治疗心血管疾病的蜚蠊提取物、制备方法和其组合物的制作方法

专利名称：：治疗心血管疾病的蜚蠊提取物、制备方法和其组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种应用于心血管领域的提取物、制备方法以及其组合物，尤其涉及以蜚蠊为药物来源的应用于心血管领域的提取物、制备方法和含有该提取物和可药用载体的组合物。技术背景蜚蠊，俗称蟑螂，又称石姜、负盘、滑虫、茶婆虫、香娘子等。属于昆虫纲，蜚蠊目，全世界大约有2300种，多分布在热带及温带地区。常见种类中有德国小蠊、东方蜚蠊、澳洲大蠊、美洲大蠊等。蜚蠊体呈长椭圆形，背腹扁平。头小而灵活，隐于前胸下，并斜向后下方伸出。口器为典型的咀嚼式口器，触角丝状，细长多节，其长度多等于体长或长过其体。复眼一对，由于环绕在触角的外方，故呈肾脏形，单眼两个或没有。前胸发达呈盾形，盖住头部。翅发达，前翅革质，成为复翅；后翅膜质。足细长，适于疾走。蜚蠊属于传统的药材，《本草纲目》中药用记载蜚蠊，气味咸、寒、有毒。主治瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉。但是，蜚蠊自身有毒，传统的给药方式不能尽发挥蜚蠊的药物功效。随着现代医药研究科技的发展，人类看到了蜚蠊具有极高的药用价值，专利申请号为CN94108943.6(公开号CN1116931，申请日为1994年8月14日)，专利申请号为CN03100149.1(公开号CN1424052，申请日为2003年1月7日)，专利号为CN03125189.7(公开号为CN1548147申请日为2003年5月12日)，专利号为CN94118839.6(公开号CN1124141，申请日为1994年12月9日)等中国专利，报道蜚蠊提取物具有治疗肝炎活性、治疗老年性痴呆和抗衰老活性、还有治疗心衰、升高血压的活性。蜚蠊逐渐成为医药领域的关注的热点，但其活性物质研究和活性组合物的制备工艺研究并没有得到相应的发展，对蜚蠊有效组分认知不确切，提取工艺水平低，工艺繁杂，导致蜚蠊的药物制剂的制备不适应大生产的要求，没有使蜚蠊的医药价值得到充分应用。
发明内容本发明提供一种应用于心血管领域，从蜚蠊获得的提取物，可通过以下方法制备A、以水和乙醇和/或甲醇为提取溶媒，将蜚蠊粉碎，其中乙醇和/或甲醇水溶液体积浓度0《V/V《60%;B、调pH至3—5;匀浆；C、密闭，静置；使蜚蠊充分浸泡；在0—15"C固液分离，取上清液；D、加热液体至微沸，调pH值，除去蛋白质；E、截取分子量lOOKDa以下的物质。上述制备方法中步骤A中提取溶媒为水和乙醇和/或甲醇，表示提取溶媒为水、乙醇水溶液、甲醇水溶液或甲醇和乙醇混合的水溶液。当V/V=0时，表示提取溶媒为水。当V/V=60%时，表示乙醇水溶液或甲醇水溶液的体积浓度为60%或乙醇和甲醇混合液的水溶液体积浓度为601上述制备方法中步骤C，通过调节pH值，使溶液中的蛋白质溶胶不稳定，除去提取物中的蛋白质。这种方法不会使分子量较小的生物活性肽溶解度变小，不会导致生物活性肽沉淀，故本发明的提取物中含有生物活性肽。本发明的蜚蠊可选用多种蜚蠊类的昆虫，本发明优选美洲大蠊。本发明所述蜚蠊提取物主要包含生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基和粘氨酸。本发明所述蜚蠊提取物含有腺嘌呤核苷，即提取物含有生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基、粘氨酸和腺嘌呤核苷。本发明所述蜚蠊提取物还可以含有尼可酸，即提取物含有生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基、粘氨酸和尼可酸；或者生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基、粘氨酸、腺嘌呤核苷和尼可酸。本发明所述蜚蠊提取物还可以含有氨基乙酸，即提取物含有生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基、粘氨酸和氨基乙酸；或者生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基、粘氨酸、腺嘌呤核苷和氨基乙酸；或者生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基、粘氨酸、腺嘌呤核苷、尼可酸和氨基乙酸。本发明所述的生物活性肽为一系列小分子低聚肽，由二个氨基酸以上，五十个氨基酸以下通过酰胺键连接的聚合物构成。分子量段在O.18—lKDa之间。本发明所述的酸性粘多糖是指将蛋白质变性分离，截留100KDa以下的物质。它具有一种重复双糖结构，含有糖醛酸和氨基糖残基，分子中的羧基或硫酸基与糖的氧原子相连或与氨基己糖的氨基氮原子相连。本发明所述的复合核苷碱基是核酸降解后的一类产物，实验中发现其含有尿嘧啶和次黄嘌呤。本发明所述的粘氨酸是糖衍生物结合氨基酸而形成的一类物质，在酸性条件下，加热可水解为氨基酸和糖类衍生物。本发明提供了一种蜚蠊提取物的制备方法，该制备方法包含以下歩骤-A、将蜚蠊粉碎，加入2—5倍量的水和乙醇和/或甲醇，进一步细化使蜚蠊细胞破裂，其中乙醇和/或甲醇水溶液体积浓度0《V/V《60%;B、调pH至3—5;匀浆；C、密闭，静置；使蜚蠊充分浸泡；在0—15'C固液分离，取上清液；D、加热液体至微沸，调pH值，除去蛋白质；E、截取分子量100KDa以下的物质。步骤A中的"粉碎"的粒度可达到毫米级；"进一步细化"是指通过胶磨机，组织捣碎机等设备使物质粒径变小的过程，通过上述过程可以使粒径达到纳米级。"细化"时间在60—90分钟。提取溶媒为水和乙醇和/或甲醇，表示提取溶媒为水、乙醇水溶液、甲醇水溶液或甲醇和乙醇混合的水溶液。当V/V^时，表示提取溶媒为水。当V/V:60，寸，表示乙醇或甲醇水溶液的体积浓度为60%或乙醇和甲醇混合液的水溶液体积浓度为60%。步骤B的"匀浆"在水和乙醇和/或甲醇的体积浓度为(^《v/v〈4(^时，温度需要在70—90。C;水和乙醇禾B/或甲醇的体积浓度为40%《^八《60%时，温度在室温即可。步骤C，"使蜚蠊充分浸泡"的时间通常为8—12个小时，在工业生产时，由于工作时间的缘故，静置过夜即可。固液分离的温度2—8'C为优选。步骤D，不同提取液"微沸"的温度不同，一般在80—10(TC。通过调节pH值，使溶液中的蛋白质溶胶不稳定，除去提取物中的蛋白质。这种方法不会使分子量较小的生物活性肽溶解度变小，不会导致生物活性肽沉淀，故本发明的提取物中含有生物活性肽。除蛋白质后，还应调溶液的pH4—5，加热，反复观察蛋白质是否除尽。然后截取lOOKDa以下分子量的物质。制备所得提取液应在2—8'C下保存。本发明采用水和乙醇和/或甲醇为提取溶媒，其中乙醇和/或甲醇水溶液体积浓度0《V/V《60%，可以完成发明目的；本发明乙醇和/或甲醇水溶液的体积浓度在0%《v/v《40%为优选范围，在0。/。《v/v《l(m为更优选范围。本发明还提供了提取物作为药物应用的组合物，该提取物可分别通过不同处理工艺制成不同的产品。可以真空浓縮，制成片剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸剂、浸膏、散剂、冲服剂、丸剂、膏剂和丹剂。可以在除菌后，加入甘露醇等辅料制成注射用粉针剂，尤其是注射用冻干粉针剂。可以除菌灌装，得到蜚蠊提取物的注射液。本发明提供了蜚蠊获提取物在制备治疗心衰、心肌缺血和高血脂的药物中的应用。本发明所采用的工艺的提取物的有效成分含量很高，为该药物的应用提供基础。所采用的工艺对有效物的提取更具有专属性，避免了色素和油质等杂质的溶出，从而在提取工艺中减少了除杂的步骤，縮短了生产周期，降低了生产成本；避免了大量使用有机溶剂，减少了工业废弃物的排放，使生产更有利于环境保护。由于工艺简化，与现有工艺对比生产时间节省，降低生产周期，提高经济效益。实施例下面通过实施例具体介绍本发明的内容，但本发明的内容不仅仅限于实施例的内容。实施例l、以水为提取溶媒制备1、将蜚蠊粉碎至《lmra，于夹层锅内，加4倍量双蒸水，在冰水降温状态下循环胶磨60分钟。2、用HCL调pH4.0。3、通蒸汽至90'C不停搅拌，90分钟，趁热加盖密闭，静置隔夜。4、保持液体温度l(TC离心，4200r/min。取上清液。取出沉淀，加1倍量双蒸水，加热至90°C，20分钟，冷却后冷冻离心。合并上清液。5、上述上清液，边搅拌边缓慢加入HCL，调pH4.0。于夹层锅内加热至微沸，停止加热。6、趁热立即倒入有盖不锈钢锅内，盖严，静置隔夜。7、次日，取上清液，沉淀如步骤4处理，合并上清液。8、步骤7上清液用NaOH调pH8.5，加热至沸，移至有盖不锈钢锅，盖严，静置隔夜。9、次日，取上清液。下层沉淀如步骤4处理，合并上清液。10、将此上清液用HCL调pH4.5。11、加热至9CTC，15分钟。反复观察在30分钟内如未产生沉淀，则盖严，静置隔夜。12、次日，lOOKDa超滤，收取超滤液。存于冰柜使温度维持2"C，存放待检。实施例2以60%乙醇为提取溶媒制备1、将蜚蠊粉碎至《lmm，加3倍量60%乙醇溶液，在室温状态下循环胶磨90分钟。2、用2NHCL调pH4.0。3、室温下，电磁搅拌器不停搅拌，维持90分钟，静置隔夜。4、维持液体温度8。C离心，4200r/min。取上清液。在沉淀中加1倍量提取溶媒，离心。合并上清液。5、上述上清液，边搅拌边缓慢加入HCL，调pH4.0。于冷凝回流装置加热至微沸。6、趁热立即倒入有盖不锈钢锅，盖严，静置隔夜。7、次日，取上清液，沉淀如步骤4处理，合并上清液。8、步骤7上清液用NaOH调pH8.0，加热至75'C，15分钟后移至有盖不锈钢锅，盖严，静置隔夜。9、次日，取上清液。沉淀如步骤4处理，合并上清液。10、将此上清液用HCL调pH4.5。11、加热至75°C，15分钟。反复观察在15分钟内如未产生沉淀，移至有盖不锈钢锅内，盖严，静置隔夜。12、上述溶液，移入真空浓縮罐，7(TC浓縮至半液体稠膏状，加双蒸水至为浓縮前体积。13、lOOKDa超滤，收取超滤液，置冰柜使温度为8。C，存放待检。实施例3以40%乙醇为提取溶媒制备I、将蜚蠊粉碎至《lmm，加3倍量40%乙醇溶液，在室温状态下循环胶磨70分钟。歩骤2—4同实施例2。5、上述上清液，于冷凝回流装置加热至微沸，维持温度。边搅拌边缓慢加入HCL，调pH4.0。步骤6—10同实施例2。II、加热至80°C，15分钟。反复观察在15分钟内如未产生沉淀，移至有盖不锈钢锅内，盖严，静置隔过夜。.后续处理步骤同实施例2，超滤液，置冰柜使温度为15"C，存放待检。实施例460%甲醇制备反应条件和步骤同60%的乙醇提取，需要加热的反应温度控制严格，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例540%甲醇提取反应条件和步骤同40%的乙醇提取，需要加热的反应温度控制严格。整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例6以30%乙醇为提取溶媒制备1、将蜚蠊粉碎至《lmm，加3倍量30%乙醇溶液，冰水降温状态下循环胶磨80分钟。2、用HCL调pH4.0。3、于冷凝回流装置加热至80'C不停搅拌，维持90分钟，趁热加盖密闭，静置隔夜。4、维持液体温度Or离心，4200r/min。取上清液。在沉淀中加1倍量提取溶媒，离心。合并上清液。5、上述上清液，边搅拌边缓慢加入HCL，调pH4.0。于冷凝回流装置加热至微沸。6、趁热立即倒入有盖不锈钢锅，盖严，隔夜静置。7、次日，取上清液，下层沉淀如步骤4处理，合并上清液。8、步骤7上清液用NaOH调pH8.5，加热至8(TC，10分钟后移至有盖不锈钢锅内，盖严，静置隔夜。9、次日，取上清液。下层沉淀如步骤4处理，合并上清液。10、将此上清液用HCL调pH4.5。11、加热至8(TC，15分钟。反复观察在15分钟内如未产生沉淀，移至有盖不锈钢锅内，盖严，静置隔夜。12、上述溶液，移入真空浓縮罐中，70'C浓縮至半液体稠膏状，加双蒸水至为浓縮前体积。13、lOOKDa超滤，收取超滤液，置冰柜使温度为6'C，存放待检。实施例7以10%乙醇为提取溶媒制备I、将蜚蠊粉碎至《lmm,加3倍量10%乙醇溶液，在室温状态下循环胶磨80分钟。步骤2—4同实施例2。5、上述上清液，边搅拌边缓慢加入HCL，调pH4.0。于冷凝回流装置加热至微沸。步骤6—10同实施例6。II、加热至80°C，15分钟。反复观察在15分钟内如未产生沉淀，移至有盖不锈钢锅内，盖严，静置隔夜。后续处理步骤同实施例6。实施例8以5%乙醇为提取溶媒制备I、将蜚蠊粉碎至《lmm，加3倍量5%乙醇溶液，在室温状态下循环胶磨80分钟。步骤2—4同实施例7。5、上述上清液，边搅拌边缓慢加入HCL，调pH4.0。于夹层锅内加热至微沸。步骤6—10同实施例7。II、加热至8(TC，15分钟。反复观察在15分钟内如未产生沉淀，移至有盖不锈钢锅内，盖严，静置隔夜。后续处理步骤同实施例7。实施例9以30%甲醇为提取溶媒制备反应条件和步骤同30%的乙醇提取，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例IO以10%甲醇为提取溶媒制备反应条件和步骤同10%的乙醇提取，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例ll以5%甲醇为提取溶媒制备反应条件和步骤同5%的乙醇提取，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例12以乙醇和甲醇混合(体积比1:1)的水溶液为提取溶媒制备，乙醇和甲醇的体积浓度为60%反应条件和步骤同60%的乙醇提取，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例13以乙醇和甲醇混合(体积比1:3)的水溶液为提取溶媒制备，乙醇和甲醇的体积浓度为60%反应条件和步骤同60%的乙醇提取，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例14以乙醇和甲醇混合(体积比l:1)的水溶液为提取溶媒制备，乙醇和甲醇的体积浓度为30%反应条件和步骤同30%的乙醇提取，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例13以乙醇和甲醇混合(体积比3:1)的水溶液为提取溶媒制备，乙醇和甲醇的体积浓度为30%反应条件和步骤同30%的乙醇提取，整个实验应注意实验仪器的密闭性。实施例14注射用冻干粉针剂在提取物的液体中加入3%的甘露醇，调整pH为4.5，空气净化局部100级的状态下，0.22um微膜过滤，无菌灌装。冻干即得。实施例15注射液提取物的液体中加入氯化钠调等渗，调pH4.'5，无菌条件下，0.22um过滤灌封，即得。实施例16片剂每片含量提取物40mg微晶纤维素55mg交联羧甲基淀粉钠5mg硬脂酸镁lmg工艺将所得到提取物液体真空浓縮成浸膏。将各辅料过80目筛，混匀，加淀粉浆(15-17%)制软材，以14目筛制粒后，置60'C干燥，2目筛整粒，加入交联羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁混匀，压片，即得。实施例17软胶囊剂单位量(g/粒)提取物0.025PEG:0.225明胶0.16甘油0.09羟乙基纤维素0.007枸橼酸0.008山梨酸甲酯0.001蜂蜡0.01水0.25工艺将所得到提取物液体真空浓縮成浸膏。称取明胶加入100L明胶反应罐，在搅拌状态下加入适量水，密闭，待明胶完全溶解后，再加入甘油、适量着色剂，搅拌均匀，抽真空脱气2小时，加入明胶保温桶中，保温静置过夜，待用。将助悬剂加入稀释剂中，混匀，称取药物，与稀释剂混合，待完全混匀后加入抗氧剂、防腐剂，搅拌均匀，室温静置。将明胶保温桶悬挂至一定高度，配好的药液倒入药斗中，换上模具开始压软胶囊，调整软胶囊装置至设计范围，干燥24小时，剔除外观质量差的胶丸，将胶丸洗涤，干燥24小时，得软胶囊半成品，质量检验合格后分装、贴签、包装，即得成品。实施例18小分子肽类的定性采用多肽双縮脲反应，取2.5ml样品溶液，加入2.5mllOX(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，混合均匀，静置10min，然后过滤，取滤液lml，加10%氧化钠溶液2滴，充分摇匀，逐渐加入硫酸铜试液，随加摇匀，溶液呈现紫红色。经过上述处理，证明样品中含有多肽。实施例19小分子肽的定量双缩脲法取2.5ml样品溶液，加入2.5mllOX(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，与漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5XTCA定容至刻度，摇匀。然后取6.Oml上述溶液置另一试管中，加入双縮脲试剂4.0ml(样液双縮脲试剂二3:2,v/v)，与漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品中的多肽浓度C(mg/ml)，计算得样品中多肽的含量。标准曲线的制作取10个10ml的容量瓶，用5XTCA依次配制0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，然后分别取6.Oml标准溶液，加入4.0ml的双縮脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm下测定0D值(以第一管做空白对照)。以肽的浓度为横坐标X(mg/ml)，OD值为纵坐标Y，制作标准曲线。经过测定，各批次样品小分子肽的含量如下表-<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>次黄嘌呤、尿嘧啶、肌苷的定性用十八垸基键合硅胶为填充剂，精密称取次黄嘌呤、尿嘧啶、肌苷对照品适量，各用流动相A配制成每lml含0.12mg的溶液，再以1:1:1的体积混合即得对照品溶液。精密称取样品0.05g，加流动相A50ml溶解即得供试品溶液。取对照品和供试品各20y1，注入液相色谱仪。流动相A:PH=5.3，0.05mol/L乙酸钠缓冲液;流动相B:以流动相A配制得80%甲醇。检测波长260nm，留宿0.6ml/min，平衡B%=0，启动后15min内BX为0—35%线性梯度，35X维持2min后回B^二0，记录约20min色谱图。理论塔板数按尿嘧啶计算应不低于1000，三个峰得保留时间应与对照品溶液中次黄嘌呤、尿嘧啶、肌苷三个峰得保留时间一致，三峰的保留时间依次约为10.895、7.655、14.273。实施例21次黄嘌呤、尿嘧啶的定量色谱条件与系统适应性用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相A:乙酸钠缓冲液(PH5.0);流动相B:以A配制的80。/。甲醇。检测波长260nm，流速0.6ml/rain，用3%B平衡，启动后流动相以3%维持3分钟，然后在2分钟内换成30XB，维持7分钟后返回3%B。记录14分钟的色谱图。理论板数分别按尿嘧啶和次黄嘌呤峰计算均应不低于1000，尿嘧啶与次黄嘌呤之间的分离度应符合要求。测定法取本品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，作为供试品溶液；取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图；另取尿嘧啶和次黄嘌呤对照品适量，用流动相A溶解并稀释成每lml分别含尿喳啶和次黄嘌呤25iU的混合对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算。经过测定，各批次样品尿嘧啶和次黄嘌呤的含量如下表批号尿嘧啶含量(％)次黄嘌呤含量(％)1122m10276.27.4710265.28.01平均5.97.54实施例22复合核苷碱基的定性精密称取本品0.05g，于50ml量瓶中，以甘氨酸盐酸缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml于100ml容量瓶中，加上述缓冲液至刻度，摇匀，即得供试品溶液。照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV)测定，本品在260士3nm波长处有最大吸收，在236土2nm波长处有最小吸收，说明含有复合核苷碱基。实施例23复合核苷碱基的定量精密称取本品0.05g，于50ml量瓶中，以甘氨酸盐酸缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml于100ml容量瓶中，加上述缓冲液至刻度，摇匀，即得供试品溶液。照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV)测定，在260土3nm波长处测定吸收度，计算复合核苷碱基的含量。经过测定，各批次样品复合核苷碱基的含量如下表批号小分子肽含量(％)112210.3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例24酸性粘多糖的定性^1)甲苯胺蓝试验取本品溶液l滴，点于层析滤纸上，待干燥后，滴加甲苯胺蓝溶液取甲苯胺蓝60mg，加醋酸溶液(1—200)100ml使溶解染色12分钟，然后用醋酸溶液(1—200)洗去多余的甲苯胺蓝溶液，点样附近出现蓝紫色的斑点。2)硫酸根鉴别取供试品溶液两份，分别置50ml纳氏比色管中，一份加25%氯化钡溶液5ml，摇匀，放置10min，反复滤过，至滤液完全澄清，加入适量硫酸钾溶液和水至50ml，摇匀，放置10min，作为对照溶液。另一份中加25X氯化钡溶液5ml与水适量使成50ml，摇匀，放置10ml，同置黑色背景上，从比色管上方向下观察，比较，供试品呈阳性反应。以上反应同时显阳性，说明样品中含有酸性粘多糖。实施例25酸性粘多糖的定量标准品溶液的制备精确称取60'C干燥至恒重的葡萄糖醛酸标准品15mg，置于25ml量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释到刻度，摇匀，精密量取lml置25ml量瓶中加水稀释至刻度(此溶液每ml中含葡萄糖醛酸24yg)。供试品溶液的制备精密称取6(TC干燥至恒重的样品粉末60mg，置于25ml量瓶中加蒸馏水使溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置于25ml量瓶中，加水稀释到刻度(每ml中含本品192iig)，摇匀，过滤，即得。测定法精密量取供试品溶液与标准品溶液各lml，分别置10ml具塞试管中，均精密加入四硼酸钠-硫酸溶液(称取四硼酸钠1.91g，置500ml烧杯中加蒸馏水5ml，加硫酸195ra].放凉后置试剂瓶中即得)6ml，摇匀室温放置20min，加0.2%咔唑溶液0.2ml，摇匀，沸水浴中加热10min，室温放置20min后，按照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV)，在520nm波长处测定吸光度，计算结果。实验结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例26粘氨酸分析采用CN941018943的方法检测，样品在长波紫外光下显蓝紫色，在强酸和高温条件下水解出氨、氨基酸、硫酸基、葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖，证明含有粘氨酸。先将小分子肽类物质除去，一般可采用溶剂沉淀法，如高浓度乙醇，三氯醋酸等。然后再根据《心脉隆注射液质量标准中若干问题的研究》(张利大理医学院学报；2000，9(3):7-8)报道的粘氨酸分析方法分析，粘氨酸含量如下:批号_粘氨酸含量(％)11224.210273.010263.7平均3.6实施例27防止心肌缺血药效学试验1.实验动物SD大鼠40只，体重(210士20)g，雌雄各半。将大鼠按雌雄各半，随机分为4组。分别为空白对照组，缺血模型组，阳性对照组(乙醇提取物4mg/kg)，样品组(4mg/kg)。空白组4只大鼠，其余各组均为12只。各组均采用腹腔注射给药。空白组和模型组给予等容量的生理盐水，给药体积为2mg/kg体重。其中"乙醇提取物"按照专利申请号为CN94118839.6(公开号为CN1124141)记载的方法制备。2.实验方法各组大鼠给药30min后，以20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，记录标准II导联心电图lmin，作为心肌缺血前正常值。样品组、阳性对照组以及缺血模型组分别在8s内匀速舌下静脉推注垂体后叶素0.5pg/kg，制备大鼠急性心肌缺血模型，空白对照组给予等容量的生理盐水。分别记录静注Pit后5s，10s，15s,30s,lmin，2min，5min和10min时心电图的变化，测量J点和T波峰值。以心电图J点，T波幅值和心率作为心肌缺血程度以及药物作用效果的评价指标。将大鼠心脏剪下，用生理盐水冲去血污，-20〔冰箱内冷冻15min后从心尖向心底方向将心脏均匀切为8片，将其置于0.1。/。的N-BT溶液中，37'C气浴振摇10-15min，用吸水纸吸干表面水分，分别切取梗死区与非梗死区并称重，计算心梗指数。心梗指数=梗死区湿质量/全心湿质量。3.统计学处理3.1分别计算各组注射Pit后J点位移变化值，T波振幅变化值以及心率的减慢值，用Excel计算各指标的均值和标准差，并与缺血模型组进行组间t检验。表一各组给垂体后叶素后大鼠心电图J点位移变化值静注Pit后J点位移变化值(mV)5s10s15s30slmin2min5min10min空A对照组40.010.03±0.0120.025±O扁0.03±00250.025±0.0220.031土0.0120.026±0.0050.02±0.012缺血模型组120.032±0,073±O.lll士0.075±0.062±00.065±0.00.045±0.00.043±0.00.0280.0250.0250.040遍222338样品组120.030±0.053±0.070±0.049±0.041±00.035±0.00.034±0.00.021±0.00.0190.0260.0180.042.022121315阳性对照组(乙醇提取物)120.019±0,063±0.077±0.061±0.05±0.0.046±0.00.045±0.00.038±0.00遍0.0510.0350.04027281616注与缺血模型组比较，表二各组给垂体后叶素后大鼠心电图T波振幅变化值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注.-与缺血模型组比较，3.2蟑螂提取物对急性心肌缺血大鼠心梗指数的影响:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注与模型组相比PO.Ol3.3蟑螂提取物对急性心肌缺血大鼠血清CK、LDH含量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.结果4.1从上表可以看出蟑螂提取物对垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血心电图J点和T波的抬高有明显的抑制作用(与模型组比较，P<0.05或PO.Ol)。4.2形态学结果显示，蟑螂提取物对Pit造成急性心梗的大鼠有明显的抑制作用。4.3酶学结果显示，蟑螂提取物可以明显降低CK、LDH水平，对缺血性心肌有保护作用。实施例28降血脂药效试验1.实验动物SD雄性大鼠30只，体重(190士20)g2.实验方法将大鼠在实验环境，畏养普通饲料，观察5-10天，鼠尾静脉取血，离出血清，测定各项血脂指标正常值。随机分3组大鼠，每组10只，各组动物换用高胆固醇饲料喂养，第一组不给药；第二组灌胃给予样品(4mg/kg);第三组灌胃给予乙醇提取物(4mg/kg)。6周后眼球取血测定各项血脂指标。其中"乙醇提取物"按照专利申请号为CN94118839.6(公开号为CN1124141)记载的方法制备。3.数据处理<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注与模型组相比PO.Ol，与阳性对照组相比P^0.05。4、结果与高脂模型相比，样品组的TC、LDL-C和TG分别下降了75.8%、67.4%、61.3%,HDL-C升高了84.2%;阳性对照组的TC、LDL-C和TG分别下降了58.3%、43.0%、55.9%,HDL-C升高了52.6%。样品与阳性对照有显著性差异，具有显著的降血脂功效。实施例29强心作用药效试验1.实验动物蟾蜍20只，雌雄兼有，体重(80±20)g2.实验方法将样品和阳性对照药(乙醇提取物)分别用任氏液稀释至0.4mg/ml。将蟾蜍随机分为2组(样品组、阳性对照组)，每组10只取蛙心采用斯氏蛙心插管，用任氏液连续换洗套管内的液体，至无血色。用带有长线的蛙心夹夹住心尖，长线与张力换能器相连，用平衡记录仪记录心脏收縮活动。记录15min内的稳定正常波形后，向样品组加入浓度为0.4mg/ml的样品溶液lml，观察并记录10min内的心肌收縮情况；阳性对照组采用同样的实验方法。其中"乙醇提取物"按照专利申请号为CN94118839.6(公开号为CN1124141)记载的方法制备。分别记录每组药物对离体蛙心的心肌张力的影响，按照下列公式心肌收縮率变化百分率变化率=(给药后心肌收縮张力-给药前心肌收縮张力)/给药前心肌收縮张力。3.数据处理:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4.试验结果蟑螂提取物的任氏液对离体蛙心有明显的兴奋作用，与阳性对照组有显著性差异。权利要求1、一种应用于心血管领域，从蜚蠊获得的提取物，其特征为由包含以下步骤的方法制备A、以水和乙醇和/或甲醇为提取溶媒，将蜚蠊粉碎，其中乙醇和/或甲醇水溶液体积浓度0≤V/V≤60％；B、调pH至3-5；匀浆；C、密闭，静置；使蜚蠊充分浸泡；在0-15℃固液分离，取上清液；D、加热液体至微沸，调pH值，除去蛋白质；E、截取分子量100KDa以下的物质。2、如权利要求1所述提取物主要含有生物活性肽、酸性粘多糖、复合核苷碱基和粘氨酸。3、如权利要求2所述提取物含有次黄嘌呤、尿嘧啶、肌苷、腺嘌呤核苷、尼克酸或氨基乙酸。4、一种如权利要求1所述提取物制备方法，包含以下步骤A、将蜚蠊粉碎，加入2—5倍量的水和乙醇f卩/或甲醇，进一步细化使蜚蠊细胞破裂，其中乙醇和/或甲醇水溶液体积浓度0《V/V《60%;B、调pH至3—5;匀浆；C、密闭，静置；使蜚蠊充分浸泡；在0—15'C固液分离，取上清液；D、加热液体至微沸，调pH值，除去蛋白质；E、截取分子量lOOKDa以下的物质。5、如权利要求4所述的方法，其中乙醇和/或甲醇水溶液的体积浓度为0《V/V《40%。6、如权利要求4或5所述的方法，其中乙醇和/或甲醇水溶液的体积浓度为0《V/V《10y。。7、一种治疗心血管疾病的药物组合物，含有如权利要求1或2所述的提取物和可药用载体。8、如权利要求7所述的药物组合物，是片剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸剂、浸膏、散剂、冲服剂、丸剂、膏剂或丹剂。9、如权利要求7所述的药物组合物，是冻干粉针剂或注射液。10、如权利要求1-5或8或9任意一项所述的蜚蠊提取物在制备治疗心衰、心肌缺血或高血脂的药物的应用。全文摘要本发明涉及一种以蜚蠊为药物来源的应用于心血管领域的提取物、制备方法和含有该提取物和可药用载体的组合物。该提取物采用水和乙醇和/或甲醇为提取溶媒，其中乙醇和/或甲醇水溶液体积浓度0≤V/V≤60％。该提取物具有降低血脂，降低胆固醇，防治心绞痛，强心、抗心衰的功效。本发明提取工艺简单高效，专属性强，所得产物有效成分含量高。本发明的提取物可以制成提取物和可药用载体的组合物。文档编号A61K35/64GK101156875SQ20071010153公开日2008年4月9日申请日期2007年4月25日优先权日2007年4月25日发明者叶澄海申请人:深圳信立泰药业股份有限公司