基于肽的体表着色试剂的制作方法

专利名称：：基于肽的体表着色试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及个人护理产品领域。更具体而言，本发明涉及包含体表结合肽和色素结合肽的二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂，其可以用于使色素与体表附着。
背景技术：
：关于体表例如毛发、皮肤和指甲的着色剂是众所周知的并且经常在个人护理产品中使用。毛发着色剂可以分成3个类别，具体而言，永久性、半永久性或直接的、和暂时的。永久性染发剂一般是提供持续约4-6周的毛发颜色的氧化染料。这些氧化染发剂由2部分组成，一部分包含氧化染料加上其他成分，而第二个部分包含氧化剂例如过氧化氢。2种组分紧在使用前混合。氧化剂使染料前体氧化，这随后组合以在毛千内形成大的颜色分子。尽管氧化染发剂提供持久的颜色，但它们包含的氧用于毛发并且提供关于约6-12^欠洗发;的颜色。这种类型的染发剂对;毛发是温和的，因为它不包含过氧化物，但毛发颜色不能够持续一样久。一些改善的耐久性通过使用具有10-500nm的粒度的纳米颗粒毛发着色材料来达到，如通过Hensen等人在WO01045652中所述。这些纳米颗粒毛发着色材料是常规的直接染发剂，其进行处理以获得纳米级尺度且显示到毛发内增加的吸附。暂时的染发剂是应用于毛发表面且在一次洗发后去除的着色剂。将希望开发提供永久性染发剂的耐久性而不使用损害毛发的氧化剂的毛发着色剂。关于目前的皮肤着色剂、非氧化染发剂以及指甲着色剂的主要问题是它们缺乏持久效应所需的必需耐久性。为此，已试图增强化妆品试剂与毛发、皮肤或指曱的结合。例如，Richardson等人在美国专利号5,490,980和Green等人在美国专利号6,267,957中描述了使用转谷氨酰6胺酶使化妆品试剂，例如皮肤调理剂、毛发调理剂、着色试剂、防晒剂和香料与毛发、皮肤和指甲共价附着。这种酶使化妆品试剂上的胺部分与皮肤、毛发和指曱中的谷氨酰胺残基交联。类似地，Green等人在WO0107009中描述了使用赖氨酸氧化酶以使化妆品试剂与毛发、皮肤和指甲共价附着。在另一种方法中，化妆品试剂已与蛋白质或蛋白水解产物共价附着。例如，Lang等人在美国专利号5,192,332中描述了包含动物或植物蛋白质或其水解产物的暂时着色组合物，其包含接枝到蛋白质链上的染料分子的残基。在那些组合物中，蛋白质充当调理剂且不增强化妆品试剂与皮肤、毛发或指曱的结合。Horikoshi等人在JP08104614中和Igarashi等人在美国专利号5,597,386中描述了毛发着色剂，其由与染料或色素共价附着的抗角蛋白抗体组成。该抗体与毛发结合，从而增强毛发着色剂与毛发的结合。类似地，Kizawa等人在JP09003100中描述了识别毛发的表面层的抗体及其处理毛发的用途。还描述了由与有色胶乳颗粒偶联的那种抗毛发抗体组成的毛发着色剂。抗体增强染料与毛发的结合的用途在增加毛发着色的耐久性中有效，但这些抗体对于生产是困难和昂贵的。Terada等人在JP2002363026中描述了由单链抗体优选地抗角蛋白组成的缀合物的用途，所述单链抗体与用于皮肤和毛发护理组合物的染料、配体和化妆品试剂偶联。单链抗体可以使用基因工程技术进行制备，但由于其大尺寸对于制备仍是困难和昂贵的。最后在WO00048558中描述了萼状蛋白(calycm)蛋白质，例如)3-乳球蛋白的用途，其包含关于化妆品试剂的结合结构域和另一种结合结构域，所述另一种结合结构域与关于调理剂、染料和香料的毛发纤维的表面或皮肤表面的至少部分结合。再次这些蛋白质是大型的且对于生产是困难和昂贵的。Linter在美国专利号6,620,419中描述了接枝到脂肪酸链的肽及其在化妆品和皮肤药学(derm叩harmaceutical)应用中的用途。选择那个公开内容中描述的肽，因为它们刺激胶原的合成；它们不是增强毛发和皮肤调理剂、以及毛发、指曱和皮肤着色剂的耐久性的特异性结合肽。已开发了基于肽的毛发调理剂、毛发着色剂及其他有利试剂，以改善这些组合物的耐久性(Huang等人，共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号2005/0050656，以及美国专利申请公开号2005/0226839)。基于肽的毛发调理剂或着色剂通过使对于毛发具有高结合亲和力的特定肽序列分别与调理剂或着色剂偶联进行制备。肽部分与毛发结合，由此强烈附着调理剂或着色剂。对于毛发具有高结合亲和力的肽已使用噬菌体展示筛选技术进行鉴定(Huang等人，同上；Estell等人WO0179479;Murray等人，美国专利申请公开号2002/0098524;Janssen等人，美国专利申请公开号2003/0152976;和Janssen等人，WO04048399)。此外，Reisch(CTzew.五"g.A^ws80:16-21(2002))4艮道了^殳计为靶向特定人组织的成分的肽家族，其已开发用于个人护理应用。然而，在那个出版物中未公开基于肽的调理剂或着色试剂的描迷。尽管这些基于肽的试剂在个人护理应用中提供了许多希望，但它们一般需要肽与着色剂的共价偶联。共价偶联化学可能是复杂和费时的，且增加试剂的成本。考虑到上文，存在用于体表例如毛发、皮肤、指甲和牙齿的着色剂的需要，其提供关于持久效应的改善的耐久性并且对于制备是容易和廉价的。申请人通过下述已解决了所述需要使用噬菌体展示筛选来鉴定以高亲和力与体表例如毛发、皮肤、指甲、牙齿、齿龈、皮肤和口腔表面特异性结合的肽序列，并且使其与特定色素结合肽偶联，以提供可以与色素结合使用以使体表着色的二嵌段和三嵌段基于肽的试剂。发明概述本发明提供了包含体表结合肽和色素结合肽的基于肽的体表着色试剂。这些基于肽的试剂可以与色素结合使用，以使体表例如毛发、皮肤、指曱和牙齿着色。体表结合肽与体表强烈结合并且色素结合肽与色素结合，从而使色素与体表附着。因此，在一个实施方案中，本发明提供了具有一般结构[(BSBP)m-(PBP)n]x的二嵌段基于肽的体表着色，其中a)BSBP是体表结合肽；b)PBP是色素结合肽；且c)m、n和x独立i也为l-约10。在另一个实施方案中，本发明提供了具有一般结构[[(BSBP)m-Sq]x-[(PBP)n-S丄]y的三嵌段、基于肽的体表着色试剂，其中a)BSBP是体表结合肽；b)PBP是色素结合肽；8c)S是分子间隔基；且d)m、n、x和z独立地为1-约10,y为1-约5,且其中q和r各自独立地为0或1，前提是r和q两者不可是0。在另一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的基于肽的体表着^(i)提供组合产生的噬菌体肽文库'；《,、'^(ii)使(i)的文库与体表接触以形成包含下述的反应溶液(A)噬菌体-肽-体表复合物；(B)未结合的体表，和(C)未复合的肽；(iii)分离(ii)的噬菌体-肽-体表复合物；(iv)从(iii)的分离的肽复合物中洗脱弱结合的肽；(v)通过直接使用在步骤(iv)后剩余的所述噬菌体-肽-体表复合物的聚合酶链反应，或通过用在步骤(iv)后剩余的噬菌体-肽-体表复合物直接感染细菌宿主细胞来鉴定剩余的结合的噬菌体-肽，在合适的生长培养基中培养受感染的细胞，并且从生长细胞中分离和鉴定噬菌体-肽。在另一个实施方案中，本发明提供了包含有效量的本发明基于肽的体表着色试剂的个人护理组合物，所述基于肽的体表着色试剂包含体表结合肽和色素结合肽。在类似实施方案中，本发明提供了用于使体表着色的方法，其包括a)提供色素；b)提供包含根据本发明的基于肽的体表着色试剂的组合物，其中体表结合肽对于体表具有亲和力，且色素结合肽对于色素具有亲和力；和c)将(a)的色素与(b)的组合物应用于体表足够使基于肽的体表着色试剂与色素和体表结合的时间。此外，本发明提供了包含基于肽的体表着色试剂的个人护理组合物，例如毛发着色、毛发调理、皮肤着色、皮肤调理、化妆品、口腔护理和指甲油组合物。附图简述和序列描述根据构成本申请的部分的下述详述、图和伴随序列描述可以更充分地了解本发明。图1是实施例17-20中描述的载体pKSIC4-HC77623的质粒图。下述序列符合37C.F.R.1.821-1.825("RequirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures腳theSequenceRules"),且与世界4、口i口、产才又纟且织、(WorldIntellectualPropertyOrganization)(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及管理i兌明(AdministrativeInstructions)的部分208和附录C)一致。用于核苦酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵照37C.F.R.§1.822中所述的规则。此处提供了光盘上的序列表。包含序列表的光盘的内容依照37CFR1.52(e)在此引入作为参考。SEQIDNO:1是毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:2是皮肤结合肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:3-52,54-59是毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO'.53是毛发结合肽和指甲结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO.'60是指甲结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:61是皮肤结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:62用于测序噬菌体DNA的寡核普酸引物。SEQIDNO:63是在如实施例5中描述的ELISA结合测定中用作对照的肽的氨基酸序列。SEQIDNO:64是半胱氨酸附着的毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO'.65是胱天蛋白酶3切割位点的氨基酸序列。SEQIDNOs:66、69和70是洗发剂抗性毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:67和68是如实施例8中所迷用于扩增洗发剂抗性、毛发结合噬菌体肽的引物的核苷酸序列。SEQIDNOs:71-74是实施例9使用的生物素化的毛发结合肽和皮肤结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:75是毛发调理剂抗性毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:76-98是毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:99-104是皮肤结合肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:105-109是以经验为主产生的毛发和皮肤结合肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:110-134是色素结合肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:135-137是肽间隔基的氨基酸序列。SEQIDNO:138-147是三嵌段基于肽的体表着色试剂的氨基酸序列。SEQIDNOs:148-151是编码作为SEQIDNOs:144-147给出的基于肽的体表着色试剂的核普酸序列。SEQIDNO:152是在实施例17-20中描述的质粒pKSIC4-HCC77623的核苷酸序列。SEQIDNOs:153-156是毛发调理剂和洗发剂抗性毛发结合肽的氨基酸序列。发明详述本发明提供了二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂，其包含直接或通过分子间隔基与至少一种色素结合肽偶联的至少一种体表结合肽。这些二嵌段和三嵌段基于肽的试剂可以与色素结合使用以使体表着色。本发明的组合物一般是基于肽的毛发和皮肤着色剂以及指曱油组合物。本发明的基于肽的二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂提供了超过个人护理产品开发中领域的利益和进步。因为试剂是基于肽的，所以它们能够与来自水性环境的体表强烈结合，因此在许多情况下是水溶性和耐水的。此外，因为试剂的含水性质，所以它们可以无需使用产生气味的化学药品从体表去除。本发明的试剂几乎立即与耙体表结合，从而消除了大多数个人护理应用中一般的长干燥时间的需要。此外，基于肽的体表着色试剂无需使体表结合肽与着色剂共价附着而使用。最重要的是，试剂的肽性质使得它们对于暴露的体表例如眼和嘴的皮肤和膜事实上是无毒和无刺激的。l要求和说明书的解释'HBP"意指毛发结合肽。'SBP"意指皮肤结合肽。'NBP"意指指曱结合肽。'OBP"意指口腔表面结合肽。'TBP"意指牙齿结合肽。'PBP"意指色素结合肽。"C"意指用于体表例如毛发、皮肤、指甲或牙齿的着色剂。"S"意指间隔基。"BSBP"意指体表结合肽。如本文所使用的，术语"本发明"意糸欠一般应用于如呈现的、或如随后修改和补充的权利要求中所述的本发明的所有实施方案。术语"肽"指通过肽键或经修饰的肽键彼此连接的2个或更多氨基酸。术语"体表"指可以充当基底用于结合二嵌段或三嵌段基于肽的体表着色试剂的人体的任何表面，所述基于肽的体表着色试剂包含至少一种体表结合肽和至少一种色素结合肽。一般的体表包括但不限于毛发、皮肤、指甲、牙齿和齿龈。如本文所使用的，术语"毛发"指任何类型的人毛发，包括眉毛、睫毛和其他面部毛发。如本文所使用的，术语"皮肤"指人皮肤、或人皮肤的替代物，例如猪皮肤、Vitro-Ski,和EpiDermTM。如本文作为体表使用的皮肤一般将包含上皮细胞层，并且可以另外包含内皮细胞层。如本文所使用的，术语"指甲"指人手指甲和脚趾甲。如本文所使用的，术语"偶联"指任何化学结合，并且包括共价和非共价相互作用。当其应用于体表结合肽的选择时，术语"严格性"指用于从体表洗脱肽的洗脱剂(一般为去污剂)的浓度。较高浓度的洗脱剂提供更严格的条件。术语"肽-体表复合物"意指包含经由肽上的结合位点与体表样品结合的肽的结构。术语"肽-毛发复合物"意指包含经由肽上的结合位点与毛发纤维结合的肽的结构。术语"肽-皮肤复合物"意指包含经由肽上的结合位点与皮肤结合的肽的结构。术语"肽-指曱复合物"意指包含经由肽上的结合位点与手指曱或脚趾甲结合的肽的结构。术语"肽-基底复合物"指肽-毛发、肽-皮肤、肽-指甲、或肽牙齿复合物。12术语"MB50"指结合肽的浓度，其产生的信号是在如实施例9中描述的基于ELISA的结合测定中获得的最大信号的50%。MB5o提供了复合物的组分的结合相互作用或亲和力的强度指示。MB5o值越低，肽与其相应基底的相互作用就越强。术语"结合亲和力"指结合肽与其各自的基底的相互作用的强度。结合亲和力在本文中就基于ELISA的结合测定中测定的MBso值而言进行定义。术语"纳米颗粒(nanoparticle)"在本文中定义为具有1-200nm的平均粒径的颗粒。优选地，颗粒的平均粒径为约1-40nm。如本文所1'吏用的，"粒度"和"粒径"具有相同含义。纳米颗粒包括但不限于金属、半导体、聚合物或硅石颗粒。术语"氨基酸"指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。下述缩写在本文中用于鉴定特定氨基酸氨基酸三字母单字母缩写缩写丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GinQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸lieI亮氨酸Leu赖氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV"基因"指表达特定蛋白质的核酸片段，包括在编码序列前(5'非编码序列)和后(3'非编码序列)的调节序列。"天然基因"指如在自然界中与其自身调节序列一起发现的基因。"嵌合基因"指并非天然的基因，包含在自然界中未一起发现的调节和编码序列的任何基因。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调节序列和编码序列，或衍生自相同来源但以与自然界中发现的那种不同的方式排列的调节序列和编码序列。"外来"基因指通常在宿主生物中未发现，但通过基因转移引入宿主生物内的基因。外来基因可以包含插入非天然生物内的天然基因、或嵌合基因。"合成基因，，可以由使用本领域技术人员已知的程序化学合成的寡核苷酸构件装配。这些构件进行连接且退火以形成基因区段，其随后酶促装配以构建完整基因。"化学合成的"当指DNA的序列时，意指组分核苷酸在体外进行装配。DNA的人工化学合成可以使用非常完善的程序来完成，或自动化的化学合成可以使用许多商购可得的机器之一来进行。因此，基因可以基于核苷酸序列的最优化就最佳基因表达进行适应，以反映宿主细胞的密码子偏倚。技术人员理解成功的基因表达的可能性，如果密码子使用朝向由宿主偏爱的那些密码子偏倚的话。优选密码子的确定可以基于衍生自其序列信息是可用的宿主细胞的基因的研究。"编码序列"指编码特定氨基酸序列的DNA序列。"合适的调节序列，，指位于编码序列上游(5'非编码序列)、之内或下游(3'非编码序列)，并且影响结合的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核芬酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎-环结构。"启动子"指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整体衍生自天然基因，或可以由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成DNA区段。本领域技术人员应当理解不同启动子可以指14导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同发育阶段时，或响应不同的环境或生理条件的表达。引起基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为"组成型启动子"。进一步认识到，因为在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全定义，所以不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。如本文所使用的，术语"表达"指衍生自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以指mRNA翻译成多肽。术语"转化"指核酸片段转移到宿主生物的基因组内，从而导致遗传上稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主生物称为"转基因"或"重组"或"转化"生物。术语"宿主细胞"指已由外源多核苷酸序列转化或转染，或能够由外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。术语"质粒"、"载体"和"盒"指通常携带这样的基因的额外染色体元件，所述基因不是细胞的中心代谢的部分，并且通常为环状双链DNA分子的形式。此种元件可以是衍生自任何来源，线状或环状，单链或双链DNA或RNA的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已连接或重组成独特的结构，其能够将关于所选择的基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3'非翻译序列引入细胞内。"转化盒"指这样的特定载体，其包含外来基因且具有除外来基因外促进特定宿主细胞的转化的元件。"表达盒"指这样的特定载体，其包含外来基因且具有除外来基因外允许那种基因在外来宿主中增强的表达的元件。术语"噬菌体"指感染细菌的病毒。改变的形式可以用于本发明的目的。优选的噬菌体衍生自称为M13的"野生型，，噬菌体。M13系统可以在细菌内生长，从而使得它不破坏它感染的细胞但使其连续产生新噬菌体。它是单链DNA噬菌体。术语"噬菌体展示"指功能外来肽或小蛋白质在噬菌体或噬菌粒颗粒表面上的展示。基因工程改造的噬菌体可以用于呈现肽作为其天然表面蛋白质的片段。肽文库可以通过用不同基因序列的噬菌体群体来生产。"PCR"或"聚合酶链反应"是用于扩增特定DNA区段的技术(美国专15利号4,683,195和4,800,159)。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,M/ecw/arC/om'"g.'jZ^6ora^oryA^"wwa/,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)(以下称为"Maniatis");和Silhavy,T.LBennan,M.L.和E叫uist，L.W.，￡>/7m',we""F脂'o肌ColdSpringHarborLaboratoryColdPressSpringHarbor,NY(1984);和由GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)出版的Ausubel,F.M.等人,CWTeW尸n^oco/sMo/ecw/or伤o/ogy描述。本发明提供了二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂，其包含直接或通过分子间隔基与至少一种色素结合肽偶联的至少一种体表结合肽。体表结合肽序列和色素结合肽序列可以使用组合方法例如噬菌体展示进行鉴定。此外，体表结合肽序列可以以经验为主产生。本发明的二嵌段和三嵌段基于肽的试剂可以经由直接或通过分子间隔基共价附着肽序列进行制备。可替代地，完整的二嵌段和三嵌段基于肽的试剂可以生物学生产。二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂可以与色素结合使用，以使体表例如毛发、皮肤、指甲和牙齿着色。体表本发明的体表是在人体上将充当基底用于结合肽的任何表面。一般的体表包括但不限于毛发、皮肤、指甲、牙齿、齿龈和口腔组织。在许多情况下，本发明的体表将暴露于空气，然而，在一些情况下，口月空例如，表面将是内部的。因此，体表可以包括上皮以及内皮细胞层。体表的样品可从多种来源获得。例如，人毛发样品例如从InternationalHairImportersandProducts(Bellerose,NY)商购可4寻,以不同颜色，例如棕色、黑色、红色和金黄色，和以各种类型，例如美籍非洲人、高加索人和亚洲人。此外，毛发样品可以例如使用过氧化氢进行处理以获得漂白的毛发。人皮肤样品可以得自尸体或体外人皮肤培养。此外，可从肉店和超市获得的猪皮肤、可从IMSInc.(Milford,CT)获得的Vitro-Skin、和可从MatTekCorp.(Ashland,MA)获得的EpiDermTM是关于人皮肤的良好替代物。人手指曱和脚趾甲可以得自志愿者。拔出的人牙齿和假牙可以得自牙科诊所。此外，可以许多形式例如从BerkeleyAdvancedBiomaterials,Inc.(SanLeandro,CA)^^f寻的幾石舞灰石可以用作关于人牙齿的模型。体表结合肽如本文所定义的，体表结合肽是以高亲和力与特定体表特异性结合的肽序列，所述体表包括但不限于例如毛发、指甲、牙齿、齿龈、皮肤和口腔组织。合适的体表结合肽序列可以使用本领域众所周知的组合方法进行选择，或可以以经验为主产生。如通过MB5Q值测量的，本发明的体表结合肽对于其各自的基底具有小于或等于约10—2M、小于或等于约1(^M、小于或等于约10^M、小于或等于约10—SM、优选小于或等于约10—6M、和更优选小于或等于约10々M的结合亲和力。本发明的组合产生的体表结合肽长度为约7个氨基酸-约50个氨基酸，更优选约7个氨基酸-约25个氨基酸。本发明的体表结合肽可以随机产生，然后基于其对目的表面的结合亲和力针对特定体表例如毛发、皮肤、指曱或牙齿样品进行选择。肽的随机文库的产生是众所周知的，并且可以通过多种技术来完成，所述技术包括细菌展示(Kemp，DJ.;淑/.爿c^/.园78(7):4520-4524(1981),和Helfman等人，尸rac.淑/.y4cadUSA80(1):31-35,(1983))、酵母展示(Chien等人，尸tocA^/^4cac/Sc,USA88(21):9578-82(1991))、组合固相肽合成(美国专利号5,449，754、美国专利号5,480,971、美国专利号5,585,275、美国专利号5，639,603)和噬菌体展示技术(美国专利号5,223,409、美国专利号5,403,484、美国专利号5,571,698、美国专利号5,837,500)。产生此种生物肽文库的技术在Dani，M.,0/7^c印tor&57g朋/Tra朋,21(4):447-468(2001)中得到描述。此外，噬菌体展示文库从公司例如NewEnglandBioLabs(Beverly,MA)商购可得。随机产生肽的优选方法是经由噬菌体展示。噬菌体展示是体外选择技术，其中肽或蛋白质与噬菌体的外壳蛋白遗传融合，从而导致融合肽展示在噬菌体病毒粒子的外部上，而编码融合物的DNA位于病毒粒子内。展示肽与编码其的DNA之间的这种物理联系允许筛选各自与相应的DNA序列连接的极大量肽变体，这通过称为"生物淘选(biopanning)"的简单的体外选择程序实现。以其最简单的形式，生物淘选通过下述来进行使噬菌体展示变体库与已固定化在板或珠上的目的靶一起温育，洗掉未结合的噬菌体，并且通过破坏噬菌体和耙之间的结合相互作用来洗脱特异性结合的噬菌体。洗脱的噬菌体随后在体内进行扩增，并且重复该过程，从而导致噬菌体库有利于最紧密的结合序列的逐步富集。3个或更多轮选择/扩增后，个别克隆通过DNA测序进行表征。更具体而言，在合适的肽文库已产生或购买后，该文库随后和合适量的测试基底具体地体表样品接触。使肽文库溶解于合适溶液中用于接触样品。体表样品可以悬浮于溶液中，或可以固定化在板或珠上。优选溶液是包含表面活性剂的緩沖水性盐水溶液。合适溶液是含0.5%Tween20的Tris緩沖盐水(TBS)。溶液可以另外通过任何方式进行搅动，以增加肽至体表样品的传质速率，从而缩短达到最大结合所需的时间。在接触后，许多随机产生的肽将与体表样品结合以形成肽-体表复合物，例如肽-毛发、肽-皮肤、肽-指甲、或肽-牙齿复合物。未结合的肽可以通过洗涤来去除。去除所有未结合的材料后，对于测试表面具有各种程度的结合亲和力的肽可以通过在具有各种严格性的緩沖液中的选择洗涤进行分级分离。增加使用的緩冲液的严格性增加在肽-体表复合物中肽和体表之间的所需键强度。许多物质可以用于改变肽选择中的緩冲溶液的严格性，包括但不限于，酸性pH(1.5-3.0);碱性pH(10-12.5);高盐浓度例如MgCl2(3-5M)和LiCl(5-10M);水；乙二醇(25-50%);二哂烷(5-20%);石危氰酸盐(1-5M);胍(2-5M);尿素(2-8M);和各种浓度的不同表面活性剂例如SDS(十二烷基石危酸钠)，DOC(脱氧胆酸钠)，NonidetP-40,TritonX-100,Tween20,其中Tween20是优选的。这些物质可以在緩冲溶液中制备，所述緩冲溶液包括但不限于Tris-HCl、Tns-緩冲盐水、Tris-硼酸盐、Tris-乙酸、三乙胺、磷酸盐緩冲液、和甘氨酸-HC1,其中Tris-緩冲盐水是优选的。应当理解对于体表基底具有渐增的结合亲和力的肽可以通过使用具有渐增严格性的緩冲液重复选择过程进行洗脱。洗脱的肽可以通过本领域已知的任何方法进行鉴定和测序。因此，可以使用用于产生体表结合肽的下述方法，例如毛发结合肽、皮肤结合肽、指甲结合肽、或牙齿结合肽。使组合产生的噬菌体-肽文库与目的体表接触，以形成噬菌体肽-体表复合物。使噬菌体-肽-体表复合物与未复合的肽和未结合的基底分开，并且来自噬菌体-肽-体表复合物的结合的噬菌体-肽优选通过酸处理从复合物中洗脱。随后，鉴定和测序洗脱的噬菌体-肽。为了鉴定与一种基底而非另一种结合的肽序列，例如与毛发结合但不与皮肤结合的肽，或与皮肤结合但不与毛发结合的肽，添加相减淘选步骤。特别地，组合产生的噬菌体-肽文库首先与非靶接触，以去除与之结合的噬菌体-肽。然后，非结合的噬菌体-肽与所需基底接触并且遵照上文过程。可替代地，组合产生的噬菌体-肽文库可以与非靶和所需基底同时接触。然后，使噬菌体-肽-体表复合物与噬菌体-肽-非靶复合物分开，且遵循上文对于所需噬菌体-肽-体表复合物描述的方法。在一个实施方案中，使用用于分离对于体表具有较高亲和力的肽的经修饰的噬菌体展示篩选法。在修饰的方法中，噬菌体-肽-体表复合物如上所述形成。随后，这些复合物用洗脱緩冲液进行处理。可以使用上文描述的任何一种洗脱緩沖液。优选地，洗脱緩沖液是酸性溶液。然后，剩余的、洗脱抗性的噬菌体-肽-体表复合物用于直接感染细菌宿主细胞，例如大肠杆菌co/z)ER2738。受感染的宿主细胞在合适的生长培养基例如LB(Luria-Bertani)培养基中进行培养，并且将这种培养物涂布在包含合适的生长培养基的琼脂上，所述生长培养基例如含IPTG(异丙基(3-D-硫代吡喃型半乳糖苷)和S-GaFM的LB培养基。生长后，挑取噬斑用于DNA分离，并且测序以鉴定对于目的体表具有高结合亲和力的肽序列。在另一个实施方案中，PCR可以用于鉴定来自上文描述的经修饰的噬菌体展示筛选法的洗脱抗性噬菌体-肽，这通过使用合适的引物对噬菌体-肽-体表复合物直接进行PCR,如由Janssen等人在美国专利申请公开号2003/0152976中所述，所述申请引入本文作为参考。毛发结合、皮肤结合、和指曱结合肽已使用上述方法进行鉴定，如由Huang等人在共同未决和共同拥有的美国专利申请公开号2005/0050656和美国专利申请公开号2005/0226839中所述，2个所述申请都引入本文作为参考。具体地，分离对于正常棕色毛发具有高亲和力的结合肽，作为SEQIDNOs:3-18、28-38、40-56和64给出；对于正常棕色毛发具有亲和力的洗发剂抗性肽，作为SEQIDNO:66、69和70给出；漂白的毛发，作为SEQIDNOs:7、8、19-27、38-40、43、44、47、57、58和59给出，手指曱，作为SEQIDNOs:53和60给出；和皮肤，作为SEQIDNO:61给出。此外，发现手指甲结合肽与漂白的毛19发结合，并且可以在本发明的基于肽的毛发试剂中使用。漂白的毛发结合肽将与手指曱结合，并且可以在本发明的基于肽的指甲试剂中使用。可替代地，毛发和皮肤结合肽序列可以通过设计包含带正电的氨基酸的肽以经验为主产生，其可以经由静电相互作用与毛发和皮肤结合，如由Rothe等人(WO2004/000257)所述。以经-睑为主产生的毛发和皮肤结合肽具有约4个氨基酸-约50个氨基酸，优选约4个-约25个氨基酸，且包含至少约40摩尔％带正电的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸。包含三肽基序例如HRK、RHK、HKR、RKH、KRH、KHR、HKX、KRX、RKX、HRX、KHX和RHX的肽序列是最优选的，其中X可以是任何天然氨基酸，但最优选地选自中性侧链氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸。此外，应当理解肽序列必须符合在最终使用中的其他功能需求，包括溶解性、粘性和与配制产物中的其他组分的相容性，并且因此将依应用的需要而变。在一些情况下，肽可以包含最高达60摩尔％的氨基酸，不包含组氨酸、赖氨酸或精氨酸。合适的以经验为主产生的毛发结合和皮肤肽包括但不限于SEQIDNOs:105-109。色素结合肽如本文定义的色素结合肽(PBP)是以高亲和力与色素特异性结合的肽序列。色素结合肽长度为约5个氨基酸-50个氨基酸，更优选地，约7个氨基酸-约12个氨基酸。例如，色素结合肽可以随机^生，然后基4其对^目的色素的结合亲和力针对特定色素进行选择，如由O'Brien等人在美国专利申请公开号2005/0054752中所述，所述申请引入本文作为参考。那种方法类似于上文对于体表结合肽的选择描述的那种。如本文所使用的，术语"色素"意指不溶性着色剂。广泛多样的单独或组合的有机和无机色素可以在本发明中使用。合适色素的例子包括但不限于D&CRedNo.36,D&CRedNo.30,D&COrangeNo.17,Green3Lake,ExtYellow7Lake,Orange4Lake,及Red28Lake;D&CRedNos.7、11、31和34的《丐色淀，D&CRedNo.12的钡色淀，D&CRedNo.13的锶色淀,FD&CYellowNo.5，FD&CYellowNo.6，FD&CNo.40,D&CRedNos.21、22、27和28,FD&CBlueNo.1,D&COrangeNo.5,D&CYellowNo.10的铝色淀，D&CRedNo.33的锆色淀；CromophthalYellow131AK(CibaSpecialtyChemicals)，SunfastMagenta122(SunChemical)和SunfastBlue15:3(SunChemical),氧化铁，碳酸钙，氲氧化铝，硫酸钓，高岭土，氰亚铁酸铁铵，碳酸镁，卡红，疏酸钡，云母，氯氧化铋，硬脂酸锌，锰紫(manganeseviolet),氧化铬，二氧化钛，二氧化钛納米颗粒，氧化锌，氧化钡，群青蓝，柠檬酸铋，和白色矿物质例如羟磷灰石，和Zircon(硅酸锆)，和炭黑颗粒。合适的色素结合肽的例子包括但不限于由O，Brien等人同上描述的那些，其对于下述色素具有高亲和力，炭黑，作为SEQIDNOs:110-113给出，CromophthalYellow,作为SEQIDNOs:114-122给出，SunfastMagenta,作为SEQIDNOs:123-125给出，和SunfastBlue,作为SEQIDNOs:122、126-134给出，以及由Nomoto等人在EP1275728中描述的那些，其对于炭黑、铜酞菁、二氧化钛和二氧化硅具有高亲和力。结合肽的生产本发明的体表结合肽和色素结合肽可以使用本领域众所周知的标准肽合成法进行制备(参见例如Stewart等人，5b/,J尸/"w尸e//We5y威MM，PierceChemicalCo.,Rockford,IL,1984;Bodanszky,/V&c/p/es。/尸e//7(ieS，7ze^,Springer-Verlag,NewYork,1984;和Pennington等人,Pe/"(ieS，f/ze、s/s/Votoco/s,HumanaPress,Totowa,NJ,1994)。此外，许多公司提供定制肽合成服务。可替4戈地，本发明的肽可以4吏用重组DNA和分子克隆4支术进行制备。编码毛发结合、皮肤结合或指曱结合肽的基因可以在异源宿主细胞中，特别是在微生物宿主的细胞中生产。用于表达本发明的结合肽的优选异源宿主细胞是微生物宿主，其可以在真菌或细菌家族内广泛找到，且可以在广泛的温度、pH值和溶剂耐受生长。因为转录、翻译和蛋白质生物合成装置是相同的，与细胞原种无关，所以功能基因被表达，与用于产生细胞生物量的碳原料无关。宿主菌抹的例子包括但不限于真菌或酵母物种，例如曲霉属(血/erg7〃ws)、木霉属(7Wc/zo<imw<2)、糖酵母属(Sacc/zarawyces)、毕赤氏酵母属(尸zc/Ha)、假丝酵母属(Cam/Wa)、汉逊氏酵母属(//a朋eww/a),或细菌物种例如沙门氏菌属(5^/wowe〃a)、芽孢杆菌属(Safd〃t")、不动杆菌属(v4"力"o/a"er)、红球菌属(朋cxioc;'(9ccz^)、链霉菌属(S/ye户tow少c^)、埃希氏菌属(￡^/^/vc/h")、假单胞菌属(T^ewt/omoww)、曱基单月包菌属(A^f/^/owow^)、甲基细菌属(iWef/^/oZ)acfer)、产石咸菌属(」/ca//gewes)、集月包蓝细菌属(5y"ec/zocj^/^)、鱼月星蓝纟田菌属(Jwa6"ewa)、石克斥干菌属(J7H'o6ac/〃ws)、曱烷涉干菌属(7Wer/z(3wo6""en'wm)和克雷伯氏菌属(if/e/w'e〃(2)。多种表达系统可以用于生产本发明的肽。此种载体包括但不限于染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、插入元件、酵母附加体(episoms)、病毒例如杆状病毒、逆转录病毒的载体，和衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件例如粘粒和噬菌粒的那些。表达系统构建体可以包含调节以及引起表达的调节区域。一般而言，在这点上，适合于在宿主细胞中维持、繁殖或表达多核普酸或多肽的任何系统或载体都可以用于表达。微生物表达系统和表达载体包含调节序列，其指导外来蛋白质的高水平表达，相对于宿主细胞的生长。调节序列是本领域技术人员众所周知的，并且例子包括但不限于引起基因表达响应化学或物理刺激打开或关闭的那些，包括载体中的调节元件的存在，例如增强子序列。这些中的任何一种都可以用于构建嵌合基因用于生产本发明的任何结合肽。这些嵌合基因随后可以经由转化引入合适的微生物内，以提供肽的高水平表达。用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域众所周知的。一般地，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列，一种或多种选择标记，和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含具有转录起始控制的基因的5'区域，和控制转录终止的DNA片段的3'区域。当2个控制区都衍生自与转化的宿主细胞同源的基因时，这是最优选的，尽管应当理解此种控制区无需衍生自对于选择为生产宿主的特定物种天然的基因。选择标记基因提供了表型性状用于选择转化的宿主细胞，例如大肠杆菌中的四环素或氨千青霉素抗性。用于驱动嵌合基因在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子是众多的且是技术人员熟悉的。事实上能够驱动基因的任何启动子都适合于生产本发明的结合肽，包括但不限于CTC八///W、GJZJ、04丄/0、爿Z)///、尸G《、i3//05、GJ尸Z)//、爿Z)C7、77^/、L^/13、Z^V2、EM9、777(用于在糖酵母菌属中的表达)；J(9X/(用于在毕赤氏酵母属中的表达)；和/ac、ara、化f、^、/7\、/尸a、77、fac和(用于在大肠22杆菌中表达)以及用于在芽孢杆菌属中表达的aw少、apr、"/r启动子和各种噬菌体启动子。终止控制区也可以衍生自对于优选宿主天然的各种基因。任选地，终止位点可能是不必要的，然而，如果包括则是最优选的。包含如上所述的合适的DNA序列、以及合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，以允许宿主表达本发明的肽。无细胞翻译系统也可以用于生产此种肽，其中使用衍生自本发明的DNA构建体的RNAs。任选地，可能希望作为转化宿主的分泌产物生产瞬时基因产物。所需蛋白质分泌到生长培养基内具有简单化和成本较低的纯化程序的优点。本领域众所周知的是分泌信号序列通常用于促进可表达蛋白质穿过细胞膜的主动转运。能够分泌的转化宿主的生成可以通过整合DNA序列来完成，所述DNA序列编码在生产宿主中有功能的分泌信号。用于选择合适的信号序列的方法是本领域众所周知的(参见例如EP546049和WO9324631)。分泌信号DNA或促进子(facilitator)可以位于表达控制DNA和瞬时基因或基因片段之间，并且在与后者相同的读框中。二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂本发明的基于肽的二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂经由使至少一种体表结合肽直接或通过分子间隔基与至少一种色素结合肽偶联来形成。试剂的体表结合肽部分与体表强烈结合，而色素结合序列与色素强烈结合，从而使色素与体表附着。本发明的二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂长度为约14个-约200个氨基酸，优选长度为约30-约130个氨基酸。合适的体表结合肽在上文得到描述，并且包括但不限于通过上文描述的筛选法选择的毛发结合、皮肤结合、指甲结合和牙齿结合肽，以及如上所述以经验为主产生的毛发和皮肤结合肽。此外，可以使用任何已知的体表结合肽，包括毛发结合肽例如SEQIDNO:1,和皮肤结合肽例如SEQIDNO:2，由Janssen等人在美国专利申请公开号2003/0152976中描述，和毛发结合肽例如SEQIDNOs:76-98，和皮肤结合肽例如SEQIDNOs:99-104,由Janssen等人在WO04048399中描述，所述2个申请引入本文作为参考。此外，可以使用毛发调理剂抗性毛发结合肽例如SEQIDNO:75,由Wang等人(美国专利申请号60/657496描述，以及毛发调理剂和洗发剂抗性毛发结合肽例如SEQIDNOs:153-156，如由O'Brien等人(美国专利申请号11/251715)描述的。合适的色素结合肽在上文得到描述，并且包括通过上文描述的筛选法选择的色素结合肽。此外，可以使用任何已知的色素结合肽，例如由Nomoto等人在EP1275728中描述的与炭黑、铜酞菁、二氧化钛和二氧化硅结合的肽。本发明的二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂经由使至少一种体表结合肽直接或通过任选的间隔基与至少一种色素结合肽偶联进行制备。偶联相互作用可以是共价键或非共价相互作用，例如氢键合、静电相互作用、疏水相互作用或范德瓦尔斯相互作用。在非共价相互作用的情况下，基于肽的体表着色试剂可以通过下述进行制备使至少一种体表结合肽、至少一种色素结合肽和任选的间隔基(如果使用)混合，且允许用于相互作用发生的足够时间。未结合的材料可以使用本领域已知的方法与所得到的基于肽的体表着色试剂分开，例如凝胶渗透层析。本发明的基于肽的体表着色试剂也可以经由使至少一种体表结合肽直接或通过间隔基与至少一种色素结合肽共价附着进行制备。任何已知的肽或蛋白质缀合化学都可以用于形成本发明的基于肽的体表着色试剂。缀合化学是本领域众所周知的(参见例如，Hermanson,i9z'0(:'o"ywg"^7ec/zm々wes,AcademicPress,NewYork(1996))。合适的偶联剂包括但不限于碳二亚胺偶联剂、二酸氯化物、二异氰酸酯和针对肽上的末端胺和/或羧酸基团反应的其他双功能偶联试剂。优选的偶联剂是碳二亚胺偶联剂，例如l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N,N，-二环己基-碳二亚胺(DCC),其可以用于活化羧酸基团。此外，可能必须保护肽上的反应性胺或羧酸基团，以产生用于基于肽的体表着色试剂的所需结构。用于氨基酸的保护基团例如叔丁氧羰基(t-Boc)的使用是本领域众所周知的(参见例如，Stewart等人，同上；Bodanszky,同上；和Pennington等人，同上)此外，由至少一种体表结合肽和至少一种色素结合肽组成的二嵌段基于肽的体表着色试剂可以使用上文描述的重组DNA和分子克隆技术进行制备。还可能希望使体表结合肽经由间隔基与色素结合肽偶联以形成三嵌段体表着色试剂。间隔基用于分离结合肽序列以确保个别肽的结合亲和力不会不利地受偶联影响。间隔基还可以提供其他所需性质，例如亲水性、疏水性、或用于切割肽序列以促进着色试剂去除的方法。间隔基可以是多种分子中的任何一种，例如烷基链、苯基化合物、乙二醇、酰胺、酯等。优选的间隔基是亲水的，且具有1-约100个原子的链长，更优选地，2-约30个原子。优选间隔基的例子包括但不限于乙醇胺、乙二醇、具有6个碳原子的链长的聚乙烯、具有3-6个重复单位的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺(propanolamide)、丁二醇、丁二醇酰胺(butyleneglycolamide)、丙基苯基链、以及乙基、丙基、己基、硬脂基(steryl)、鲸蜡基和棕榈酰烷基链。间隔基可以使用上文描述的任何偶联化学与体表结合和色素结合肽序列共价附着。为了促进间隔基的掺入，可以使用在2个末端上包含间隔基和反应基团用于与肽偶联的双功能交联剂。合适的双功能交联剂是本领域众所周知的，并且包括但不限于二胺，例如l,6-二氨基己烷；二醛，例如戊二醛；双N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)，二琥珀酰亚胺基戊二酸酯，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯，和乙二醇-双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)；二异氰酸酯例如1,6-己二异氰酸酯；双环氧乙烷，例如1,4-丁二基(butanediyl)二环氧甘油醚；二叛酸，例如琥珀酰二水杨酸酯等。还可以使用在每个末端上包含不同反应基团的异双功能交联剂。异双功能交联剂的例子包括但不限于具有下述结构的化合物其中R!是H或取代基例如-S03Na,-N〇2或-Br;且尺2是间隔基例如-CH2CH2(乙基)，-(CH2)3(丙基)或-(CH2)3C6H5(丙基苯基)。此种异双功能交联剂的例子是3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。这些试剂的N-羟基琥珀酰亚胺酯基团与一种肽上的胺基反应，而马来酰亚胺基与另一种肽上存在的硫醇基反应。硫醇基可以通过给结合肽序列的至少一个末端(即，C末端或N末端)添加至少一个半胱氨酸基团而掺入肽内。几个间隔基氨基酸残基，例如甘氨酸，可以掺入结合肽25序列和末端半胱氨酸之间，以使反应性硫醇基与结合序列分开。此外，至少一个赖氨酸残基可以加入结合肽序列的至少一个末端，即C末端或N末端，以提供胺基用于偶联。此外，间隔基可以是包含任何氨基酸及其混合物的肽。优选的肽间隔基包含氨基酸甘氨酸、丙氨酸、和丝氨酸、及其混合物。此外，肽间隔基可以包含特异性酶切割位点，例如由SEQIDNO:65给出的蛋白酶胱天蛋白酶3位点，其允许色素从毛发处酶促去除。肽间隔基长度可以为l-约50个氨基酸，优选l-约20个氨基酸。合适的间隔基的例子包括但不限于由SEQIDNOs:135-137给出的序列。这些肽间隔基可以通过本领域已知的任何方法与结合肽序列连接。例如，完整的三嵌段基于肽的体表着色试剂可以使用上文描述的标准肽合成法进行制备。此外，结合肽和肽间隔基嵌段可以使用如上所述的碳二亚胺偶联剂(参见例如，Hermanson,说'oc'呵'wg她rec/w一es,AcademicPress,NewYork(19%)))、二酸氯化物、二异氰酸酯和与肽上的末端胺和/或羧酸基团反应的其他双功能偶联试剂进行组合。可替代地，完整的三嵌段基于肽的体表着色试剂可以使用上文描述的重组DNA和分子克隆技术进行制备。间隔基还可以是肽间隔基和有机间隔基分子的组合，其可以使用上文描述的方法进行制备。三嵌段体表着色试剂的例子包括但不限于作为SEQIDNOs:138-147给出的序列。还可能希望具有偶联在一起的体表结合肽和色素结合肽的多个拷贝，以增强基于肽的体表着色试剂与体表和色素之间的相互作用，如由Huang等人(美国专利申请公开号2005/0050656)描述的。可以使用相同的体表结合肽和色素结合肽的多个拷贝或不同的体表结合肽和色素结合肽的组合。多拷贝基于肽的体表着色试剂可以包含如上所述的各种间隔基。多拷贝体表结合肽-色素结合肽体表着色试剂的例子包括但不限于作为SEQIDNOs:144、145和147给出的序列。在本发明的一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[(BSBP)m-(PBP)n]x、包含体表结合肽(BSBP)和色素结合肽(PBP)的二嵌^:组合物，其中n和m独立地为1-约10，优选1-约5，且x可以是1-约10。在另一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂包含如上所述的使体表结合肽与色素结合肽分开的分子间隔基(S)。还可以使用体表结合肽和色素结合肽的多个拷贝，并且体表结合肽和色素结合肽的多个拷贝可以通过分子间隔基与它们自己和彼此分开。在这个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[[(BSBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y、包含体表结合肽、间隔基和色素结合肽的三嵌段组合物，其中n、m、x和z独立地为1-约10,y为1-约5,并且其中q和r各自独立地为0或1,前提是q和r两者不是0。优选地，m和n独立地为l-约5，并且x和z为1-约3。在另一个实施方案中，体表结合肽是毛发结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[(HBP)m-(PBP)n]x、包含毛发结合肽(HBP)和色素结合肽(PBP)的二嵌段组合物，其中n和m独立地为1-约10,优选1-约5,并且x可以是l-约10。在另一个实施方案中，体表结合肽是毛发结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[[(HBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y、包含毛发结合肽(HBP)、间隔基(S)和色素结合肽(PBP)的三嵌段组合物，其中n、m、x和z独立地为l-约10,y为l-约5,并且其中q和r各自独立地为0或1，前4是是q和r两者不是0。优选地，m和n独立地为l-约5，并且x和z为l-约3。在另一个实施方案中，体表结合肽是皮肤结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[(SBP)m-(PBP)n]x、包含皮肤结合肽(SBP)和色素结合肽(PBP)的二嵌段组合物，其中n和m独立地为l-约10,优选1-约5,并且x可以是l-约10。在另一个实施方案中，体表结合肽是皮肤结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[[(SBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y、包含皮肤结合肽(SBP)、间隔基(S)和色素结合肽(PBP)的三嵌段组合物，其中n、m、x和z独立地为l-约10,y为l-约5,并且其中q和r各自独立地为0或1，前一是是q和r两者不是0。优选地，m和n独立地为l-约5,并且x和z为l-约3。在另一个实施方案中，体表结合肽是指甲结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[(NBP)m-(PBP)n]x、包含指甲结合肽(NBP)和色素结合肽(PBP)的二嵌段组合物，其中n和m独立地为l-约10,优选1-约5,并且x可以是l-约10。在另一个实施方案中，体表结合肽是指曱结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[[(NBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y、包含指曱结合肽(NBP)、间隔基(S)和色素结合肽(PBP)的三嵌段组合物，其中n、m、x和z独立地为l-约10,y为l-约5,并且其中q和r各自独立地为O或l,前纟是是q和r两者不是0。优选地，m和n独立地为l-约5，并且x和z为l-约3。在另一个实施方案中，体表结合肽是牙齿结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[(TBP)m-(PBP)n]x、包含牙齿结合肽(TBP)和色素结合肽(PBP)的二嵌段组合物，其中n和m独立地为l-约10,优选1-约5,并且x可以是l-约10。在另一个实施方案中，体表结合肽是牙齿结合肽，且基于肽的体表着色试剂是具有一般结构[[(TBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y、包含牙齿结合肽(TBP)、间隔基(S)和色素结合肽(PBP)的三嵌段组合物，其中n、m、x和z独立地为l-约10,y为l-约5,并且其中q和r各自独立地为O或l,前一是是q和r两者不是0。优选地，m和n独立地为l-约5,并且x和z为l-约3。应当理解如本文所使用的，BSBP、HBP、SBP、NBP、TBP和PBP是一般命名，并且不分别意指单个体表结合肽、毛发结合肽、皮肤结合肽、指甲结合肽、牙齿结合或色素结合肽序列。当如上文使用的m或n大于1时，提供其中一系列不同序列的体表结合肽和不同序列的色素结一般;语并且不意指单:间隔基！当如上文关于三嵌段组合物使用的x和y大于1时，提供其中一系列不同间隔基可以形成组合物的部分的情况完全在本发明的范围内。还应当理解这些结构不一定代表肽和任选的分子间隔基之间的共价键。如上所述，肽和任选的间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的。个人护理组合物本发明的二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂可以与一种或多种色素结合用于个人护理组合物中，以使体表例如毛发、皮肤、指甲和牙齿着色。基于肽的体表着色试剂的体表结合肽嵌段对于体表具有亲和力，而色素结合肽嵌段对于使用的色素具有亲和力，从而使色素与体表附着。基于肽的体表着色试剂可以存在于与色素相同的组合物中，或基于肽的体表着色试剂和色素可以存在于2种不同的个人护理组合物中，其如下所述以任何顺序应用于体表。个人护理组合物包括但不限于毛发护理组合物、毛发着色组合物、皮肤护理组合物、化妆品组合物、指曱油纟且合物、和口力空护理组合物。毛发护理组合物在一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是毛发护理组合物的组分，且基于肽的体表着色试剂包含至少一种毛发结合肽。毛发护理组合物在本文中定义为用于处理毛发的组合物，包括但不限于洗发剂、护理剂、润丝、洗剂、气溶胶、凝胶和摩丝。用于在毛发护理组合物中使用的有效量的基于肽的体表着色试剂是相对于组合物总重量的按重量计约0.01%-约10%,优选约0.01%-约5%的浓度。这个比例可以依毛发护理组合物的类型而变。此外，毛发护理组合物可以进一步包含至少一种色素。合适的色素在上文得到描述。与色素浓度相关的基于肽的体表着色试剂的浓度可能需要就最佳结果进行最优化。此外，对于不同色素具有亲和力的不同基于肽的体表着色试剂的混合物可以在组合物中使用。混合物中的基于肽的体表着色试剂需要进行选择，从而使得在肽之间不存在减轻有利效应的相互作用。基于肽的体表着色试剂的合适混合物可以由本领域技术人员使用常规实验进行测定。如果基于肽的体表着色试剂的混合物在组合物中使用，那么试剂的总浓度是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约10重量％。组合物可以进一步包含化妆品上可接受的用于毛发护理组合物的介质，所述介质的例子由Philippe等人在美国专利号6,280,747中，以及由Omura等人在美国专利号6,139，851和Cannell等人在美国专利号6,013,250中进行描述，所有所述专利都引入本文作为参考。例如，这些毛发护理组合物可以是水性、醇或水性-醇溶液，醇优选是乙醇或异丙醇，以相对于水性-醇溶液总重量的约1-约75重量％的比例。此外，毛发护理组合物可以包含一种或多种常规化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB遮光剂、日用香料、增稠剂、湿润剂以及阴离子、非离子或两性聚合物和染料。毛发着色组合物在另一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是毛发着色組合物的组分，且基于肽的体表着色试剂包含至少一种毛发结合肽。毛发着色组29合物在本文中定义为用于使毛发着色或染色的组合物，其包含一种或多种着色剂。如本文定义的，着色剂是可以用于改变体表例如毛发、皮肤、指曱或牙齿的颜色的任何染料、色素等。毛发着色剂是本领域众所周知的(参见例如Green等人同上，CF7^//7&r"""o腦/CWor//朋必od,第2版，MicellePress,England(1992)和Co扁e"cT/awc/ZwoA:,USFoodandDrugAdministration,FDA/IASBooklet(1992))，并且从各种来源商购可得(例如Bayer,Pittsburgh,PA;Ciba-Geigy,Tarrytown,NY;ICI,Bridgewater，NJ;Sandoz,Vienna,Austria;BASF,MountOlive,NJ;和Hoechst,Frankfurt,Germany)。用于在毛发着色组合物中使用的有效量的基于肽的体表着色试剂在本文中定义为相对于组合物总重量的约0.01重量％-约20重量％的比合物可以在组合物中使用。混合物中的基于肽的体表着色试剂需要进行选择，从而使得在肽之间不存在减轻有利效应的相互作用。基于肽的体表着色试剂的合适混合物可以由本领域技术人员使用常规实验进行测定。如果基于肽的体表着色试剂的混合物在组合物中使用，那么试剂的总浓度是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约20重量％。用于毛发着色组合物的化妆品上可接受的介质的组分由Dias等人在美国专利号6，398,821中和Deutz等人在美国专利号6,129,770中进行描述，所述2个专利都引入本文作为参考。例如，毛发着色组合物可以包含螯合剂、稳定剂、增稠剂、緩冲剂、载体、表面活性剂、溶剂、抗氧化剂、聚合物和调理剂。皮肤护理组合物在另一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是皮肤护理组合物的组分，且基于肽的体表着色试剂包含至少一种皮肤结合肽。皮肤护理组合物在本文中定义为用于处理皮肤的组合物，包括但不限于护肤用品、皮肤清洁剂、美容品和抗皱产品。用于在皮肤护理组合物中使用的有效量的基于肽的体表着色试剂是相对于组合物总重量的按重量计约0.01%-约10%，优选约0.01%-约5%的浓度。这个比例可以依皮肤护理组合物的类型而变。此外，对于不同色素具有亲和力的不同基于肽的体表着色试剂的混合物可以在组合物中使用。混合物中的基于肽的体表着色30用。基于肽的体表着色试剂的合适混合物可以由本领域技术人员使用常规实验进行测定。如果基于肽的体表着色试剂的混合物在组合物中使用，那么试剂的总浓度是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约10重量％。皮肤护理组合物可以进一步包含至少一种色素，所述色素的合适例子在上文给出。与色素浓度相关的基于肽的体表着色试剂的浓度可能需要就最佳结果进行最优化。组合物可以进一步包含用于皮肤护理组合物的化妆品上可接受的介质，所述介质的例子由Philippe等人同上进行描述。例如，化妆品上可接受的介质可以是包含脂肪物质的无水组合物，其比例一般是相对于组合物总重量的约10-约90重量％,其中脂肪相包含至少一种液体、固体或半固体脂肪物质。脂肪物质包括但不限于油、蜡、树胶、和所谓的糊状脂肪物质。可替代地，组合物可以是合适分散体的形式，例如油包水或水包油乳剂。此外，组合物可以包含一种或多种常规化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB遮光剂、日用香料、增稠剂、湿润剂以及阴离子、非离子或两性聚合物和染料。皮肤着色組合物在另一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是皮肤着色组合物的组分，且基于肽的体表着色试剂包含至少一种皮肤结合肽。皮肤着色组合物包含一种或多种着色剂。可以使用上文描述的着色剂中的任何一种。皮肤着色组合物可以是任何化妆品或美容品产品，包括但不限于粉底、腮、红、口红、唇线笔、透明高光亮唇膏、眼影和眼线笔。这些可以是包含化妆品上可接受的介质的无水美容品产品，所述介质其包含脂肪物质，或它们可以是合适分散体的形式，例如如上所述的油包水或水包油乳剂。在这些组合物中，有效量的基于肽的体表着色试剂一般是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约40重量％。此外，对于不同色素具有亲和力的不同基于肽的体表着色试剂的混合物可以在组合物中使用。混合物中的基于肽的体表着色试剂需要进行选择，从而使得在肽之间不存在减轻有利效应的相互作用。基于肽的体表着色试剂的合适混合物可以由本领域技术人员使用常规实验进行测定。如果基于肽的体表着色试剂的混合物在组合物中使用，那么试剂的总浓度是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约40重量％。化妆品组合物在另一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是化妆品组合物的组分，且基于肽的体表着色试剂包含至少一种毛发结合肽。如本文定义的，化妆品组合物是可以应用于睫毛或眉毛的组合物，包括但不限于睫毛油和画眉笔。这些化妆品组合物包含一种或多种着色剂。可以使用上文描述的着色剂中的任何一种。用于在化妆品组合物中使用的有效量的基于肽的体表着色试剂在本文中定义为相对于组合物总重量的约0.01重量％-约20重量％的比例。此外，对于不同色素具有亲和力的不同基于肽的体表着色试剂的混合物可以在组合物中使用。混合物中的基于肽的体表着色试剂需要进行选择，从而使得在肽之间不存在减轻有利效应的相互作用。基于肽的体表着色试剂的合适混合物可以由本领域技术人员使用常规实验进行测定。如果基于肽的体表着色试剂的混合物在组合物中使用，那么试剂的总浓度是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约20重量％。化妆品组合物可以是包含化妆品上可接受的介质的无水美容品产品，其包含比例一般是相对于组合物总重量的约10-约90重量％的脂肪物质，其中如上所述脂肪相包含至少一种液体、固体或半固体脂肪物质。脂肪物质包括但不限于油、蜡、树胶、和所谓的糊状脂肪物质。可替代地，这些组合物可以是合适分散体的形式，例如如上所迷的油包水或水包油乳剂。指曱油组合物在另一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是指甲油组合物的组分，且基于肽的体表着色试剂包含至少一种指甲结合肽。指甲油组合物用于使手指甲和脚趾曱着色，并且包含一种或多种着色剂。可以使用上文描述的着色剂中的任何一种。用于在指甲油组合物中使用的有效量的基于肽的体表着色试剂在本文中定义为相对于组合物总重量的约0.01重量％-约20重量％的比例。此外，对于不同色素具有亲和力的不同基于肽的体表着色试剂的混合物可以在组合物中使用。混合物中的基于肽的体表着色试剂需要进行选择，从而使得在肽之间不存在减轻有利效应的相互作用。基于肽的体表着色试剂的合适混合物可以由本领域技术人员使用常规实验进行测定。如果基于肽的体表着色试剂的混合物在组合物中使用，那么试剂的总浓度是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约20重量％。用于指曱油组合物的化妆品上可接受的介质的组分由Philippe等人同上进行描述。指曱油组合物一般包含溶剂和成膜物质，例如纤维素衍生物、聚乙烯衍生物、丙烯酸类聚合物或共聚物、乙烯共聚物和聚酯聚合物。此外，指曱油可以包含增塑剂，例如磷酸三甲苯酯、笨甲酸千酯、磷酸三丁酯、乙酰蓖酸丁酯、柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、邻苯二曱酸二丁酯或樟脑。口腔护理组合物在另一个实施方案中，基于肽的体表着色试剂是口腔护理组合物的组分，且基于肽的体表着色试剂包含至少一种牙齿结合肽。本发明的口腔护理组合物包含至少一种白色着色剂且用于使牙齿变白。可以在口腔护理组合物中使用的合适的白色着色剂包括但不限于白色色素例如二氧化钛和二氧化钛纳米颗粒；和白色矿物质例如羟^寿灰石和Zircon(石圭酸锆)。本发明的口腔护理组合物可以为粉末、糊剂、凝胶、液体、软膏或片剂的形式。示例性口腔护理组合物包括但不限于，牙膏、牙乳膏、凝胶或牙4分、漱口剂、口腔清新剂和牙线。口腔护理组合物包含在口部可接受的载体介质中有效量的本发明的基于肽的体表着色试剂。用于在口腔护理组合物中使用的有效量的基于肽的体表着色试剂可以依产品的类型而变。一般地，有效量的基于肽的体表着色试剂是相对于组合物总重量的约0.01重量％-约90重量％的比例。此外，对于不同色素具有亲和力的不同基于肽的体表着色试剂的混合物可以在组合物中使用。混合物中的基于肽的体表着色试剂需要进行选择，从而使得在肽之间不存在减轻有利效应的相互作用。基于肽的体表着色试剂的合适混合物可以由本领域技术人员使用常规实验进行测定。如果基于肽的体表着色试剂的混合物在组合物中使用，那么试剂的总浓度是相对于组合物总重量的约0.001重理％-约90重量％。口部可接受的载体介质的组分由White等人在美国专利号6,740,311中；Lawler等人在美国专利号6,706,256中；和Fuglsang等人在美国专利号6,264,925中进行描述；所有所述专利都引入本文作为参考。例如，口腔护理组合物可以包含下述中的一种或多种磨料、表面活性剂、螯合剂、氟化物来源、增稠剂、緩冲剂、溶剂、吸湿剂、载体、膨胀剂、和口部有利试剂，例如酶、防牙菌斑剂、防污剂、抗;微生物剂、防龋剂、调。未剂、冷却剂和流;延剂。用于使体表着色的方法
技术领域：
：本发明的基于肽的体表着色试剂可以与一种或多种色素结合使用，以使体表例如毛发、皮肤、指曱和牙齿着色。基于肽的体表着色剂的体表结合肽嵌段对于体表具有亲和力，而色素结合肽嵌段对于使用的色素具有亲和力。基于肽的体表着色试剂可以存在于与色素相同的组合物中，或基于肽的体表着色试剂和色素可以存在于2种不同的组合物中。在一个实施方案中，将包含至少一种基于肽的体表着色剂和至少一种色素的个人护理组合物应用于体表足够基于肽的体表着色剂与体表结合的时间，所述基于肽的体表着色剂经由色素结合肽嵌段与色素偶联。在另一个实施方案中，至少一种色素在包含至少一种基于肽的体表着色试剂的组合物应用前应用于体表。在另一个实施方案中，包含至少一种基于肽的体表着色试剂的组合物在至少一种色素应用前应用于体表。在另一个实施方案中，至少一种色素和包含至少一种基于肽的体表着色试剂的组合物伴随地应用于体表。任选地，包含基于肽的体表着色试剂的组合物可以在色素应用和包含基于肽的体表着色试剂的组合物最初应用后再次应用于体表。另外，包含聚合密封剂的组合物可以在色素和包含基于肽的体表着色试剂的组合物应用后应用于体表。用于使毛发着色的方法
技术领域：
：本发明的基于肽的体表着色试剂可以用于使色素和毛发的表面附着，从而使毛发着色。基于肽的体表着色试剂和色素可以从任何合适的毛发护理组合物应用于毛发，例如毛发着色剂或毛发调理剂组合物。这些毛发护理组合物是本领域众所周知的，并且合适的组合物在上文得到描述。间，一般为约5秒-约60分钟。任选地，毛发可以进行沖洗以去除与毛发未结合的色素。然后，将包含基于肽的体表着色试剂的组合物应用于毛发足够体表着色试剂与毛发和色素结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。包含基于肽的体表着色试剂的组合物可以从毛发中冲洗或留在毛发上。34在另一个实施方案中，将包含基于肽的体表着色试剂的组合物应用于毛发足够体表着色试剂的毛发结合肽嵌段与毛发结合的时间，一般为组合物。然后，将色素应用于毛发i够色素与体表着色试剂的色素结合嵌段结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。未结合的色素可以从毛发中冲洗或留在毛发上。在另一个实施方案中，将色素和包含基于肽的体表着色试剂的组合物伴随地应用于毛发足够体表着色试剂与毛发和色素结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。任选地，毛发可以进行沖洗以乂人毛发中去除未结合的色素和包含基于肽的体表着色试剂的组合物。在另一个实施方案中，色素作为包含基于肽的体表着色试剂的组合物的部分提供，例如毛发着色组合物。将包含色素和体表着色试剂的组合物应用于毛发足够体表着色试剂与毛发结合的时间，所述体表着色试剂通过色素结合肽嵌段与色素偶联，一般为约5秒-约60分钟。包含色素和体表着色试剂的组合物可以从毛发中冲洗或留在毛发上。在上文描述的任何一种方法中，包含基于肽的体表着色试剂的组合物可以任选在色素应用和包含基于肽的体表着色试剂的组合物最初应用后再次应用于毛发，以进一步增强着色剂的耐久性。此外，在上文描述的任何一种方法中，包含聚合密封剂的组合物可以任选在色素和包含基于肽的体表着色试剂的组合物应用后应用于毛发，以进一步增强着色剂的耐久性。包含聚合密封剂的组合物可以是包含聚合密封剂的水溶液或毛发护理组合物，例如调理剂或润丝。一般地，聚合密封剂以相对于组合物总重量约0.25重量％-约10重量％的浓度存在于组合物中。聚合密封剂是个人护理产品领域中众所周知的，并且包括但不限于聚烯丙胺、丙烯酸酯、丙烯酸酯共聚物、聚氨基甲酸酯、卡波姆、聚甲基硅氧烷(methicones)、氨基二曱聚硅氧烷(amodimethicones)、聚乙二醇(polyethyleneneglycol)、蜂蜡、硅氧烷等。聚合密封剂的选择依赖于使用的具体色素和基于肽的体表着色试剂。最佳聚合密封剂可以由本领域技术人员使用常规实验容易地测定。用于使皮肤着色的方法
技术领域：
：本发明的基于肽的体表着色试剂可以用于使色素和皮肤的表面附着，从而使皮肤着色。基于肽的体表着色试剂和色素可以从任何合适的皮肤护理组合物应用于皮肤，例如皮肤着色剂或皮肤调理剂组合物。这些皮肤护理组合物是本领域众所周知的，并且合适的组合物在上文得到描述。在一个实施方案中，将色素应用于皮肤足够色素与皮肤结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。任选地，皮肤可以进行沖洗以去除与皮肤未结合的色素。然后，将包含基于肽的体表着色试剂的组合物应用于皮肤足够体表着色试剂与皮肤和色素结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。包含基于肽的体表着色试剂的组合物可以从皮肤中冲洗或留在皮肤上。在另一个实施方案中，将包含基于肽的体表着色试剂的组合物应用于皮肤足够体表着色试剂的皮肤结合肽嵌段与皮肤结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。任选地，皮肤可以进行冲洗以去除未与皮肤结合的组合物。然后，将色素应用于皮肤足够色素与体表着色试剂的色素结合嵌段结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。未结合的色素可以从皮肤中冲洗或留在皮肤上。在另一个实施方案中，将色素和包含基于肽的体表着色试剂的组合物伴随地应用于皮肤足够体表着色试剂与皮肤和色素结合的时间，一般为约5秒-约60分钟。任选地，皮肤可以进行沖洗以,人皮"夫中去除未结合的色素和包含基于肽的体表着色试剂的组合物。在另一个实施方案中，色素作为包含基于肽的体表着色试剂的组合物的部分提供，例如皮肤着色组合物。将包含色素和体表着色试剂的组合物应用于皮肤足够体表着色试剂与皮肤结合的时间，所述体表着色试剂通过色素结合嵌段与色素偶联，一般为约5秒-约60分钟。包含色素和体表着色试剂的组合物可以从皮肤中冲洗或留在皮肤上。在上文描述的任何一种方法中，包含基于肽的体表着色试剂的组合物可以任选在色素应用和包含基于肽的体表着色试剂的组合物最初应用后再次应用于皮肤，以进一步增强着色剂的耐久性。此外，在上文描述的任何一种方法中，包含聚合密封剂的组合物可以任选在色素和包含基于肽的体表着色试剂的组合物应用后应用于皮肤，以进一步增强着色剂的耐久性。上文描述的用于毛发着色的任何聚合密封剂都可以以水溶液或皮肤护理组合物的形式使用。用于使指甲、眉毛、睫毛和牙齿着色的方法上文描述的用于使毛发和皮肤着色的方法也可以通过将合适的组合物应用于目的体表用于使手指曱和脚趾曱、眉毛、睫毛和牙齿着色，所述合适的组合物具体地为指曱油组合物、化妆品组合物、或口腔护理组合物。实施例本发明在下述实施例中进一步定义。应当理解这些实施例在指出本发明的优选实施方案的同时，仅为了举例说明而给出。根据上文讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以制备本发明的各种改变和修饰以使其适应各种用途和条件。使用的缩写的含义如下"min"意指分钟,"sec"意指秒,"h"意指小时，'VL"意指微升，"mL"意指毫升,"L"意指升,"nm"意指纳米,"mm"意指亳米，"cm"意指厘米，'Vm"意指微米，"mM"意指毫摩尔浓度，"M"意指摩尔浓度，"mmol"意指毫摩尔，》moe"意指微摩尔，"g"意指克，"貼"意指微克，"mg"意指毫克,"g"意指万有引力常数，"rpm，，意指每分钟转数，"pfu"意指噬斑形成单位，"BSA"意指牛血清清蛋白，"ELISA"意指酶联免疫吸附测定，"IPTG"意指异丙基(3-D-硫代吡喃型半乳糖苦，"A"意指吸光度，"A45o"意指在450nm波长处测量的吸光度，"OD6冊"意指在600纳米处测量的光密度，"TBS"意指Tris緩冲盐水，"TBST-X"意指包含Tween⑧20的Tris緩冲盐水,其中"X"是Tween⑧20的重量百分比，"Xgal"意指S-溴-4-氯-3-吲哚-(3-D-吡喃型半乳糖苷，"SEM，，意指平均值的标准误，"ESCA"意指光电子能谱法，"eV"意指电子伏特，"TGA"意指热解重量分析法，"GPC"意指凝胶渗透层析，"MW"意指分子量，"Mw"意指重均分子量，"vol%"意指体积百分比，"wt%"意指重量百分比，"NMR"意指核磁共振波语法，"MALDI质谗法，，意指基质辅助激光解吸电离质谱分析法，"atm，，意指大气压，"kPa"意指千帕斯卡，"SLPM，，意指标准升/分钟，"psi"磅/平方英寸，"RCF"意指相对离心场。一般方法在实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周^口的，并且由Sambrook，J.,Fritsch,E.F.和Maniatis，T.,A<fo/ecw/arC7謹力g.'爿/^oratoryMm認/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989,T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.37Enquist，w/f/zFim'ora，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1984,以及Ausubd,F.M.等人，Cwrrewf/Votoco/sMo/ecw/arA.o/ogy，GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,N.Y.,1987描述。适合于维持和培养细菌培养物的材料和方法也是本领域众所周知的。适合于在下述实施例中使用的技术可以在A/""認/o/A^AoA/^Genera/So"en'o/ogy,PhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.Kiieg和G.BriggsPhillips,编辑,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.,1994,或ThomasD.Brockin祝她c如o/cgy.'」7^Aoo^:/maW^a/A^C7-o6/'o/(9gy,笫2版,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA，1989中找到。除非另有说明，用于培养和维持细菌细胞的所有试剂、限制酶和材料得自AldrichChemicals(Milwaukee,WI)、BDDiagnosticSystems(Sparks,MD)、LifeTechnologies(Rockville,MD)或SigmaChemicalCompany(StLouis,MO)。实施例1使用标准生物淘选选择毛发结合噬菌体肽这个实施例的目的是使用标准噬菌体展示生物淘选来鉴定与正常毛发和漂白的毛发结合的毛发结合噬菌体肽。噬菌体展示肽文库在本发明中使用的噬菌体文库——"Ph.D,12TMPhageDisplayPeptideLibraryKit和Ph.D,7TMPhageDisplayLibraryKit购自NewEnglandBioLabs(Beverly,MA)。这些试剂盒基于与M13噬菌体的次要外壳蛋白(pin)融合的随机肽7或12聚体的组合文库。展示的肽在pin的N末端上表达，从而使得在信号肽切割后，外壳蛋白的第一个残基是展示的肽的第一个残基。Ph.D.-7和Ph.D.-12文库分别由约2.8x109和2.7x109个序列组成。10]liL的体积包含每种肽序列的约55个拷贝。每个最初轮次的实验使用由制造商提供的原始文库来进行，以避免将任何偏倚引入结果内。毛发样品的制备用作正常毛发的样品是得自InternationalHairImportersandProducts(Bellerose,NY)的6英寸中棕色人毛发。将毛发在室温下置38于90%异丙醇中30分钟，然后各自用去离子水洗涤5次IO分钟。毛发在室温下风干过夜。为了制备漂白的毛发样品，将中椋色人毛发在室温下置于用氬氧化铵调整至pH10.2的6%H202tIO分钟，然后各自用去离子水洗涤5次IO分钟。毛发在室温下风干过夜。将正常和漂白的毛发样品切成0.5-1cm长度，并且将约5-10mg毛发置于具有猪皮肤底的定制的24孔生物淘选装置的孔内。相等数目的猪皮肤底孔留空。猪皮肤底装置用作相减程序以去除对于皮肤具有亲和力的噬菌体-肽。这种装置通过修改斑点印迹装置(得自Schleicher&Schuel，Keene,NH)以适合生物淘选过程来产生。具体而言，斑点印迹装置的顶部96孔块替换为24孔块。将4x6英寸的处理猪皮肤置于24孔块下，并且淘选具有猪皮肤底的孔通过使装置密封来形成。猪皮肤购自当地超市且贮藏于-8(TC。在使用前，将皮肤置于去离子水中解冻，然后使用纸巾吸干。皮肤的表面用90%异丙醇擦拭，然后用去离子水冲洗。将24孔装置装满由溶于包含0.5%Tween20的TBST(TBST-0.5%)的mg/mLBSA组成的阻断緩冲液，并且于4。C温育1小时。孔和毛发用TBST-0.5。/。洗涤5次。向每个孔中加入包含1mg/mLBSA的1毫升TBST-0.5。/。。然后，将10pL原始噬菌体文库(2x1()Hpfu),12聚体或7聚体文库加入不包含毛发样品的猪皮肤底孔中，并且使噬菌体文库在室温下温育15分钟。随后将未结合的噬菌体转移至包含毛发样品的猪皮肤底孔，并且在室温下温育15分钟。毛发样品和孔用TBST-0.5%洗涤10次。随后将毛发转移至24孔板的干净的、塑料底孔，并且向每个孔中加入1mL由溶于0.2M甘氨酸-HCl,pH2.2的1mg/mLBSA组成的非特异性洗脱緩冲液，并且温育10分钟以洗脱结合的噬菌体。随后，向每个孔中加入由]MTns-HC，pH9.2组成的160中和緩冲液。将来自每个孔的洗脱的噬菌体转移至新管用于滴定和测序。为了滴定结合的噬菌体，洗脱的噬菌体用SM緩冲液(100mMNaCl，12.3mMMgS〇4-7H20,50mMTris曙HCl,pH7.5和0.01wt/vol%明胶)进行稀释，以制备1oMo"的io倍系列稀释物。使每种稀释物的10pL等分试样与200对数中期大肠杆菌ER2738(NewEnglandBioLabs)—起温育，在LB培养基中生长20分钟，然后于45。C与3mL琼脂糖顶层(含5mMMgCl2和0.7。/。琼脂糖的LB培养基)混合。将这种混合物涂布到S-GalTM/LB琼脂板(SigmaChemicalCo.)上，并且于37。C温育过夜。S-GalTM/LB琼脂掺合物包含溶于500mL蒸馏水的5g胰蛋白胨、2.5g酵母提取物、5g氯化钠、6g琼脂、150mg3,4-环己酮七叶苦(cyclohexenoesculetin)-卩-D-p比喃型半乳糖苷(S-GalTM)、250mg柠檬酸铁铵和15mg异丙基(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。板通过使S-GalTM/LB在121-124。C下高压灭菌15-20分钟来制备。随机挑取单个黑色噬斑用于DNA分离和序列分析。剩余的洗脱的噬菌体通过与稀释的大肠杆菌ER2738—起于37。C温育4.5小时进行扩增，所述ER2738来自在LB培养基中1:100稀释的过夜培养物。这个时间后，将细胞培养物离心30秒，并且将上层80%上清液转移至新鲜管，加入1/6体积的PEG/NaCl(20%聚乙二醇-800、2.5M氯化钠)，并且允许噬菌体于4。C沉淀过夜。沉淀物通过于4。C在10,000xg下离心进行收集，并且将所得到的沉淀重悬浮于1mLTBS中。这是第一轮扩增的原种。扩增的第一轮噬菌体原种随后根据如上所述的相同方法进行滴定。对于下一轮生物淘选，使用来自第一轮的超过2xlO"pfu噬菌体原种。依赖于实验，生物淘选过程重复3-6轮。单个噬斑裂解物根据制造商的说明书(NewEnglandBiolabs)进行制备，并且单链噬菌体基因组DNA使用QIAprepSpinM13Kit(Qiagen,Valencia，CA)进行纯化，并且使用-96gill测序引物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，)在DuPontSequencingFacility进行测序，所述引物作为SEQIDNO:62给出。展示的肽紧位于基因III的信号肽后。来自从第五轮生物淘选分离的12聚体文库的洗脱的正常毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列在表1中给出。来自从第五轮生物淘选分离的12聚体文库的洗脱的漂白的毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列在表2中给出。来自从第三轮生物淘选分离的，95个随机选择克隆的7聚体文库的洗脱的正常毛发结合噬菌体肽的重复氨基酸序列在表3中给出。表1来自12聚体文库的洗脱的正常毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表2来自12聚体文库的洗脱的漂白的毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>在这些克隆中存在多个DNA片^R插入(intersion)。实施例2使用修改方法选择高亲和力毛发结合噬菌体肽这个实施例的目的是鉴定具有更高的结合亲和力的毛发结合噬菌体肽。如实施例1中所述用酸性洗脱緩沖液处理的毛发用洗脱緩沖液再洗涤3次，然后用TBST-0.5。/。洗涤3次。具有仍附着的耐酸噬菌体肽的这些毛发用于直接感染500对数中期细菌宿主细胞大肠杆菌ER2738(NewEnglandBioLabs),其随后在LB培养基中生长20分钟，然后于45°C与3mL琼脂糖顶层(含5mMMgCl2和0.7%琼脂糖的LB培养基)混合。将这种混合物涂布到LB培养基/IPTG/S-GalTM/板(含15g/L琼脂、0.05g/LIPTG和0.04g/LS-GalTM6々LB培养基)上，并且于37。C温育过夜。计数黑色噬斑以计算噬菌体滴度。如实施例1中所述，随机挑取单个黑色噬斑用于DNA分离和测序分析。这个过程对正常和漂白的毛发样品进行，如实施例1中所述，所述毛发样品用7聚体和12聚体噬菌体展示文库进行筛选。这些高亲和力、毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列在表4-7中给出。表4来自7聚体文库的高亲和力、正常毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列克隆ID氨基酸序列SEQIDNO:D5GPHDTSSGGVRPNLHHTSKKEKRENRKVPFYSHSVTSRGNV133A36MHAHSIA37B41TAATTSP38在这个克隆中存在多个DNA片l殳插入。43来自7聚体文库的高亲和力、漂白的毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表6来自12聚体文库的高亲和力、正常毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表7来自12聚体文库的高亲和力、漂白的毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列克隆ID氛基酸序列SEQIDNO:A5EQISGSLVAAPW43C4NEVPARNAPWLV57D30NSPGYQADSVAIG58C44AKPISQHLQRGS40E66LDTSFPPVPFHA44C45SL隨VTIPGPKI47E化TQDSAQKSPSPL59实施例3高亲和力手指甲结合噬菌体肽的选择这个实施例的目的是鉴定对于手指甲具有高结合亲和力的噬菌体肽。实施例2中描述的经修饰的生物淘选法用于鉴定高亲和力、手指曱结合噬菌体肽克隆。人手指曱从测试受试者中进行收集。手指甲通过用皂溶液刷洗进行清洁，用去离子水沖洗，且允许在室温下风干。手指甲随后在液N2下磨成粉末，并且将10mg手指曱加入96孔滤板的每个孔中。手指甲样品用由溶于TBST-0.5。/o的1mg/mLBSA组成的阻断緩沖液处理1小时，然后用TBST-0.5。/。进行洗涤。使手指曱样品与噬菌体文库(Ph.D-12PhageDisplayPeptideLibraryKit)—起温育，并且使用实施例1中描述的相同条件洗涤10次。实施例1中描述的酸性洗脱步骤后，手指曱样品用洗脱緩冲液再洗涤3次，然后用TBST-0.5。/。洗涤3次。如实施例2中所述，具有仍附着的耐酸噬菌体肽的酸处理手指曱用于直接感染大肠杆菌ER2738细胞。这个生物淘选过程重复3次。随机挑取总共75个单个黑色噬菌体噬斑用于DNA分离和测序分析，并且鉴定2个重复克隆。这些噬菌体肽的氨基酸序列在表8中列出。还发现这些手指甲结合肽与漂白的毛发良好结合。表8高亲和力手指甲结合噬菌体肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>4贞率表示在75个测序克隆中出现的相同序列的数目。实施例4高亲和力皮肤结合噬菌体肽的选择这个实施例的目的是鉴定对于皮肤具有高结合亲和力的噬菌体肽。实施例2和4中描述的经修饰的生物淘选法用于鉴定高亲和力、皮肤结合噬菌体肽克隆。猪皮肤在该过程中充当关于人皮肤的模型。猪皮肤如实施例1中所述进行制备。使用实施例4中描述的相同程序用定制的、猪皮肤底生物淘选装置进行3轮筛选。随机挑取总共28个单个黑色噬菌体噬斑用于DNA分离和测序分析，并且鉴定1个重复克隆。在28个序列中出现9次的这个噬菌体肽的氨基酸序列是作为SEQIDNO:61给出的TPFHSPENAPGS。实施例5毛发结合噬菌体克隆的结合亲和力的定量表征这个实施例的目的是通过滴定和ELISA定量噬菌体克隆的结合亲和力。毛发结合噬菌体克隆的滴定展示特定肽的噬菌体克隆用于比较不同肽序列的结合特征。基于滴度的测定用于定量噬菌体结合。这个测定测量由10mg毛发表面保留的输出pfu,具有103-104的信噪比。关于所有噬菌体克隆的输入为10"pfu。应当强调这个测定测量肽表达噬菌体颗粒而不是肽结合。将正常毛发切成0.5cm长度，并且将10mg切割毛发置于96孔滤板(Qiagen)的每个孔内。然后，将孔装满包含溶于TBST-0.5W的1mg/mLBSA的阻断緩沖液，并且于4。C温育1小时。毛发用TBST-0.5。/o洗涤5次。随后将孔装满1mL包含1mg/mLBSA的TBST-0.5%,然后向每个孔中加入纯化的噬菌体克隆(1014pfu)。毛发样品在室温下温育15分钟，随后用TBST-0.5%洗涤10次。将毛发转移至干净孔，并且向每个孔中加入l.OmL由溶于在pH2.2下的0.2M甘氨酸-HC1的1mg/mLBSA组成的非特异性洗脱緩沖液。使样品温育10分钟，随后向每个孔中加入160|iiL中和緩沖液(1MTris-HCl，pH9.2)。将来自每个孔的洗脱噬菌体转移至新管用于滴定和测序分析。为了滴定结合的噬菌体，洗脱的噬菌体用SM緩沖液进行稀释，以制备10M()S的IO倍系列稀释物。使每种稀释物的10pL等分试样与200pL对数中期大肠杆菌ER2738(NewEnglandBioLabs)—起温育，在LB培养基中生长20分钟，然后于45。C与3mL琼脂糖顶层(含5mMMgCl2和0.7%琼脂糖的LB培养基)混合。将这种混合物涂布到LB培养基/IPTG/Xgal板(含15g/L琼脂、0.05g/LIPTG和0.04g/LXgal的LB培养基)上，并且于37。C温育过夜。计数蓝色噬斑以计算噬菌体滴度，其在表9中给出。表9毛发结合噬菌体克隆的滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>通过ELISA表征毛发结合噬菌体克隆酶联免疫吸附测定(ELISA)用于评估所选择的噬菌体-肽克隆的毛发结合特异性。扩增实施例1和2中鉴定的噬菌体-肽克隆连同随机选择的对照G-F9，KHGPDLLRSAPR(作为SEQIDNO:63给出)。将超过10"pfu噬菌体加入预阻断的毛发表面。相同量的噬菌体也加入预阻断的猪皮肤表面作为对照以证实毛发结合特异性。独特的毛发或猪皮肤底96孔装置通过下述进行制备将一层Parafilm⑧应用于MinifoldIDot-BlotSystem(Schleicher&Schuell,Inc.,Keene,NH)的顶部96孔块下，在Parafiln^盖的顶部上加入毛发或无毛猪皮肤层，然后使装置密封。对于待检测的每个克隆，毛发覆盖孔与由溶于TBS的2%脱脂乳粉(Schleicher&Schuell，Inc.)组成的200|uL阻断緩冲液一起在室温下温育1小时。在孔底具有猪皮肤的第二种Mmifold系统同时用阻断緩冲液进行处理以充当对照。阻断緩沖液通过使系统倒置并且用纸巾将其吸干来去除。该系统用由TBST-0.05。/。组成的洗涤緩冲液冲洗6次。孔装满包含1mg/mLBSA的200|iiLTBST-0.5%,随后向每个孔中加入10pL(超过1012个拷贝)纯化的噬菌体原种。使样品于37。C伴随緩慢振荡温育15分钟。非结合噬菌体通过用TBST-0.5%洗涤孔10-20次来去除。随后，向每个孔中加入在阻断IC沖液中1:500稀释的lOO^L辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(AmershamUSA,Piscataway,NJ),并且在室温下温育l小时。取出缀合溶液，并且孔用TBST-0.05。/。洗涤6次。向每个孔中加入得自PierceBiotechnology(Rockford,IL)的TMB底物(200pL)，并且允许颜色在室温下发展5-30分钟，一般为10分钟。随后，向每个孔中加入终止溶液(200pL2MH2S04),且将溶液转移至96孔板，并且八45()使用微量培养板分光光度计(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)进行测量。作为至少3次重复的平均值报告的所得到的吸光度值和平均值的标准误(SEM)在表10中给出。48表10用皮肤和毛发的ELISA测定的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如由表10中的数据可见的，所有毛发结合克隆对于毛发具有比对照明显更高的结合亲和力。此外，与猪皮肤相比较，毛发结合克隆显示出对于毛发各种程度的选择性。克隆D21对于毛发具有最高的选择性，对于毛发具有极强的亲和力和对于猪皮肤具有极低的亲和力。实施例6肽结合特异性和亲和力的证实这个实施例的目的是使用竟争ELISA测试毛发结合肽D21的肽结合位点特异性和亲和力。ELISA测定仅检测保持与毛发表面结合的噬菌体颗粒。因此，如果合成肽与噬菌体颗粒竟争在毛发表面上的相同结合位点，那么由于肽竟争，将合成肽加入ELISA系统内将显著减少ELISA结果。作为SEQIDNO:46给出的合成毛发结合肽D21由SynPep(Dublin,CA)合成。作为对照，将作为SEQIDNO:61给出的无关合成皮肤结合肽加入系统中。实验条件类似于在实施例5中描述的ELISA法中使用的那些。简言之，将100^iL结合緩沖液(含0.1。/。Tween⑧20和1mg/mLBSA的lxTBS)和1011pfu纯D21噬菌体颗粒加入96孔滤板的每个孔中，所述滤板包含正常毛发的样品。将合成肽(100吗)加入每个孔中(对应于0.8mM的浓度)。反应在室温下伴随轻微振荡进行1小时，随后用TBST-0.5。/。洗涤5次。剩余步骤与实施例5中描述的ELISA法中^:用的那些相同。作为在450nm处的吸光度(A45Q)呈现的ELISA结果显示于表11中。每个个别ELISA测试一式三份地进行；表11中的值是一式三份测定的平均值。表11肽竟争ELISA的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>这些结果证实合成肽D21不与噬菌体克隆D21竟争在毛发表面上的相同结合位点。实施例7使用生物淘选选择洗发剂抗性毛发结合噬菌体肽这个实施例的目的是使用生物淘选伴随洗发剂洗涤来选择洗发剂抗性毛发结合噬菌体肽。为了选择洗发剂抗性毛发结合肽，如实施例2中所述进行使用12聚体噬菌体肽文库针对正常和漂白的毛发的生物淘选实验。代替使用正常TBST緩沖液洗掉未结合的噬菌体，噬菌体复合毛发用10%、30%和50%洗发剂溶液(PantenePro-V洗发剂，SheerVolume,Proctor&Gamble,Cincinnati,OH)在分开的管中洗涤5分钟，随后为6次TBS緩沖液洗涤。如在实施例2中描述的经修饰的生物淘选法中描述的，洗过的毛发直接用于感染宿主细菌细胞。关于这种方法的潜在问题是洗发剂对噬菌体感染细菌宿主细胞能力的作用。在对照实验中，将已知量的噬菌体颗粒加入10%洗发剂溶液中5分钟，然后将该溶液的部分用于感染细菌细胞。洗发剂处理噬菌体的滴度比未处理的噬菌体的那种低90%。30%和50%洗发剂处理对于噬菌体感染宿主细胞的能力产生甚至更严重的损害。然而，如表12中所示，鉴定了2种洗发剂抗性毛发结合噬菌体肽。表12使用生物淘选法鉴定的洗发剂抗性毛发结合噬菌体肽的肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>实施例8使用PCR选择洗发剂抗性毛发结合噬菌体肽这个实施例的目的是使用PCR法选择洗发剂抗性毛发结合噬菌体肽，以避免洗发剂诱导针对噬菌体的损害的问题。PCR法的这种原理是噬菌体颗粒内的DNA片段可以使用PCR进行回收，与噬菌体的生存力无关，并且对应于毛发结合肽序列的回收的DNA片段随后可以克隆回噬菌体载体内，且包装到健康的噬菌体颗粒内。如实施例1中所述，生物淘选实验使用7聚体和12聚体噬菌体肽文库针对正常和漂白的毛发来进行。最后洗涤后，对噬菌体处理的毛发实施5分钟洗发剂洗涤，随后为6次TBS緩冲液洗涤。将洗发剂洗涤的毛发置入装满1mL水的新管内，并且煮沸15分钟以释放DNA。这种包含DNA的煮沸溶液用作关于PCR反应的DNA沖莫板。在PCR反应中使用的引物是下述引物作为SEQIDNO:67给出的M13KE-1412正向5，-CAAGCCTCAGCGACCGAATA-3',和作为SEQIDNO:68给出的M13KE-1794反向5，-CGTAACACTGAGTTTCGTCACCA—3，。PCR条件是于96。C3分钟变性，随后为94。C30秒、5CTC30秒和60°C2分钟的35个循环。PCR产物(400bp)和M13KE载体(NewEnglandBioLabs)用限制酶￡agI和Xcc65I进行消化。使用如Ph.D.PeptideDisplayCloningSystem(NewEnglandBiolabs)中所述的连接和转化条件。所得到的洗发剂抗性毛发结合噬菌体肽的氨基酸序列是作为SEQIDNO:70》合出的NTSQLST。实施例9毛发结合和皮肤结合肽的亲和力的测定这个实施例的目的是使用ELISA测定来确定作为MB5Q值测量的，毛发结合和皮肤结合肽对于其各自的基底的亲和力。毛发结合和皮肤结合肽由SynPepInc.(Dublin,CA)合成。肽通过在氨基酸结合序列的C末端上添加生物素化的赖氨酸残基进行生物素化用于检测目的，并且将酰胺化的半胱氨酸加入序列的C末端。如表13中所示，测试的肽的氨基酸序列作为SEQIDNOs:71-74给出。对于毛发样品，使用的程序如下。使用的表面特异性96孔系统的设置与实施例5中描述的那种相同。简言之，具有毛发或猪皮肤表面的96孔在室温下用阻断緩沖液(SuperBlockTMfromPierceChemicalCo.,Rockford,IL)阻断1小时，随后为在室温下用TBST-0.5。/。的6次洗涤，各2分钟。向每个孔中加入各种浓度的生物素化的结合肽，于37。C温育15分钟，并且随后为在室温下用TBST-0.5。/。的6次洗涤，各2分钟。然后，向每个孔中加入链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(PierceChemicalCo.)(1.0pg/孑L)，并且在室温下温育l小时。温育后，孔在室温下用TBST-0.5。/。洗涤6次，各2分钟。最后，颜色发展和测量如实施例5中所述进^f亍。对于肽-皮肤复合物的MBso的测量，使用下述程序。首先，猪皮肤进行处理以阻断皮肤中的内源生物素。这通过向阻断緩冲液添加链霉抗生物素蛋白来完成。阻断猪皮肤样品后，皮肤用D-生物素进行处理以阻断过量的链霉抗生物素蛋白结合位点。剩余步骤与用于毛发样品的那些相同。结果使用GraphPadPrism4.0(GmphPadSoftware,Inc.，SanDiego，CA)作图为八450对肽的浓度。MB5o值由斯卡查德(Scatchard)图进行计算，并且概括于表13中。结果证实毛发结合肽(D21、F35和I-B5)和皮肤结合肽(SEQWIDNO:61)对于其各自的基底的结合亲和力高，而毛发结合肽(D-21和I-B5)对于皮肤的结合亲和力相对低。52<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>进行纯化，并且使用-96gill测序引物进行测序。鉴定的肽序列将对于牙齿具有结合亲和力。鉴定的牙齿结合肽的结合特异性和亲和力如实施例6中所述进行测定。实施例11-16使用三嵌段基于肽的体表着色试剂的毛发着色这些实施例的目的是使用与炭黑色素组合的三嵌段基于肽的体表着色试剂证实毛发的着色。使用的三嵌段基于肽的体表着色试剂由以经验为主产生的毛发结合肽、脯氨酸间隔基和炭黑结合肽组成。在这些实施例中使用的三嵌段基于肽的体表着色试剂的序列在表14中给出。这些基于肽的试剂得自SynPep(Dublin,CA)。表14三嵌段基于肽的体表着色试剂的序列实施例肽序列SEQIDNO:11FHENWPS(炭黑结合肽)-PPP(间隔基)-KKKK(毛发结合肽)13812FHENWPS(炭黑结合肽)-PPP(间隔基)-HHHH(毛发结合肽)13913FHENWPS(炭黑结合肽)-PPP(间隔基)-RRRR(毛发结合肽)14014WHLSWSPVPLPT(炭黑结合肽)-PPP(间隔基)-KKKK(毛发结合肽)14115WHLSWSPVPLPT(炭黑结合肽)-PPP(间隔基)-HHHH(毛发结合肽)14216WHLSWSPVPLPT(炭黑结合肽)-PPP(间隔基)-RRRR(毛发结合肽)143待测试的基于肽的体表着色试剂的3wt%溶液通过使合适量的肽溶解于水中进行制备。向这种水性肽溶液中加入包含14wt%固体的1.5mL自分散的炭黑色素分散体，所述分散体如Yeh等人在美国专利号6,852,156，实施例l中所述制备。将所得到的混合物搅动16小时。得自InternationalHairImporters的天然白色毛发样品浸入混合物中，伴随30分钟的搅动。这个时间后，将毛发样品从混合物中取出，允许风干，然后用水沖洗以去除未结合的色素。作为对照，毛发使用相同程序使用不含肽试剂的炭黑色素进行着色。对于测试的所有基于肽的体表着色试剂，在水沖洗后毛发的颜色是比对照毛发样品明显更暗的黑色，所述对照毛发样品未使用基于肽的体表着色试剂进行着色。实施例17-20三嵌段基于肽的体表着色试剂的生物生产这些实施例的目的是使用重组DNA和分子克隆技术制备基于肽的体表着色试剂。基于肽的体表着色试剂是包含由肽间隔基分开的毛发结合肽序列和炭黑结合肽序列的三嵌段结构。肽在大肠杆菌中作为内含体表达。另外的氨基酸序列(即，肽标记)与基于肽的体表着色试剂序列融合，以促进内含体形成。生产菌抹的构建基于肽的体表着色试剂的序列在表15中给出。设计编码这些肽的DNA序列，其中使用对于大肠杆菌有利的密码子且避免序列重复和mRNA二级结构。基因DNA序列使用专有软件通过DNA2.0,Inc.(MenloPark,CA)进行设计，所述专有软件由Gustafsson等人(7>eAwA^ec/mo/.22(7):346-355(2004))描述。在每种情况下，编码氨基酸序列的序列随后为2个终止密码子和关于内切核酸酶Ascl的识别位点。在N末端上的GS氨基酸序列由关于内切核酸酶BamHI的识别位点(GGA/TCC)编码。DNA序列由SEQIDNOs:148-151给出。55表15三嵌段基于肽的体表着色试剂的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>基因由合成寡核苷酸进行装配并且通过DNA2.0,Inc克隆到标准质粒克隆载体内。序列通过DNA2.0,Inc由DNA测序进行验证。合成基因用内切核酸酶限制酶BamHI和Ascl与克隆载体切开，并且使用标准重组DNA法连接到表达载体内。载体pKSIC4-HC77623杏亍生自商购可得的载体pDEST17(Invitrogen，Carlsbad，CA)。它包括衍生自商购可得的载体pET31b(Novagen,Madison,WI)的序列，所迷载体编码酮基类固醇异构酶(KSI)的片段。KSI片段包括为融合配偶体，以促进肽分配到大肠杆菌中的不溶性内含体内。来自pET31b的KSI编码序列使用标准诱变程序(QuickChangeII,Stratagene,LaJolla,CA)进行修饰，以包括3个另外的Cys密码子，加上在野生型KSI序列中发现的l个Cys密码子。由SEQIDNO:152给出且在图1中显示的质粒pKSIC4-HC776234吏用标准重组DNA法进行构建，所迷标准重组DNA法是本领域技术人员众所周知的。通过替代载体中BamHI和Ascl位点之间的序列，将编码基于肽的体表着色试剂的DNA序列(表15)插入pKSIC4-HC77623内。包含肽编码序列的质粒DNA和载体DNA用内切核酸酶限制酶BamHI和Ascl进行消化，然后使肽编码序列和载体DNA混合，并且使用标准DNA克隆程序通过噬菌体T4DNA连接酶进行连接，所述标准DNA克隆程序是本领域技术人员众所周知的。其中编码基于肽的体表着色试剂的序列分别插入pKSIC4-HC77623内的正确构建体使用标准方法通过限制酶切分析进行鉴定，并且通过DNA测序进行-验证。在这些构建体中，编码目的肽的序列替代编码HC77623的那些。这些序列与噬菌体T7基因IO启动子可操作地连接，并且作为与变体KSI配偶体融合的融合蛋白表达。为了测试基于肽的试剂的表达，将表达质粒转化到BL21-AI大肠杆菌菌林(Invitrogen,目录号C6070-03)内。为了生产重组融合肽，用转化的细菌接种50mLLB-氨千青霉素液体培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨、5g/L细菌用酵母提取物、10g/LNaCl、100mg/L氨卡青霉素，pH7.0),并且使培养物于37。C振荡直至OD6oo达到0.6。表达通过向培养物中添加0.5mL20wtWL-阿拉伯糖进行诱导，并且振荡再持续4小时。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析细胞蛋白质证实融合肽的生产。发酵57上文描述的重组大肠杆菌菌抹在6-L发酵中生长，其最初以分批方式，然后以补料分批方式运行。发酵培养基的组成在表l6中给出。发酵培养基的pH是6.7。发酵培养基通过高压灭菌进行灭菌，这之后添加下述灭菌的组分盐酸硫胺素(4.5mg/L)、葡萄糖(22.1g/L)、痕量元素参见表17(10mL/L)、氨苄青霉素(100mg/L)、和接种物(种子)(125mL)。pH使用氢氧化铵(20vol%)或磷酸(20vol%)根据需要进行调整。添加的组分通过高压灭菌或过滤进行灭菌。表16发酵培养基的组成组分浓度KH2P049g/L(NH4)2HP044g/LMgS04-7H201.2g/L柠檬酸1.7gZL酵母提取物5.0g/LMazuDF204Antifoam0.1mL/L表17痕量元素组分浓度，mg/LEDTA840CoCl2'H20250MnCl2.4H201500CuCl2'2H20150H3B〇3300Na2Mo04.2H20250Zn(CH3COO)2.H201300杼檬酸铁10000用于发酵的操作条件概括于表18中。葡萄糖的起始浓度为22.1g/L。当起始残留葡萄糖除尽时，预定的(pre-scheduled)、指数葡萄糖补料从发酵运行的补料分批阶段开始。葡萄糖补料(参见表19和20)包含500g/L葡萄糖且补加有5g/L酵母提取物。补料培养基的组分通过高压灭菌或过滤进行灭菌。目的是维持0.13h"的比生长速率，假定得率系数(生物量对葡萄糖)为0.25g/g,且使乙酸水平以极低值(即，小于0.2g/L)维持于发酵容器中。葡萄糖补料持续直至运行结束。诱导在所选择的时间(即15小时经过的发酵时间)用2g/LL-阿拉伯糖团来起始。递送5g酵母提取物/L发酵液体培养基的团在下述时间加入发酵容器中诱导前1小时，诱导时，和诱导时间后1小时。发酵运行在19.97小时经过的发酵时间和诱导时间后4.97小时后终止。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>*串联搅拌器，随后气流。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>肽的分离和纯化发酵运行完成后，使全部发酵液体培养基以12,000psi(82,700kPa)通过APV型号2000Gaulin型匀浆器3次。在每次匀浆前使液体培养基冷却至低于5。C。使匀浆的液体培养基立即以600mL/分钟和12,000RCF通过WestfaliaWhisperFuge(WestfaliaSeparatorInc.,Northvale,NJ)叠盘离心机进行加工，以使内含体与悬浮细胞石争片和溶解杂质分开。将回收的糊以15g/L(干燥基础)重悬浮于水中，并且使用NaOH将pH调整至8.0-10.0的值。选择pH以帮助取出来自内含体的细胞碎片而不溶解内含体蛋白质。对于单次通过使悬浮液以12,000psi(82,700kPa)通过APV2000Gaulm型匀浆器以提供严格混合。使匀浆的高pH悬浮液立即以600mL/分钟和12,000RCF在WestfaliaWhisperFugeTM叠盘离心机中进行加工，以使洗涤的内含体与悬浮细胞碎片和溶解杂质分开。将回收的糊以15gm/L(干燥基础)重悬浮于纯水中。对于单次通过使悬浮液以12,000psi(82,700kPa)通过APV2000Gaulm型匀浆器以提供严才各洗涤。使匀浆的悬浮液立即以600mL/分钟和12,000RCF在WestfaliaWhisperFugeTM叠盘离心机中进行加工，以使洗涤的内含体与残留的悬浮细胞碎片和NaOH分开。将回收的糊以25g/L(干燥基础)重悬浮于纯水中，并且使用HC1将混合物的pH调整至2.2。如果待回收的肽包含半胱氨酸残基，那么加入二硫苏糖醇(DTT，10mM)以破坏二硫键。使酸化的悬浮液加热至70。C5-14小时以完成DP位点的切割，从而使融合肽与产物肽分开而不损害耙肽。使用NaOH将产物浆调整至pH5.1(注本文使用的pH可以依赖于待回收的肽的溶解性而变)，然后冷却至5。C且保持12小时。混合物在9000RCF下离心30分钟，并且倾析上清液。上清液随后用0.2fxm膜进行过滤。对于一些低溶解性肽，需要多次洗涤沉淀以增加肽回收。过滤产物pH调整至2.0,并且与足够的乙腈混合以产生10vol%乙腈的溶液，以使样品稳定。将这种溶液装载到包含10-15pmC18介质的22x250mm或50x250mm反相层析柱中，所述C18介质用10vol%乙腈、90vol%水与0.1vol%三氟乙酸(TFA)进行预处理。产物通过用水和乙腈的梯度洗脱柱以纯化状态回收，所述梯度为溶于含0.1volQ/oTFA的水中10vo1%-40vol%乙腈斜升。收集包含产物肽的洗脱液，并且在冻干前以2:1的因子通过真空蒸发进^"浓缩。在220和278nm处的分光光度计检测用于监控和追踪产物肽的洗脱。实施例21使用三嵌段基于肽的体表着色试剂的毛发着色这个实施例的目的是使用与炭黑色素组合的三嵌段基于肽的体表着色试剂证实毛发的着色。保色性使用分光光度计测量技术进行定量。如Yeh等人在美国专利号6,852,156,实施例l中所述制备的，包61含Mwt%固体的自分散的炭黑色素分散体用水进行1:IO稀释。将作为SEQIDNO:147给出的25毫克基于肽的体表着色试剂(实施例20)溶解于5g水中。随后，将10g稀释的炭黑色素分散体缓慢加入肽溶液中，并且使溶液混合至少60分钟。得自InternationalHairImporters的天然白色毛发样品浸入混合物中，伴随30分钟的搅动。这个时间后，将毛发样品从混合物中取出，允许风干，然后用水沖洗以去除未结合的色素。作为对照，毛发使用相同程序使用不含肽试剂的炭黑色素进行着色。水冲洗后的颜色强度使用X-RiteSP78SphereSpectrophotometer(X-Rite,Inc.,Gmndville,MI)进行测量，这通过将有色的毛发样品置入光电传感器内，且计算表示光度计应答的L*、&*和1)*参数实现。起始基线LM直对于无色毛发进行测量，并且所有测量是5次个别测定的平均值。AE值使用下式1进行计算AE=((L、-L*2)2+(ai-a2)2十(brb2)2,2(1)其中L*=亮度变量，并且a氺和t^是如由InternationalCommissionofIllumination(CIE)(Minolta,尸rec&eCV/orCwwww/c"/7'cw-Go/orFromFee/z7gTVwtrwwew/^/^'ow,MinoltaGameraCo.，1996)定义的CIELAB色空间的色度坐标。较大的AE值指示较佳的保色性。结果概括于表21中。表21水沖洗后的保色性结果样品AE基于肽的体表着色试剂加色素31.4对照，单独的色素18.2如由表21中的数据可见的，水沖洗后的保色性对于用基于肽的体表着色试剂和色素处理的样品明显高于用对照样品的，所述对照样品仅用色素进行处理。权利要求1.一种具有一般结构[(BSBP)m-(PBP)n]x的二嵌段、基于肽的体表着色试剂，其中a)BSBP是体表结合肽；b)PBP是色素结合肽；且2.—种具有一般结构[[(BSBP)m-Sq]x-[(PBP)n-Sr]z]y的三嵌段、基于肽的体表着色试剂，其中a)BSBP是体表结合肽；b)PBP是色素结合肽；c)S是分子间隔基；且d)m、n、x和z独立地为l-约10,y为l-约5，并且其中q和r各自独立地为O或l,前提是r和q两者不可是O。3.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽和所迷色素结合肽中的任何一种或两种通过选自下述的方法组合产生噬菌体展示、酵母展示、细菌展示和组合固相肽合成。4.根据权利要求3的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽为约7-约50个氨基酸。5.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽以经验为主产生。6.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽与选自下述的体表结合毛发、指甲、牙齿、齿龈、皮肤和口腔组织。7.根据权利要求6的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽为约7-约25个氨基酸，并且对于体表具有作为MB5o测量的等于或小于10—5M的结合亲和力。8.根据权利要求6的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表包含上皮细胞层。9.根据权利要求8的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表包含内皮细胞层。10.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽是选自SEQIDNOs:1、43、44、45、46、47、48、49、50、51、，52、53、58、59、60、64、66、69、70、75、105、106、107、108、109、153、154、155和156的毛发结合肽。11.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽是选自SEQIDNOs:2、61、99、100、101、102、103和104的皮肤结合肽。12.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽是选自SEQIDNO:SEQIDNOs:7、8、19-27、38-40、43、44、47、53、57、58、59和60的指甲结合肽。13.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述色素结合肽为约5-约50个氨基酸。14.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述色素结合肽对于选自下述的色素具有亲和力D&CRedNo.36,D&CRedNo.30,D&COrangeNo.17,Green3Lake,Ext.Yellow7Lake，Omnge4Lake,Red28Lake;D&CRedNos.7、11、31和34的钓色淀，D&CRedNo.12的钡色淀，D&CRedNo.13的锶色淀，FD&CYellowNo.5,FD&CYelowNo.6，FD&CNo.40，D&CRedNos.21、22、27和28,FD&CBlueNo.1,D&COrangeNo.5,D&CYellowNo.IO的铝色淀；D&CRedNo.33的4告色;定；CromophthalYellow,SunfastMagenta，SunfastBlue，氧化铁，碳酸钙，氢氧化铝，硫酸4丐，高呤土，氰亚铁酸铁铵，碳酸镁，卡红，硫酸钡，云母，氯氧化铋，硬脂酸锌，锰紫，氧化铬，二氧化钛，二氧化钛纳米颗粒，氧化锌，氧化钡，群青蓝，柠檬酸铋，羟磷灰石，硅酸锆，和碳黑颗粒。15.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述色素结合肽选自SEQIDNOs:110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133和134。16.根据权利要求2的三嵌段基于肽的体表着色试剂，其中所述间隔基选自乙醇胺、乙二醇、具有6个碳原子的链长的聚乙烯、具有3-6个重复单位的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基链、乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、硬脂基烷基链、鯨蜡基烷基链、和棕榈酰烷基链。17.根据权利要求2的三嵌段基于肽的体表着色试剂，其中所述间隔基是包含1-约50个氨基酸的肽。18.根据权利要求17的三嵌段基于肽的体表着色试剂，其中所述间隔基包含选自脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸及其混合物的氨基酸。19.根据权利要求17的三嵌段基于肽的体表着色试剂，其中所述间隔基包含选自SEQIDNOs:65、135、136和137的肽序列。20.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述基于肽的体表着色试剂为约14-约200个氨基酸。21.根据权利要求2的三嵌段基于肽的体表着色试剂，其中所述三嵌段基于肽的体表着色试剂具有选自SEQIDNOs:138、139、140、141、142、143、144、145、146和147的氨基酸序列。22.根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表结合肽通过包括下述步骤的方法进行分离(i)提供组合产生的噬菌体肽文库；(ii)使(i)的所述文库与体表接触以形成包含下述的反应溶液(A)噬菌体-肽-体表复合物；(B)未结合的体表，和(C)未复合的肽；(iv)分离(ii)的所述噬菌体-肽-体表复合物；(iv)从(iii)的所述分离的肽复合物中洗脱弱结合的肽；(v)通过直接使用在步骤(iv)后剩余的所述噬菌体-肽-体表复合物的聚合酶链反应，或通过用在步骤(iv)后剩余的所述噬菌体-肽-体表复合物直接感染细菌宿主细胞来鉴定所述剩余的结合的噬菌体-肽，在合适的生长培养基中培养所述受感染的细胞，并且从所述生长细胞中分离和鉴定噬菌体-肽。23.根据权利要求22的基于肽的体表着色试剂，其中所述体表选自毛发、指曱、牙齿、齿龈、皮肤和口腔组织。24.—种个人护理组合物，其包含有效量的权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂，所述基于肽的体表着色试剂包含体表结合肽和色素结合肽。25.根据权利要求24的个人护理组合物，其中a)所述体表结合肽对于选自毛发、指甲、牙齿、齿龈、皮肤和口腔组织的体表具有亲和力；且b)所述体表结合肽为约7-约25个氨基酸，并且对于体表具有作为MBso测量的等于或小于10—SM的结合亲和力26.—种用于使体表着色的方法，其包括a)提供色素；b)提供包含根据权利要求1或2的基于肽的体表着色试剂的组合物，其中所述体表结合肽对于所述体表具有亲和力，且所述色素结合肽对于所述色素具有亲和力；和c)将(a)的所述色素与(b)的所述组合物应用于体表足够使所述基于肽的体表着色试剂与所述色素和所述体表结合的时间。27.根据权利要求26的方法，其中所述体表选自毛发、指甲、牙齿、齿龈、皮肤和口腔组织。28.根据权利要求26的方法，其中所述色素和包含基于肽的体表着色试剂的所述组合物伴随地应用于所述体表。29.根据权利要求26的方法，其中所述色素在包含基于肽的体表着色试剂的所述组合物应用前应用于所述体表。30.根据权利要求26的方法，其中包含基于肽的体表着色试剂的所述组合物在所述色素应用前应用于所述体表。31.根据权利要求26的方法，其进一步包括下述步骤d)在所述色素和包含基于肽的体表着色试剂的所述组合物应用后，将包含聚合密封剂的组合物应用于所述体表。32.根据权利要求31的方法，其中所述聚合密封剂选自聚烯丙胺、丙烯酸酯、丙烯酸酯共聚物、聚氨基曱酸酯、卡波姆、聚甲基硅氧烷、氨基二曱聚硅氧烷、聚乙二醇、蜂蜡和硅氧烷。全文摘要已鉴定了以高亲和力与体表结合的肽，所述体表例如毛发、皮肤、指甲、牙齿、齿龈和口腔组织。描述了经由使体表结合肽直接或通过间隔基与色素结合肽偶联来形成的二嵌段和三嵌段基于肽的体表着色试剂。基于肽的体表着色试剂可以与色素结合使用以使体表着色。文档编号A61K8/64GK101453981SQ200780019418公开日2009年6月10日申请日期2007年3月20日优先权日2006年3月27日发明者H·王,J·P·奥布赖恩,Y·吴申请人:纳幕尔杜邦公司