专利名称：：白芷香豆素提取方法
技术领域：
：本发明为中药提取的方法，主要涉及中药有效组分提取的方法，尤其涉及白芷香豆素的提取方法。
背景技术：
：白芷为伞形科植物白芷爿"ge/fcacfaM^ca.(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook,f或杭白芷<ia/mn,ca.(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.vanformosana(Boiss.)ShanetYuan的干燥根。白芷主要产于河南禹县，长葛，河北安国、定县，四川；杭白芷现广泛栽培于江苏、安徽、浙江、湖南、和四川等地。白芷性温味辛,归胃、大肠、肺经。具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功效。用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻渊、牙痛、白带、疮疡肿痛。白芷的化学成分包括香豆素类成分及挥发油。其中香豆素类主要有氧化前胡素(oxypeucedanin)，欧前胡素(imperatorin)，异欧前胡素(isoimperatorin)。白芷中香豆素组分(CAD)主要有的解热、镇痛和抗炎作用。现有的白芷香豆素提取方法，一般采用水提取、超临界C02萃取或乙醇提取后，浓縮，干躁，即得。这种方法提取的香豆素含量低，用本发明可以克服此缺点。
发明内容本发明公开了一种白芷香豆素提取方法，该方法是将白芷以乙醇加热回流提取，滤过，浓縮，浓縮液醇沉后以水定容，经石油醚萃取后以氯仿萃取，回收氯仿，浓缩干燥获得白芷香豆素。获得白芷香豆素的方法。本发明涉及的白芷香豆素提取纯化方法，是将白芷以1~14倍体积50~95%的乙醇回流提取14次，每次提取的时间为0.5~2小时。最优选的提取方法为将白芷以6倍95%乙醇回流提取2次，每次1小时。本发明提供的白芷香豆素提取方法，是提取液浓縮后加水定容至药材质量的1/101，加95%乙醇使醇浓度至60%~80%，搅匀，静置过夜，滤过，减压回收乙醇至稠膏。最优选的方法为提取液浓縮后加水定容至药材质量的1/5，加95°/。乙醇使醇浓度至60%，搅匀，静置过夜，滤过，减压回收乙醇至稠膏。本发明提供的白芷番豆素提取纯化方法，是将醇沉后的稠膏加水将浓縮液体积定容至药材质量的1/2。本发明提供的白芷香豆素提取纯化方法，是将提取液以1~4倍体积石油醚萃取1~4次，每次14小时。最优选的方法为将提取液以等休积石油醚萃取3次，每次1小时。本发明提供的白芷香豆素提取纯化方法，是经石油醚萃取后的水层以氯仿萃取，每次加入0.54倍体积的氯仿，萃取15次，每次18小时。最优选的方法为经石油醚萃取后的水层以氯仿萃取，每次加入1.5倍体积的氯仿，萃取2次，每次2小时。本发明提供的白芷香豆素提取纯化方法，获得纯化的白芷香豆素含量大于50%。本发明具有以下优点1、本发明是一种操作简便、快捷的方法。2、本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。3、氯仿萃取后可用简单的方法清除。4、用本发明方法提取白芷香豆素含量可达50%以上，且重现性好，溶剂可重复使用。具体实施方式本发明将结合具体实施例做进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。说明白芷香豆素含量测定方法①仪器与试药仪器尤尼科(上海)仪器有限公司WFZUV-2000型紫外可见分光光度仪，日本岛津LIBRORAEL-200万分之一电子分析天平，上海亚荣2000A型旋转蒸发仪。试药欧前胡素对照品(供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号110826-200409)。水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。②检测波长300nm。③对照品溶液的制备精密称取欧前胡素对照品12.2mg，置25ml量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。④工作曲线制作精确移取O.l至25ml量瓶、0.2、0.4、0.6、0.8、l.Oml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。于300nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，欧前胡素对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程为-Y=41.479X-0.0099，R2=0.9999。欧前胡素在1.95pg/ml48.8(^g/ml范围内呈良好线性关系。⑤供试品溶液的制备取白芷提取物适量，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密移取1.0ml至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。⑥含量测定取样品溶液置300nm处测定吸光度，记录吸光度值，代入工作曲线计算香豆素含量。实施例l本发明的一种纯化方法(1)白芷提取白芷以6倍体积95%乙醇，加热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓縮至相对密度为1.25(55°C)，加95%乙醇使醇浓度至60%，搅匀，静置4小时，滤过，减压回收乙醇至稠膏，稠膏加水稀释至体积生药重-l:2，备用。(2)萃取将白芷提取液以等体积石油醚萃取3次每次1小时，水层再以1.5倍体积氯仿萃取3次，合并萃取液，回收氯仿并浓縮至稠膏，真空干燥(80°C)，即得纯化产物。实施例2选用不同条件进行提取采用本发明提供的方法，选用不同条件进行白芷香豆素提取实验。①、白芷提取工艺条件的优选称取白芷20g药材，共9份，按表l的因素水平，表3的提取条件分别进行正交试验，提取后滤液合并，减压浓縮至干，以甲醇容于25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，移取0.1ml至50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定香豆素的含量。并对结果进行方差分析，结果见表1。方差分析结果表明，以提取出香豆素的量为指标，因素C无显著性差异，A、B、D因素有显著性差异，且D〉A:^因此从正交表中应选A^sdD^B因素是加醇量，考虑到工业生产乙醇成本问题，应选择A3B2dD2。故确定白芷的提取条件为用95%的乙醇，分别以6倍、4倍量提取2次。表l.因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2.提取正交实验表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3.正交试验方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*:F005(2.2)=19.00验证优选提取工艺取50g白芷药材，3份，以6倍量的95%乙醇热回流提取2次，每次lh，滤过，合并滤液，减压浓縮至干，以甲醇容于25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，移取0.1ml至50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。另取50g白芷药材，3份，分别用8倍量的95%乙醇热回流提取2次，每次lh，其它同上。按上述方法测定香豆素的含量。并对结果进行分析。见表4。表4.不同加醇量提取白芷番豆素数据表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>②、醇沉的工艺考察为了进一步提高香豆素的含量和纯度，需将白芷醇提浸膏醇沉。选定浓縮液比重(A)，乙醇浓度(B)为影响因素，设计二因素三水平正交试验，见表5。取1000g白芷药材，按上述方法提取，将提取液合并，平均分成10份(每份100g生药)，取其中3份减压浓縮到比重为1.21-1.25(50-60。C)，3份浓縮至比重为1.16-1.20(50-60t:)，3份减压浓縮至比重为1.11-1.15(50-60°C)。相同比重浓縮液分别加95%乙醇使醇浓度至60%、70%、80%，静置过夜，滤过，滤液分别减压浓缩至干，精密称取干膏适量，以甲醇溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取l.Oml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定其中香豆素的含量。结果见表6、7。表5白芷醇沉正交试验因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表6白芷醇沉实验含量测定表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表7白芷醇沉正交试验方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表7可知，浓縮膏比重(A)和醇沉浓度(B)都有显著性差异，且B>A,由表得最佳组合为A^i，虽总香豆素含量高，但出膏率也大，但如杂质较多，不利于进一步纯化，另外，从醇耗考虑，使用低浓度乙醇醇沉，综合上述因素，考虑用A3B,，浓縮至密度1.25左右(50-60°C)，加乙醇使醇浓度达到60%。并对醇沉工艺进行比较验证。验证醇沉工艺称取白芷150g，按上述优选提取工艺提取，提取液浓縮约6ml(r=1.25)，加入10ml95。/。乙醇，加热使全部溶解，冰箱放置，分层后滤过，滤液减压回收乙醇至干，加水至75ml，以等体积氯仿萃取3次，回收氯仿，减压干燥，按上述方法测定干膏中香豆素含量。另取白芷150g，按上述方法，浓縮至1=1.15，加乙醇使醇浓度至60%，其余同上。表8白芷不同醇沉工艺比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表8知，所选工艺醇沉后香豆素含量高。③、萃取的工艺考察为了进一步提高有效成分的含量和纯度，需将白芷的醇提物醇沉后浓縮，水层液经石油醚萃取除去杂质后再用氯仿萃取。取2000g白芷药材，按上述方法提取，将提取液合并，回收乙醇，浓縮到体积生药重-l:10(ml/g)，即200ml，以等体积石油醚萃取3次，每次1小时。将萃取过的水溶液平均分成10份，按表9的因素水平进行正交试验，每次静置萃取1.5小时，合并萃取液，减压浓縮至干，干膏用甲醇溶于25ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀再移取0.1ml至25ml量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，摇匀。按上述方法测定香豆素的含量。并对结果进行方差分析，结果见表IO、11。表9.因素水平表水平因素A加水量(倍)B氯仿水(v/v)C萃取次数12.51:12251.5:133102:14注以D因素为误差项表IO.白芷水液萃取正交实验含量测定表ABcD质量1111154.532122260.813133371.274212361.115223166.496231273.967313262.458321365.449332174.86Kl186.61178.09193.93195.87K2201.55192.74196.77197.22K3202.75220.08200.21197.82R16.1441.996.281.94表ll.正交试验含量测定方差分析表方差来源离差平方和自由度方差F值显著性A53.92226.9681.7B302.872151.44458.8C6.5923.299.9*D0.6620.331.0误差0.6620.33*:F0.i0(2,2)=9.00**:F005(2,2)=19.00由表IO、ll可知，显著性B〉AX:，因素C无显著性差异，因素A、B有显著性差异，综合考虑优选条件为A2B3Q，即经醇沉后稠浸膏合并油层加水稀释至药材重的1/2(v/m)，用石油醚等体积萃取3次后，以氯仿萃取2次氯仿的用量每次不少于药液的1.5倍。验证萃取工艺称取白芷200g,按上述工艺提取，浓縮膏加水稀释至100ml，以氯仿萃取2次，每次200ml，静置1.5小时，回收氯仿萃取液，减压浓縮至干，真空干燥，测定干膏香豆素含量，另取白芷200g，同上，浓縮膏加水稀释至200ml,氯仿萃取4次，每次200ml,静置1.5小时，回收氯仿萃取液，减压浓縮至千，真空干燥，测定干膏香豆素含量。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表12知，A3B3C3比A2B3d只高约4%，从生产成本考虑，选择A2B3C,。④、萃取时间考察做氯仿萃取试验中，未考虑时间因素，把萃取时间定为1.5小时，为研究萃取时间对试验结果的影响，将时间列为单因素考査。称取3份白芷药材，每份500g，分别按上述最佳工艺提取，醇沉，并稀释至250ml，分别以石油醚萃取3次，每次250ml，静置lh，水层再以氯仿萃取3次，每次375ml，分别静置lh、2h、3h，氯仿萃取液浓縮至干，减压干燥，称重。干膏以甲醇溶于25ml量瓶中，移取0.1ml置50ml量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，摇匀，于300nm处测定吸收度。按上述方法计算干膏中香豆素含量。结果见表13。表13氯仿萃取时间考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果表明静置lh与3h差别不显著，从生产时效考虑选择静置lh。最佳工艺验证称取白芷药材500g，3份，按上述最佳工艺提取。干膏以甲醇溶于25ml量瓶中，移取0.1ml置50ml量瓶中，甲醇稀释定容至刻度，摇匀，于300nm处测定吸收度。按上述方法计算干膏中香豆素含量。结果见表14。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果表明，最佳工艺重现性较好，提取物香豆素含量为53.94%，得率为0.15%。权利要求1.白芷香豆素提取方法，具体方法是将白芷经乙醇提取，滤过，滤液浓缩，浓缩液醇沉后以水定容，经石油醚萃取后以氯仿萃取，回收氯仿，浓缩干燥获得白芷香豆素。2、如权利要求1所述的白芷香豆素提取方法，其特征是:将白正以1~14倍体积50~95%的乙醇回流提取1~4次，每次提取的时间为0.52小时。将白芷以6倍95。/。乙醇回流提取2次，每次1小时。3、如权利要求l所述的白芷香豆素提取方法，其特征是提取液浓縮后加水定容至药材质量的1/10~1倍，加95%乙醇使醇浓度至60%~80%，搅匀，静置过夜，滤过，减压回收乙醇至稠膏。最优选的方法为提取液浓縮后加水定容至药材质量的1/5倍，加95%乙醇使醇浓度至60%，搅匀，静置过夜，滤过，减压回收乙醇至稠膏。4、如权利要求l所述的白芷香豆素提取方法，其特征是将醇沉后的稠膏加水将浓縮液体积定容至药材质量的1/2。5、如权利要求l所述的白芷香豆素提取方法，其特征是将提取液以14倍体积石油醚萃取1~4次，每次14小时。最优选的方法为将提取液以等体积石油醚萃取3次，每次1小时。6、如权利要求l所述的白芷香豆素提取方法，其特征是经石油醚萃取后的水层以氯仿萃取，每次加入0.54倍体积的氯仿，萃取1~5次，每次1~8小时。最优选的方法为经石油醚萃取后的水层以氯仿萃取，每次加入1.5倍体积的氯仿，萃取2次，每次2小时。7、如权利要求l所述的白芷香豆素提取方法，其特征是获得纯化的白芷香豆素含量大于50%。全文摘要本发明公开了一种白芷香豆素提取方法，该方法是将白芷以乙醇加热回流提取，滤过，浓缩，浓缩液醇沉后以水定容，经石油醚萃取后以氯仿萃取，回收氯仿，浓缩干燥获得白芷香豆素。本发明涉及的白芷香豆素提取方法是一种操作简便、快捷的方法。本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。氯仿萃取后可用简单的方法清除。用本发明方法提取白芷香豆素含量可达50％以上，且重现性好，溶剂可重复使用。文档编号A61K36/185GK101255165SQ20071007957公开日2008年9月3日申请日期2007年3月1日优先权日2007年3月1日发明者颂郭申请人:颂郭