专利名称：甘松挥发油及含有甘松挥发油的组合物在制药中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘松挥发油在制药中的新用途，还涉及含有甘松挥发油的组合物在制药中 的新用途，该药物用于治疗或预防包括人在内的动物心律失常；还涉及该药物或其组合物 通过肺、鼻给药和口服给药。
背景技术：
心律失常是引起各种心脏病死亡的主要原因之一，尤其在心力衰竭，心肌缺血或心肌 梗死时，心律失常的发生率、病死率更高。但是目前抗心律失常药物总的有效率仅有30 %—60%(周江，赵飞.稳心颗粒治疗心律失常临床疗效观察.中国医药，2006， 1(6): 342 343)。至今为止，所有的抗心律失常西药在抗心律失常的同时又存在着致心律失常作用， 即抗心律失常西药在治疗过程中诱发了新的或者加重了原有的心律失常，其发生率平均约 13%，并且药物促发的心律失常可以表现为所有的心律失常的类型。这一严重的副作用在 各类抗心律失常药(指西药抗心律失常药的分类)都可引起。其发生与年龄、性别、冠脉 病变、临床表现、药动学参数等都无明确关系(方文贤.抗心律失常中药的临床应用.中 国临床医生，2001， 29 (4); 52)。
中医药学是我国的传统特色医学。据报道抗心律失常中药的远期疗效优于西药，可能 机制在于中药具有明显的多个离子通道靶点作用的特点。总体上，西药分子量较小，对 离子通道具有较强的阻滞作用，而不具有离子通道调节的作用，而中药分子量较大，对离 子通道不具有较强的作用，但其具有的多靶点作用特性使其可能作用于不同的离子通道， 产生对离子通道功能紊乱的调节作用。
甘松(Nardostachys chinensis)又名香松，为败酱科植物甘松(Nardostachys chinensis Batal)或匙叶甘松(Nardostachys jatamansi DC)的干燥根及根茎。甘松干燥的根及根茎可 入药，其气味芬芳，味辛、甘、性温，具有理气止痛，开郁醒脾的功能。古代临床应用于 脾胃气滞，腙腹胀痛；也可以用于医治牙痛等。马传庚等人(马传庚，项思远等.甘松乙醇提取液的抗心律失常作用的实验研究.安徽医学院学报，1980， 15 (4): 9)发现乙醇提
取液静脉注射给药具有一定抗心律失常作用，但是迄今为止没有报道挥发油的抗心律失常 作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是找到一种中药的有效部位用于治疗心律失常。 为此本发明提供如下技术方案。
甘松(Nardostachyschinensis)挥发油及含有甘松挥发油的组合物在制药中的用途，该 药物用于治疗或预防包括人在内的动物心律失常。所述甘松为为败酱科植物甘松 (Nardostachyschinensis Batal)或匙叶甘松(Nardostachys jatamansi DC)的干燥根及根茎。 所述甘松挥发油，采用水蒸气蒸馏方法制备。将甘松粉碎或切碎，用水浸泡一定时间或者 不浸泡，置入蒸馏锅，通入常压水蒸气或者加压水蒸气，优选加压水蒸气，可以减少蒸馏 时间，蒸馏2-200小时，优选6-24小时，冷凝含油蒸汽，优选冷凝温度小于6(TC，油水分 离，得粗油，粗油加入无水硫酸钠或者其他方法脱水，过滤得甘松挥发油(精油)。应为 黄色、黄绿色、绿色或棕色透明液体。
所述的甘松挥发油，包括卡拉烯(白菖烯,Calarene)、 /\1(1())-土青木香烯酮-2及甘松醇 (Jatamansinol)。由于中药组分的复杂性，甘松挥发油还包括如下已知成分和未知成分。 桉树脑(Eucaiyptol) 、 a-蒎烯(a-Pinene)、 P-蔽烯(e-Pinene) 、 P-橄榄烯(0-Maaliene)、 土青木香烯(Aristolene)、 la,2,3，4,4a,5,6,7b-辛氢-l,l,4,7-四甲基-lH丙垸甘菊环烃、4-(2，6,6,-三甲基-l-环已垸烯-l)-3-丁烯酮、香木兰垸(Aromadendrane)、荜橙茄二烯(Carinane)、芹菜 二烯-3，7(Seiina-3.7-diene)、匙叶桉油烯醇(Spathulenol)、桉砲醇(Globulol)、 e-石竹烯(P -caryophyllen) 、 1,2,3，4,5,6,7,8-辛氢-1,4-二甲基-7-(1-甲基亚乙基)-甘菊环烯、广藿香醇 (Patchouli alchol)、 A!(叫-土青木香烯酮-2(A"叫-Aristolenone-2)、 土青木香柔酮(Debilone)、 甘松酮(Nardostachone,l,8,9,10-tetradehydrouristolan-2-one)、 JE十九烷(Nonadecane)。
所述的含有甘松挥发油的组合物，还包括附加剂，附加剂包括溶剂或潜溶剂、和/或抗 氧剂、和/或表面活性剂。所述溶剂或潜溶剂选自水、乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、 聚乙二醇(PEG) 400、 二甲基亚砜(DMSO)、油酸，所述抗氧剂选自脂溶性抗氧剂和水 溶性抗氧剂，脂溶性抗氧剂选自没食子酸丙酯、对羟基叔丁基茴香醚(BHA)、 二叔丁基对甲苯酚(BHT)、卵磷脂、维生素E、迭迭香、叔丁基对苯二酚(叔丁基氢醌)或称特丁基 对苯二酚(Tertiary butylhydroquinone)。水溶性抗氧化剂选自维生素C、亚硫酸钠、亚硫酸 氢钠、焦亚硫酸钠、盐酸半胱氨酸。上述组合物形成均一的溶液，或者多相的乳液或者微 乳液。液体经手动施压雾化呈一定粒径的液滴，通过鼻或口吸入肺部，发挥药效；也可以 直接喷致鼻腔粘膜，通过鼻粘膜给药，此时有必要加入一些促渗剂，优选的具有更好安全 的促渗剂包括，氮酮、噻酮、胆酸、胆酸盐等。
所述的包括附加剂的含有甘松挥发油的组合物，还包括抛射剂，抛射剂选自氟氯烷烃 (Freon)、氢氟烷(HFA)、丙垸、正丁垸、异丁烷、二氧化碳或氮气的一种或几种。氢氟 烷选自HFA227 (1，1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)、HFA134a (1,1，1,2，-四氟乙烷)，其通用名分别为 阿帕氟烷(Apaflurane)诺氟垸(Norflurane)。由于氟氯烷烃对臭氧层的破坏，已有相关国际 公约禁止使用氟氯烷烃(氟利昂)，因此优选非氟氯垸烃类抛射剂。上述抛射剂的作用是， 依靠封闭在罐内的高压(液化)气体使含药液体组合物雾化成适宜粒径的液滴，可以准确 到达肺部，发挥药效。
所述含有甘松挥发油的组合物分装容器中，制成气雾剂或者喷雾剂，通过鼻或肺给药， 或者喷射至口腔粘膜或体表皮肤透皮给药。该容器优选带有定量阀，可以固定每喷剂量。
所述的含有甘松挥发油的组合物，其特征在于还包括油溶性或水溶性基质，所述基质 熔点高于4(TC，使得组合物在室温下呈固体状态。可以制成滴丸或者其他制剂，可以通过 舌下含服或者口服给药发挥药效，优选舌下含服。油溶性基质选自括硬脂酸、单硬脂酸甘 油酯、硬脂醇等，水溶性基质选自适宜分子量的聚乙二醇(PEG)，如PEG2000， PEG4000， PEG6000。优选水溶性基质。
图1钳位电压在-80mV时甘松对心肌细胞内向电流影响，A.对照；B.给药(甘松挥 发油试液(1:20K)) 8分钟后；C.洗脱；D.内向电流对时间作图。钳位电压在-80mV时； 当去极化刺激达0 mV时阳离子通道开放，当应用甘松挥发油1:20K时，抑制内向电流， 该图显示给药后8分钟，内向电流的抑制达到最高。短期洗脱后，内向电流有轻度的回升。图2钳位电压在-100mV时甘松对心肌细胞内向电流影响，A.对照；B.给药甘松挥发油 试液(1:20K); C.给药甘松挥发油试液(1:1K); D.内向电流对时间作图。钳位电压在 -lOOmV，当去极化刺激达OmV，药浓度l: 20K时，内向电流与对照无明显变化，只有药 浓度达l: 1K(68g/L)时才明显抑制内向电流。该图显示给药后l分钟，内向电流的抑制 达到最高。
图3比较两种给药方式在各观察时间点ERP。
图4比较两种给药方式在各观察时间点ERP/RR比值。
具体实施例方式
实施例l甘松挥发油的制备
取粉碎后的甘松1000g,置入蒸馏装置中，通入常压蒸汽蒸馏6小时，冷凝含油蒸汽， 油水分离得粗油，加入硫酸钠干燥粗油，过滤得甘松挥发油14.7g。形状为浅绿色透明油 状液体，具有甜香气味。密度0.952g/ml。
实施例2甘松挥发油对心肌细胞钠离子通道的影响
1.材料与方法
1.1甘松挥发油试液将实施例1所得甘松挥发油1.0克用二甲亚砜溶解,加生理盐水定容 稀释至1000ml，得甘松挥发油试液(1: lk)，相当于生药68g/L。将甘松挥发油试液(1: lk)稀释20倍得甘松挥发油试液(1: 20k)，相当于生药3.4g/L。
1.2大鼠心肌细胞分离方法大鼠8只，体重200-300克，雌雄不拘，腹腔注射1000单 位(lml)肝素，15分钟后腹腔注射25-50 mg (1 ml )巴比妥钠麻醉，迅速开胸取心， 在37'C恒温供氧条件下在Langendorff灌流装置中灌流，首先用50 ml正常台氏液灌流约 2 3分钟，以清除其血液。然后换成无钙液(MITRA/MORAD液)灌流5min，再用同样 液体加入了胶原酶，蛋白酶，牛血清蛋白酶(BSA: Bovine Serum Albumin)的消化液.循 环灌流10 15min，取下心脏剪去心房，小心地将心室剪成小块，在MITRA/MORAD液 中温孵并轻轻振荡，每5 10 min倒出血清并加入新鲜的MITRA/MORAD液，且缓慢每 次逐步增加Ca2+直至达1.8mM，以达到逐渐复钙的效果。如此反复3 5次，分离的细胞 在室温下保存一小时后即可使用。或沉淀细胞于小载薄片上保存于36t:供用。 1.3全细胞膜片钳记录
L3.1膜片钳记录使用的仪器与设备膜片钳放大器Axon/USA (Ax叩atch 200Bmplifier/pClamp9/Digidata packl322A )，精密微操纵器SD/USA(MX7600/R Motorized Manipulator/MC 1000e Controller/Amplifier headstage mount),荧光倒置显微镜，03-D型玻 璃微电极拉制仪，MPS多通道快速微量加药系统，防震台，心脏Langendorff灌流装置， 玻璃电极管经微电极拉制仪二步法拉制电极拉制成尖端1 1.5 u m的电极，电极充灌内液， 入水阻抗为1 1.5MQ 。
1.3.2膜片钳记录程序与方法数控恒温槽在电压钳制模式下，根据钳制电位的不同，分 别测量Na+离子通道电流。用滴管吸数滴细胞保存液或用附有细胞的载薄片加入2的灌流 槽中，放置在倒置显微镜工作台上，用含100%饱和氧细胞外液以灌流装置灌流，选流纹 清晰，表面无颗粒，无收縮的细胞作为实验对象。使电极尖端移向细胞表面，再进行封接， 当阻抗达到1GQ以上，补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式，调节慢电容补偿和 串联电阻补偿以减少瞬时充放电流和钳制电位误差。膜片钳放大器与计算机相连，信号发 放和采集均由软件完成并存储在硬盘内，供测量和分析用。
1.3.3膜片钳记录溶液与试剂正常台氏液成分NaCl 140mM; KC1 5.4mM; CaC12〗.8mM; MgC12 0.5mM; HEPES 5.0mM; Dextrose 5.5mM; NaH2P04 0.4mM; pH用NaOH调至7.40。 无钙台氏液(MITRA/MORAD为正常台氏液中不加CaC12); NaCl 135mM; KC1 5.4mM; MgC12 1.0Mm; HEPES 10mM; Detrose llmM; NaH2P04 0.33mM; PH用NaOH调至7.30。 记录外部溶液(External Solution): NaCl 25mM; MgC12 1.2mM; HEPES 20mM; D-glucose llmM; CsC15mM; CoC12 1.0mM; Tetramethylammonium chloride 115mM。记录内部溶液 (Internal Solution): CsF 145mM; NaF 5.6mM; HEPES 5mM; 用CsOH 1M调PH至7.2 ±0.02。 2.结果
研究发现不同浓度甘松挥发油对大鼠心肌细胞在不同的钳位电压下有不同的钠离子 通道的影响，药浓度l: 20K (相当于生药3.4g/L)仅钳位电压在-80mV时，有明显的阻滞 作用，给药8分钟后内向电流抑制达到最高。而钳位电压在-100mV时，该浓度未能引起 内向电流的明显变化。而药浓度达l:lK(相当于生药68g/L)时呈现明显的内向电流抑制， 给药后不到l分钟，内向电流的抑制即达到最高，见图K图2。
上述实验结果表明甘松挥发油在不同钳位电压下对大鼠心肌细胞阳离子通道的不同 影响就直接涉及到心肌组织的不应期变化，从而发挥其抗心律失常作用。其中上述钳位电 压在-80mV与心律失常细胞的电压相适应，而钳位电压在-100mV与正常心肌细胞的电压 相适应，因此也表明甘松挥发油具有非常宽的的治疗窗，在浓度为1:1K (相当于有效浓度的20倍)时才会影响正常细胞，具有很高的安全性。
实施例3甘松挥发油对大鼠心室肌有效不应期及其校正值影响
l.材料与方法健康雄性Wistar大鼠(250士50g)共50只，分为用药组(11=40)和对照组(n=10)。 用药组均给予实施例2中的甘松挥发油试液(:20K)(相当生药3.4g/L)。用药组分为心外膜 局部浸润(n=20)和气道吸入给药组(n=20)，对照组给甘松挥发油溶剂。心外膜局部浸 润给药方式为滴加药液0.2ml至心外膜方式，气道吸入给药方式为滴加药液0.2ml (相当于 含挥发油10ug，或相当于生药0.68mg)至棉球吸附，至于三通管中的侧管，三通管-一端接 呼吸机，另一端接气管插管，从棉球挥发出的甘松挥发油随着呼吸机运动进入大鼠肺部。 各组按给药时间分为用药前，用药后15、 30、 45、 60min五个时间段进行实验与观察。3% 戊巴比妥钠按30mg/kg经大鼠腹腔麻醉，气管插管，暴露心脏。
将Franz双极记录电极缝合固定于左心室尖心外膜，双极刺激电极则置于心室游离壁 近房室沟外膜处，心室肌产生可传播的动作电位，此时的S1S2间期定为有效不应期(ERP)， 按通常的方法测定ERP。计算校正值ERP/RR (RR为心率)。
实验采取双重对照，即用药前后自身和对照组对照，以消除个体差异。实验数据均采 用均数土标准差(x 士s)表示，每组用药前后各参数比较用配对t检验,组间比较采用两样本均 数的t检验,由SPSS统计软件完成统计学处理。 结果
l.心外膜局部浸润给药对ERP的影响心外膜局部浸润给药后15、 30、 45、 60min， ERP 分别是120.83±7.93、 124,17±6.69、 125.83±12.40、 100.83士9.00ms，分别与用药前66.67士4.98ms 及其相应时间对照组68.0±4.47、 66.0±5.48、 68.0±4.47、 66.0士5.48ms比较均有显著差异(p 〈O.Ol), 15、30、45min之间ERP比较(pX).05)，分别与60min ERP相比均有显著差异(p <0.01图3)。
2. 气道吸入给药组对ERP的影响给药后15、 30、 45、 60min， ERP分别是123.00士6.75、 127急10.59、 128.00±11.35、 97.00±12.52 ms，分别与用药前64.00士5.16ms及其相应时间 对照组64.0士5.48、 66,0±5.48、 68.0±4.47、 64.0士5.48ms比较有显著差异(p〈0.01)用药后15、 30、 45min间ERP比较(pX).05),分别与60min ERP相比均有显著差异(p<0.01图3)。
3. 心外膜局部浸润、气道吸入给药组对ERP/RR比值的影响与对ERP的作用相同，用 药后ERP/RR比值与各相应对照组相比有显著差异(p<0.01图4)。
4. 用ERP观察比较两种给药方式之间无统计学差异(p〉0.05图3)，但用ERP/RR比值比较两者，由于消除了心率的影响，两种给药方式之间存在统计学差异(P〈0.05图4)。 临床一般常用口服以及静脉给予抗心律失常药物，临床至今没有挥发性的抗心律失常 药物。由于甘松挥发油是一种挥发性物质，易于从吸入和浸润途径给药，心律失常往往是 阵发性的，口服药物药效作用比较慢，静脉给药多需在医院进行，而雾化吸入给药药物起 效迅速，半衰期较短，副作用小，携带又方便，便于急救。为了明确甘松挥发油不同给药 途径的有效性，本实验中采取心外膜局部浸润和气道吸入给药方式。
实验结果提示用药后组内各时间段比较，对ERP以及ERP/RR比值的延长作用均在 15至45min较平稳，45min后药效逐渐减弱，这一作用趋势符合挥发性药物起效迅速，消 失也迅速的特性。结果显示甘松挥发油用药后可以明显延长心室肌的有效不应期，而有效 不应期的延长可以使一些提早发生的早搏因此被阻断，还能阻断折返通道，达到抗快速心 律失常的作用。
本实验结果用ERP评价比较两种给药方式没有统计学差异，而用ERP/RR比值之后， 则显示两种给药方式之间存在着统计学差异。这一结果一方面说明ERP/RR比值较为准确 的反应出甘松挥发油对ERP的影响，另一方面也说明，吸入该药，由于药物迅速弥散进肺 部，肺部毛细血管丰富，比起心外膜局部浸润给药，血药浓度更高，药效更佳。证明甘松 挥发油从吸入途径给药是一种有效且迅速的给药方式。
实施例4 一种用于肺部吸入的气雾剂处方
组分 处方量
甘松挥发油 L()g
DMSO 0.2g
水 1000ml HFA227 400g
制成1000瓶
权利要求
1. 甘松挥发油及含有甘松挥发油的组合物在制药中的用途，该药物用于治疗或预防包括人在内的动物心律失常。
2. 根据权利要求l所述的甘松挥发油，其特征在于，采用水蒸气蒸馏方法制备。
3. 根据权利要求1所述的甘松挥发油，其特征在于，包括卡拉烯、^1(10)-土青木香烯酮-2 及甘松醇。
4. 根据权利要求1所述的含有甘松挥发油的组合物，其特征在于，还包括附加剂，附加剂 包括溶剂或潜溶剂、和/或抗氧剂、和/或表面活性剂。
5. 根据权利要求4所述的含有甘松挥发油的组合物，其特征在于，还包括抛射剂，抛射剂 选自氟氯烷烃、氢氟垸、丙烷、正丁垸、异丁烷、二氧化碳或氮气的一种或几种。
6. 根据权利要求4所述的含有甘松挥发油的组合物，其特征在于，组合物分装容器中，通 过鼻腔或口腔喷射或吸入给药，或者喷射至口腔粘膜或者体表皮肤透皮给药。
7. 根据权利要求1所述的含有甘松挥发油的组合物，其特征在于还包括油溶性或水溶性基 质，所述基质熔点高于4(TC，使得组合物在室温下呈固体状态。
8. 根据权利要求7所述的含有甘松挥发油的组合物，其特征在于，组合物通过舌下含服或 者口服给药。
全文摘要
本发明涉及甘松挥发油及含有甘松挥发油的组合物在制药中的新用途，该药物用于治疗或预防包括人在内的动物心律失常。甘松挥发油对大鼠心肌细胞钠离子通道起抑制作用而发挥抗心律失常作用，并且具有非常宽的治疗窗，具有很高的安全性。心外膜局部浸润和气道吸入给药均能延长大鼠心肌有效不应期。
文档编号A61K36/185GK101468048SQ20071016480
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月24日 优先权日2007年12月24日
发明者吴志婷, 吴炜玮, 葛郁芝 申请人:浙江正方医药科技有限公司