专利名称：3－取代香豆素化合物、其制法和其药物组合物与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及通式I所示的的3-取代香豆素化合物，及其制备方法，含有一个或多个这化合物的组合物，和这类化合物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
背景技术：
心血管疾病仍然是严重威胁人类健康的重大疾病，而动脉粥样硬化是大部分心血管疾病的病理改变基础，近来的研究发现，经氧化修饰的LDL，即oxLDL是比LDL更危险的动脉粥样硬化形成因子，它在内皮下能够更加迅速和大量地被巨噬细胞、单核细胞摄取而形成泡沫样细胞沉积在内皮下，大量的沉积进一步形成粥样斑。发表于Nature的一项研究和其它一系列文章显示，凝集素氧氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)是介导oxLDL损伤内皮细胞和进入皮下的关键因子。
目前的研究表明，oxLDL通过LOX-1的介导作用于内皮细胞，使内皮细胞损伤，胞内产生大量的超氧阴离子，一氧化氮的释放减少，同时激活NF-kB通路，触发一系列的信息传导通路，最终介导oxLDL内化而进入内皮下，被单核、巨噬细胞吞噬，转化为泡沫样细胞沉积在内皮下形成动脉粥样硬化斑。
以上研究表明，LOX-1使血管损伤和动脉粥样硬化形成的关键因子，也是血管保护和抗动脉粥样硬化的重要靶点。目前临床上用于治疗该类疾病的药物主要是降血脂药，如他汀类药，他们的主要作用是降低血液中的LDL，减少AS病变的发生，但他们对已经形成的oxLDL无能为力，而oxLDL恰恰是AS的更危险因子。所以LOX-1拮抗剂将会对oxLDL引起的血管内皮损伤和动脉粥样硬化的形成起到积极的保护作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的3-取代香豆素化合物。
本发明的另一目的在于提供一种制备3-取代香豆素的方法。
本发明的再一目的在于提供一种含有一个或多个这种化合物的药物组合物。
本发明的又一目的在于提供一种该类化合物在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的应用。
为了完成本发明之目的，可采用如下技术方案具体讲，本发明涉及通式(I)所示的化合物或其异构体 其中，R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7烷氧基、羧酸C1-7直链或支链酯基；优选的R1，R2为卤素、羧基、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、甲氧酰基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Y选自O，N，S；Z选自CH2，NH。
优选的化合物，包括但不限定于如(Ia)所示 其特征在于R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羧酸C1-4直链或支链酯基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Z选自CH2，NH。
优选的化合物，包括但不限定于如(Ib)所示 其特征在于R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羧酸C1-4直链或支链酯基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Z选自CH2，NH。
优选的化合物，包括但不限定于如(Ic)所示 其特征在于R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羧酸C1-4直链或支链酯基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Z选自CH2，NH。
制备本发明所述化合物或其异构体的方法，包括以下步骤间苯二酚与3-乙氧亚甲基乙酰乙酸乙酯在乙醇钠存在下环合得到3-乙酰基香豆素，再同取代的尿素缩合，得到一系列目的物。
具体讲，根据本发明，通式(I)化合物可通过路线I制备反应路线I i环合，ii缩合本发明还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
本发明的化合物对血管内皮的保护作用和抗动脉粥样硬化作用。
本发明是通过研究分析本发明化合物结构特点，并研究了其在体外细胞水平和分子水平，以及在大鼠体内的药效学特点，证实本发明的化合物具有抗动脉粥样硬化和血管保护作用。
本发明的优益之处在于氧化型低密度脂蛋白是血管内皮损伤和动脉粥样硬化形成的高危因子，这种作用是通过血管内皮细胞表达的LOX-1所实现的，本发明的化合物能够拮抗LOX-1，从而保护了血管内皮细胞免受oxLDL的损伤，同时阻断了oxLDL的内吞、泡沫细胞的形成，进一步抑制了动脉粥样硬化的形成，因此可用于制备血管内皮保护药和抗动脉粥样硬化药。
图1为在细胞水平化合物14抑制细胞表达的人LOX-1内吞荧光标记oxLDL的显微镜下结果。
图2为在细胞水平化合物14抑制细胞表达的人LOX-1内吞荧光标记oxLDL的相对量化指标柱状图。
图3为化合物14对抗oxLDL对血管内皮损伤的相对荧光密度值变化。
图4为化合物14治疗大鼠动脉粥样硬化病理切片结果。
图5为化合物14治疗大鼠动脉粥样硬化血清学LDL、HDL、CHO水平柱状图。
具体实施例方式
在本发明中使用的原料为已知化合物或按本领域技术人员公知的方法制备的化合物。制备虽然不生成本发明的化合物，但是合成制备本通式(I)化合物的有用中间体。
步骤A实施例115.21g(0.1mol)邻香草醛溶于200ml无水乙醇，加14ml(0.13mol)乙酰乙酸乙酯，及1ml六氢吡啶，搅拌加热，数分钟后有固体出现，回流25min，冷至室温，过滤后得所需产物， 产率95％Mp167-169℃，1H-NMR(CDCl3)实施例2用实施例1类似的方法以5-溴邻香草醛和乙酰乙酸乙酯以无水乙醇为溶剂，六氢吡啶催化下得到化合物， 产率97.1％
Mp206℃，1H-NMR(CDCl3)步骤A实施例30.242g(10.5mmol)钠加入40ml无水乙醇，至完全溶解，加1.1gl(10mmol)间苯二酚，完全溶解后加入1.86g(10mmol)乙氧亚甲基乙酰乙酸乙酯，室温搅拌，很快有固体生成，加热回流1.5小时，放置过夜，过滤后所得固体溶于水，过滤除去不溶物，滤液用浓盐酸调pH2，析出大量固体，过滤得所需产物， 产率60％Mp167-169℃，1H-NMR(CDCl3)实施例4用实施例3类似的方法以2，6-二羟基甲苯和乙氧亚甲基乙酰乙酸乙酯以无水乙醇为溶剂乙醇钠催化得到化合物， 产率97.1％Mp206℃，1H-NMR(CDCl3)实施例5用实施例3类似的方法以3，5-二羟基苯甲酸和乙氧亚甲基乙酰乙酸乙酯以无水乙醇为溶剂乙醇钠催化得到化合物， 产率97.1％
Mp206℃，1H-NMR(CDCl3)步骤B实施例61.1g(5mmol)8-甲氧基香豆素溶于45ml乙醇，加0.456gl(5mmol)氨基硫脲的20ml 50％乙醇溶液，及1ml冰醋酸，加热回流，1小时后，有固体出现，回流4小时，放置过夜，过滤后得所需产物， 产率97.1％Mp206℃，1H-NMR(CDCl3)实施例7用实施例6类似的方法以5-溴-8-甲氧基香豆素和氨基胍以冰醋酸为溶剂反应，得到化合物， 实施例8用实施例6类似的方法以5-溴-8-甲氧基香豆素和氨基硫脲以冰醋酸为溶剂反应，得到化合物， 实施例9用实施例6类似的方法以5-溴-8-甲氧基香豆素和氨基胍以冰醋酸为溶剂反应，得到化合物， 实施例10用实施例6类似的方法以5-溴-8-甲氧基香豆素和盐酸氨基脲以冰醋酸为溶剂反应，得到化合物， 实施例11用实施例6类似的方法以5-羧基-7-羟基香豆素和乙酰肼以乙醇为溶剂冰醋酸催化，得到化合物， 1H-NMR(DMSO)13.64(s，1H)，10.51(s，1H)，8.94(s，1H)，7.37(s，1H)，6.95(s，1H)，2.15(s，6H).
实施例12用实施例6类似的方法以5-羧基-7-羟基香豆素和氨基硫脲以乙醇为溶剂冰醋酸催化，得到化合物，
1H-NMR(DMSO)11.03(s，1H)，10.42(s，1H)，8.85(s，1H)，8.34(br.，1H)，7.76(br.，1H)，7.35(s，1H)，6.94(s，1H)，2.23(s，3H).
实施例13用实施例6类似的方法以5-羧基-7-羟基香豆素和氨基脲以乙醇为溶剂冰醋酸催化，得到化合物， 实施例14用实施例6类似的方法以5-羧基-7-羟基香豆素和氨基胍以乙醇为溶剂冰醋酸催化，得到化合物， 1H-NMR(DMSO)9.47(s，1H)，7.29(s，1H)，6.72(s，1H)，3.33(br.，3H)，2.28(s，3H)实施例15用实施例6类似的方法以7-羟基-8-甲基香豆素和氨基硫脲以乙醇为溶剂冰醋酸催化，得到化合物，
1H-NMR(DMSO)10.56(s，1H)，9.38(s，1H)，8.21(s，1H)，7.43(d，J＝11.2Hz，1H)，6.87(d，J＝11.6Hz，1H)，6.47(s，1H)，3.35(br.，1H)，2.15(s，3H)，2.10(s，3H).
实施例16用实施例6类似的方法以7-羟基-8-甲基香豆素和氨基脲以乙醇为溶剂冰醋酸催化，得到化合物， 1H-NMR(DMSO)11.04(s，1H)，8.56(s，1H)，7.63(d，J＝11.6Hz，1H)，6.90(d，J＝11.6Hz，1H)，3.31(s，1H)，2.55(s，3H)，2.15(s，3H).
实施例17用实施例6类似的方法以5-羧甲基香豆素和氨基脲以乙醇为溶剂冰醋酸催化，得到化合物， 药理实验实验例1化合物14在分子水平对LOX-1的拮抗作用重组表达获得纯化的人LOX-1蛋白标记荧光物FITC，从正常人血浆提取低密度脂蛋白并氧化位oxLDL，具体不走如下反应总体系为50微升，检测方法为极化荧光，检测波长为激发485nm，发射525nm。
(1)在微孔板中加入25微升PBS缓冲液、10微升FITC标记的人LOX-1(使其终浓度为)，测定其极化值(A)；(2)加入10微升oxLDL(使其终浓度为)，37℃反应20分钟，检测其极化荧光值(B)；(3)加入5微升化合物14，浓度为100ug/ml，37℃反应20分钟，检测其极化荧光值(C)；(4)抑制率计算方法为(B-C)/A×100％；(5)结果，化合物14抑制率为95％，IC50为4.2umol/l。
本实施例结果说明化合物14在分子水平具有明显的具有竞争性拮抗oxLDL与LOX-1的结合作用。
实验例2化合物14在细胞水平对LOX-1的拮抗作用构建包含LOX-1基因的质粒，LOX-1-pcDNA3.1(+)，用Lipofectamine2000kit，根据试剂盒说明书，将LOX-1基因稳定转染入CHO-K1细胞，并使其稳定表达人LOX-1。稳定表达LOX-1的CHO-K1细胞与15umol/l的化合物14共培养1小时，然后换新培养基，加入10ug/ml荧光物DiI标记的oxLDL培养3小时后荧光显微镜下观察，发现化合物14明显抑制了LOX-1对oxLDL的内吞作用。结果如图1和2所示。
实验例3化合物14对血管的保护作用脐静脉内皮细胞原代培养，第二代细胞铺板使其达到90％融合后换为无血清培养基，加入DCFH-DA15微升，孵育15分钟后，加入脂多糖诱导细胞表达LOX-1，然后分组加入60ug/ml的oxLDL，化合物14，终浓度为10umol/l。30分钟后在激发485nm，发射525nm测定荧光值，结果显示化合物14可以明显降低oxLDL引起的细胞内升高的反应性氧物质(ROS)水平。见图3。
实验例4(1)动物分组、造模与给药方法雄性SD大鼠随机分为6组，空白对照组(10只)给予普通饲料喂养；动脉硬化模型组(25只)给予高脂饲料喂养；化合物14高剂量组(12只)给予高脂饲料喂养，每日上午灌服化合物140.4mg/kg；化合物14低剂量组(12只)给予高脂饲料喂养，每日上午灌服化合物140.1mg/kg；阳性药组(8只)给予高脂饲料喂养，每日上午灌服辛伐他汀(3.5mg/kg)；除空白对照组以外，其它模型组与给药组下午均灌服胆酸钠(300mg/kg)和丙基硫氧嘧啶(150mg/kg)，连续造模和给药90天。
(2)检测指标在实验结束时，采用眼眶取血方法采血约2毫升，3000rpm，离心15min得到血清，测定血清中CHO、LDL-C、HDL-C等生化指标，以观察LOX-1抑制剂化合物14对实验性动脉粥样硬化大鼠的作用；并每个给药组分别处死2～4只动物，进行主动脉粥样病变病理检查。
(3)结果与模型组比较，化合物14治疗组病理结果显示没有明显的动脉粥样硬化特征；同时血清学检测发现，治疗组低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(CHO)水平比模型组显著降低，而高密度脂蛋白(HDL)水平却明显升高。说明化合物1 4有抗动脉粥样硬化作用。见图4、5和表1。
表1化合物14对动脉粥样硬化大鼠血中CHO、LDL、HDL的影响
注*与正常比较，P＜0.05；#与模型比较，P＜0.05。
权利要求
1.如通式(I)所示的化合物或其异构体 其特征在于R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-7烷基、C1-7烷氧基、羧酸C1-7直链或支链酯基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Y选自O，N，S；Z选自CH2，NH。
2.根据权利要求1的化合物，其特征在于，所述的化合物如(Ia)所示 其特征在于R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羧酸C1-4直链或支链酯基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Z选自CH2，NH。
3.根据权利要求1的化合物，其特征在于，所述的化合物如(Ib)所示 其特征在于R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羧酸C1-4直链或支链酯基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Z选自CH2，NH。
4.根据权利要求1的化合物，其特征在于，所述的化合物如(Ic)所示 其特征在于R1，R2可分别位于杂环的5、6、7、8任一位；其中R1，R2独立的选自氢、羧基、羟基、卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、羧酸C1-4直链或支链酯基；R3，R4独立的选自氢、C1-4直链或支链烷基；Z选自CH2，NH。
5.根据权利要求1-4所述的化合物或其异构体，其特征在于，所述的化合物包括
6.制备权利要求1-5所述的化合物或其异构体的方法，其包括以下步骤间苯二酚与3-乙氧亚甲基乙酰乙酸乙酯在乙醇钠存在下环合得到3-乙酰基香豆素，再同取代的尿素缩合，得到一系列目的物。
7.一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的如权利要求1-5所述的任一化合物及药用载体。
8.权利要求1-5的化合物在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的心血管疾病是血管内皮细胞损伤和/或动脉粥样硬化。
全文摘要
本发明公开了通式I所示的的3－取代香豆素化合物，及其制备方法，含有一个或多个这化合物的组合物，和这类化合物在制备治疗心血管疾病的药物中的应用。
文档编号A61P9/10GK101074222SQ20061008089
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者杜冠华, 张天泰, 谢平, 徐世平, 陈修平, 田华, 焦晓臻 申请人:中国医学科学院药物研究所