专利名称：鹿茸碱性成纤维生长因子(deer fgf)提取及其制备方法
技术领域：
本发明属于鹿茸提取物的医用或食用制品领域。更具体地来说，本发明涉及由鹿茸提取具有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)活性的提取物的方法以及由该方法制备的富含碱性成纤维细胞生长因子的鹿茸提取物。另外，本发明还涉及该鹿茸提取物在药品、食品和化妆品等方面的应用。
背景技术：
鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作为传统的中药材，具有强筋健骨、补肾壮阳、疏通血脉等功效，自古以来就被广泛应用于配制成为各种滋补药品、食品和化妆品。通过现代药物化学研究分析，鹿茸中含有许多种生理活性成分，包括磷脂、生物胺类化合物、前列腺素、维生素、氨基酸、无机盐、不保护脂肪酸、皮质醇等。随着现代生物技术高速发展，人们发现鹿茸中除了含有上述各种生理活性成分之外，其中还含有胰岛素样生长因子(IGF-1)、胰岛素、人生长激素(HGH)、促生长释放因子(GHRF-6)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)等大分子活性蛋白质。以上各种活性成分，尤其是各种活性蛋白质，相互协同作用，发挥功效。其中，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有突出的药理作用。
碱性成纤维细胞生长因子是一种分子量约为17kD的蛋白质。最初因其具有很强的促成纤维细胞生长的作用而得名(参见Nature，1974，249123)，但其促进生长的作用广泛，对几乎所有来源于中胚层的细胞都有效(参见Nature CancerInstitute Monograph，1978，48109、中国专利CN1055009A等)。因此bFGF能够刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种细胞的分化、增殖，能保护神经元，促进神经突起生长，对周围神经再生具有一定的效果。
然而，在传统的鹿茸加工过程中，鹿茸直接粉碎后服用，颗粒较大，造成吸收效率低下；有时，鹿茸的加工需要经过加热煎煮、烘干等步骤，高温会使其中的bFGF等蛋白质变性，从而降低乃至丧失它们的功效。另一种传统的加工方式是将鹿茸浸泡在高浓度酒精含量的酒中，制成药酒服用。但是由于酒中含有高浓度的作为有机溶剂的酒精，会使bFGF等蛋白质变性，而且从大颗粒鹿茸中也不利于溶解出bFGF等蛋白质，因而会导致鹿茸中的bFGF利用效率低下，造成资源浪费。另外，高浓度酒精含量的药酒也限制了每次的服用量。
为了提高鹿茸材料的使用效率，人们尝试了各种方法提取鹿茸中富含碱性成纤维细胞生长因子的有效成分。例如，中国专利CN1104095A中公开了一种含有bFGF的鹿茸生长因子制剂，预处理后，需要对鹿茸浸提液进行盐析、Sephadex C50柱层析和Sepharose亲和柱层析，不但制备过程中需要换层析柱，而且没有提供洗脱峰的图谱，收集到的所谓活性峰只有标号，需要重新摸索才能重复该方法。
针对现有技术中存在的缺陷，经过长期艰苦的研究摸索，本发明人获得了一种具有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)活性的鹿茸提取物的制备方法，该方法通过阶段梯度洗脱，预处理后，仅仅需要一步层析就可以获得高纯度的碱性成纤维细胞生长因子，大大简化了生产工艺的复杂程度，便于在大规模生产中控制质量，节约成本。此外，在制备工艺中没有使用任何化学添加剂，产品更易为消费者接受。
发明内容
本发明的发明目的在于提供提取鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的方法以及由该方法制备的富含碱性成纤维细胞生长因子的鹿茸提取物，并提供了该鹿茸提取物在药品、食品、保健品和化妆品等方面的应用。
具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种提取鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步凝胶过滤层析。在本文中，术语“鹿茸碱性成纤维细胞生长因子”指的是来自鹿茸的具有碱性成纤维细胞生长因子活性的蛋白质。通过本领域普通技术人员熟悉的实验手段就可以判断提取自鹿茸的蛋白质是否具有碱性成纤维细胞生长因子活性，并检测出该蛋白质的纯度，例如分析蛋白质电泳图谱。优选本发明的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子纯度大于90％，更优选大于95％。
在本发明中，术语“一步”指的是在本发明的方法中，仅仅在同一种层析柱(即凝胶过滤层析柱)上进行上样和洗脱，而不包括进行其他层析的步骤。本发明由于只进行一种层析，因此工艺较之现有技术更简单，节约了生产成本，适合在大规模生产中推广。凝胶过滤层析是本领域普通技术人员所熟知的，优选那些已经商品化的。目前已经有成熟的方法来检测碱性成纤维细胞生长因子，优选用本发明实施例中的活性检测方法来确定含鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的峰并收集。在本发明的一个具体实施方式
中，凝胶过滤层析优选为Sephadex G75凝胶柱层析。层析时，本发明优选使用水来进行洗脱，收集含鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的峰，这样可以不引入额外的化学试剂。本发明人的研究表明，对于使用Sephadex G75凝胶柱，用水就可以将高纯度的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子洗脱下来，因此在本发明的第一个方面中，优选将鹿茸浸提液上样于Sephadex G75凝胶柱，并且用水洗脱，收集含鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的峰。
本文中，鹿茸浸提液指的是用水或缓冲液对鹿茸进行浸渍而得的提取液，其中含有鹿茸中的水溶性成分，包括碱性成纤维细胞生长因子。本发明优选选用新鲜鹿茸或冷藏的新鲜鹿茸作为原材料，这样有利于最大限度地保存bFGF的含量和活性。本文中所用的术语“新鲜”指的是采集鹿茸后6小时内就开始进行加工制备本发明的纳米化制品或进行冷藏了，优选加工或冷藏不迟于采集后的3小时，更优选不迟于1小时，最优选不迟于20分钟。本文中所用的术语“冷藏”指的是将鹿茸保存于0℃以下的环境中，优选保存于-20℃的环境中。优选浸提鹿茸前先将鹿茸粉碎(如，切片、研磨、匀浆和/或超生波破碎)，这样有利于提高浸提出有效成份的效率。通过离心和/或过滤等方式，可以收集鹿茸浸提液，去除不溶物质。
优选本发明第一个方面的方法，其依次包括如下步骤 (1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液； (2)将鹿茸浸提液上样于Sephadex G75凝胶柱，再用蒸馏水洗脱，收集含鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的峰。
在第二个方面，本发明提供了一种具有碱性成纤维细胞生长因子活性的鹿茸提取物的制备方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步凝胶过滤层析。在本发明中，术语“一步”指的是在本发明的方法中，仅仅在同一种层析柱(即凝胶过滤层析柱)上进行上样和洗脱，而不包括进行其他层析的步骤。本发明由于只进行一种层析，因此工艺较之现有技术更简单，节约了生产成本，适合在大规模生产中推广。凝胶过滤层析是本领域普通技术人员所熟知的，优选那些已经商品化的。目前已经有成熟的方法来检测碱性成纤维细胞生长因子，优选用本发明实施例中的活性检测方法来确定具有鹿茸碱性成纤维细胞生长因子活性的峰并收集。在本发明的一个具体实施方式
中，凝胶过滤层析优选为Sephadex G75凝胶柱层析。层析时，本发明优选使用水来进行洗脱，收集具有鹿茸碱性成纤维细胞生长因子活性的峰，这样可以不引入额外的化学试剂。本发明人的研究表明，对于使用Sephadex G75凝胶柱，用水就可以将高纯度的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子洗脱下来，因此在本发明的第一个方面中，优选将鹿茸浸提液上样于Sephadex G75凝胶柱，并且用水洗脱，收集具有鹿茸碱性成纤维细胞生长因子活性的峰。优选还可以包括进一步浓缩的步骤。
本发明优选本发明第二个方面的方法，其依次包括如下步骤 (1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液； (2)将鹿茸浸提液上样于Sephadex G75凝胶柱，再用蒸馏水洗脱，收集具有鹿茸碱性成纤维细胞生长因子活性的峰。
在第三个方面，本发明提供了本发明第一个方面的方法提取的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子。该bFGF能够刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种细胞的分化、增殖，能保护神经元，促进神经突起生长，对周围神经再生具有一定的效果；而且通过分析蛋白质电泳图谱，其纯度大于90％，更优选大于95％。在本发明的具体实施方式
中，该bFGF能显著促使细胞增殖，生物活性达到1.55×104IU/mL。。
在第四个方面，本发明提供了本发明第二个方面的方法制备的具有碱性成纤维细胞生长因子活性的鹿茸提取物。在该鹿茸提取物中，鹿茸碱性成纤维细胞生长的蛋白质纯度大于90％，优选大于95％。测定蛋白质纯度可利用本领域所常用的手段来进行，例如通过分析蛋白质电泳图谱。该鹿茸提取物具有碱性成纤维细胞生长因子活性，能够刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种细胞的分化、增殖，能保护神经元，促进神经突起生长，对周围神经再生具有一定的效果。在本发明的具体实施方式
中，该鹿茸提取物能能显著促使细胞增殖，生物活性达到1.55×104IU/mL。。
在第五个方面，本发明提供了含有本发明第四个方面的鹿茸提取物的制剂。鹿茸提取物可以和药学上可接受的辅剂组合从而加工各种制剂。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的制剂优选为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。在本发明的具体实施方式
中，制剂优选为鹿茸碱性成纤维细胞生长因子冻干剂，其由本发明第四个方面的鹿茸提取物冷冻干燥而得。
在第六个方面，本发明提供了本发明第三个方面的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子、本发明第四个方面的鹿茸提取物或本发明第五个方面的制剂在制备用于刺激细胞分化和/或增殖的药品、食品和/或化妆品中的应用。由于bFGF能够刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种细胞的分化、增殖，能保护神经元，促进神经突起生长，因此可以治疗或预防相应疾病。
对于药品来说，可以对需要刺激细胞分化和/或增殖的患者进行给药。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、病情、患病时间、身体状况等)确定。一般而言，bFGF计，给药的剂量为0.001～100mg/kg患者体重，优选为0.01～1mg/kg，优选为0.02～0.1mg/kg。给药形式可以根据各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选使用口喷剂或胶囊剂口服给药。
对于食品和/或化妆品来说，由于是天然制品，而且鹿茸本身有着悠久的使用历史，健康人服用一定量的本发明的bFGF提取物或制品有助于维持其正常的细胞增殖、分化。本发明的bFGF提取物或制品可以单独作为食品和/或化妆品使用，也可以添加到其他食品和/或化妆品中使用，例如，可以添加到常规的饮料、食品和/或化妆品中配合应用。
本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
图1显示了bFGF凝胶层析图谱，其中箭头所指的峰为鹿茸碱性成纤维细胞生长因子所在的峰。
图2显示了bFGF的等电聚焦电泳图谱，其中右边的条带为鹿茸碱性成纤维细胞生长因子，而左边的条带为标准pH电泳标记。
具体实施例方式 实施例1，鹿茸的预处理 取新鲜鹿茸0.5kg，用冷冻切片机将鹿茸切成厚度为1～2mm的切片，然后加入适量(200mL)预冷的去离子水在4℃用匀浆机进行粉碎，匀浆操作进行至匀浆中没有可见的组织块时结束。然后向匀浆物中加入200mL预冷的去离子水，混匀后在冰浴条件下进行超声波破碎。对得到的破碎产物以5000转/分钟(rpm)离心20分钟，取上清液。在离心沉淀中加入200mL预冷的去离子水，重悬沉淀后再次以5000rpm离心20分钟，取上清液。然后，重复上述重悬、离心过程一次，取上清液。合并各次离心分离所得的上清液，即得到经预处理后的鹿茸浸提液680mL。
实施例2，鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的层析纯化及冻干剂的制备 向60mL实施例1中得到的鹿茸浸提液上样于Sephadex G75凝胶柱(2.6cm×110cm)(购自Amersham公司)，然后用蒸馏水以80ml/h的流速进行洗脱并用紫外检测仪在280nm波长处进行检测(洗脱图谱如图1所示)。通过如实施例3所述的检测方法检测各个洗脱级分经透析得到的产物，发现如图1中“目的蛋白峰”所指的峰为鹿茸碱性成纤维细胞生长因子。因此，收集该目的蛋白峰，由此得到纯化的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子溶液55mL。将得到的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子溶液装入透析袋，用聚乙二醇20000进行浓缩。然后将浓缩液冷冻，然后在-30～-50℃下用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到鹿茸碱性成纤维细胞生长因子冻干剂共210mg。
实施例3，碱性成纤维细胞生长因子的检测 根据《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年)和陈琼玉等的MTT比色法(中国病理生理杂志，2006，22(2)247-250)检测鹿茸碱性成纤维细胞生长因子。将实施例2得到的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子溶液进行等电聚焦电泳(以7.5％聚丙烯酰胺为支持介质，用pH3.5～10的两性电介质，150V聚焦4h)，电泳结束后以考马斯亮兰染色，电泳凝胶照片如图2所示，在约pH9.5处有碱性成纤维细胞生长因子单一条带，通过面积归一法进行图像分析得其纯度达到96.8％。用雪旺细胞的增殖来检测bFGF的生物活性以加入缓冲液的空白组为对照，在加入实施例2得到的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子溶液的实验组中，细胞显著增殖，生物活性为1.55×104IU/mL。
权利要求
1.具有碱性成纤维细胞生长因子活性的鹿茸提取物的制备方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步凝胶过滤层析。
2.提取鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步凝胶过滤层析。
3.根据权利要求2的方法，其中提取的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子纯度大于90％，优选大于95％。
4.根据权利要求1-3之任一的方法，其中所述凝胶过滤层析为Sephadex G75凝胶柱层析。
5.根据权利要求4的方法，其中层析包括，将鹿茸浸提液上样于SephadexG75凝胶柱，并且用水洗脱，收集含鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的峰。
6.根据权利要求1-5之任一的方法，其依次包括如下步骤
(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；
(2)将鹿茸浸提液上样于Sephadex G75凝胶柱，再用蒸馏水洗脱，收集含鹿茸碱性成纤维细胞生长因子的峰。
7.权利要求2-6之任一的方法提取的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子，优选其纯度大于90％，更优选大于95％。
8.权利要求1、4-6之任一的方法制备的具有碱性成纤维细胞生长因子活性的鹿茸提取物。
9.鹿茸碱性成纤维细胞生长因子冻干剂，其由权利要求8所述的鹿茸提取物冷冻干燥而得。
10.权利要求7所述的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子、权利要求8所述的鹿茸提取物或权利要求9所述的鹿茸碱性成纤维细胞生长因子冻干剂在制备用于刺激细胞分化和/或增殖的药品、食品和/或化妆品中的应用。
全文摘要
本发明涉及由鹿茸提取具有碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)活性的提取物的方法，其包括对鹿茸浸提液进行一步凝胶过滤层析。另外，本发明还涉及由该方法制备的富含碱性成纤维细胞生长因子的鹿茸提取物以及该鹿茸提取物在药品、食品和化妆品等方面的应用。
文档编号A61K35/32GK101214259SQ20071016463
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者朱成钢, 王利忠 申请人:王利忠