所述水性混悬 液还可以包含一种或多种防腐剂，例如乙基、或正丙基对羟基苯甲酸酯， 一种或多种着色剂， 一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，诸如蔗糖 或糖精。
油性混悬液可以通过将活性成分混悬在植物油如花生油、橄榄油、芝 麻油或椰子油，或矿物油如液体石蜡中而配制。所述油性混悬液可以包含 增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可以加入甜味剂和调味剂，以提供 可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸而保存。
适合通过加入水而制备水性混悬液的分散的粉剂和粒剂提供与分散 或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散或湿 润剂或悬浮剂通过上文已经提及的那些示例。其它的赋形剂，例如甜味剂、 调味剂和着色剂，也可以存在。
本发明的药物组合物还可以以水包油的乳液的形式。油相可以是植物 油或矿物油或这些的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如， 阿拉伯树胶或黄芪树胶，天然存在的磷脂，例如，大豆、磷脂酰胆碱，以 及来源于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇一油酸酯，和 所述偏酯与烯化氧的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯。乳液 还可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以使用甜味剂配制，甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨丰唐 醇、葡萄糖或蔗糖。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和调味剂以及 着色剂。所述药物组合物可以以无菌注射水性或油性混悬液的形式存在。
这种混悬液可以按照己知的技术使用上文已经提及的那些适当的分 散剂或湿润剂和悬浮剂进行配制。
无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无 菌注射溶液或混悬液，例如，作为在1,3-丁二醇中的溶液。在可以使用的
可接受的赋形剂和溶剂中是水、Ringer's溶液和等渗氯化钠溶液。另外， 无菌的、不挥发的油便利地用作溶剂或混悬介质。出于这一目的，可以使 用任何刺激性少的不挥发的油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外， 脂肪酸如油酸可以用于注射制剂中。
本发明的化合物还可以以栓剂形式施用，例如，用于药物的直肠施用。 这些组合物可以通过将药物与适当的无刺激性的赋形剂混合而制备，所述 赋形剂在常温下为固体，但是在直肠温度下是液体，并且因此将在直肠中 熔融而释放药物。这样的物质包括可可脂和聚乙二醇。
本发明的肽和衍生物也可以与其它治疗化合物组合施用给受试者，以 提高综合治疗效果。使用多种化合物治疗适应症可以增加有益效果同时减 少副作用的存在。
按照本发明的另一个方面，提供一种特异性结合具有序列rER的肽的 抗体，或者特异性结合具有序列ReR的肽的抗体。"特异性结合"意指所 述抗体以显著大于可以观察到的任何非特异性结合的水平与所述肽结合。 本领域的技术人员应该理解，对rER肽(或ReR肽)特异的抗体仍然可 以结合具有相似表位的其它的抗原。特异性抗体可以通过用包含本发明的 rER肽(或ReR肽)的制剂免疫受试的哺乳动物而制备。本发明的抗体可 以是多克隆的或单克隆的。本发明的抗体可以包括重组的、嵌合的、或人 源化的抗体。本发明还提供这样的抗体的免疫活性片段；特别是F(ab)和 F(ab，)2片段。
本发明的抗体可以用来筛选其它的化合物，以鉴定具有与rER肽相似 的活性的潜在的候选分子。因此，本发明还提供鉴定具有用于治疗神经变 性病症、或用于提高认知功能的活性的化合物的方法，所述方法包括将候
选化合物与对具有序列rER或序列ReR的肽特异性的抗体接触，并且确 定所述抗体是否结合所述化合物。
附图简述
现在，将通过仅是举例的方式和参考附图而描述本发明的这些和其它
方面，所述附图显示
图1.作为记忆增强剂的不同的D/L形式的三肽对弱记忆的作用。 图2.在患有Ap-诱导的遗忘症的小鸡中，Ac-rER对记忆的作用。 图3.在弱训练任务(WT)训练的小鸡中，Ac-rER作为记忆增强剂的作用。
图4.荧光素标记的Ac-rER在小鸡大脑中的分布。三肽通过外周(ip) 和颅内(ic)注射。
图5. Ac-rER在弱训练中的作用的剂量-依赖性。 图6.Ac-rER的稳定性。
图7.在小鸡中，Ac-rER对茴香霉素-诱导的遗忘症的作用。
图8.Ac-rER对MK801-诱导的遗忘症的作用。
图9.颅内注射的Ac-rE(Me)R对弱训练(WT)的作用。
图IO.外周注射的Ac-rE(Me)R对弱训练(WT)的作用。
附图详述
图1.作为记忆增强剂的不同的D/L形式的三肽对弱记忆的作用。在 训练前60分钟，将小鸡颅内注射不同D/L形式的三肽，并且24小时后进 行检测。对照组接受盐水。保持计算为在表现出回避和区分的每个组中的 百分数。对每只小鸡进行训练，并且只检测一次，组间差异通过G-检验进 行检测统计学显著性(Sokal,和Rohlf， 1995)。注意，G-检验反映组差异， 并且因此在附图上没有误差条。
图2.在患有A(3-诱导的遗忘症的小鸡中，Ac-rER对记忆的作用。在 训练前6小时和12小时，给小鸡外周注射Ac-rER 2次，1 mg/100 gr bw。 训练前60分钟，颅内注射A卩l-42(2吗/半球)。在24小时后检测小鸡。保 持计算为在表现出回避和区分的每个组中的百分数。对每只小鸡进行训 练，并且只检测一次，组间差异通过G-检验进行检测统计学显著性(Sokal, 禾口Rohlf， 1995)。
图3.在弱训练任务(WT)训练的小鸡中，Ac-rER作为记忆增强剂的作 用。在训练前30分钟和6小时，将小鸡外周注射注射液2次，lmg/100gr bw，并且24小时后检测。对照组接受Ac-REr。保持计算为在表现出回避 和区分的每个组中的百分数。对每只小鸡进行训练，并且只检测一次，组 间差异通过G-检验进行检测统计学显著性(Sokal，和Rohlf， 1995)。
图4.荧光素标记的Ac-rER在小鸡大脑中的分布。在解剖大脑分析荧 光素-标记的rER的分布前6小时，外周(2mg/100grbw)和颅内(8 )ig/半 球)注射荧光素-Ahx-Ahx-rER。左图显示在颅内注射后荧光素-标记的rER 的分布。右图显示在外周注射后荧光素-标记的rER的分布。注意到荧光 的分布几乎相同。
图5. Ac-rER在弱训练中的作用的剂量-依赖性。在训练前60分钟， 将小鸡外周注射不同剂量的Ac-rER，并且在24小时后检测。对照组接受 盐水。保持计算为在表现出回避和区分的每个组中的百分数。对每只小鸡 进行训练，并且只检测一次，组间差异通过G-检验进行检测统计学显著性 (Sokal,和Rohlf， 1995)。
图6. Ac-rER的稳定性。在训练前1, 2， 4, 6和12小时，将小鸡外周注 射Ac-rER， 2mg/100gbw，并且在24小时后检测。对照组接受盐水。保 持计算为在表现出回避和区分的每个组中的百分数。对每只小鸡进行训 练，并且只检测一次，组间差异通过G-检验进行检测统计学显著性(Sokal, 和Rohlf， 1995)。
图7.在小鸡中，Ac-rER对茴香霉素-诱导的遗忘症的作用。在训练前 60分钟，将小鸡颅内注射8iag/半球的Ac-rER，然后在训练后立即颅内注 射茴香霉素(125 nmol/半球)。对照注射盐水。在训练后3小时对小鸡进 行检测。保持计算为在表现出回避和区分的每个组中的百分数。对每只小 鸡进行训练，并且只检测一次，组间差异通过G-检验进行检测统计学显著 性(Sokal,和Rohlf， 1995)。
图8. Ac-rER对MK801-诱导的遗忘症的作用。在训练前60分钟，将 小鸡颅内注射8吗/半球的Ac-rER，然后在训练前外周注射MK801 (0.020
mg/100 gr)。对照注射盐水。在3小时后对小鸡进行检测。保持计算为在 表现出回避和区分的每个组中的百分数。对每只小鸡进行训练，并且只检 测一次，组间差异通过G-检验进行检测统计学显著性(Sokal，和Rohlf， 1995)。
图9.颅内注射的Ac-rE(Me)R对弱训练(WT)的作用。在训练前60分 钟，将小鸡颅内注射8昭/半球的Ac-rE(Me)R，并且在24小时后检测。对 照注射盐水。保持计算为在表现出回避和区分的每个组中的百分数。对每 只小鸡进行训练，并且只检测一次，组间差异通过G-检验进行检测统计学 显著性(Sokal，和Rohlf， 1995)。
图IO.外周注射的Ac-rE(Me)R对弱训练(WT)的作用。在训练前6小 时，将小鸡外周注射2 mg/100 grbw的Ac-rE(Me)R，并且在24小时后检 测。对照注射盐水。保持计算为在表现出回避和区分的每个组中的百分数。 对每只小鸡进行训练，并且只检测一次，组间差异通过G-检验进行检测统 计学显著性(Sokal,和Rohlf， 1995)。
材料和方法
动激爾练
将商购获得的Ross Chunky卵在孵化箱中温育和孵化，并且保持到16 土6小时龄。将小鸡成对放在小的铝制围栏中。在l小时的平衡时间后， 将小鸡进行预训练和训练，基本上按照Lossner和Rose所述(J. Neurochem (神经化学杂志).41,1357-1363 (1983)，其内容通过引用结合于此)。预 训练包括以大约5分钟的时间间隔3次提供小(2 mm直径)白珠，提供 持续10秒。在三次提供中至少有两次没能啄食所述珠子的小鸡(低于5%)， 随后不再使用，但是在实验的持续期间保持在它们的围栏中。使用两种训 练技术"强"和"弱"训练。在这两种训练中，在最后一次预训练试验 后5-10分钟，通过提供4 mm直径的铬珠训练小鸡，提供持续10秒，所 述铬珠曾经浸过苦味的邻氨基苯甲酸甲酯。对照小鸡啄食水-包被的或干燥 的珠子。在"强"形式的任务中，使用100%的邻氨基苯甲酸甲酉旨。在"弱" 形式中，使用10%的邻氨基苯甲酸甲酯。小鸡本能地在20秒内啄食训练 的或对照的珠子。啄食苦味珠子的小鸡表现出恶心反应，并且在随后的数
小时内通常将不啄食相似的但干燥的珠子。在检测了训练的小鸡后数次，
通过给它们提供干燥的4 mm直径的铬珠，10分钟后提供小的(2 mm直 径)白珠，分别持续20-30秒。动物由不知道每只小鸡曾经接受过那种处 理的实验者进行检测。如果它们在检测时回避铬珠而啄食白珠(区分)， 那么认为小鸡记住了该任务，如果它们啄食两种珠子，那么认为它们已经 忘记了该任务。记忆计算为回避得分百分数(避开铬珠的小鸡的百分数) 和区分得分(避开络珠但是啄食白珠的小鸡的百分数)。使用区分得分确 保小鸡的确看到并且准确地啄食所述珠子；并且因此回避铬珠不是由于非 特异性因素，诸如缺乏视觉眼肌运动的协调、动机、注意、觉醒等，而是 积极的行为，这证明了对不好的味道刺激的记忆。对每只小鸡进行训练， 并且只检测一次，组间差异通过Sokal和Rohlf所述的g-检验进行检测统 计学显著性(biometry: the Principles and Practice of Statistics in Biological Research (寿命测定生物研究中的统计学原理和实践)(第2版)，W H Freeman,纽约(1981))，其内容通过引用结合于此。Andrew充分讨论了用 来评估记忆形成的这种特别的训练任务的有效性(Neural and Behavioural Plasticity: the Use of the Domestic Chick as a Model (神经禾口行为可塑性使 用家禽小鸡作为模型)，牛津大学出版社，牛津，英国(1991))，其内容通 过引用结合于此。
我们发现在强形式的任务上训练的小鸡记忆所述回避持续至少48小 时，并且发现大于80%的小鸡在24小时进行检测时正常回避和区分。因 此，如果施用引起健忘的药剂…-即，引起小鸡忘记的药剂，小鸡将表现出 忘记，在检测时啄食而不是避开铬珠。相反，发现小鸡通常记忆"弱"形 式的任务，只持续几个小时-…总共约6-8小时；在24小时的保持通常减 少到约20-30%。因此，该学习经历没有构成长期的记忆。因此可以检测 作为记忆增强剂的药剂。施用给在弱学习任务上训练的小鸡的记忆增强 剂，产生保持的增加…-在24小时增加回避铬珠。g卩，这样的记忆增强剂 通过能够由更短的记忆转化成更长期的记忆而帮助将弱的学习转换成强 的学习。
鹏微
1. 颅内(ic)注射在训练前或训练后的不同的时间点，将APP-来 源的肽的两侧颅内注射液(8昭，2 pl/半球)大脑内注射到特殊的脑区域
(中间上纹状体腹侧)，该脑区域己知是记忆形成必需的，注射使用配有
塑料套的5吗Hamilton注射器进行，以允许穿透3 mm。在完成注射后， 将针头保持在该位置5秒。正确的放置通过使用Davis等所述的特别设计 的头部固定器而保证，(Physiol. Behav. 22, 177-184 (1979)，其内容通过引 用结合于此)，并且通常在死后进行视觉监测。
2. 外周(ip)注射在训练流程之前或之后的不同时间，使用lml的皮 下注射器，腹膜内(0.2 ml/小鸡)施用测试肽或其它物质。在完成注射后， 将针头保持在该位置3秒。按上文所述在训练后的不同时间点对小鸡进行 检测。观察注射后小鸡的全面行为，以检测针对所述注射的任何潜在的非 特异性的或不利的反应。
使用常规肽合成仪，以本领域的技术人员公知的方式，合成所施用的 多肽。所合成的多肽通过使用RP-HPLC进行纯化，并且通过质谱 (MALDI-TOF)进一步检验纯度，这两种技术都是本领域的技术人员公知 的。合成后，将多肽以冻干状态保存在氩气中，氩气防止半胱氨酸、甲硫 氨酸以及特别是色氨酸的氧化。
实验结果
国际专利申请WO02/083729描述了许多来源于APP的肽。特别地， 小肽RER表现出有效用作认知增强剂和针对|3淀粉状蛋白诱导的记忆丧 失的保护剂。我们希望研究该肽的更稳定的形式，其可以更好地用作有效 的治疗剂。
稳定肽的标准方法是在N-端保护分子。这通过酰化作用而实现。 Ac-RER有效地作为认知增强剂，并且有效地针对(3淀粉状蛋白进行保护。
然后，我们决定研究该肽的d-异构体形式的生物活性。D-异构体通常 是有毒的，并且通常不表现与天然存在的L-形式相似的生物活性。我们合 成了下述D/L-形式D-R-L-E-L-R (rER), L-R-D-E-L-R (ReR)， L-R-L-E-D-R
(REr)和D-R-D-E-D-R(rer)。只有一种，rER，及其酰化形式Ac-rER，表现 出与RER相似程度的生物活性，作为认知增强剂和针对(3淀粉状蛋白诱 导的记忆丧失进行保护是有活性的。该肽的ReR形式表现出较少的生物活 性，但是当与没有肽或者与该肽的其它形式相比较时，仍然提供提高的作用。
图1显示在弱厌恶性学习任务上训练的小鸡中，不同的D/L形式的三 肽对记忆保持的作用。在训练前60分钟，将小鸡颅内注射不同D/L形式 的三肽，并且在注射后24小时检测。对照组接受盐水。数据表明，Ac-D/L/L (Ac-rER)将记忆保持提高到在用Ac-L/L/L/形式的(Ac-RER)处理的小鸡中 观察到的水平，而Ac-L/D/L (Ac-ReR)表现出显著的但是较小的作用。所 有其它形式都是生物活性较小的。
图2显示在用Ap-诱导的遗忘症小鸡中Ac-rER对记忆的作用。在训 练前6小时和12小时，将小鸡用Ac-rER注射，外周注射2次，1 mg/100 grbw。在训练前60分钟颅内注射A卩l-42。 A(31-42是APP的结构域，其 形成卩淀粉状蛋白斑，并且在Carrodeguas等(2005)中更详细地描述。数据 表明，在训练前6或12小时注射的Ac-rER恢复了认知功能，并且防止另 外由于注射A卩而导致的记忆丧失。这证实Ac-rER保护免受A|3诱导的记 忆丧失，并且因此可以有利于治疗在衰老和神经变性病症包括阿尔茨海默 病过程中发生的认知缺陷。
图3显示在弱训练任务(WT)训练的小鸡中Ac-rER作为记忆增强剂的 作用。在训练前30分钟和6小时，将小鸡注射2次，外周注射，lmg/100 grbw。对照组接受Ac-REr。结果表明，在给与Ac-rER的那些动物中，在 弱训练任务上的表现显著增强。
从潜在的治疗应用观点看来重要地是，这些结果表明，当外围注射时， Ac-rER是有效的。为了证明这是由于Ac-rER穿过血脑屏障并且结合与 RER结合的相似的位点的能力，我们外周和颅内注射了荧光素标记的 Ac-rER，并且6小时后，切下部分用于荧光分析。图4比较了在这两次注 射路径后Ac-rER的结合。Ac-rER比Ac-RER更稳定，原因在于它可以在 训练前多达12小时注射，并且作用为认知增强剂和神经保护剂(图2和3)， 相反，未保护的L-形式的最大时间是3小时(如在WO02/083729中所述)。
图5显示在弱厌恶性任务训练的小鸡中，不同剂量的Ac-rER的作用。 数据表明，在弱训练任务上训练的小鸡中，低至lmg/100g体重的剂量足 以增强记忆。
图6显示当施用给在弱训练任务上训练的小鸡时，Ac-rER作用的持 久性。当在训练前多至12小时给与l-2mg/100gbw的单次注射时，该肽 是有效的。数据还表明，当在训练前2-6小时之间，优选地在4小时施用 时，该肽最有效。
我们还研究了 Ac-rER在逆转或保护免受通用蛋白合成抑制剂(茴香 霉素，图7)和NMDA受体的阻断剂(MK801;图8)诱导的遗忘症中的功 效，所述通用蛋白合成抑制剂和NMDA受体的阻断剂都是公知的引起遗 忘剂。据我们所知，尚没有可用的已知的药剂能够逆转这些物质的引起遗 忘的作用。在图7和8所述的实验中，茴香霉素在训练后立即颅内施用， MK801在训练前20分钟外周给与，而Ac-rER在训练前30分钟颅内施用。 结果表明，Ac-rER防止这些药物诱导遗忘症。
最后，我们还研究了 Ac-rE(Me)R在弱训练(图9和10)中的功效。 使用N-甲基基团对肽主链内的氢键的替换应该更进一步提高D/L三肽的 稳定性。如在图4中所述，Ac-r-E(Me)R在训练前6小时颅内或外周施用， 并且在24小时后检测小鸡。图9 (颅内施用)和10 (外周施用)比较了 在两种注射路径后Ac-rER的作用，并且表明，Ac-rER的甲基化类似物， Ac-rE(Me)R是耐受的，即使在Ac-r-E-(Me)R中没有氢键，并且该分子在 两种实验条件下都增强记忆。
结论
这些结果表明，Ac-rER和Ac-ReR对增强正常动物的认知和学习提供 有利作用，以及防止诱导的遗忘症。Ac-rER针对Ap诱导的遗忘症的作用 表明，该肽有效地减轻与衰老和神经变性有关的认知缺失，并且因此用作 治疗阿尔茨海默病的治疗剂。从初始的RER肽的已知的活性，没有办法 预先预测rER肽的令人惊讶的增强作用，并且与无活性的形式相比是有活 性的所述肽的这种形式的发现，提供了关于与神经元膜上其推定的受体位 点结合所需要的分子的空间构型的有价值的信息。
应该理解，前述只是举例说明的目的，在不背离本发明的范围的前提
下，可以对本文公开的药剂进行各种修饰。特别地，可以使用结合rER或 ReR序列的更长的肽和肽模拟物。可以对rER或ReR肽进行额外的修饰， 例如，以提高稳定性或生物利用度。 一种这样的修饰是在肽主链上结合甲 基基团。肽可以结合其它的氨基酸残基，优选地来自人APP蛋白，并且优 选地还来自APP蛋白邻近RER基序的区域。备选地，或另外，可以结合 来自其它蛋白的氨基酸残基，其可以是非肽分子。
权利要求
1.一种增强正常受试者的认知功能的方法，其包括给受试者施用包括具有序列rER(D-Arg-L-Glu-L-Arg)或序列ReR(L-Arg-D-Glu-Arg)的肽的化合物。
2. —种增强正常受试者的记忆的方法，其包括给受试者施用包括具有 序列rER (D-Arg-L-Glu-L-Arg)或序列ReR (L-Arg-D-Glu-Arg)的肽的化合
3. 包括具有序列rER或序列ReR的肽的化合物的应用，其用于制备 治疗受损的记忆的药物。
4. 权利要求3的应用，其中所述受损的记忆是遗忘症。
5. —种鉴定具有有效用于治疗受损的记忆或有效增强认知功能的活 性的化合物的方法，所述方法包括，将候选化合物与对具有序列rER的肽 特异性的抗体接触，或者与对具有序列ReR的肽特异性的抗体接触，并且 确定所述抗体是否与所述化合物结合。
6. 权利要求l， 2或5的方法，或权利要求3或4的应用，其中所述 肽具有序列rER。
7. 权利要求l， 2或5的方法，或权利要求3或4的应用，其中所述 肽包含一个或多个保护基团。
8. 权利要求7的方法或应用，其中所述保护基团是N-端保护基团。
9. 权利要求7或8的方法或应用，其中所述保护基团是酰基基团。
10. 权利要求9的方法或应用，其中所述保护基团是乙酰基基团。
11. 前述权利要求中任一项的方法或应用，其中所述肽是Ac-rER。
12. 前述权利要求中任一项的方法或应用，其中所述肽具有结构式
13.前述权利要求中任一项的方法或应用，其中所述肽基本上由具有序列rER的三肽组成，所述肽任选地具有保护基团。
14. 权利要求1到10中任一项的方法或应用，其中所述肽包含其它的 氨基酸残基。
15. 权利要求14的方法或应用，其中所述肽包括与在人APP的氨基 酸残基328-330找到的RER序列邻近的残基。
16. 权利要求14或15的方法或应用，其中所述肽由序列rER， rERM， 和rERMS中的任一种组成或者包括序列rER， rERM,和rERMS中的任一 种。
17. 权利要求14到16中任一项的方法或应用，其中所述肽包含其它 的非标准氨基酸。
18. 权利要求14到16中任一项的方法或应用，其中所述肽包括具有 序列rER的三肽，其任选地具有保护基团，与和人APP不相关的另一种 肽序列缀合。
19. 权利要求1到12或13到16中任一项的方法或应用，其中所述肽 与非肽分子缀合。
20. 权利要求1到10或13到19中任一项的方法或应用，其中所述肽 主链已经被取代或替换。
21. 权利要求20的方法或应用，其中所述肽主链包括甲基基团。
全文摘要
本发明公开了具有序列D-Arg-L-Glu-L-Arg，或序列L-Arg-D-Glu-L-Arg的肽及其衍生物。所述肽有效用于治疗神经变性病症，并且用作认知增强剂。优选的肽包含保护基团。
文档编号A61K38/06GK101351214SQ200680050196
公开日2009年1月21日 申请日期2006年11月24日 优先权日2005年11月25日
发明者史蒂文·彼得·罗素·罗斯, 拉德米拉·米莱乌斯尼奇 申请人:英国开放大学