激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因与其在制备鼠疫疫苗中的应用。
背景技术：
耶尔森氏鼠疫杆菌(Y.pestis)是一种革兰氏阴性菌，属于enterobacteriacae家族，直接或间接(通过跳蚤)在动物之间传播。该菌会引起某些动物(如老鼠、松鼠或旱獭等)的慢性病，若从这些动物传播到其它动物则会引起这些动物的急性病，即鼠疫。
鼠疫是一种烈性传染病，近年来感染人数有不断上升的趋势。在人类中传播的鼠疫有三种。腺鼠疫是其中最常见的形式，通常由感染了鼠疫的跳蚤叮咬人引起。细菌从叮咬位置传播到流经的淋巴结点，引起肿大，可以有一个鸡蛋大小，是腺鼠疫的典型特征。如果没有形成肿大，就会发展成败血病鼠疫，特征是发热、伤寒、头痛、虚弱和肠胃不适。正是因为症状的大众化，导致患者常被误诊，死亡率很高。最可怕的是当细菌在肺泡中增殖导致肺炎，就成为肺鼠疫。肺鼠疫导致了相当高传染性的血痰，咳嗽导致含有细菌的飞沫传播到易感人群，在极短的时间内(1-3天)就可发病，具有高死亡率和高传染率的特点。同时由于其可能作为潜在的生物恐怖武器而引起了各国政府和人民的高度关注。
鉴于目前还没有治疗肺鼠疫的特效药，同时也为了防御可能的生物恐怖袭击，研制有效的预防鼠疫的疫苗成为当前生命科学研究的重要领域。迄今为止，已经生产并使用了多种药物和疫苗来预防鼠疫，并已取得了令人鼓舞的效果。过去常用疫苗和抗生素来预防和治疗鼠疫。其中，链霉素就是一种很好的治疗腺鼠疫的药物。但抗生素在治疗败血型鼠疫和肺鼠疫过程中很少成功，可能是因为疾病发展太快，而且治疗必须是在疾病发生的早期阶段。而免疫接种死疫苗需要一个超过六个月的免疫过程。因此，死疫苗主要用于那些可能暴露于致病原的人员。研究认为这种疫苗对预防腺鼠疫感染有一定效果，但因副反应较大后来停止使用，如1961-1971年在侵越美军中使用的USP疫苗。Baca-Estrada等(Baca-Estrada ME，Foldvari MM，Snider MM，et al.Vaccine.2000，18(21)2203-11.)采用脂质体过滤甲醛溶液灭活的全菌体死疫苗(KWCV)给小鼠进行鼻腔内接种，然后测定免疫抗体和免疫细胞，并用气溶胶攻击，结果显示，用脂质体过滤的KWCV较单独用KWCV引起的粘膜免疫显著增强，经测定肺部和鼻腔洗液中的特异分泌性IgG和IgA抗体，以及肺内分泌特异性抗体的细胞均有明显增加。另外，在脂质体疫苗免疫的小鼠中，不仅脾细胞特异性增值，分泌TNF-γ的细胞也显著增加，经鼻腔免疫的小鼠对鼻腔感染攻击也有明显的保护作用，证明了粘膜免疫对于抗吸入性感染的重要性，以及脂质体剂型可以改进传统疫苗的免疫效果。
EV76减毒活疫苗是阴性染色的耶尔森氏菌突变株，它起源于耶尔森氏菌全毒菌株。自1908年起开始使用这种疫苗，用EV76疫苗免疫小鼠诱导免疫应答能够抵抗皮下和呼吸道攻击，研究结果表明用EV76疫苗免疫能够保护人抵抗腺鼠疫和肺鼠疫。然而，这种疫苗对人的安全性还存在疑问，据报道在研究鼠疫疫苗的研究人员中这种疫苗的致死率约为1％。
近年来，研究人员主要集中发展用亚单位疫苗预防鼠疫，这是基于毒性因子可能定位于细菌表面，因此用这些成份免疫小鼠可以诱导产生保护性抗体，这些抗体在III型分泌系统中起调节作用。
粘膜免疫系统(mucosal immune system)与系统免疫系统(systemic immunesystem)是机体的两大免疫系统，两者至少在两个方面具有不同的免疫功能。一是粘膜免疫常常激发粘膜和系统免疫应答，而系统免疫仅仅激发系统免疫反应，不激活粘膜免疫系统或很弱；二是粘膜免疫反应主要产生sIgA，而系统免疫不产生或产生很少的sIgA。
但是绝大数非复合抗原(如纯蛋白质抗原)经粘膜供给时免疫原性弱，特别是经口服途径，只有大量和反复接种后才可能引起免疫应答，且应答持续时间短，易引起免疫耐受。寻找能够增强疫苗粘膜免疫原性的粘膜佐剂成为粘膜疫苗开发中的关键问题。比较理想的粘膜佐剂应高效、安全，能激活粘膜免疫系统，在其存在的情况下抗原经粘膜供给可引发抗原特异性全身和粘膜的体液和细胞介导的免疫应答，同时能避免诱导粘膜耐受。抗原对粘膜免疫系统有效的刺激是产生sIgA的必要条件，对粘膜免疫系统的有效刺激需要两个条件，一是疫苗抗原能够有效的传递到粘膜淋巴组织；二是需要合适的粘膜佐剂。
在许多情况下，鼻腔免疫更为有效，而且所需的疫苗量和佐剂量一般较小。
粘膜免疫系统担负着哨兵的责任，区分无害与有害以决定是放过去(耐受)还是拦下来(免疫反应)，粘膜免疫系统主要是通过分泌sIgA和IgM发挥作用，slgA可以阻止微生物在粘膜上皮层驻扎繁殖，禁止它们进入上皮层。特殊的位置、极其重要的作用使粘膜免疫系统形成与外周免疫系统形成迥然不同的解剖学结构、淋巴细胞和免疫反应分子机制。从数量上说，粘膜免疫系统是免疫系统中最大的，这里淋巴细胞的数量比其他部分的总和还要多，60％T细胞的工作岗位在粘膜。
此外，以注射方式在小鼠模型中取得成功的鼠疫疫苗，往往在灵长类动物或人身上并不理想。原因可能就在于灵长类动物或人类身体中含有体积巨大的粘膜系统，鼠疫杆菌通过粘膜感染人类，而普通的注射方式并不能激发灵长类动物或人体内的粘膜免疫反应。因此，研究有效的粘膜疫苗不仅仅要引发体内的系统免疫，更重要的是引发长时间有效的局部粘膜免疫应答。
霍乱毒素(Cholera toxin，CT)是由霍乱弧菌产生的一种分子量为84KD的肠毒素，由一个A亚单位(CTA)和5个B亚单位(CTB)形成的五聚体连接而成。CTA为毒性亚单位，CTB为无毒性的受体结合亚单位，通过与哺乳动物小肠上皮细胞上的神经节苷脂GM1结合而介导CTA进入细胞。CT及其CTB均具有较强的免疫佐剂作用，由于CT具有肠毒性，限制了其作为免疫佐剂的应用，因而无毒性的CTB就成为研究的热点。许多研究发现，单独的CTB就具有较强的免疫活性，但当其经化学方法或基因融合技术与不相关抗原形成偶联蛋白或融合蛋白时，CTB的免疫活性大大高于单独CTB的佐剂活性。因此，CTB是一种良好的蛋白半抗原和弱抗原的载体，同时还可以赋予半抗原免疫原性，增强弱抗原的免疫原性。CTB是一种良好的粘膜免疫佐剂和输送抗原载体，通过粘膜途径免疫效果最佳，将其与目的抗原偶联或表达成融合蛋白后可增强其佐剂和载体的作用能够诱导粘膜和全身免疫应答。采用重组CTB作为佐剂，不引起巨噬细胞的毒性反应，不使血管通透性增加，而且在鼻腔、小肠和肌肉的给药部位没有明显的局部组织病理反应。CT引发粘膜免疫非常有效，CT与非关联蛋白抗原经口、鼻共用，可促进分泌IL24、IL25的抗原特异性CD4+Th细胞的出现，引发极强的粘膜S2IgA和血清IgG应答。CT发挥佐剂效应主要通过诱导抗原特异性CD4+Th2型细胞，活化的CD4+Th2型细胞不仅相应产生IL24、IL25、IL26和IL210，而且支持全身IgG1和IgG2b亚类、IgE和粘膜S2IgA应答的出现。由于天然毒性的存在，目前许多研究正尝试将这两种分子的致腹泻活性(毒性)与佐剂活性分开。有一种方法是将毒素的A、B亚基分开，单独使用其无毒的B亚基作为粘膜佐剂。Millar DG等应用CTB作为粘膜佐剂与鸡蛋溶菌酶共用经鼻免疫小鼠，发现两者可增强血清和分泌抗体滴度，刺激脾脏和淋巴结淋巴细胞增殖。本发明的发明者构建和表达了霍乱毒素B亚单位(CTB)，进行了佐剂特异性和活性的鉴定以及动物实验，证明了其在鼠疫亚单位疫苗中的作用。
因生物相容性好，美国FDA已批准用于注射给药的PLGA(乙交酯-丙交酯)和在PLGA中加入亲水性的PEG(聚乙二醇)制备成嵌段聚物PELA(聚乙二醇-聚丙交酯)为材料，包裹不同抗原成分，研究其免疫原性，目的是制备出最佳的微球疫苗。可以恒定的、继续的、预定的方式将抗原传递至特定组织；释放前可很好地保护抗原，不仅提高抗体，也可提高细胞免疫反应。以毒副作用小、生物可降解、生物相容性好的高分子材料制作的微球或纳米粒子载体，因粒径小、表面积大、吸附能力强、生物活性高，有着较高的生物医学价值，已成为疫苗载体研究的新热点。微球疫苗能特异性靶向APCs，提高用药安全性，延长抗原表达时间，保护抗原，增加免疫途径还起免疫佐剂作用。PLGA已经用于破伤风类毒素，结核病的蛋白疫苗，百日咳和亲肺炎细菌的抗原，流感、麻疹以及马脑炎等病毒，疟原虫的环状子孢子DNA疫苗的微球包裹。也有与其他佐剂合用的情况，例如Tobio等报道破伤风类毒素以PLGA包裹微球与磷酸铝合用，比单独使用磷酸铝产生的抗体水平高出2-3倍并可持续性26周以上(Tobio M，Sanchez A，Vila A，et al.Colloids Surf B Biointerfaces.2000，18(3-4)315-323.)。PLGA不仅用于注射免疫，而且可用于粘膜免疫。Partidos(Partidos CD，Vohra P，Anagnostopoulou C，et al.Mol Immunol.1996，33(6)485-91.和Hilbert(Hilbert AK，Fritzsche U，Kissel T.Vaccine.1999，17(9-10)1065-73)等报道PLGA用于麻疹和流感疫苗，不仅增强抗体的产生，而且能增强细胞免疫和粘膜免疫。DNA疫苗PLGA包裹可将DNA疫苗引入体内固定位置并可以控制其逐渐释放，起到增强免疫反应的效果。
蛋白体是一种纯化的脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)，具有能增强免疫原性的生物传递和免疫刺激特性，而且还能明显减弱如脂多糖(LPS)这样抗原的毒性。蛋白体是疫苗投递和佐剂系统，由纯化的细菌外膜蛋白形成豪微粒。蛋白体同时具有疫苗投递载体和佐剂独特的特征，这个特征使蛋白体提供所有的信号增强免疫反应---在系统上缺乏这种能力，它只提供投递或只提供佐剂刺激功能。免疫系统在识别微粒比可溶性蛋白更有效。蛋白体作为疫苗投递载体是由于它的豪微粒性质，形成小泡或小泡群的大小比得上小病毒的大小。蛋白体疫苗小泡和小泡群的大小在20-800nm，依据抗原的类型和量形成蛋白体。蛋白体疏水的性质使细胞外膜孔道蛋白也有助于疫苗投递能力，易于疫苗微粒的相互作用，疫苗的摄取，细胞激活启动免疫应答。蛋白体是有效的鼻用疫苗的事实被认为它与增强识别和摄取提供通过蛋白体的微粒和疏水性质相关。疫苗抗原的免疫应答被增强是由于被佐剂免疫刺激。蛋白体发挥它的佐剂活性有三种途径①蛋白体蛋白质的促进，促进在抗原提呈细胞(APC’s)表面的配位体分子的表达，因此增强APC的功能。APC的功能关键是刺激免疫反应，由于APCs负责加工和提呈抗原到其它免疫细胞。蛋白体增加某一表面蛋白的密度，负责APCS与其它免疫细胞的有效相互作用。②蛋白体蛋白质的活化，活化B细胞的增生和分泌。B细胞也具有APCS的提呈抗原到T细胞的功能，另外，刺激B细胞的分化和成熟，细胞能产生抗体蛋白。这些抗体在血液中循环，也出现在粘膜表面中和微生物的侵害。③蛋白体也刺激免疫反应，通过提供额外或专有T细胞辅助分子，是T细胞自己缺乏有效刺激T细胞的能力。蛋白体的似蛋白质的成分非共价复合使分子易于刺激作用。

发明内容
本发明的目的是提供一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的融合蛋白，命名为F1-V，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO12)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加可激发机体对鼠疫产生免疫力的蛋白质。
所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
序列表中的SEQ ID NO1由478个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第2-149位为鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1(GenBank号X61996)的氨基酸残基序列，自氨基端第152-478位为鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V(GenBank号M26405)的氨基酸残基序列。
编码本发明融合蛋白的基因(F1-V)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在激发机体产生鼠疫免疫力中起重要作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO2由1437个碱基组成，其编码框为自5’端第1-1437位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第4-450位碱基编码鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1，自5’端第457-1434位碱基编码鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V。
含有上述融合蛋白基因F1-V的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增所述融合蛋白基因F1-V中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种表达上述可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白的方法。
本发明所提供的表达上述融合蛋白的方法，是将含有上述融合蛋白基因F1-V的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白。
所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α或E.coli Top10等。
用于构建所述含有可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白基因F1-V的表达载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pET-11c、pET-22b或pET-32a等。
其中，以pET-11c为出发载体，构建的含有可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白基因F1-V的表达载体为pET-11c-F1-V。
上述重组表达载体均可按照常规方法构建。
将上述重组表达载体转化宿主菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法或PEG介导的原生质体转化法等。
培养含有本发明的可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白基因F1-V的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。
发酵重组大肠杆菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mM，诱导温度为30-37℃，诱导时间为3-4小时。
本发明的融合蛋白F1-V可用于制备鼠疫亚单位疫苗，编码融合蛋白F1-V的基因可用于制备鼠疫DNA疫苗。
所述鼠疫DNA疫苗中的融合蛋白基因F1-V可存在于真核表达载体中。
用于构建携带有融合蛋白基因F1-V的真核表达载体的出发载体可为PVAX1(Novagen，www.novagen.com，ordering800-526-7319)等。
需要的时候，在上述疫苗中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂等。
为获得更好的免疫效果，本发明的疫苗中还可以加入Al(OH)3、CTB、脂多糖(LPS)和蛋白体(Proteosome)等佐剂中的一种或多种作为免疫佐剂。其中，LPS和蛋白体混合佐剂的制备方法可为将去毒的LPS溶于TEEN缓冲液中，无菌过滤除菌，将LPS溶液与等量的蛋白体混合，加入3-5倍体积的冷无水乙醇，沉淀混合物，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，最后用无菌蒸馏水溶解沉淀，超声，使蛋白体与LPS相互结合和溶解，最后去除不可溶的物质，得到佐剂，命名为Protollin。所述LPS的来源是广泛的，如减毒痢疾菌、减毒大肠杆菌等。
本发明的疫苗可以制成注射液、喷剂、涂抹剂、贴片剂或口服液等多种剂型，上述各种剂型的疫苗可以按照药学领域的常规方法制备。
在制备口服剂型的疫苗时，可将携带有融合蛋白基因F1-V的真核表达载体转化进减毒鼠伤寒沙门氏菌，从而实现对人或动物的直接免疫。
此外，本发明疫苗的免疫途径也是多种多样的，如注射、鼻内、透皮或口服等，并可将不同的免疫途径联合应用，以获得更好的免疫效果。
本发明提供了一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因。实验证明，该融合蛋白可激发动物机体产生特异性抗体，对鼠疫菌具有较好的免疫保护效果，可用于鼠疫的预防和治疗中。该融合蛋白稳定、制备方法简便易行，可应用于大规模工业化生产。可以该融合蛋白或其编码基因为活性成分制备成鼠疫疫苗，该疫苗的剂型和免疫途径的选择多种多样，并均可获得较好的免疫效果及免疫保护作用。本发明在医学领域具有重要的应用前景和实际意义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1A为工程菌F1-V/pET-11c表达产物的SDS-PAGE检测结果图1B为工程菌F1-V/pET-11c表达产物的免疫印迹鉴定结果图1C为经纯化的F1-V融合蛋白的SDS-PAGE检测结果图2为经纯化的F1-V融合蛋白的HPLC反相色谱纯度测定色谱3A为不同剂量的F1-V抗原引发的血清抗体水平检测结果图3B为50μgF1-V免疫剂量组的小鼠末次免疫后IgG抗体的亚型分析结果图4A为经IPTG诱导前、后的pCTB/pET-32a表达菌体培养上清和菌体沉淀的SDS-PAGE检测结果图4B为不同浓度咪唑梯度洗脱产物的SDS-PAGE检测结果图5为表达蛋白CTB的Western blotting鉴定结果图6A为鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后血清抗体IgG水平的变化图6B为鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后血清抗体IgA水平的变化图7A和7B为鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后抗体亚型的检测结果图8A-图8D为鼠疫F1-V黏膜疫苗滴鼻免疫后黏膜IgA抗体水平变化的检测结果图9为鼠疫F1-V黏膜佐剂疫苗滴鼻免疫后不同时间血清抗体水平变化的检测结果图10A为鼠疫F1-V黏膜佐剂疫苗滴鼻免疫末次后各佐剂疫苗组小鼠的IgG1和IgG2a水平变化的检测结果图10B为鼠疫F1-V黏膜佐剂疫苗滴鼻免疫末次后各佐剂疫苗组小鼠的IgG1/IgG2a变化的检测结果图11为不同剂量的F1-V对受强毒鼠疫菌攻击小鼠的免疫保护作用的检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成，所有测序工作均由三博远志生物技术有限责任公司协助完成。
实施例1、可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白基因F1-V的获得及其编码蛋白的原核表达一、可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白基因F1-V的获得根据鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1(GenBank号X61996)和鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V(GenBank号M26405)的氨基酸残基序列，以及载体pET-11c(购自Novagen公司)的酶切图谱设计2对引物，分别用于扩增鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1基因片段和鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V基因片段，引物序列如下用于扩增鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1基因片段的引物P1(上游引物)5’-GCCATATGATGAAAAAAATCAGTTCC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Nde III的识别位点)P2(下游引物)5’-CGGAATTCTTATTGGTTAGATACGGT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I的识别位点)；用于扩增鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V基因片段的引物P3(上游引物)5’-CGGAATTCATGATTAGAGCCTACGAA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I的识别位点)P4(下游引物)5’-GCGGATCCTCATTTACCAGACGTGTCA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I的识别位点)。
以鼠疫耶尔森氏菌EV76减毒活疫苗(购自兰州生物制品研究所)为模板，在引物P1和P2的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增获得了长度约为500bp的DNA片段，与预期结果相符，用冻融法回收该目的片段，将其连接入载体pGEM-T(Promega公司)中，再将连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，将此重组质粒命名为pGEM-F1，再对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1基因片段。
再以鼠疫EV76减毒活疫苗为模板，在引物P3和P4的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增获得了1000bp左右的DNA片段，与预期结果相符，用冻融法回收该目的片段，将其连接入载体pGEM-T中，再将连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，将此重组质粒命名为pGEM-V，再对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V基因片段。
最后，将上述PCR扩增的鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1基因和鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V基因用限制性内切酶EcoR I进行酶切后，将两个基因片段的EcoR I酶切产物用T4 DNA连接酶共同连接入载体pET-11c的Nde I和BamH I酶切位点之间，再将连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，将此重组质粒命名为pET-11c-F1-V，再对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1和鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V融合蛋白基因，该融合基因具有序列表中的SEQ ID NO2的核苷酸序列，由1437个碱基组成，其编码框为自5’端第1-1437位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中自5’端第4-450位碱基编码鼠疫耶尔森氏菌膜蛋白F1，自5’端第457-1434位碱基编码鼠疫耶尔森氏菌毒力蛋白V，将该融合基因命名为F1-V，其编码蛋白命名为F1-V。
二、融合蛋白F1-V的原核表达1、工程菌的构建将步骤一构建的质粒pET-11c-F1-V用CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于含0.1mg/L氨苄青霉素的LB平板上进行抗性筛选，长出单克隆后，提质粒，用限制性内切酶Nde I和BamH I进行双酶切鉴定，结果经酶切获得了大小约为1400bp的DNA片段，与预期结果相符，再对其用测序的方法做进一步鉴定，结果序列正确，证明获得了携带有pET-11c-F1-V的工程菌，命名为F1-V/pET-11c。
2、F1-V的原核表达及鉴定挑取步骤1构建的工程菌F1-V/pET-11c，将其接种于5mL LB液体培养基中，在37℃下培养12-24小时，然后再按1∶100的比例将菌液接种于含0.1mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养3-4小时至A600达0.8-1.0，加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，在相同条件下继续培养4小时，同时，以用上述方法培养的pET-11c空载体转化菌作为阴性对照。培养结束后，离心收集菌体，将菌体在冰浴条件下超声破碎，分别收集沉淀和上清，进行12％SDS-PAGE检测，结果如图1A所示(泳道1为表达外源蛋白的细菌原液，泳道2为阴性对照，泳道3为低分子量蛋白Marker)，经表达获得了分子量约为50KD的目的蛋白，与预期结果相符，外源表达的目的蛋白占细菌总蛋白的20％以上。对该目的蛋白用免疫杂交的方法做进一步鉴定，具体方法为在Bio-Rad电转移仪上用半干胶转移法将各蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，然后用1.5％(W/V)的酪蛋白封闭12-24小时，再用按1∶50比例稀释的兔抗鼠的F1-V多抗(按常规方法制备)作为一抗及按1∶800比例稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗抗体(购自Sigma-Aldrich公司)作为二抗进行逐级标记，DAB显色，结果如图1B所示(泳道1为表达外源蛋白的细菌原液，泳道2为阴性对照，泳道3为低分子量蛋白Marker)，结果表达的目的蛋白可与兔抗鼠的F1-V多抗特异结合，证明经表达获得了正确的融合蛋白F1-V。
3、F1-V融合蛋白的色谱柱层析纯化将步骤2大量培养的F1-V/pET-11c工程菌超声裂解，离心留取上清，首先将超声上清用0.8M的硫酸铵处理后通过Source 30Q离子交换层析柱(购自美国GE公司)，再将收集的样品通过HiPrep Butyl FF 16/10疏水层析柱(购自美国GE公司)，然后将收集的样品浓缩后通过Sephadex G-25F脱盐柱(购自美国GE公司)，最后将收集的F1-V融合蛋白进行12％SDS-PAGE检测，结果如图1C所示(泳道1为细菌表达原液，泳道2为阴性对照，泳道3为纯化穿透峰，泳道4-6为经纯化的目的蛋白，泳道7为低分子量蛋白Marker)，经HPLC分析融合蛋白的纯度(色谱柱规格为150×4.6mm，Century SIL BDS C8柱(购自美国GE公司)，粒径为5μm，孔径为300-。流动相A液为0.1％三氟乙酸的5％乙腈水溶液，B液为0.1％三氟乙酸的95％乙腈水溶液，流速为0.7mL/min。)，结果如图2所示(横坐标为时间，纵坐标为280nm下的AU值)，表明获得了纯度较高的F1-V目的蛋白，纯度可达90％以上。
实施例2、以Al(OH)3为佐剂检测F1-V的免疫效果一、血清抗F1-V抗体的效价测定及抗体亚型检测实验分组实施例1获得的经纯化的重组F1-V蛋白+Al(OH)3组及Al(OH)3对照组。
免疫方案将不同剂量的重组融合蛋白抗原与氢氧化铝佐剂混合，使氢氧化铝佐剂的浓度保持在1.2mg/mL，轻轻搅拌过夜(12小时以上)，得到F1-V重组融合蛋白亚单位疫苗候选株。融合蛋白抗原的浓度由每只小鼠的免疫剂量决定，分别为50μg、20μg和10μg/只。采取肌肉注射的方式对小鼠进行免疫。实验组的小鼠于后腿肌肉注射相应剂量的上述氢氧化铝佐剂吸附的融合蛋白抗原，而对照组则注射氢氧化铝(或PBS)。小鼠初次免疫后每隔2周进行相同剂量的加强免疫，共加强免疫3次。
每次免疫后第10天断尾取血分离血清，通过间接ELISA法测定血清中抗F1-V抗体效价。F1-V重组蛋白用包被液稀释后(5μg/mL，每孔100μl)包被酶联板，免疫后血清作为一抗，以HRP标记的二抗IgG、IgG1、IgG2a(均购自美国Bethyl公司)鉴定结合的抗体。用酶标仪在450nm波长处测A值。阳性的判定标准为实验孔A比阴性对照A≥2.1。
间接ELISA法测定不同剂量F1-V重组融合蛋白免疫的小鼠血清，比较每次免疫后450nm波长处测得的A值。按照上述方法测定血清的抗体效价，结果如图3A所示(横坐标为免疫次数，纵坐标为OD450值)，在所有测试的F1-V浓度中，50μg剂量诱导的抗体效价要高于其它两个剂量，50μg免疫剂量组小鼠体内可产生高达102400的IgG抗体效价，而20μg和10μg免疫剂量组小鼠血清中的IgG抗体效价平均为51200，说明高浓度剂量的F1-V蛋白抗原可以刺激产生更高水平的抗原特异性IgG抗体。
其中，50μg剂量组的IgG抗体的亚型分析结果如图3B所示，血清样本来自末次免疫后取血，IgG1效价平均为50000，而IgG2a组的效价平均仅为6000，免疫小鼠的IgG1和IgG2a的比值平均值为5.0，IgG1的数量显著性高于IgG2a(p＜0.01)，说明抗体反应趋向Th2型反应，重组抗原诱导的免疫应答以体液免疫为主。
二、T淋巴细胞的亚型分析采用细胞表面不同抗原分子荧光标记抗体，对上述不同F1-V免疫剂量组的小鼠脾细胞的淋巴细胞亚群进行染色分析，方法为采集小鼠脾淋巴细胞，置于含有5％胎牛血清的完全RPMI-1640培养基中培养。过滤，离心去除上清。加入5mL含有5％胎牛血清的完全RPMI-1640培养基悬浮并洗涤细胞2次，并最终使细胞浓度达到105个/mL。向脾细胞悬浮液中加入FITC-CD3+、PE-CD4+和PerCP-CD8+双染荧光抗体(购自美国Bethyl公司)，4℃避光孵育40min，PBS洗2次，1％多聚甲醛固定，流式细胞仪测定，Cellquest软件分析。
其中，50μg F1-V免疫剂量组的小鼠脾细胞的淋巴细胞亚群的染色分析结果如表1所示，CD4+含量的均值为74.79±1.46％，CD8+含量的均值为21.61±1.25％，CD4+/CD8+均值为3.74±0.25；而对照组(注射氢氧化铝)的CD4+含量、CD8+含量和CD4+/CD8+的均值则分别为62.83±0.37％、33.53±1.26％和1.87±0.18。统计学分析表明，实验组的CD4+/CD8+比值与对照组相比有显著性差异(*表示P＜0.01)，说明脾细胞的T淋巴细胞主要为CD4+细胞，从而主要在小鼠体内引发体液免疫应答。20μg和10μg F1-V免疫剂量组的实验结果与50μg F1-V免疫剂量组相似。
表1 50μg F1-V免疫剂量组的小鼠脾细胞T淋巴细胞的流式细胞分析结果

*P＜0.01实施例3、以霍乱毒素B亚单位(CTB)为佐剂检测F1-V的粘膜免疫效果一、重组CTB的获得1、CTB基因的扩增根据基因文库中提供的CTB基因序列(AY804244，序列表中的SEQ ID NO3)设计引物，引物序列如下P5(上游引物)5′-GGCGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3′(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点)P6(下游引物)5′-GGCAAGCTTTTAATTTGCCATACTTAATA-3′(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)以埃尔托霍乱弧菌稻叶血清型(购自中国药品生物制品检定所)的基因DNA组为模板，在引物P5和P6的引导下，PCR扩增CTB基因，扩增结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR扩增获得了约375bp的DNA片段，与预期结果相符，用冻融法回收该目的片段，将其连接入载体pGEM-T中，再将连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，将此重组质粒命名为pGEM-CTB，再对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的CTB基因。
2、CTB原核表达载体及工程菌的构建用限制性内切酶BamH I和Hind III对pGEM-CTB进行双酶切，回收约375bp的目的片段，将回收片段与经相同酶双酶切的载体pET-32a(+)(Novagen公司)用T4 DNA连接酶连接16h，再将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于含0.1mg/L氨苄青霉素的LB平板上进行抗性筛选，长出单克隆后，在引物P5和P6的引导下进行菌落PCR鉴定，结果经PCR扩增获得了约375bp的DNA片段，与预期结果相符。再提取阳性克隆的质粒，用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切鉴定，与预期结果相符。最后用测序的方法做进一步鉴定，结果序列正确，证明获得了携带有CTB基因的工程菌，命名为CTB/pET-32a，将CTB基因的原核表达载体命名为pET-CTB。
3、CTB的原核表达挑取步骤2构建的工程菌CTB/pET-32a，将其接种于5mL LB液体培养基中，在30℃下培养12-24小时，然后再按1∶100比例将菌液接种于含0.1mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养至A600达0.4-0.6，加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，在相同条件下继续培养约4.5小时。培养结束后，8000rpm离心15min收集菌体，将菌体在冰浴条件下超声破碎，12000rpm离心10min，分别收集沉淀和上清，进行15％SDS-PAGE检测，结果如图4A所示(泳道M.蛋白分子量标准；泳道1.IPTG诱导前的CTB/pET-32a；泳道2.IPTG诱导后的CTB/pET-32a；泳道3.经IPTG诱导后的pCTB/pET-32a的培养上清；泳道4.经IPTG诱导后的pCTB/pET-32a细菌沉淀)，结果经表达获得了34KD的目的蛋白，与预期结果相符。
4、表达产物的纯化及ELISA鉴定用Hitrap HP亲和层析柱(购自GE公司)对步骤3获得的表达产物进行纯化，洗脱液为浓度分别为15％、25％、40％、50％、60％、70％和80％的咪唑溶液，然后对不同浓度咪唑的梯度洗脱产物进行15％SDS-PAGE检测，检测结果如图4B所示(泳道1-7分别为亲和层析中咪唑浓度分别为15％、25％、40％、50％、60％、70％和80％的梯度洗脱的CTB蛋白样品)，表明获得了纯度较高的CTB蛋白，分子量约为34KD。再对纯化蛋白进行ELISA鉴定，方法为用牛GM1(购自Sigma公司)包被酶标板，然后加入纯化的重组蛋白，重复3孔，以CTB免疫家兔获得的多抗血清为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG(Jackson Immuno Research)为二抗，以邻苯二胺为底物进行显色反应，测定490nm的吸光值，以不加重组蛋白的作为阴性对照，重复3孔。检测结果表明重组蛋白可与兔抗CTB多抗特异结合，证明经表达获得了正确的CTB蛋白。
5、表达产物的免疫印迹鉴定对步骤3获得目的蛋白用免疫印迹(Western blotting)的方法做进一步鉴定，具体方法为在Bio-Rad电转移仪上用半干胶转移法将各蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，然后用5％(W/V)的脱脂奶粉封闭2小时，PBST振洗3次(每次5min)，加入兔抗CTB多抗血清(一抗)作用2小时，PBST振洗3次(每次5min)，再加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(购自Sigma公司，二抗)作用2小时，DAB显色。结果如图5所示(泳道M.蛋白分子量标准，泳道1.兔抗霍乱毒素血清抗体特异性结合原核系统表达的CTB蛋白)，结果表达的目的蛋白可与兔抗CTB多抗特异结合，证明经表达获得了正确的CTB蛋白。
二、以CTB为佐剂检测F1-V的粘膜免疫效果选取8周龄的雌性Balb/C小鼠为实验动物，乙醚轻度麻醉后通过鼻腔吸入按5∶2、5∶1、1∶1、1∶2和1∶5不同比例混合的F1-V融合蛋白和CTB，以PBS、CTB为对照组，分别于免疫后第0、7、14、21天摘除眼球放血，收集血清。然后暴露小鼠的气管，从喉头部位切开，用EP吸头从喉头插入，以0.6mL PBS(含有1％牛血清白蛋白)注入小鼠的下呼吸道，反复冲洗3次，制备肺冲洗液。用ELASA法检测血清和肺冲洗液的IgG和IgA，并进行抗体亚型分类和T细胞亚群分类。
1、小鼠血清总IgG和IgA水平的测定用rCTB与鼠疫F1-V重组蛋白制备的黏膜疫苗滴鼻初次免疫后10d各组小鼠均可检测到特异性抗体产生，4次免疫后抗体水平明显升高。小鼠血清IgG、IgA抗体水平的检测结果如图6A和图6B所示，黏膜疫苗各组均能使小鼠血清IgG、IgA抗体水平显著高于F1-V组(P＜0.01)，而且各个疫苗组间也有差异，其中，5∶1疫苗组和1∶2疫苗组的免疫应答水平最强。可见，rCTB佐剂能显著提高鼠疫F1-V重组蛋白黏膜疫苗的体液免疫应答水平。rCTB不仅可增强系统的IgG抗体水平，而且可显著提高全身的IgA抗体水平。
2、抗体亚型分类用rCTB与鼠疫F1-V重组蛋白制备的黏膜疫苗滴鼻第四次免疫后采集血清进行抗体亚类分析。结果如图7A和图7B所示，疫苗组小鼠的IgG1水平远远高于IgG2a水平，说明黏膜疫苗组小鼠的特异性抗体是以IgG1为主，趋向Th2型反应；而各疫苗组中，5∶1疫苗组IgG1/IgG2a显著高于其它3组，说明F1-V抗原与黏膜佐剂5∶1比例的疫苗引起的Th2型反应更加强烈。
3、小鼠呼吸道、消化道、生殖道特异性sIgA的测定结果鼠疫F1-V重组蛋白黏膜疫苗滴鼻免疫四次后，黏膜冲洗液检测结果如图8A-图8D所示(纵坐标为OD450nm值，横坐标为按5∶2、5∶1、1∶1、1∶2不同比例混合的F1-V融合蛋白和CTB，以及PBS和F1-V实验组)，其中，图8A为小鼠肺冲洗液中IgA抗体变化的检测结果，图8B为小鼠鼻咽冲洗液中IgA抗体变化的检测结果，图8C为小鼠阴道冲洗液中IgA抗体变化的检测结果，图8D为小鼠小肠冲洗液中IgA抗体变化的检测结果，黏膜疫苗组小鼠肺冲洗液中产生较高sIgA的水平，但比F1-V抗原组无显著性差异(P＞0.05)；在鼻咽喉冲洗液中在1∶25效价时疫苗组检测到sIgA，但各疫苗组比F1-V抗原组无显著性差异(P＞0.05)；消化道小肠冲洗液中疫苗组sIgA显著高于F1-V组(P＜0.01)，并且1∶1疫苗组和1∶2疫苗组极显著高于其它疫苗组；在生殖道阴道冲洗液中，疫苗组sIgA比F1-V组有显著差异(P＜0.01)，并且5∶1和5∶2组的sIgA显著高于其它疫苗组(P＜0.01)。结果说明，rCTB可使鼠疫F1-V重组蛋白抗原诱导呼吸道、消化道和生殖道黏膜分泌型IgA抗体，使疫苗有效诱导局部黏膜的免疫应答。
采用细胞表面的不同抗原分子荧光标记抗体(所用抗体均购自美国BD公司)，对不同免疫组小鼠SP、NA、PP、MLN中的淋巴细胞亚群进行染色分析。结果如表2所示，在SP中各疫苗组CD4+/CD8+细胞比值比F1-V组显著降低(P＜0.01)，而F1-V组比PBS对照组显著升高；但在NA和PP各疫苗组CD4+/CD8+细胞比值比F1-V组无显著差异(P＞0.05)，但比PBS正常组显著升高(P＜0.01)；在MLN中CD4+/CD8+细胞比值比PBS对照差异无显著性。结果说明，单独滴鼻免疫F1-V蛋白会引起局部鼻黏膜相关组织、小肠PP结和脾脏中CD4+细胞显著增加，免疫应答趋向Th2型反应；但是加有rCTB佐剂的疫苗组，脾脏中的CD8+细胞会显著升高，表明rCTB佐剂也能使疫苗增强脾脏的细胞免疫水平，所以rCTB佐剂既有Th1型又有Th2型免疫应答。
表2 鼠疫F1-V重组蛋白疫苗滴鼻免疫4次后T细胞表型变化

实施例4、粘膜佐剂Protollin的制备及以其为佐剂检测F1-V的免疫效果一、LPS的提取及检测1、LPS的提取采用热酚水法提取减毒痢疾菌的LPS，具体方法包括以下步骤1)将减毒痢疾菌用普通营养琼脂(潘劲草，黄志成，余文炳等，中国人兽共患病杂志，1999，15(3)59-61)培养24h，收集菌体，用灭菌生理盐水适量洗1-2次，3000rpm离心30min，沉淀称湿重。
2)将细菌收集物按每克加3mL蒸馏水进行悬浮，然后反复冻融3-5次。每250mL菌液加45％酚水作用5min，再加等量的95％酚，在68℃下水浴30min，水浴过程中不断搅拌，然后冷却至约10℃，7000rpm离心45min，分为三层上层水相LPS，中层为变性蛋白，下层为沉淀。小心吸取上层水相，下层沉淀依上法反复提取，至少2次。
3)将总的水层溶液装透析袋，流水冲洗48h，然后用蒸馏水透析2天，每天换水6-10次。
4)用聚乙二醇2000浓缩，提取液中加DNAase 50ug/mL和RNAase 50ug/mL，在37℃下作用4h，100℃水浴10min，冷却至室温，1500rpm离心30min，弃沉淀，收集上清，4℃保存。
2、LPS的脱毒称取冻干的步骤一提取的LPS 66mg，溶于14.5mL 0.1M NaOH中，60℃水浴3h，再用等体积的乙酸中和NaOH，加入5倍体积的冷无水乙醇沉淀，7000rpm离心30min，收集沉淀，再用冷无水乙醇洗2次，用无菌蒸馏水溶解，在4℃下用100体积的蒸馏水透析12-24小时。
3、LPS的检测A.脱毒检测对LPS进行14％SDS-PAGE，银染，再用免疫双扩散试验进行脱毒检测，结果表明福氏2a痢疾杆菌LPS经脱毒得到LPS中不含类脂A部分。
B.蛋白质含量的测定用牛血清白蛋白为标准蛋白，系列稀释，具体操作见BCA法试剂盒(购自碧云天)，然后做标准曲线，测出LPS提取物560nm的OD值，从标准曲线找出其蛋白含量。结果蛋白含量为0.028mg/mL。
C.糖含量的测定①标准曲线的绘制分别取100mg/L葡萄糖溶液0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mL，用蒸馏水补足到1mL，再加入3mL蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待每只试管均加完后，一起浸入沸水浴中维持10min，取出，用自来水冲冷，室温下平衡约10min，用分光光度测定620nm的OD值，然后用重蒸水为空白进行比色，绘制标准曲线；②测定LPS糖含量取1mL提取的LPS加入3mL蒽酮试剂(称取蒽酮溶于浓硫酸(AR95-98％)，使其终浓度为2g/L)，迅速浸入冰水中冷却，然后浸入沸水浴中维持10min，取出用自来水冲冷，室温下平衡约10min，再用测定620nm的OD值，用重蒸水为空白进行比色，然后根据标准曲线中得到糖含量。结果糖含量为0.484mg/ml，符合标准。
D.核酸含量测定取一定量的LPS用紫外分光光度仪测定在260nm和280nm波长处吸光度，根据DNA浓度＝OD260×稀释倍数×50/1000(μg/ul)RNA浓度＝OD280×稀释倍数×40/1000(μg/ul)计算核酸含量。结果核酸含量为0.846％，核酸含量低于1％，符合标准。
E.异常毒性试验取Balb/c小鼠10只，体重18-22g，分两组，每组5只，分别腹腔注射0.5m含1mg、2mg的LPS，注射前称取每只小鼠体重，观察7天。结果小鼠观察期间全部健存，无异常反应，观察结束时每只小鼠体重增加，合格。
上述检测结果表明所提取的LPS符合标准，可作为佐剂使用。
二、蛋白体(Proteosome)的提取和纯化1、脑膜炎球菌的培养按常规方法对脑膜炎奈瑟氏菌B群2b型脑膜炎球菌(购于中国药品生物制品检定所，菌号29353)进行复苏、接种和培养。在培养过程中和杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。培养物于对数生长期后或静止期前期收获。将培养物加入苯酚杀菌，以确保杀菌安全并不损伤菌体蛋白体为宜。
2、外膜蛋白复合物的制备取培养菌液，用0.5％的苯酚灭活2小时，8000rpm离心20min收集菌体，悬浮用0.15M NaCl，8000rpm离心20min，弃上清；将菌体用1V(相同菌体体积)的1M的乙酸钠缓冲液(pH 5.0)和9V的6％Empigen BB(EBB)的1M的CaCl2悬浮，加入乙醇使终浓度为20％，在室温搅拌1h。12000rpm离心10min，弃沉淀。在上清中加入乙醇终浓度为45％，12000rpm离心10min，收集沉淀。溶解在1％E的TEEN(0.15M的NaCl，0.01M的EDTA，0.05M的Tris·HCl，pH 8.0)中，12000rpm离心10min，弃去不溶的物质，得到外膜蛋白复合物。
3、外膜蛋白的纯化将外膜蛋白复合物溶解在1％EBB的TEEN，短暂超声，12000rpm离心20min，弃沉淀，再重复上述步骤一次，加入50％硫酸铵，搅拌混匀，直到完全溶解，室温放置1h，然后12000rpm离心20min，将沉淀溶解在1％EBB的TEEN中(1-2mg/mL)，用20V的含0.1％EBB的TEEN透析，换4次液，除去硫酸铵，15000rpm离心20min，将上清依次用孔径为0.45um、0.22um的滤膜过滤，再用0.22um的滤膜在无菌条件下过滤，-70℃储存。
4、外膜蛋白鉴定对步骤3纯化的蛋白体进行下述鉴定1)HPLC和非还原SDS-PAGE鉴定，结果纯度大于90％；2)电镜观察或扫描大小为60-300nm的球形囊泡；3)核酸含量检测，结果含量低于1％；4)用微量测磷含量的方法检测荚膜多糖的含量，结果低于1％；5)异常毒性试验，结果该蛋白无毒，安全性较高；6)稳定性检测，各取4份浓度为2.0mg/mL的蛋白体，分别放置在-70℃、-20℃、4℃和25℃4种温度条件下，分别在1周、2周、4周和8周取一定量，检测蛋白体的浓度，用SDS-PAGE检测纯度变化，结果4种条件下不同时间检测蛋白体的稳定性在量和性上都没有变化；7)蛋白体组分鉴定，将蛋白体进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色，从胶上切取蛋白体的三条带，用胰蛋白酶酶切，待测定的蛋白质样品送国家生物医学分析中心经MALDI-TOF-MS，使用Matrixscience-Macot数据库搜索，进行蛋白体组分的定性鉴定，结果证明，这三个蛋白分别是脑膜炎B群2b型奈瑟氏双球菌外膜蛋白的PorA、PorB和Class 4孔道膜蛋白。上述检测结果表明用上述方法获得的蛋白体符合标准，可作为佐剂使用。
三、粘膜佐剂Protollin的制备将去毒的LPS溶于TEEN缓冲液中，无菌过滤除菌，将LPS溶液与等量的蛋白体混合，加入4倍体积的冷无水乙醇，沉淀混合物，收集沉淀，再用无水乙醇洗3次，最后用无菌蒸馏水溶解，用超声仪温和超声，使蛋白体与LPS相互结合和溶解，将可溶的溶液10000rpm离心10min，去除不可溶的物质，得到粘膜佐剂，命名为Protollin。
四、粘膜佐剂Protollin及F1-V的免疫效果检测动物8-10周龄的雌性BALB/c小鼠。
免疫方案分四组，具体免疫方案见表3(将F1-V重组蛋白与佐剂按4∶1在4℃下疏水混合)。
表3 Protollin佐剂疫苗滴鼻免疫方案

1、小鼠血清总IgG水平的检测用proteosome，LPS和Protollin与F1-V重组蛋白制备的粘膜疫苗滴鼻免疫后不同时间各组小鼠的血清特异性抗体的变化如图9所示(横坐标为免疫时间，纵坐标为抗体效价)，F1-V组、proteosome组和Protollin组血清IgG抗体水平随时间变化显著增强，而且proteosome组和新型佐剂组显著高于F1-V组(P＜0.01)，Protollin佐剂组显著高于proteosome组(P＜0.01)，LPS组血清IgG抗体水平随时间变化血清特异性抗体无显著差异，表明Protollin佐剂比proteosome佐剂更显著提高鼠疫F1-V重组蛋白粘膜疫苗的系统免疫应答。
2、抗体亚型分类用proteosome，LPS和Protollin与F1-V重组蛋白制备的粘膜疫苗第四次免疫后采集血清进行抗体亚类分析，各佐剂疫苗组小鼠的IgG1和IgG2a水平的检测结果如图10A所示，各佐剂疫苗组小鼠的IgG1水平显著高于IgG2a水平，说明粘膜疫苗组小鼠的特异性抗体是以IgG1为主，趋向Th2型反应。各佐剂疫苗组小鼠的IgG1/IgG2a的统计结果如图10B所示，proteosome，LPS和Protollin佐剂疫苗组IgG1/IgG2a显著低于F1-V组，说明proteosome，LPS和Protollin佐剂疫苗组产生的IgG1抗体水平显著低于F1-V抗原组。
3、小鼠血清IgA和呼吸道、消化道、生殖道特异性sIgA的测定用proteosome，LPS和Protollin佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白制备的粘膜疫苗滴鼻第四次免疫后，粘膜抗体水平检测结果见表4，粘膜疫苗组中Proteosome佐剂组和Protollin佐剂组小鼠能产生较高的血清IgA，而且显著高于F1-V组(P＜0.01)。Proteosome佐剂组和Protollin佐剂组肺冲洗液和阴道冲洗液中产生较高的IgA抗体，显著高于F1-V组。在鼻咽喉冲洗液中和小肠冲洗液中没有检测到IgA，与F1-V组无显著差异(P＞0.01)。上述检测结果表明，Protollin佐剂与Proteosome佐剂作用相同，可使鼠疫F1-V重组蛋白抗原诱导呼吸道和生殖道粘膜分泌型IgA抗体，可使疫苗有效诱导局部免疫应答。
表4 鼠疫F1-V重组蛋白粘膜疫苗滴鼻免疫4次后粘膜IgA的抗体变化


*P＜0.01，和F1-V抗原组比较4、淋巴细胞亚群分析采用细胞表面的不同抗原分子荧光标记抗体，对用proteosome、LPS和Protollin佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白制备的粘膜疫苗免疫组小鼠SP中的淋巴细胞亚群进行染色分析，结果见表5，在SP中LPS和Protollin佐剂疫苗组CD4+、CD8+细胞及CD4+/CD8+比PBS对照组显著降低(P＜0.01)，而F1-V组比PBS对照组显著升高，说明单独滴鼻免疫F1-V蛋白会引起脾脏中CD4+细胞显著增加，免疫应答趋向Th2型反应；但是加有LPS和Protollin佐剂的疫苗组，脾脏中的CD8+细胞会相对升高，表明LPS和Protollin佐剂能使疫苗增强机体的细胞免疫水平。
表5 鼠疫F1-V重组蛋白疫苗滴鼻免疫4次后T细胞表型变化

5、小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验对用proteosome，LPS和Protollin佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白制备的粘膜疫苗用MTT法进行小鼠脾脏淋巴细胞增殖试验，免疫组小鼠以ConA+组与ConA-组的A570值的比值(即为刺激指数SI)表示淋巴细胞的增殖能力。检测结果见表6，表明用proteosome，LPS和Protollin佐剂与鼠疫F1-V重组蛋白制备的粘膜疫苗对小鼠脾细胞在体外有促进生长和增殖能力。
表6 ConA刺激的鼠疫F1-V重组蛋白疫苗免疫小鼠脾细胞增殖(A570值)

实施例5、F1-V鼠疫疫苗粘膜佐剂的筛选试验将CTB佐剂的F1-V鼠疫疫苗、可生物降解F1-V鼠疫微球疫苗和蛋白体F1-V鼠疫疫苗及蛋白体联合CTB佐剂的F1-V鼠疫疫苗进行动物试验，以检测各佐剂的免疫保护效果。取Balb/C小鼠60只，随即分为6组，每组10只，免疫分组及其免疫方案见表5，免疫方法将小鼠乙醚轻度麻醉后，通过鼻腔吸入不同粘膜佐剂的上述F1-V鼠疫疫苗，以PBS为对照组，免疫后14天加强免疫一次，共免疫三次。结果如表7所示，氢氧化铝佐剂组、蛋白体组、蛋白体/CTB联合组可至少对200LD50耶尔森氏菌141强毒株的皮下攻毒产生100％的保护；CTB同样条件下的保护率仅为60％，而可生物降解鼠疫微球疫苗组则只有40％，PBS对照组小鼠全部死亡。这说明，蛋白体是一种很好的鼠疫黏膜疫苗佐剂。
表7 鼠疫F1-V疫苗粘膜佐剂筛选试验的分组及其免疫剂量

实施例6、强毒鼠疫菌攻毒试验检测不同剂量的F1-V对受强毒鼠疫菌攻击小鼠的免疫保护作用，试验分注射攻毒试验和气溶胶攻毒试验，实验F1-V剂量分别为10、20、50μg具体试验方法如下一、注射攻毒试验对免疫后的小鼠2周内用鼠疫耶尔森氏菌141强毒株(保存于中国疾病预防控制中心)进行皮下攻毒，攻毒剂量为25-600LD50。记录小鼠死亡时间。
实验组和对照组小鼠在末次免疫两周后用鼠疫耶尔森氏菌141强毒株进行皮下攻毒实验，观察60天以上，记录小鼠存活情况，并计算平均死亡时间(MTD)。存活率统计结果如图11所示，50μg剂量组的小鼠相对其它两个剂量组的小鼠对鼠疫强毒株的皮下攻毒有更好的保护性。20μg的剂量足以使小鼠对400LD50的鼠疫耶尔森氏菌141强毒株产生完全的保护，这表明，结合经济性和有效性，20μg剂量是最合适的。10μg的剂量只能对100LD50的鼠疫耶尔森氏菌141强毒株产生100％的保护，当攻毒剂量升高时，这个剂量产生的保护率急剧下降，然而，与对照组相比，皮下攻毒后的平均死亡时间被显著的延迟。比如，在200LD50的攻毒剂量下，10μg剂量的小鼠平均死亡时间为13.6±0.4，而PBS对照组则为3.6±0.6。实验结果表明本发明的融合蛋白F1-V对受强毒鼠疫菌皮下攻击小鼠(腺鼠疫模型)具有较好的免疫保护作用。
二、气溶胶攻毒试验试验分5组F1-V组，F1组，V组，F1+V组和对照组。先对小鼠按组别接种上述不同蛋白，接种量为20ug/只，免疫后14天加强免疫一次，共免疫4次，对照组不接种，对免疫后的小鼠2周内用鼠疫耶尔森氏菌141强毒株进行皮下攻毒，攻毒剂量为400LD50，观察25天内动物死亡情况。结果经四次免疫后，抗原接种组接受高达400LD50强毒鼠疫菌攻击小鼠的健康状况良好，体重正常增加，注射部位无脱毛、硬结等异常表现，而对照组10只小鼠在6-16天内相继死亡，实验组数据结果见表8，该实验结果进一步证明本发明的融合蛋白F1-V对受强毒鼠疫菌气溶胶攻击小鼠(肺鼠疫模型)具有较好的免疫保护作用。
表8 气溶胶攻毒试验数据

序列表<160>3<210>1<211>478<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Met Ala Asp Leu Thr Ala Ser Thr Thr Ala Thr Ala Thr Leu Val Glu1 5 10 15Pro Ala Arg Ile Thr Leu Thr Tyr Lys Glu Gly Ala Pro Ile Thr Ile20 25 30Met Asp Asn Gly Asn Ile Asp Thr Glu Leu Leu Val Gly Thr Leu Thr35 40 45Leu Gly Gly Tyr Lys Thr Gly Thr Thr Ser Thr Ser Val Asn Phe Thr50 55 60Asp Ala Ala Gly Asp Pro Met Tyr Leu Thr Phe Thr Ser Gln Asp Gly65 70 75 80Asn Asn His Gln Phe Thr Thr Lys Val Ile Gly Lys Asp Ser Arg Asp85 90 95Phe Asp Ile Ser Pro Lys Val Asn Gly Glu Asn Leu Val Gly Asp Asp100 105 110Val Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp Phe Phe Val Arg Ser Ile Gly115 120 125Ser Lys Gly Gly Lys Leu Ala Ala Gly Lys Tyr Thr Asp Ala Val Thr130 135 140Val Thr Val Ser Asn Gln Glu Phe Met Ile Arg Ala Tyr Glu Gln Asn145 150 155 160Pro Gln His Phe Ile Glu Asp Leu Glu Lys Val Arg Val Glu Gln Leu165 170 175Thr Gly His Gly Ser Ser Val Leu Glu Glu Leu Val Gln Leu Val Lys180 185 190Asp Lys Asn Ile Asp Ile Ser Ile Lys Tyr Asp Pro Arg Lys Asp Ser195 200 205Glu Val Phe Ala Asn Arg Val Ile Thr Asp Asp Ile Glu Leu Leu Lys210 215 220
Lys Ile Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Glu Asp Ala Ile Leu Lys Gly Gly225 230 235 240His Tyr Asp Asn Gln Leu Gln Asn Gly Ile Lys Arg Val Lys Glu Phe245 250 255Leu Glu Ser Ser Pro Asn Thr Gln Trp Glu Leu Arg Ala Phe Met Ala260 265 270Val Met His Phe Ser Leu Thr Ala Asp Arg Ile Asp Asp Asp Ile Leu275 280 285Lys Val Ile Val Asp Ser Met Asn His His Gly Asp Ala Arg Ser Lys290 295 300Leu Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Thr Ala Glu Leu Lys Ile Tyr Ser305 310 315 320Val Ile Gln Ala Glu Ile Asn Lys His Leu Ser Ser Ser Gly Thr Ile325 330 335Asn Ile His Asp Lys Ser Ile Asn Leu Met Asp Lys Asn Leu Tyr Gly340 345 350Tyr Thr Asp Glu Glu Ile Phe Lys Ala Ser Ala Glu Tyr Lys Ile Leu355 360 365Glu Lys Met Pro Gln Thr Thr Ile Gln Val Asp Gly Ser Glu Lys Lys370 375 380Ile Val Ser Ile Lys Asp Phe Leu Gly Ser Glu Asn Lys Arg Thr Gly385 390 395 400Ala Leu Gly Asn Leu Lys Asn Ser Tyr Ser Tyr Asn Lys Asp Asn Asn405 410 415Glu Leu Ser His Phe Ala Thr Thr Cys Ser Asp Lys Ser Arg Pro Leu420 425 430Asn Asp Leu Val Ser Gln Lys Thr Thr Gln Leu Ser Asp Ile Thr Ser435 440 445Arg Phe Asn Ser Ala Ile Glu Ala Leu Asn Arg PheIle Gln Lys Tyr450 455 460Asp Ser Val Met Gln Arg Leu Leu Asp Asp Thr Ser Gly Lys465 470 475<210>2<211>1437<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2atggcagatt taactgcaag caccactgca acggcaactc ttgttgaacc agcccgcatc 60actcttacat ataaggaagg cgctccaatt acaattatgg acaatggaaa catcgataca120gaattacttg ttggtacgct tactcttggc ggctataaaa caggaaccac tagcacatct180gttaacttta cagatgccgc gggtgatccc atgtacttaa catttacttc tcaggatgga240aataaccacc aattcactac aaaagtgatt ggcaaggatt ctagagattt tgatatctct300cctaaggtaa acggtgagaa ccttgtgggg gatgacgtcg tcttggctac gggcagccag360gatttctttg ttcgctcaat tggttccaaa ggcggtaaac ttgcagcagg taaatacact420gatgctgtaa ccgtaaccgt atctaaccaa gaattcatga ttagagccta cgaacaaaac480ccacaacatt ttattgagga tctagaaaaa gttagggtgg aacaacttac tggtcatggt540tcttcagttt tagaagaatt ggttcagtta gtcaaagata aaaatataga tatttccatt600aaatatgatc ccagaaaaga ttcggaggtt tttgccaata gagtaattac tgatgatatc660gaattgctca agaaaatcct agcttatttt ctacccgagg atgccattct taaaggcggt720cattatgaca accaactgca aaatggcatc aagcgagtaa aagagttcct tgaatcatcg780ccgaatacac aatgggaatt gcgggcgttc atggcagtaa tgcatttctc tttaaccgcc840gatcgtatcg atgatgatat tttgaaagtg attgttgatt caatgaatca tcatggtgat900gcccgtagca agttgcgtga agaattagct gagcttaccg ccgaattaaa gatttattca960gttattcaag ccgaaattaa taagcatctg tctagtagtg gcaccataaa tatccatgat 1020aaatccatta atctcatgga taaaaattta tatggttata cagatgaaga gatttttaaa 1080gccagcgcag agtacaaaat tctcgagaaa atgcctcaaa ccaccattca ggtggatggg 1140agcgagaaaa aaatagtctc gataaaggac tttcttggaa gtgagaataa aagaaccggg 1200gcgttgggta atctgaaaaa ctcatactct tataataaag ataataatga attatctcac 1260tttgccacca cctgctcgga taagtccagg ccgctcaacg acttggttag ccaaaaaaca 1320actcagctgt ctgatattac atcacgtttt aattcagcta ttgaagcact gaaccgtttc 1380attcagaaat atgattcagt gatgcaacgt ctgctagatg acacgtctgg taaatga 1437<210>3<211>375<212>DNA<213>埃尔托霍乱弧菌<400>3atgattaaat taaaatttgg tgtttttttt atagttttac tatcttcagc atatgcacat 60ggaacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaagacc acaacacaca aatacatacg120ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc180attactttta agaatggtgc aacttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat240tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa300gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt360agtatggcaa attaa 37权利要求
1.激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加可激发机体对鼠疫产生免疫力的蛋白质。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；3)与序列表中SEQ ID NO2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且在激发机体产生鼠疫免疫力中起重要作用的核苷酸序列；4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
5.一种表达权利要求1所述的激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白的方法，是将含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白。
6.一种预防性鼠疫疫苗，其活性成分为权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的基因。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于向所述疫苗中添加Al(OH)3、CTB、LPS和蛋白体中的一种或多种佐剂。
8.根据权利要求6或7所述的疫苗，其特征在于所述佐剂为LPS和蛋白体的混合型佐剂，其制备方法为将去毒的LPS溶于TEEN缓冲液中，无菌过滤除菌，将LPS溶液与等量的蛋白体混合，加入3-5倍体积的冷无水乙醇，收集沉淀，用无水乙醇洗涤，最后用无菌蒸馏水溶解沉淀，超声，去除不可溶的物质，得到混合型佐剂。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于所述LPS来源于减毒痢疾菌或减毒大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因与其在制备鼠疫疫苗中的应用。该融合蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)将序列表中SEQ ID NO1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加可激发机体对鼠疫产生免疫力的蛋白质。实验证明，该融合蛋白可激发动物机体产生特异性抗体，对鼠疫菌具有较好的免疫保护效果，可用于鼠疫的预防和治疗中。该融合蛋白稳定、制备方法简便易行，可应用于大规模工业化生产。本发明在医学领域具有重要的应用前景和实际意义。
文档编号A61P31/00GK101062951SQ20071009914
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者王栋, 邢丽, 王希良 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所