专利名称：刺激细胞生长、突触重塑和巩固长期记忆的方法
技术领域：
本发明涉及上调和下调蛋白激酶c的方法，该方法能用于刺激细胞生长、
突触重塑和增强记忆力并能治疗细胞增生性疾病。
背景技术：
存在各种影响认知的病症和疾病。认知过程大致可以被描述成至少包括3个不同部分:注意、学习和记忆。每个部分和它们各自的水平均影响对象认知能力的总体水平。例如，尽管阿耳茨海默病患者会遭受总体认知的丧失，和由此带来的这些特征的全部衰退，然而与该疾病最常相关的却是丧失记忆。其它疾病的患者则遭受与不同认知特征更显著相关的认知损伤。例如，注意缺陷型多动症(ADHD)，关注个体保持注意力集中状态的能力。其它疾病包括与其它神经疾病、衰老和可以对心智能力带来有害影响的疾病治疗例如癌症治疗、中风/缺血和智力低下有关的普通痴呆。
历经数十年对各种记忆病例进行研究终于证明了长期记忆需要蛋白质的合成。Agranoff等(1967) Sc〖e"ce 158:1600-1601 ; Bergold等(1990)/Voc.A^/.v4cac/.5W 87:3788-3791 ; Cavallaro 等(2002)尸rac.Ato/JcfldSc/.99:13279-16284; Crow等(1990)A^/.」c。d 87:4490-4494; Crow等(1999) 乂 A^Mra/ /i!;w'o/. 82:495-500; Epstein等(2003) A^wro6Zo/.丄eam. iWem.79:127-131; Ezzeddine等(2003) / 23:9585-9594; Farley等(1991)尸rac.
tV。〃. ^c"d 88:2016-2020;Flexner等(1996)尸rac Afe/. JcW. SW. 55:369-374;Hyden等(1970) Proc. A^/. ^cac/, Sd 65:898-904; Nelson等(1990) ZVoc. 7Va〃.Jew/. 87:269-273; Quattrone等(2001)尸麼.麵.」cac/. 98:11668-11673;Zhao等(1999) 5/。/. C/zem.274:34893-34902; Zhao等(2000)14:290-300。 Flexner首先揭示了药物诱导的蛋白质合成抑制(如，用5-丙基尿嘧啶或茴香霉素)，当该抑制发生于训练案例之后的临界时间间隔时，能阻断长期记忆。Flexner等(1996)尸rac. Ato/.」cad 55:369-374。如果在该临界时 间窗前或该窗后的任何时间抑制蛋白质的合成，则对长期记忆没有影响。然而 巩固记忆的必需蛋白质、它们的调控机制和它们对巩固长期记忆的作用仍然是 个谜。
已经揭示许多物种的长期关联记忆的形成依赖于蛋白激酶C(PKC)同工酶 易位到神经元膜上并活化。首先，当这些PKC同工酶被钙和辅因子如二酰甘 油组合活化时，可以使外部神经元膜的内表面和内部细胞器如内质网的膜之间 产生稳定的关联。PKC活化发生在软体动物海蛞蝓(/^，/^6"^)的一种已鉴定 的B类细胞中(McPhie等(簡) /脸卿由m. 60:646-651)，基于巴甫洛夫 (Pavlovian)条件反射的各种哺乳动物关联学习方案中，包括家兔瞬膜条件反射 (Bank等(198S)尸rac.淑/,Sc/. 85:1988-1992; Olds等(1989) 245:866-869)、大鼠的空间迷宫学习(01ds等(1990)JiVewrasc/. 10:3707-3713)和大 鼠的嗅觉辨别学习。而且，在一种已鉴定的B类细胞中， 一种PKC的a同工 酶的高亲和力底物克莱斯汀(calexcitin)(Nelson等(1990) Sc/e"ce 247:1479-1483) 的数量和磷酸化程度以巴夫洛夫条件反射依赖性方式增加(Kuzirian等(2001) J.7Vewrac,/. 30:993-1008)。
更多证据表明个体的PKC同工酶在生物过程中起着不同的，有些时候是 相反的作用，这为药物开发提供了两个方向。 一个是设计PKC的特异性(优选 同工酶特异性)抑制剂。由于事实上催化域并不是主要负责PKC同种型特异性 的功能域，因此该方法较为复杂。另一种方法是开发具有同工酶选择性的靶向 调控位点的PKC活化剂。这样可以无需考虑具有相反的生物学作用的其它信 号转导通路的影响。或者，通过在剧烈活化后诱导PKC下调，可以使PKC活 化剂产生长期拮抗作用。
进行了关联记忆方法之后，与特定脑区中膜部分关联的PKC的增加会持 续许多天(01ds等(1989) 5Wence 245:866-869)。与这些发现一致，施用有效的 PKC活化剂苔藓抑素，能增强大鼠的空间迷宫学习能力(Sun等(2005) Ez^乂尸A"rwaco/.512: 45-51)。而且，用PKC活化剂苔藓抑素进行的临床试验表 明(Marshall等(2002) Owcw S/o/ogy cfe 7Tzerap;; l:409-416)通过间歇安排药物递 送可能可以增强PKC的活性作用。 一种PKC活化剂是苔藓抑素，它是一种大环内酯，能够活化亚纳摩尔浓度的 PKC(Talk等(1999)A^ra6/o/丄eamMem.72:95-117)。与佛波酯(phorbol esters)和内源性活化剂DAG一样，苔藓抑素可以结合到PKC的C1域，使它易位到膜上，然后被下调。
为了以已知能使PKC最初活化然后下调延长的剂量(25-12(Hig/m^来治疗癌症，已经在人体内对非致瘤性PKC活化剂苔藓抑素进行了广泛的试验(Prevostel等(2000) Jowma/ o/CW/Sc/e"ce 113:2575-2584; Lu等(1998) Mo/.所o/,Ce//. 8:839-845; Leontieva等(2004) J5/o/.Ozem.279:5788陽5801)。近来还显示PKC活化剂苔藓抑素能够在人成纤维细内活化切割淀粉样前蛋白(APP)产生无毒可溶性前体蛋白片段(sAPP)的a分泌酶(Etcheberrigaray等(2004)尸rac. 7Va仏」cadSc/. 101:11141-11146)。苔藓抑素还能增强大鼠对空间迷宫任务的学习和记忆能力(Sun等(2005)fw /尸/wrm"co/. 512:45-51)，家兔瞬膜案例中的学习能力(Schreurs和Alkon，未发表)和初步研究报告中的海蛞蝓(/f"m/Ment/a)条件反射(Scioletti等(2004)5Zo/. 5w〃. 207:159)。因此，PKC的最佳活化在正常和疾病状态下对影响认知的许多分子机制而言是重要的。
因为没有下调难以获得PKC的上调，反之亦然，于是需要能够上调PKC而使下调最小化的方法来增强所观察到的与PKC活化有关的认知效果。本发明的方法和组合物可以满足这些需要，它会大大改善对于阿耳茨海默病和其它神经变性疾病的临床治疗效果，并预防性地提供了改善的认知增强作用。还提供了通过调节a分泌酶来治疗和/或提高认知状况的方法和组合物。
发明概述
本发明涉及使PKC活化剂接触蛋白激酶C以至刺激蛋白质的合成从而巩固长期记忆的方法。
本发明涉及的方法包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激细胞生长的步骤。
本发明涉及的方法包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激神经元生长的步骤。
本发明涉及的方法包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激树突生长的步骤。本发明涉及的方法包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激树突棘 形成的步骤。
本发明涉及的方法包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激树突棘 密度的步骤。
本发明涉及的方法包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激ELAV 易位到近端树突的步骤。
本发明提供了减缓或逆转记忆力和学习力丧失的方法，包括使有效量PKC 活化剂接触已鉴定为记忆力丧失的对象的蛋白激酶C(PKC)以减缓或逆转记忆 力丧失的步骤。在一个实施方式中，所述使有效量PKC活化剂接触PKC刺激 了细胞或神经元生长。在另一个实施方式中，所述使有效量PKC活化剂接触 PKC刺激了树突生长。再在另一个实施方式中，所述使有效量PKC活化剂接 触PKC刺激了树突棘形成。再在另一个实施方式中，所述使有效量PKC活化 剂接触PKC刺激了树突棘密度。
本发明还提供了刺激细胞或神经元生长的方法，包括使有效量PKC活化 剂接触对象的蛋白激酶C(PKC)从而刺激细胞或神经元生长的步骤。在一个实 施方式中，所述对象被鉴定为学习力或记忆力受损。在另一个实施方式中，所 述使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突生长。再在另一个实施方式中， 所述使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突棘形成。再在另一个实施方式 中，所述使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突棘密度。
在一个实施方式中，所述PKC活化剂是大环内酯。在一个实施方式中， 所述PKC活化剂是苯并内酰胺。在一个实施方式中，所述PKC活化剂是吡咯 烷酮。在一个优选实施方式中，所述大环内酯是苔藓抑素。在更加优选的实施 方式中，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17或國18。在最优选的实施方式中，所述苔藓 抑素是苔藓抑素-1。
在一个实施方式中，所述大环内酯是纳瑞他汀(neristatin)。在一个优选实 施方式中，所述纳瑞他汀是纳瑞他汀-1。
在一个实施方式中，所述接触活化PKC。在一个实施方式中，所述接触使 PKC数量增加。在一个实施方式中，所述接触使PKC合成增加。在一个实施方式中，所述接触使克莱斯汀(calexcitin)的数量增加。在一个实施方式中，所述接触不导致PKC随后发生显著失调(deregulation)。
在一个实施方式中，重复所述接触。在另一个实施方式中，以规律间隔重复所述接触。在另一个实施方式中，所述间隔为l周至l个月，1天至1周，或少于1小时至24小时。在另一个实施方式中，所述间隔为1周至1个月。在另一个实施方式中，所述间隔为1天至1周。在另一个实施方式中，所述间隔为少于1小时至24小时。
在一个实施方式中，在一固定期间内保持所述接触。在另一个实施方式中，所述固定期间为少于24小时。在另一个实施方式中，所述固定期间为少于12小时。在另一个实施方式中，所述固定期间为少于6小时。在另一个实施方式中，所述固定期间为少于6小时。在另一个实施方式中，所述固定期间为少于4小时。在另一个实施方式中，所述固定期间为少于2小时。在一个优选实施方式中，所述固定期间约为1-12小时。在更加优选的实施方式中，所述固定期间约为2-6小时。在最优选的实施方式中，所述固定期间约为4小时。
在一个实施方式中，在多于l天的期间内重复所述接触。在另一个实施方式中，在l天至l个月的期间内重复所述接触。在另一个实施方式中，在l天至I周的期间内重复所述接触。在另一个实施方式中，在1周至1个月的期间内重复所述接触。在另一个实施方式中，在l-6个月的期间内重复所述接触。在另一个实施方式中，在1个月的期间内重复所述接触。在另一个实施方式中，在多于1个月的期间内重复所述接触。
在一个实施方式中，给予所述PKC活化剂以至增强对大脑或中枢神经系统的送药并最小化对外周组织的送药。在另一个实施方式中，给予所述PKC活化剂以增强PKC活化剂穿过血脑屏障运送。在一个实施方式中，PKC活化剂被制成能增强对大脑或中枢神经系统的送药并最小化对外周组织的送药的药物组合物。在另一个实施方式中，本发明的PKC活化剂利用美国专利公开号20040204354中所述的人造LDL颗粒给予，该专利公开通过引用全文纳入本文。在另一个实施方式中，所述PKC活化剂被制成人造LDL颗粒。再在另一个实施方式中，所述PKC活化剂与胆固醇结合并被制成人造LDL颗粒。
本发明涉及使PKC活化剂接触蛋白激酶C以至下调PKC的方法。在一个实施方式中，所述PKC活化剂是大环内酯。在一个实施方式中，所述PKC活化剂是苯并内酰胺。在一个实施方式中，所述PKC活化剂是吡咯垸酮。在一个优选实施方式中，所述大环内酯是苔藓抑素。在更加优选的实施
方式中，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、-11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、或-18。在最优选的实施方式中，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1。
在一个实施方式中，所述大环内酯是纳瑞他汀。在一个优选实施方式中，所述纳瑞他汀是纳瑞他汀-1 。
在一个实施方式中，所述接触不刺激PKC合成。在另一个实施方式中，所述接触基本上不刺激PKC合成。在另一个实施方式中，所述接触使PKC数量减少。在另一个实施方式中，所述接触使PKC数量显著减少。在另一个实施方式中，所述接触不刺激克莱斯汀的合成。
在一个实施方式中，在一段持续期间内进行所述接触。在一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至24小时。在另一个实施方式中，所述持续期间为1天至1周。在另一个实施方式中，所述持续期间为l周至l个月。在另一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至12小时。在另一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至8小时。在另一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至4小时。在一个优选实施方式中，所述持续期间约为4小时。
在一个实施方式中，所述接触造成PKC持续下调。在一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至24小时。在另一个实施方式中，所述持续期间为1天至1周。在另一个实施方式中，所述持续期间为1周至1个月。在另一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至12小时。在另一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至8小时。在另一个实施方式中，所述持续期间为少于1小时至4小时。在一个优选实施方式中，所述持续期间约为4小时。
本发明涉及使PKC活化剂接触蛋白激酶C以至刺激蛋白质的合成从而巩固长期记忆的方法，还包括抑制PKC降解的步骤。
在一个实施方式中，所述降解通过泛素化作用进行。在另一个实施方式中，所述降解受乳胱素(lactacysteine)抑制。在另一个实施方式中，所述PKC来自人。
本发明涉及使PKC活化剂接触蛋白激酶C以至刺激蛋白质的合成从而巩固长期记忆的方法，其中以含有PKC活化剂和药学上可接受的载体的药物组 合物形式提供所述PKC活化剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物还含有PKC抑制剂。在另一个实施 方式中，所述PKC抑制剂是在外周组织内抑制PKC的化合物。文中，本文所 用的"外周组织"是指除脑以外的组织。在另一实施方式中，所述PKC抑制 剂是优选在外周组织中抑制PKC的化合物。在另一实施方式中，所述PKC抑 制剂是一种能够缓解PKC活化剂给药相关肌痛的化合物。在另一实施方式中， 所述PKC抑制剂是一种能够在PKC活化剂受治个体中缓解肌痛的化合物。在 另一实施方式中，所述PKC抑制剂是一种能够提高PKC活化剂耐受剂量的化 合物。具体而言，PKC抑制剂包括，例如，但不限于-
维生素E、维生素E类似物，以及它们的盐；钙感光蛋白C;噻唑垸二酮 类；罗伯斯妥林(ruboxistaurin)，及它们的组合。本文所用的"维生素E"是指 a-生育酚(5，7，8-三甲基生育酚)；(3-生育酚(5，8-二甲基生育酚；5-生育酚(8-甲基 生育酚)；和Y-生育酚(7，8-二甲基生育酚)，以及它们的盐和类似物。
附图简述
图1描述了苔藓抑素对获得长期记忆的影响，该图显示，经亚优训练的动 物在接受苔藓抑素后均表现为获得了长期记忆。
图2描述了苔藓抑素对获得长期记忆的影响，该图显示，用或不用苔藓抑 素，随机进行光照和旋转未产生条件反应。
图3描述了苔藓抑素对获得长期记忆的影响，该图显示，使动物连续两天 接触苔藓抑素4小时，然后在第3天进行2次训练事件(TE)，动物表现出获得 了至少6天的长期记忆。
图4描述了苔藓抑素对获得长期记忆的影响，该图显示，使动物连续三天 接触苔藓抑素4小时，然后在第4天进行2次TE，动物表现出获得了至少96 小时的长期记忆。
图5描述了苔藓抑素对获得长期记忆的影响，该图显示，接触苔藓抑素 8-20小时，然后进行2次TE不足以获得与接触苔藓抑素4小时所得相当的记 忆。图6描述了苔藓抑素对获得长期记忆的影响，该图显示，接触浓度超过
1.0ng/ml的苔藓抑素抑制长期记忆的获得。
图7描述了苔藓抑素和茴香霉素对获得长期记忆的影响，该图显示，单次 接触苔藓抑素4小时，加上2次TE能产生持续数小时的长期记忆，而在接触 苔藓抑素时存在茴香霉素则会完全消除这种记忆。
图8描述了苔藓抑素和乳胱素的影响，该图显示，乳胱素将单次接触苔藓 抑素(接着进行2次TE)所产生的短时记忆转变为持续许多天的长期记忆。
图9描述了 PKC活化对克莱斯汀的影响。
图10a描述了苔藓抑素和训练事件对克莱斯汀免疫染色的影响。本图显 示，在B型细胞中，克莱斯汀随着训练事件数的增加而增加。
图10b通过免疫染色显示单独的苔藓抑素对克莱斯汀的影响。
图lla显示了连续两天接触苔藓抑素4小时并在24小时后进行2次训练 事件对克莱斯汀强度的影响。该图显示，连续两天接触苔藓抑素4小时并在24 小时后进行2次训练事件才能将克莱斯汀水平提高到巩固长期记忆所需的量。
图lib描述了接触苔藓抑素后加入茴香霉素对克莱斯汀的影响。本图显示 了在2次TE加3天4小时接触苔藓抑素后加入茴香霉素未减少克莱斯汀的免 疫染色。
图12显示，据细胞溶胶组分中组蛋白磷酸化检测，重复的4小时苔藓抑 素接触对PKC活性的影响。本图显示，连续两天接触苔藓抑素使PKC活性显 著高于对照或基线水平。
图13显示，据细胞膜组分中组蛋白磷酸化检测，重复的4小时苔藓抑素 接触对PKC活性的影响。本图显示，连续两天接触苔藓抑素使PKC活性显著 高于对照或基线水平。
图14描述了茴香霉素对PKC活性的影响。本图显示，连续三天接触苔藓 抑素的过程中每天存在茴香霉素能降低细胞溶胶和细胞膜组分中的PKC活性。
图15描述了苔藓抑素对海马神经元中的膜-结合PKC的影响。本图显示， 使培育的海马神经元接触单剂活化剂量的苔藓抑素(0.28nM) 30分钟导致短期 的PKC从细胞溶胶易位到颗粒部分(约60%)，及此后长期的下调。第一次接触 后再次接触长达4小时使单次接触苔藓抑素4小时后发生的下调显著减弱。图16描述了重复接触苔藓抑素对PKC活性的影响。本图显示，延迟2-4 小时后进行第二次接触消除了单次接触苔藓抑素30分钟所产生的显著下调， 如果第一次接触后延迟4小时再进行第二次，则活性增加到基线之上，并显著 高于2小时或更短时间之后进行第二次接触所得水平。
图17描述了苔藓抑素对蛋白质合成的作用。使大鼠IGF-IR细胞接触 0.28nM苔藓抑素30分钟，培育1-79小时。然后将["S]甲硫氨酸(9.1pCi)加入 培养液，然后分析放射标记物。据收集神经元前最后半小时内的"S-甲硫氨酸 掺入检测，单次接触0.28nM苔藓抑素30分钟，在接触后24小时内使总体蛋 白质合成提高了 20%， 79小时内提高了 60%，但当同时存在PKC抑制剂 Ro-32-0432时，提高幅度显著降低。
图18描述了 PKOx易位到神经元细BT质膜的诱导。
图19描述了 CA1神经元中PKCa的剂量和时间依赖性。
图20描述了苔藓抑素-介导的ELAV核输出到树突轴(dendritic shaft)。
图21描述了苔藓抑素-介导的ELAV核输出到树突轴的剂量和时间依赖性。
图22描述了通过标记棘特异性蛋白一亲棘蛋白一测得的苔藓抑素-介导的 树突棘密度提高。
图23描述了使CA1和CA3神经元接触苔藓抑素30分钟后，苔藓抑素-介导的近端树突轴内树突棘密度的提高。
图24描述了苔藓抑素-介导的CA1神经元内棘数增加的剂量和时间依赖性。
图25描述了体内条件下CA1和CA3海马神经元内苔藓抑素-介导的棘数 增加。
图26描述了苔藓抑素对学习和记忆力保留的影响。星号表示明显不同于 游泳对照(**， p<.01; **， p<.001)。在试探测试(probe test)中，迷宫+苔藓抑素 (Bryo)明显不同于迷宫和迷宫+苔藓抑素+RO (p<.05)。
图27描述了苔藓抑素对经过空间迷宫任务训练的大鼠树突棘的影响。星 号表示明显不同于天然对照(*， p<.05; **， p<.001)。
图28描述了苔藓抑素对蘑菇棘(mushroom spine)的影响。星号表示明显不同于天然对照(*， p<.05; **， p<.001)。
图29描述了苔藓抑素对突触前和突触后结构的不同作用。星号表示明显
不同于天然对照(*， p<.05; **， p<.01; ***， p<.001)。
图30描述了通过激活PKC提高棘密度的机制。黄色箭头表示质膜。白色 箭头表示CA1神经元。
图31描述了通过激活PKC提高棘密度的机制。星号表示明显不同于天然 对照(*， p〈.05; **， p〈.01; ***， p<.001)。
发明详述
1.定义
本文所用的"上调"是指通过各种机制(包括但不限于增加转录、翻译和
/或提高转录物或蛋白质产物的稳定性)而相比于基线状态增加某种物质如PKC
蛋白或转录物的数量或提高其活性。
本文所用的"下调"是指通过各种机制(包括但不限于减少转录、翻译和 /或降低转录物或蛋白质产物的稳定性)而相比于基线状态减少某种物质如PKC 蛋白或转录物的数量或降低其活性。
本文采用的术语"药学上可接受的载体"是指活性成分可与之组合，且组 合后可用来将活性成分施用到个体的化学组合物、化合物或溶剂。本文所用的 "药学上可接受的运载体"包括但不限于一种或多种以下物质赋形剂；表面 活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；防腐剂； 可生理降解的组合物如明胶；水性载体和水性溶剂；油性载体和油性溶剂；悬 浮剂；分散剂或湿润剂；乳化剂，缓和剂(demulcent);缓冲液；盐类；增稠剂； 填充剂；抗氧化剂*，稳定剂；和药学上可接受的多聚或疏水材料和本领域已知 的和有记载的其它成分，例如全文纳入本文做参考的Genaro编(1985)的国宾夕 法尼亚州伊斯顿市的马克出版公司(MackPublishing Co.)出版的《雷明顿药物科 学(i em/"gtow'f /Vzamwcewh'cfl/5We"ce^》中i己载的另卩些。
可以用药物学领域各种己知的或今后的方法制备本文所述药物组合物制 剂。通常，这种制备方法包括将活性成分与运载体或一种或多种其它助剂组合 的步骤，然后，如果必须或需要，将该产物成形或包装成所需的单剂单位或多剂单位。
尽管本文所述的药物组合物主要是指适于人用的药物组合物，技术人员应 该理解这种组合物一般说来适用于各种动物。如何使所述组合物适用于各种动 物而对适于人用的药物组合物作出改变是本领域所熟知的，普通兽药学家即使 需要也仅需要进行普通实验就可以设计和完成这类改变。据信，可以施用本发 明药物组合物的个体包括但不限于人及其它灵长类和其它哺乳动物。
2.阿耳茨海默病
阿耳茨海默病与脑中的特异性神经元亚群大量损伤有关的，其普遍症状为 丧失记忆。(Katzman(1986) 7Vew五wg/aw" Jowma/ o/314:964)。阿耳茨 海默病的特点是神经病理性改变。然而，己报道的外周组织异常支持了这样一 种可能性，就是阿耳茨海默病是一种最显著表现为中枢神经系统病变的全身性 疾病。(Connolly(1998)祭遂，r/尸S Co/. 19:171-77)。将阿耳茨海默病与遗传起 源和染色体1、 14和21相联系的论述参见St.George-Hyslop等(1987) Sc/e"ce 235:885; Tanzi等#"述，7Vewra6/o/ogy o/A'jewe 3:159-168; Hardy(1996)爿"a W譜"固^谱7^ 165:13-17。
对个体患上阿耳茨海默病的定义是进行性记忆损伤、失语以及视觉空间技 能和行为不足(McKhann等(1986) Wewra/ogy 34:939-944)。患有阿耳茨海默病的 个体的认知受损是由位于大脑皮层、海马、基底前脑和其它脑区的神经元细胞 退化所造成的。对尸体解剖获得的阿耳茨海默病患者大脑进行的组织学分析证 明了在退化神经元的核周体和轴突中、胞外神经炎性(老年性)斑和受影响脑区 的一些血管内壁和周围的淀粉样斑中均存在神经元纤维缠结(NFT)。神经元纤 维缠结是含有以螺旋型配对的纤维(直径约10nm)的异常纤维样结构，因此也称 为成对螺旋纤维。神经炎性斑位于退化的神经末梢(包括轴突和树突)，含有淀 粉样蛋白纤维的核心化合物。总之，阿耳茨海默病的特点是具有某些神经病理 特征，包括胞内神经元纤维缠结，主要由细胞骨架蛋白和胞外薄壁组织和脑血 管淀粉样蛋白组成。此外，本领域目前已经有办法区分阿耳茨海默病患者、正 常的老年人和其它神经变性疾病如帕金森症、亨廷顿氏舞蹈病、韦尼克-科尔 萨科夫综合征(Wernieke-Korsakoff)或精神分裂症的患者，在美国专利5,580,748 和美国专利6,080,582中有进一步的举例描述。尽管引起神经元损伤的细胞改变和疾病的根本病因仍在研究中，但已确证 了 APP代谢具有重要影响。在阿耳茨海默病患者的脑中被始终确定为对脑生 理学或病理生理学有作用的两种蛋白质是(3-淀粉样蛋白和T蛋白。(参见
Selkoe(2001)/V^/o/og/c"/^v/ewy.81:2)。有关卩-淀粉样蛋白代谢缺陷和异常钙 禾急态禾口/或f丐活化激酶的论述。(Etcheberrigaray等j/z/ze/wer》i epw^第3、 5 和6巻第305-312页；Webb等(2000) B〃力W Jowr"a/ o/P/2"wwco/ogy 130:1433-52)。
阿耳茨海默病(AD)是一种脑病，其特点为蛋白质分解代谢发生变化。蛋白 质磷酸化改变与阿耳茨海默病患者中发现的胞内形成神经元纤维缠结有关。淀 粉样前体蛋白质(APP)的加工处理产生的片段，之后聚集形成作为阿耳茨海默 病(AD)特征的淀粉样沉淀片段，称为老年斑或AD斑。阿耳茨海默病的主要病 理特征是斑块内有淀粉样蛋白质沉淀。因此，APP加工处理是AD的早期和关 键的病理生理学事件。
已确定存在3种APP加工处理途径。前文术语"正常"加工处理包括在 A卩序列的Lysl6残基位点(或在Lysl6和Leul7之间；APP770命名法)处切割 APP的酶的参与，得到非促淀粉样变片段大的N-末端外功能区和小的9kDa 膜结合片段。尚待完全确定的所述酶称为a-分泌酶。还有另外两种分泌酶可以 参与APP的加工处理。 一种或选途径包括在Ap功能域外的Met671和Asp672 位点之间切割APP(用p-分泌酶)和内体-溶酶体(endosomal-lysomal)系统的参 与。另一个切割位点发生在A(3段的羧基末端，质膜内A)3肽的第39位氨基酸 之后。该分泌酶(力的作用产生了含有A(3全序列和6kDa细胞关联片段的胞外 氨基酸末端。因此，经过P和Y分泌酶的加工处理，产生了因为含有AP全序 列而成为的潜能促淀粉样变片段。多条证据链显示所有或选途径均可发生于同 一个给定系统，可溶性A(3可以是"正常产物"。然而，仍然有证据表明CSF 和血浆中的循环AP的数量在带有"瑞典人(Swedish)"突变的患者中升高了。 而且，用该突变或APP717突变转染的培养细胞分泌更多的A|3。最近，揭示 了其它APP突变和PS1和PS2突变的携带者可以分泌出更多的特定形式的长 (42-43氨基酸)片段AP。
因此，尽管在正常情况下所有或选途径均可能发生，在家族性和可能的散发性AD中出现了促进促淀粉样变加工的失衡。这些增强的促淀粉样变途径最
终导致AD患者脑中形成纤维和斑块。因此，促进非促淀粉样变、a-分泌酶途 径的干预能够有效地将APP加工平衡转向据信为非致病性的、增加APP比之 可能有毒的AP肽的相对数量的加工。
所述PKC同工酶提供了一种关键的、特异的限速分子靶点，由此可以阐明 生物化学、生物物理学和行为效力之间的独特关联并应用这种关联来改善认知 能力。
此夕卜，就正常和异常记忆而言，已经证明K+和Ca^通道均对记忆储存和记 忆复苏起着关键的作用。例如，已发现在记忆储存过程中钾通道会变化。 (Etcheberrigaray等(1992)尸rac.A^/.」cw/.Sc/. 89:7184; Sanchez-Andres等(1991) ■/ow/W q/We腳6油gy 65:796; Collin等(1988) 5/。/ ty由Jo画a/ 55:955; Alkon 等(1985) 5e/zav/ora"m/iVewra/历o/ogy 44:278; Alkon(1984) S"e"ce 226:1037)。 该观察结果，结合阿耳茨海默病患者中几乎都会发生的失忆症状，使我们开始 对钾通道功能可能是阿耳茨海默病的一个病理位点和PKC调控对认知的影响 展开研究。
3.蛋白激酶C和阿耳茨海默病
己经确定，PKC是最大的非受体丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因家族之一。 自从Nishizuka和同事们在八十年代早期有关PKC的发现(Kikkawa等(1982) JS/o/.C/zem. 257:13341)和将它确定为佛波酯的主要受体(Ashendel等(1983) Omc^:i "， 43:4333)以来，己经有了许多关于该酶的生理学信号传导机制的 描述。人们对PKC的如此强烈的兴趣源于其可以被钙和二酰甘油(和它的佛波 酯模拟物)体外活化这一独特能力，二酰甘油是一种效应物，它的形成与生长 因子和分化因子作用下的磷脂转变相偶联。
目前，所述PKC基因家族由ll种基因组成，将它们分成4个亚组l)经 典的PKCou &、 j32((3,和f32是同一种基因的另路剪接形式)和Y， 2銜型PKCS、 s、 Ti和e， 3)非典型性PKCC、 X、 ti禾Bt以及4)PKQi。 PKCp类似于新型PKC 同工型，差别在于它具有推定的跨膜区(综述参见Blohe等(1994) C""cw M"aWJ ev.l3:411; Hug等(1993) 5/oc&m 291 :329; Kikkawa等(1989) ^肌i ev.说oc/2e肌58:31)。 a、 (3!、 |32和y同工型是Ca2、磷脂和二酰甘油依赖型，代表了经典的PKC同工型，而其它同工型均受磷脂和二酰甘油的活化却不依
赖于CA^。所有同工型均包含5个可变(V1-V5)区，cu p、 y同工型含有4个 (Cl-C4)高度保守的结构域。除PKCa、 P和y以外的所有同工型均缺乏C2区， x、 T!和同工型的C1内还缺乏结合二酰甘油的两个富含半胱氨酸的锌指区中的 九个。Cl区还含有在所有同工型中均高度保守的伪底物序列，其通过阻断底 物结合位点产生无活性的酶构象而起着自身调节功能(House等，(1987) Sc/e"ce 238:1726)。
因为具有这些结构特征，不同的PKC同工型在应答生理学刺激的信号传 导(Nishizuka (1989) Ca"cer 10:1892)，以及在肿瘤转化和分化中(Glazer (1994) 《蛋白激酶C(尸rafeZw&waw C)》J.F.Kuo编，牛津大学出版社(1994)第171-198 页)具有高度特异性的作用。关于已知的PKC调节剂的讨论参见 PCT/US97/08141、美国专利号5,652,232; 6,043,270; 6,080,784; 5，891，906; 5，962，498; 5,955,501; 5,891,870和5，962，504。
鉴于PKC在信号转导中起着主要作用，据证明PKC是调控APP加工的 兴奋靶点。已经确证PKC参与APP加工。已经揭示，例如佛波酯能显著增加 通过PKC活化分泌的非促淀粉样变可溶性APP(sAPP)的相对量。然而，用佛 波酯活化PKC看起来无法使APP分子直接磷酸化。不考虑作用的精确位点， 佛波醇诱导的PKC活化能增强或促进a-分泌酶，非促淀粉样变途径。因此， PKC活化有望作为影响无害sAPP的产生，甚至产生有益sAPP且同时减少A(3 肽相对量的方法。然而，由于佛波酯具有肿瘤促进活性，因而不是最终迸行药 物研发的合适化合物。(Ibarreta等(1999)7Vewrai e;wW第10巻，第5和6号， 第1034-40页)。
本发明人还观察到蛋白激酶C的活化促进阿耳茨海默病(AD)淀粉样前体 蛋白(APP)的a-分泌酶加工，由此产生非促淀粉样变可溶性APP(sAPP)。结果
减少促淀粉样变AM。和Am2(3)的相対分泌量。这一点尤其重要，因为成纤维细 胞和其它表达APP和早老素AD突变的细胞的总A(3分泌量增加和/或 Am2(3)/Amo的比僮提高。有趣的是，在AD患者脑中(a和p同工型)和AD患 者的成纤维细胞中(a-同工型)均发现PKC缺陷。
研究表明对a、 p和y同工型选择性增强的其它PKC活化剂(即苯并内酰胺)能增强sAPP分泌使之超过基线水平。经苯并内酰胺处理的AD细胞的sAPP 分泌也略高于经苯并内酰胺处理的成纤维细胞对照，仅在用10pM BL处理后 才出现显著的sAPP分泌增加。据进一步报道，十字孢碱(一种PKC抑制剂)能 够消除苯并内酰胺对对照和AD成纤维细胞的影响，而相关化合物还在PC12 细胞中引起 3倍的sAPP分泌。本发明发明人发现用苔藓抑素作为PKC活化 剂来促进非促淀粉样变APP加工没有肿瘤促进作用且已在II期临床试验阶段， 因而极具治疗价值。
阿耳茨海默病(AD)患者的成纤维细胞中的变化包括PKC的变化，以及钙 调和钾(K+)通道的变化。据检测TEA-诱导的[Ca"]增加显示，已经表明PKC活 化能够恢复正常的K+通道功能。进一步的膜片钳数据证实了 PKC活化剂对 113psK+通道活性恢复的作用。因此，基于PKC活化剂来恢复K+通道已被确立 为研究AD病理生理学的方法之一，它为AD治疗提供了有价值的模型。(参见， 审理中的美国申请序列号09/652,656，以其全文纳入本文作为参考。)
特别有意义的是刺激PKC的大环内酯类(即苔藓抑素类和纳瑞他汀类)。在 苔藓抑素类化合物中，已经显示苔藓抑素-1能活化PKC，而且被证明没有促肿 瘤活性。苔藓抑素-1，作为一种PKC活化剂，还由于其具有双相的剂量反应曲 线而特别有用。此外，还证实苔藓抑素-l能够差异调控PKC同工型，包括PKCou PKCS和PKCs。已经在动物和人身上对苔藓抑素-1进行了毒性和安全性的研 究，并且正作为抗癌药被广泛研究。用苔藓抑素-l进行的研究确定，其对人的 主要副作用是肌痛，因此最大剂量限制在40mg/m2。本发明采用浓度为O.lnM 的苔藓抑素-1大大增加了 sAPP的分泌。将苔藓抑素-1与单独载体和另一种 PKC活化剂苯并内酰胺(BL)(高10,000倍的浓度)进行了比较。目前正在对苔藓 抑素作为抗癌药进行临床试验。已知苔藓抑素会结合PKC的调控区并活化该 酶。苔藓抑素是PKC的同工型选择性活化剂之一。已经发现除了苔藓抑素以 外还有其它化合物能调控PKC。(参见例如，W097/43268;以其全文纳入本文 作参考)。
大环内酯类，尤其是苔藓抑素-1可参见美国专利4,560,774 (以其全文纳入 本文作为参考)。大环内酯类和它们的衍生物在本领域的其它地方有所描述， 例如美国专利6,187,568、美国专利6,043,270、美国专利5,393,897、美国专利5,072,004、美国专利5,196,447、美国专利4,833,257和美国专利4,6U,066(均以 其全文纳入本文作参考)。上述专利描述了大环内酯类的各种化合物和各种用 途，包括它们的消炎用途或作为抗肿瘤药的用途。关于苔藓抑素类化合物的其 它讨论参见Szallasi等(1994)在NIH 3T3成纤维细胞中苔藓抑素1和佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐对蛋白激酶C同工型的差异调控(Differential Regulation of Protein Kinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH 3T3 Fibroblasts), Jowrwa/ o/5/o/og〖ca/ C7zem&^y 269(3):2118-24; Zhang 等(1996)蛋白激酶C的活化剂，天然产物抗癌药苔藓抑素1的临床前药理学 (Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer Agent Bryostatin 1 ， an Activator of Protein Kinase C)， Cawcer 7 e鄉ra^ 56:802-808; Hennings等(1987) 蛋白激酶C的活化剂苔藓抑素1抑制佛波酯对SENCAR小鼠皮肤肿瘤的促进 作用(Bryostatin 1 ， an Activator of Protein Kinase C ， inhibits tumor promotion by phorbol esters in SENCAR mouse skin)， Gar"'wogewei^ 8(9):1343-46; Varterasian 等(2000)苔藓抑素1对复发的低级非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病 患者的II期试验(Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low-Grade Non-Hodgkin，s Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukemia), C7/m'ca/ Ca"cer i^earc/z 6:825-28;和Mutter等(2000)综述文章苔藓抑素的化学和临床生物 對Review Article:Chemistry and Clinical Biology of the Bryostatins) ， 5z'oo;-g謹'c & MeAc/"a/ C/zew/^y 8:1841-1860 (均以其全文纳入本文作参考)。
肌痛是限制PKC活化剂的耐受剂量的主要副作用。例如，在使用苔藓抑 素-1的II期临床试验中，据报道，10-87%的患者发生肌痛。(Clamp等(2002) ^z"-CawerDn^ 13:673-683)。每周一次，每次2(Hig/m2，持续3周的剂量耐 受良好，未见肌痛或其它副作用。(Weitman等(l999) C//m'ca/Ca"c"i e"arc力 5:2344-2348)。另一项临床研究中，每周一次施用25pg/m2的苔藓抑素-1 ，持续 8周是最高的耐受剂量。(Jayson等(1995)5nY/^2J o/Q "cer 72(2):461-468)。另 一项研究报道，50^ig/mS(每两周静脉输注1小时来给药，持续6周)是最高的耐 受剂量。(Prendville等(1993)Bnfe/^. o/Omcer 68(2):418-424)。报道的肌痛随 着苔藓抑素-1的重复给药而加剧，并开始于初次注射后的数天。肌痛对患者生 活质量的不良影响是苔藓抑素-1治疗中断的原因之一。苔藓抑素诱发肌痛的病因尚未确定。
(美国)国立癌症研究所建立了分级肌痛的通用毒性标准。具体地说，该标 准分成5类或5个等级。0级表示无肌痛。1级肌痛的特点是无需止痛药的缓 和短暂疼痛。1级肌痛时，患者行动自如。2级肌痛的特点是中等疼痛，该疼
痛或所需的止痛药会干扰一些功能但不会干扰日常生活的活动。3级肌痛是剧 烈疼痛，该疼痛或必需的止痛药会严重干扰日常生活的活动。4级肌痛使人丧 失活动能力。
本发明组合物通过在外周组织中降低PKC活化提高了患者对PKC活化剂 的耐受剂量并且/或者减少或减轻了与PKC活化有关的副作用。具体地说，PKC 抑制剂能抑制外周组织中的PKC，或优选抑制外周组织中的PKC。例如，实 验显示，维生素E能够在糖尿病大鼠主动脉和接触高葡萄糖水平的大鼠平滑肌 细胞培养物中使二酰甘油-蛋白激酶C活化恢复正常。(Kunisald等(1994) D/a&to 43(11): 1372-1377)。在中度阿耳茨海默病患者中进行的维生素 E(2000IU/天)双盲试验中发现，维生素E降低了死亡率和发病率，但无法增强 认知能力。(Burke等(1999) PoW Grafifware 7We&c/"e 106(5):85-96)。
大环内酯类，包括苔藓抑素类，最初来源于多室草苔虫(所gw/a朋n'""a丄)。
尽管已经知道大环内酯类，尤其是苔藓抑素类，具有多重用途，但尚了解大环
内酯类和认知增强之间的联系。
可用于本发明的化合物的例子包括大环内酯类(即苔藓抑素类和纳瑞他汀
类化合物)。尽管实施例和具体描述中描述了这些化合物的具体实施方式
，但 应该理解，参考文献中公开的化合物及其衍生物也可用于本发明的组合物和方法。
本领域普通技术人员应该理解，大环内酯化合物及其衍生物，尤其是苔藓 抑素类，可以通过组合合成技术进行制备，因此可以建立化合物文库来优化包 括但不限于组合物的效力和安全性在内的药理学参数。此外，还可以用这些文 库试验确定那些更适宜调控a-分泌酶和/或PKC的成员。
本发明还包括采用苔藓抑素的合成类似物。具体地说，据与苔藓抑素的 NMR光谱比较，这些类似物保留了Cl-、 C19-、 C26-氧识别区的取向以及不同 程度的PKC结合亲和力。美国专利号6，624,189(以其全文纳入本文作参考)所公开和描述的所述苔藓抑素类似物也可用于本发明的方法中。具体地说，美国
专利号6,624,189的式I类化合物(第3栏，第35-66行)和美国专利号6,624,189 的式II-VII以及1998a和1998b化合物(第8栏，第28-60行)所表示的苔藓抑 素类似物是适用于本发明方法的PKC活化剂。
仍然需要通过认知能力的具体特征或者通过普遍认知来发展能够改善总 体认知的治疗方法。仍然需要发展能够增强认知的方法，而不论它是否与具体 疾病状况或认知紊乱有关。本发明的方法和组合物满足了这些需要，能够大大 改善临床上对阿耳茨海默病和其它神经变性疾病的治疗效果，同时，能够增强 认知能力。还提供了通过调节a分泌酶来处理和/或增强认知状况的方法和组合 物。
4.蛋白激酶C的活化和突触可塑性
活化蛋白激酶C能刺激突触可塑性。突触可塑性这一术语用来描述改变两 个神经元之间的连接或突触的强度的能力。协作实现突触可塑性的一些机制包 括释放到突触中的神经递质量的改变以及细胞响应那些神经递质的效率的改 变(Gaiarsa等，2002)。由于记忆力是大脑内相互连接的突触网络产生的，因此 突触可塑性是学习力和记忆力的一种重要神经化学基础。
树突棘密度的改变构成突触可塑性的基础。树突棘密度改变在包括学习力 和记忆力在内的许多大脑功能中发挥作用。例如，长期记忆部分受到新树突棘 生长调节从而强化特殊神经通路。通过强化两个神经元之间的联系，突触前细 胞激活突触后细胞的能力得以增强。
树突棘是一种小的(亚微米)膜凸出部，它从树突上伸出并形成一半突触。 典型的棘具有球状的头(棘头)，其通过细小棘颈与母树突相连。在大脑中大多 数主要神经元的树突上发现了树突棘。根据形状可将棘分为，例如，蘑菇棘、 细棘和粗棘。电镜显示出这些类型之间的形状连续性。 一些证据表明，不同形 状的棘反映了不同的突触发育阶段和强度。激光扫描和共焦显微术显示出包括 棘大小和密度在内的棘特性的变化。采用这些技术对活体大脑进行的慢速研究 已显示，棘会产生和消失，较大的蘑菇棘最稳定。
一些蛋白质是树突棘形成的标记物。例如，亲棘蛋白在树突棘中高度富集 并已显示能调节树突棘的形成和功能。ELAV蛋白是神经元分化的最早期标记基因表达的转录后调节。
实施例
实施例l:行为药理学
接^#^"#"^^素一开始实验前，将海蛞蝓(/ferm&e^/a Cra^&om/力样品置 于穿孔的50-ml锥形离心管中在15。的人造海7K(ASW)中养3天。将从海生苔 藓动物多室草苔虫中纯化得到的苔藓抑素溶解于EtOH，并在ASW中稀释至 所需的终浓度。使该动物与苔藓抑素一起在ASW中培养4小时，然后用标准 ASW漂洗。针对所选实验往ASW中加入乳胱素(IO ^M)或茴香霉素。
通过往每个动物所居住的8cm长，直径为lcm的试管内的培养浴液中加 入药物使苔藓抑素对海蛞蝓的行为及其生物化学属性产生影响。
实施例2:免疫染色方法
实验性处理和试验之后，将动物快速去头，取出中枢神经系统(CNS)后在 含有4%多聚甲醛的20mM Tris-缓冲(pH8)的天然海水(NSW; 0.2pm微孔过滤) 中固定。然后将CNS包埋入聚酯蜡(20)中，切片(6pm)，用偶联到结合亲和素 的微过氧化物酶上的生物素化二抗免疫染色(ABC方法，载体公司(Vector))，用 氨基乙基咔唑(AEC)作为发色团。在家兔中由提取自乌贼眼叶的全长克莱斯汀 蛋白培养多克隆一抗(命名为25U2)。根据数码显微照片中划定的B-感光器细 胞质区域减去同一背景区(未染色神经毡)来检测灰度强度。
实施例3:蛋白激酶C试验
在含有lmM EGTA、 lmM PMSF和50mM NaF的100(il 10mM Tris-HCL pH7.4缓冲液中，用超声处理(5秒，25W)使细胞匀浆化。将匀浆物转移到异质 同晶聚合物离心管中，4。和100，000xg离心10分钟。分出上清液，立即置于干 冰上冷冻。将颗粒部分在lO(Hd上述缓冲液中通过超声处理使其再次悬浮，-80° 保存。为了测定PKC，将10pl细胞溶胶或颗粒部分在含有10pM组蛋白、4.89 mMCaCl2、 1.2|ig/^il磷脂酰-L-丝氨酸、0.18吗4dl.2-二辛酰基-sn-甘油、10 mM MgCl2、 20mMHEPES(pH7.4)、 0-8mMEDTA、 4mMEGTA、 4%甘油、8吗/ml 抑肽酶、8吗/ml亮抑肽酶和2mM苄脒的条件下37°培育15分钟。加入 0.5|iCi[Y32-P]ATP，如前所述(25)通过吸附到磷酸纤维素上来检测"P-磷蛋白的形成。稍稍调整该试验方法使其分别适用于海蛞蝓神经系统匀浆物或培育的哺 乳动物神经元匀浆物。
实施例4:细胞培养物
将大鼠的海马细胞H19-7/IGF-IR(ATCC)置于涂有多聚-L-赖氨酸的平板 上，使它们在DMEM/10%FCS中于35。生长数天直到覆盖度达到约50%。然后 用含有10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的5ml N2培养液换下原培养液诱导 细胞分化成神经元表型，在T-25烧瓶中于39'C进行培养(26)。然后往1(^1水 溶液中加入各种浓度的苔藓抑素(O.Ol-l.O nM)。 一定间隔后，去除培养液，用 PBS洗涤细胞，轻刮取下细胞，1000rpm离心5分钟收集细胞。
实施例5:行为的条件反射
对海蛞蝓进行巴甫洛夫条件反射训练包括重复成对的神经刺激，即光，和 无条件刺激，即环形振荡。(参见Lederhendler等(24)和Epstein等(6》。旋转/ 振荡刺激能使平衡囊毛细胞兴奋，从而诱发无条件反应称为"足"的肌肉性 下表面迅速收縮，与此同时，附着或"粘着"到支撑足部的表面。条件反射训 练之前，光诱发弱阳性趋光性，与此同时，足部伸长。足够次数的光-旋转成 对刺激后，光不再诱发趋光性，转而诱发新的反应(24):先前只有通过无条件 刺激才能诱发的"粘着"和足縮短(图1)。因此，无条件刺激即旋转或环形振 荡的意义转移到条件剌激，表现为光诱发的足收縮一一种足长度的负改变。对 光的这种条件反应可持续数周，它并不能由随机的光和旋转产生，而是刺激特 异性的，具有哺乳动物巴夫洛夫条件反射的其它特征。
实施例6:苔藓抑素诱使关联记忆延长
对海蛞蝓的巴夫洛夫条件反射训练很好地定义了能使习得条件反应保持 时间逐步延长的训练参数。例如，两次(2TE)光和环形振荡成对训练(参见"方 法")能诱导习得条件反应(光诱发的足收縮或縮短)，不用药时该反应保留约7 分钟的。4-6次训练(4-6TE)诱发了保留长达数小时的条件反应，但在训练结束 约1天后消失。9次TE能产生持续许多天，通常高达2周的长时关联记忆。
釆用4-和6-次成对CS/US训练(TE)的亚优选方案训练动物，在训练前的 暗适应期间(10分钟)加入苔藓抑素(0.25ng/ml)，持续4小时，或者不加苔藓抑 素(NSW对照)；9-次成对的TE和NSW作为阳性对照。在第4小时和此后每隔24小时，所有动物接受单独CS的测试。用苔藓抑素处理过的经亚优方案训
练的动物全部表现为保有长期记忆(11=8-16动物/条件/实验；ANOVA， pO.Ol)。 2次TE加苔藓抑素能使记忆保持数小时(相比之下，不用苔藓抑素时只有 数分钟)，4次TE加苔藓抑素使保持时间延长到超过24小时(图l)和6次TE 加苔藓抑素能使保持时间达1周或更长。
在第4小时进行测试时，不用苔藓抑素(NSW)，随机和成对的CS/US训 练(TE)没有产生LTM或诱发CR。进行6-TE条件反射训练前(IO分钟的暗适应 期间)施用苔藓抑素(0.25ng/mlNSW)并在此后持续4小时产生正的CR(足收縮； 长度的负改变)，由此表明建立了 LTM。拮抗剂Ro-32在训练前(暗适应期间) 施用时，会阻断6TE加苔藓抑素的作用，即动物会伸长(正的长度改变)并具有 正常的趋光性(11=4-8动物/条件/实验；ANOVA差，p<0.01)。随机给予光和旋 转，不论用或不用苔藓抑素，都不会产生条件反应(图2)，即，光诱发的足收 縮。因此，在亚优选训练试验中，在训练期间并紧随其后使用苔藓抑素可以延 长记忆的保留时间。
实施例7:训练前几天预接触苔藓抑素能增强记忆获得 之前的检测(15、 17)表明学习可以诱导的PKC结合于神经元膜(g卩，易位) 可以是持续性的。已经发现，家兔瞬膜条件反射、大鼠空间迷宫学习、迷宫学 习和大鼠嗅觉辨别学习均伴有训练后持续数天的PKC易位。海蛞蝓条件反射 伴有训练后持续至少1天的PKC易位，可在单一可鉴定的B型细胞中观察到 这种现象(15)。
如上所述，训练期间和之后接触苔藓抑素4小时将2TE诱发的记忆保留 时间从6-8分钟延长到数小时。然而，在训练前一天以及2TE当日接触苔藓抑 素4小时可以使训练后的记忆保留时间延长到1天以上。仅采用CS进行试验 时的CR(身体长度收縮)证明了 ，使动物连续2天接触苔藓抑素(0.25ng/m1)4小 时和进行2次成对CS/US训练能产生至少6天的长期记忆(11=16动物/条件； ANOVA， p〈0.01)(图3)。
使动物连续3天接触苔藓抑素(0.25ng/ml)4小时，1天之后进行2-TE，表 现出可在训练后96小时以上测得的长期记忆(LTR)。未接触苔藓抑素的动物(同 图3所示)未表现出任何行为改变(CS检测无CR)。经3天苔藓抑素处理的动物训练后立即给予茴香霉素(ANI)(lpg/ml)，持续4小时，不能阻止长期记忆形成。 因此，3天的苔藓抑素处理可以消除对产生LTR所必需的蛋白质合成的依赖性， 所述蛋白质合成通常受训练后加入的ANI所阻断(11=16动物/条件；ANOVA， pO.01)。第三天的一次4小时苔藓抑素处理引起了类似的巴甫洛夫条件反应记 忆保留延长(图4)。以上结果支持这样的观点，即连续2次间隔开的接触苔藓 抑素能活化PKC，还可能激活长期记忆关键蛋白质的合成，同时尽可能避免了 同时发生和后续发生的PKC下调。2次TE之前延长苔藓抑素接触时间(即8-20 小时)(图5)本身不足以产生与训练前连续2天接触4小时所得结果相当的长期 记忆，这一观察结果进一步支持了上述观点。这些实验中，观察了在训练时接 触苔藓抑素(0.25ng/m1)20小时的作用。采用亚优化的2-成对TE条件反射训练 方案时，48小时后记忆丧失。而采用预接触苔藓抑素20小时的4-成对TE条 件反射训练所得的长期记忆则得以保持(n-8只动物/条件；第48小时的 ANOVA， p<0.01)。已知，在其它细胞系统中，充分延长苔藓抑素接触时间(如， 8-12小时)能引起持续的PKC下调，从而抵消PKC活化和促进PKC合成。
类似地，充分提高的苔藓抑素浓度最终会抑制记忆保持(图6)，据推测可 能也是因为PKC的下调。亚优化(4TE)训练条件下，苔藓抑素浓度〈.50ng/ml 能增加记忆的获得和保持。那些浓度对9-成对TE所得的记忆保持没有明显作 用。然而，在所有检测的训练条件下，浓度》1.0ng/ml均抑制行为的习得和保 持(『16只动物/条件)，据推测可能是由于PKC下调。
实施例8:预接触苔藓抑素能消除对训练期间蛋白质合成的依赖性 对动物进行2-成对训练(TE)， 4小时后检测其记忆保持。在训练前的10 分钟暗适应期间和此后4小时将苔藓抑素(0.25 ng/ml)加入NSW给予动物，结 果表现出行为条件反射保持(足收缩(CR)和体长縮短)。NSW对照动物和那些训 练前接受苔藓抑素处理并在训练后立即接受茴香霉素(1.0^ig/ml)处理的动物均 未发生CR，其足部伸长并表现出正常的正趋光性(11=12动物/条件/实验，双向 ANOVA统计学方法，pO.Ol)。单次4小时接触苔藓抑素加上2次TE能产生 持续数小时的长期记忆，当茴香霉素与苔藓抑素同时存在时，这种记忆保持完 全丧失(图7)。 6TE加苔藓抑素实验中也观察到类似的茴香霉素阻断作用。然 而，重复多次短暂接触苔藓抑素能提高PKC、克莱斯汀和其它记忆蛋白的净合成，这样，如果PKC下调被充分抑制，则不再需要巴夫洛夫条件反射训练期 间和之后的新增合成。对训练前3天每天接触苔藓抑素4小时的动物进行2次
TE后立即施用茴香霉素进行4小时的蛋白质合成抑制。这种情况下，茴香霉 素诱发的蛋白质合成抑制并未阻碍记忆的保持，记忆仍然持续了许多天(图4)。 相反，同样的茴香霉素处理4小时完全消除了 9次TE(—种通常会产生1-2周 记忆保持的训练方案(27))所产生的记忆保持。最后，如果连续3天接触苔藓抑 素4小时，每次均联用茴香霉素，1天后进行2次TE，长期记忆消失。 实施例9:预先接受蛋白酶体抑制能增强苔藓抑素对记忆的影响 增强和延长PKC和其它记忆相关蛋白质从头合成的另一种方法是阻断蛋 白质降解通路。其中之一的泛素-蛋白酶体通路(28-30)，被认为是PKC的a-同 工酶降解的主要途径。如前所述，20pM-5QpM的蛋白酶体抑制剂乳胱素可以 很大程度地阻止PKC-a降解。
将动物与苔藓抑素(0.25ng/ml)和乳胱素(10^/M)同时培养4小时，然后，24 小时之后采用2-次CS/US成对训练(TE)诱导条件反射。接着在训练后第4小时， 然后每隔24小时单用CS测试动物。联用苔藓抑素/乳胱素进行处理的动物具
有持久保持的条件反射行为；单用苔藓抑素处理的动物其行为保持在24小时 后消失。单用乳胱素处理的动物未表现出行为训练的习得或保持(数据未作图)。
(n-28动物，联用苔藓抑素/乳胱素；n=20，单用苔藓抑素；n=16，单用乳胱 素)。此例中，乳胱素将单独接触苔藓抑素(然后进行2次TE)所产生的短时记 忆转换成了持续数天的长期记忆(图8)。
实施例10:基于PKC活性的克莱斯汀-免疫染色
最近我们揭示了在海蛞蝓条件反射的习得和保持期间， 一种已鉴定的B 类细胞中免疫染色标记物克莱斯汀增加(20)。之前的许多发现提示，低分子量 钙-结合和GTP-结合蛋白克莱斯汀，在海蛞蝓条件反射训练期间是PKC同工酶 的底物(19)。目前已经测出了一些物种的克莱斯汀的全序列，它看起来与在其 它物种中的相似蛋白具有显著的同源性(31)，在海蛞蝓巴甫洛夫条件反射训练 期间和之后经历了磷酸化的改变。它同时还是PKC的a同工酶的高亲和力底 物以及p和Y同工酶的低亲和力底物(19)。
显微照片(A、 B)描绘了具代表性的经克莱斯汀多抗25U2免疫染色的海蛞蝓眼组织切片。有或没有预先施用苔藓抑素的经历过成对CS/UCS关联条件反
射训练的动物的B细胞感光器CB-Cdl)中发生阳性克莱斯汀染色(B)。随机给 予这两种刺激(训练，TE)未引起行为改变，也没有使克莱斯汀高于正常的背景
水平(A);用脊椎动物多抗对基底膜和晶状体进行人工染色。检测染色强度的
差异，将其记录为灰度强度(0-256; B-细胞胞质减掉组织背景)。图(C)显示了 进行9次随机TE(左栏)的海蛞蝓的测得强度和连续两天接触PKC激动剂苔藓 抑素(0.25 ng/ml)然后进行2次成对TE进行关联条件反射训练的动物的测得强 度。两次接触苔藓抑素加上2次TE增强产生的PKC活化将克莱斯汀的水平显 著提高，达到与9-次成对TE和巩固(长时)记忆相关的水平(t^4-8只动物/条件/ 重复；f检验比较，p<0.01)。
克莱斯汀免疫染色的灵敏度足以分辨感光-前庭轴突区内的突触小结(D)。 箭头代表中间神经元(a)、对侧神经元轴突(b)和推定感光器的轴突末端突触小结 (c)间的枝状区。刻度条=10(^11; CPG，脑侧神经节(图9、 10)。
由于免疫染色抗体与蛋白质的磷酸化和无磷酸化形式都反应，因此，该条 件诱发的克莱斯汀标记物增加反映实际蛋白质数量增加。由于特异性PKC-阻 断剂Ro-32阻止的学习和学习特异性的克莱斯汀在B类细胞中增加(如上所 述)，因此之前发现在所述各个B类细胞内发生易位的PKC看起来引起了条件 诱发的克莱斯汀标记物增加。无训练和/或随机化的对照训练方法产生的克莱斯 汀(CE)免疫染色只相当于训练诱发染色程度一个很小的分数(图9)。
没有苔藓抑素的随机训练(4-TE)得到略高于背景的测得强度。施用苔藓抑 素可以增加这两种训练例的克莱斯汀水平。随机训练情况下，当偶尔发生CS 和US的重叠(配对)时，就如此处所述，CE有可能增加(增加2.0)。然而，成对 训练时，克莱斯汀水平的增加会超过4.3倍(平均数iSE， N=5只动物/处理。 4RTE-随机对照，4次随机光和旋转试验；6PTE-成对试验，6次成对光和旋转 试验。6PTE-0Bry比6PTE-0.25Bry; p〈0.001; 4RTE-0.25Bry比6PTE-0.25Bry; pO.001(f检验)。当采用亚优化训练(4-6TE)时，CE免疫染色(图IOA)有中度升 高。这些亚优选方案不足以产生持续超过24小时的记忆保持。如上所述，6TE 训练期间施用苔藓抑素能引发长期记忆保持(>1周)。而且，苔藓抑素加6TE诱 导的CE免疫染色堪比9TE所得。低剂量(0.1-0.25ng/ml)苔藓抑素显著增强2、 4或6次训练试验后的记忆。 施用苔藓抑素时，6TE的巴甫洛夫条件反射训练能产生持续许多天的记忆，不 用苔藓抑素则仅持续数小时。茴香霉素或PKC抑制剂Ro-32能够阻断上述记 忆增强。重要的是，9次TE之后24小时，CE免疫染色大大衰减，尽管记忆 仍能在此后持续超过1周。然而，最少训练(2TE)之前重复接触苔藓抑素数天 获得了更持久的CE免疫染色。
1、 2和3天每天单独施用苔藓抑素(不同时进行条件反射)4小时，每次接 触苔藓抑素后24小时进行检测，发现海蛞蝓的B感光器中的克莱斯汀水平逐 渐增强。接触苔藓抑素4小时1次后24小时，CE免疫染色没有增强(图IOB)。 两次接触苔藓抑素(连续两天，每天1次)后24小时，CE免疫染色残留增多。 接触苔藓抑素3次，然后只进行2次成对训练(成对的光和环形振荡)，克莱斯 汀水平进一步升高，同时，关联条件反射诱发的行为改变保持天数显著延长 (n=16只动物/条件ANOVA， pO.Ol)。 3次接触后第一天进行2次TE， 24小 时后CE免疫染色的水平接近之前9次TE后立即观察到的水平(图IOB)。因此， 3天每天接触苔藓抑素4小时后进行最少训练(2 TE)后的CE免疫染色为比单独 训练试验所得的更持久。这种新合成克莱斯汀的持久性与表明苔藓抑素诱导蛋 白合成增强的生物化学观察结果相一致。
连续两天每天接触苔藓抑素4小时，24小时后进行2次训练(2TE)才能将 克莱斯汀水平提高到与巩固的长期记忆相关的水平。 一般而言，2-TE配合以2 次接触苔藓抑素能产生超过l周的记忆保持(n-16只动物/条件J检验，p0.01)。 先进行连续3天每天接触苔藓抑素4小时能使克莱斯汀水平达到获得巩固记忆 所需水平。2次训练后立即加入茴香霉素不会减少上述克莱斯汀水平，并且， 巩固记忆可以持续许多天(N-8只动物/条件；Z检验，p>0.05，不显著)。(图IIA、 B)。
值得注意的是苔藓抑素加训练后立即施用PKC抑制剂Ro-32没能阻止长 期记忆的产生，而在训练加苔藓抑素的过程中进行抑制确能阻止记忆的巩固。 相反，有和没有苔藓抑素的训练期间加入茴香霉素未能阻止长期记忆，而有和 没有苔藓抑素的训练后加入茴香霉素则能完全抑制记忆形成。因此，训练期间 PKC活化之后是记忆所需蛋白质的合成。因此， 一旦PKC活化被诱导到足够的水平，就不可避免的会发生必需的蛋白质合成。所以，训练前数天的苔藓抑 素诱导PKC活化，配合以最少训练，足以产生长期记忆。而且，后一种情况 下的长期记忆无需训练(和训练前PKC活化)后的蛋白合成。再次重申，预先的
PKC活化足以导致后来形成长期记忆所需的蛋白质合成。其合成受苔藓抑素诱 导的PKC活化以及条件反射试验所诱导的蛋白质之一是克莱斯汀 一 如免疫 染色标记所证明的那样。另一种是PKC本身。 实施例ll:苔藓抑素对PKC活性的影响
已知苔藓抑素通过增加PKC与细胞膜组分的结合而瞬时活化PKC。已有 许多关联记忆范例被证明增强PKC与神经元膜的结合。因此，我们对使海蛞 蝓重复接触苔藓抑素(g卩，精确按照训练方法接触4小时)也会诱导持久的PKC 活化这一假设进行了检验。
连续数天将完整的海蛞蝓在所述条件下("行为药理学")以4小时间隔接 触苔藓抑素(0.28nM)。然后检测分离的食管外周神经系统中细胞溶胶中的组蛋 白磷酸化(参见"方法")。2次接触苔藓抑素的第二次后10分钟和24小时检 测到的PKC活性显著高于基线水平(每次检测的N-6)(图12、 13)。因此，两中 组分中的PKC数量都明显增加，但胞膜内PKC与细胞溶胶中PKC之比没有 增加。这些结果表明，与学习本身相比，预接触苔藓抑素对PKC产生了某些 不同的作用。最初活化后(通过易位)，苔藓抑素的该作用极有可能是由PKC合 成增加产生的，这与苔藓抑素引起克莱斯汀水平升高一致，但与重复接触苔藓 抑素不直接相关。
但如图12、 13所述，每次接触苔藓抑素(0.25ng/ml)的同时加入茴香霉素 (1.0ng/ml)。注意，连续三天接触苔藓抑素后，茴香霉素显著减少海蛞蝓食管周 围神经系统的细胞溶胶组分和胞膜组分的PKC活性(每次检测的N=3， p〈01)(图14)。
为了进一步检测重复接触苔藓抑素的生物化学效应，对经过逆转录病毒转 导温度敏感型tsA5CSV40大T抗原而永生化的大鼠海马祌经元进行研究(25)。 这些神经元在N2培养液中经碱性成纤维细胞生长因子诱导后分化出神经元表 型(26)，并表达出包括PKC在内的全部常规神经元蛋白质。
使培育的海马神经元接触单剂激活剂量的苔藓抑素(0.28nM)30分钟引起了PKC从细胞溶胶向颗粒部分的迅速易位(约60y。)，此后是持续的下调(图15)。 最初的PKC活化和后来的下调均己在先前描述过，并经测定膜和细胞溶胶中 的PKC活性得以确定。使培育的海马神经元接触苔藓抑素30分钟，然后间隔 30分钟-8小时后再次接触30分钟，使膜结合的PKC更快地恢复(rebound)。因 此，延迟2-4小时后再次接触消除了单次接触苔藓抑素导致的显著下调(图16)。 接触苔藓抑素后最初的4个小时内在胞质组分中未检测到PKC活性的显著变 化。相反，如果使细胞在2小时内两次接触苔藓抑素，第二次接触后的PKC 活性显著降低。然而，如果第二次接触比首次接触晚4小时，则活性提高到基 线之上，显著高于2小时或更短时间后进行第二次接触所诱导的水平(图16)。
这些结果符合以下解释苔藓抑素先活化PKC后PKC又下调(28-30)导致 PKC同工酶(以及上述克莱斯汀)合成增加(通过蛋白质从头合成)。实际上，我 们通过收集神经元前最后半小时内的"S-甲硫氨酸掺入检测发现，单次接触 0.28nM苔藓抑素30分钟能在接触苔藓抑素后24小时内使得总蛋白质合成增 加了20%， 79小时内增加60%(图17)。当同时存在PKC抑制剂Ro-32时，苔 藓抑素所引起的这种持久而复杂的蛋白质合成增加被部分抑制(图17)。
许多观察结果表明，足以引起PKC活化的苔藓抑素不可避免地也会使 PKC逐渐失活，然后下调。实际上，足够剂量的苔藓抑素(超过1.0ng/ml)抑制 巴甫洛夫条件反射。这极有可能是由PKC下调所引起的，而PKC下调正是高 浓度苔藓抑素所致行为结果的特征之一。已经知道，有两条不同途径可以下调 苔藓抑素诱发的PKC活化。 一条途径也受佛波酯诱导，包括泛素化，接着经 由蛋白酶体路径蛋白水解。第二种下调机制不由佛波酯诱导，包括通过胞膜窖 区室(caveolar compartment)移动以及磷酸酶PP1和PP2A介导的降解。PKC活 化剂的浓度足够高和/或持续时间足够久，PKC降解途径使PKC不足从而刺激 PKC的从头合成，PKC的合成不能补偿其失活和下调，由此造成可用PKC减 少95%或更多。
实施例12:苔藓抑素对学习和记忆保持的影响
利用大鼠空间迷宫模型研究苔藓抑素对学习和记忆的影响。在第l、 3、 5 天，进行水迷宫训练前20分钟，腹膜内注射苔藓抑素(NCI， 10ue/ks体重)。 在注射苔藓抑素前10分钟，经尾静脉注射RO-31-8220(西格玛公司(Sigma)，500 ug/kg体重)。结果见图26。星号表示与游泳对照有显著差异(**， p<.01; **， P<.0(m。在试探测试(probetest沖，迷宫+苔藓抑素明显不同于迷宫和迷宫 十苔藓抑素+RO (p〈.05)。
在图26A中，与对照相比，苔藓抑素治疗动物组中大鼠到达平台的潜伏 时间大大縮短(即促进学习)；但在PKC-a抑制剂RO-31-8220存在下未出现这 种縮短。在图B中，在所有训练后24小时的保持第l天，与对照相比苔藓抑 素治疗动物到达目标象限的时间縮短(即增强了记忆保持)；但在RO-31-8220 存在下未出现这种縮短。在图C中，在所有训练后1天的保持第1天，苔藓抑 素治疗动物的目标穿越次数类似地增加(即增强了记忆保持)。
实施例13:苔藓抑素对经过空间迷宫任务训练的大鼠树突棘的影响 图27显示了苔藓抑素对经过水迷宫训练的大鼠树突棘形成的影响。在保 持第2天，采用共聚焦显微术和DiI染色来研究丝状伪足和树突棘蘑菇棘、 细棘和粗棘(图A)。水迷宫训练增加了蘑薛棘的数目；苔藓抑素能增强这一效 果(图B)。单独苔藓抑素沃训练)增加了粗棘的数目(pH)(图C)。在所有情况 下，未观察到丝状伪足或细棘有变化(未显示)。仅用苔藓抑素处理的大鼠以及 仅接受训练的大鼠中丝状伪足和(所有形状)棘的总数有类似的增加(图D)。但 水迷宫训练大鼠的同时用苔藓抑素处理时这种增加得到增强(p〈05)。星号表明 与天然对照有显著差异(*， p<.05; **， p<.001)。
实施例14:苔藓抑素对蘑菇棘的影响 图28为电子显微照片，显示了蘑菇棘(M)和突触后密度(PSD;黄色箭头) 的变化；红色箭头=突触前膜；0=苔藓抑素处理和训练后的树突(图A)。迷宫+ 苔藓抑素(bryo)图显示穿孔PSD(中央有空洞的大PSD)，而其他图是斑点类型 (没有空洞的小PSD)。无论有或没有苔藓抑素，水迷宫均能提高PSD的平均大 小(图B)，这是由于有穿孔PSD的大蘑菇棘的数目增加(图C)。星号表明与天 然对照有显著差异(*， p<，05; **， p<.001)。
实施例15:苔藓抑素对突触前和突触后结构的不同影响 通过定量共聚焦免疫组织化学测定出，水迷宫训练增加了树突棘标记物亲 棘蛋白(图29;图B)、突触后膜标记物神经粒蛋白(图29;图A和D)以及突触 前标记物GAP-43 (图A和E)的数量，但未增加轴突突触小结标记物突触小泡蛋白(图29;图A和B)。这些结果显示，新棘与之前存在的轴突突触小结形成 突触，该轴突突触小结已经与之前存在的棘形成突触。仅接受苔藓抑素的大鼠 也显示突触前标记物的数目增加。无论有或没有苔藓抑素处理，水迷宫训练增 加了突触前和突触后膜的尺寸，证实水迷宫训练能选择性增加具有大PSD的 蘑菇棘。星号表明与天然对照有显著差异(*， p<.05; **， p<.01; ***， p<.001)。
实施例16:通过激活PKC提高棘密度的机制 图30显示了通过激活PKC提高棘密度的机制。快速海马切片用O.l nM 苔藓抑素连续培育，处理后进行共聚焦免疫组织化学检测。苔藓抑素刺激PKCoc 向质膜易位(黄色箭头)并将其激活，并刺激PKC-依赖性ELAV， mRNA-稳定蛋 白，核输出到CA1神经元的细胞体和近端树突的胞质中(白色箭头)。通过测定 棘标记物亲棘蛋白发现，苔藓抑素还增加树突棘数目。
实施例17:通过激活PKC提高棘密度的机制 图31显示了通过激活PKC提高棘密度的机制。在海马切片中，苔藓抑素 选择性激活PKCa，但不激活PKC5和PKCs(图A)。用苔藓抑素培育120分钟 时，ELAV明显转移到树突(图B)，树突棘数目增加(图C)。 PKC阻断剂 RO-31-8220或白屈菜季铵碱能抑制这种作用(图D)。蛋白质合成阻断剂也抑制 棘密度提高(未显示)。总而言之，这说明苔藓抑素刺激了 PKCa-激活的ELAV 蛋白，从而导致抑制mRNA降解和增强对于棘形成很重要的蛋白质的合成。 在试探测试后第2天和水迷宫训练的6天中，树突中的ELAV仍旧升高(图E)， 说明水迷宫通过PKC/ELAV/蛋白质合成级联增加蘑菇棘密度。然而，无论有或 没有苔藓抑素，空间学习后树突中的ELAV都持续增加，说明PKC/ELAV/蛋 白质合成不是蘑菇棘形成的唯一途径。星号表明与天然对照有显著差异(*， p<.05; **， p<.01; ***， p<.001)。
权利要求
1.一种方法，该方法包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激细胞或神经元生长的步骤。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化剂接触蛋白激酶 C(PKC)刺激了树突生长。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化剂接触蛋白激酶 C (PKC)刺激了树突棘形成。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化剂接触蛋白激酶 C(PKC)刺激了树突棘密度。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，使PKC活化剂接触蛋白激酶 C (PKC)刺激了 ELAV易位到近端树突。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是大环内酯。
7. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是苯并内酰胺。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是吡咯烷酮。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是苔藓抑素。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1、 -2、陽3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、 或-18。
11. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1。
12. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是纳瑞他汀。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述纳瑞他汀是纳瑞他汀-1。
14. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述接触活化PKC。
15. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述接触使PKC数量增加。
16. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述接触使PKC合成增加。
17. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PKC是PKCa。
18. 如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述PKC是PKC(x。
19. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述PKC是PKC(x。
20. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接触使克莱斯汀的数量 增加。
21. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接触不导致PKC随后明显下调。
22. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，重复使PKC活化剂接触PKC 的步骤。
23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，以规律间隔重复使PKC活 化剂接触PKC的步骤。
24. 如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述间隔为1周至1个月， 1天至1周，或少于1小时至24小时。
25. 如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述间隔为l周至l个月。
26. 如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述间隔为l天至l周。
27. 如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述间隔为少于1小时至 24小时。
28. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在一固定期间内保持PKC 活化剂与PKC的接触。
29. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于24小时。
30. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于12小时。
31. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于6小时。
32. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于4小时。
33. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于2小时。
34. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期间约为2-6小时。
35. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述固定期间约为4小时。
36. 如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述接触时间约为l-12小时。
37. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，在多于1天的期间内重复 所述接触。
38. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，在1天至1个月的期间内 重复所述接触。
39. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，在1天至1周的期间内重 复所述接触。
40. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，在1周至1个月的期间内 重复所述接触。
41. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，在l-6个月的期间内重复所 述接触。
42. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，在1个月的期间内重复所 述接触
43. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，在多于1个月的期间内重 复所述接触。
44. 一种方法，包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以刺激蛋白质的 合成从而巩固长期记忆的步骤。
45. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是大环内酯。
46. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是苯并内酰胺。
47. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是吡咯垸酮。
48. 如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是苔藓抑素。
49. 如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1、 -2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、 或-18。
50. 如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1 。
51. 如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是纳瑞他汀。
52. 如权利要求51所述的组合物，其特征在于，所述纳瑞他汀是纳瑞他汀-1。
53. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述接触活化PKC。
54. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述接触使PKC数量增加。
55. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述接触使PKC合成增加。
56. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述接触使克莱斯汀的数 量增加。
57. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述接触不导致PKC随后 明显下调。
58. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，重复使PKC活化剂接触PKC 的步骤。
59. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，以规律间隔重复使PKC活 化剂接触PKC的步骤。
60. 如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述间隔为l周至l个月， 1天至1周，或少于1小时至24小时。
61. 如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述间隔为1周至1个月。
62. 如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述间隔为1天至1周。
63. 如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述间隔为少于1小时至 24小时。
64. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，在一固定期间内保持PKC 活化剂与PKC的接触。
65. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于24小时。
66. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于12小时。
67. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于6小时。
68. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于4小时。
69. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期间为少于2小时。
70. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期间约为2-6小时。
71. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述固定期间约为4小时。
72. 如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述接触时间约为l-12小时。
73. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，在多于1天的期间内重复所述接触。
74. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，在1天至1个月的期间内重复所述接触。
75. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，在1天至1周的期间内重复所述接触。
76. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，在1周至1个月的期间内重复所述接触。
77. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，在l-6个月的期间内重复所述接触。
78. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，在l个月的期间内重复所述接触。
79. 如权利要求58所述的方法，其特征在于，在多于1个月的期间内重复所述接触。
80. —种方法，包括使PKC活化剂接触蛋白激酶C(PKC)以下调PKC的步骤。
81. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是大环内酯。
82. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是苯并内酰胺。
83. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述PKC活化剂是吡咯烷酮。
84. 如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是苔藓抑素。
85. 如权利要求84所述的方法，其特征在于，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1、-2、 -3、 -4、 -5、 -6、 -7、 -8、 -9、 -10、 -11、 -12、 -13、 -14、 -15、 -16、 -17、或-18。
86. 如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述苔藓抑素是苔藓抑素-1。
87. 如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述大环内酯是纳瑞他汀。
88. 如权利要求81所述的组合物，其特征在于，所述纳瑞他汀是纳瑞他汀-1。
89. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述接触下调PKC。
90.如权利要求89所述的方法，其特征在于，所述接触显著下调PKC。
91. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述接触不刺激PKC合成。
92. 如权利要求91所述的方法，其特征在于，所述接触基本上不刺激PKC合成。
93. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述接触使PKC数量减少。
94. 如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述接触使PKC数量显著减少。
95. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述接触不刺激克莱斯汀的合成。
96. 如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述接触不刺激克莱斯汀(calexitin)的合成。
97. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，在一持续期间使PKC活化剂接触PKC。
98. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述持续期间为少于1小时至24小时。
99. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述持续期间为1天至1周。
100. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述持续期间为l周至l个月。
101. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述持续期间为少于l小时至12小时。
102. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述持续期间为少于l小时至8小时。
103. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述持续期间为少于l小时至4小时。
104. 如权利要求97所述的方法，其特征在于，所述持续期间约为4小时。
105. 如权利要求80所述的方法，其特征在于，所述接触导致PKC持续下调。
106. 如权利要求44所述的方法，还包括抑制蛋白激酶C(PKC)降解的步骤。
107. 如权利要求106所述的方法，其特征在于，所述降解通过泛素化作用进行。
108. 如权利要求107所述的方法，其特征在于，所述降解受乳胱素的抑制。
109. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述PKC来自人。
110. 如权利要求44所述的方法，其特征在于，以含有PKC活化剂和药学上可接受的载体的药物组合物形式提供所述PKC活化剂。
111. 如权利要求110所述的方法，其特征在于，所述药物组合物还含有PKC抑制剂。
112. 如权利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制剂能在外周组织中抑制PKC。
113. 如权利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制剂选择性地抑制外周组织中的PKC。
114. 如权利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制剂是一种能够缓解给予个体PKC活化剂相关肌痛的化合物。
115. 如权利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制剂是一种能够提高PKC活化剂耐受剂量的化合物。
116. 如权利要求lll所述的方法，其特征在于，所述PKC抑制剂为维生素E、维生素E类似物、维生素E盐、钙感光蛋白C、噻唑烷二酮、罗伯斯妥林或其组合。
117. —种减缓或逆转记忆力和学习力丧失的方法，包括使有效量PKC活化剂接触已鉴定为记忆力丧失的对象的蛋白激酶C(PKC)以减缓或逆转记忆力丧失的步骤。
118. 如权利要求U7所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了细胞或神经元生长。
119. 如权利要求117所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突生长。
120. 如权利要求117所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突棘形成。
121. 如权利要求117所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突棘密度。
122. —种刺激细胞或神经元生长的方法，包括使有效量PKC活化剂接触对象的蛋白激酶C(PKC)，从而剌激细胞或神经元生长的步骤。
123. 如权利要求122所述的方法，其特征在于，所述对象被鉴定为学习力或记忆力受损。
124. 如权利要求122所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突生长。
125. 如权利要求122所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突棘形成。
126. 如权利要求122所述的方法，其特征在于，使有效量PKC活化剂接触PKC刺激了树突棘密度。
全文摘要
本发明提供了减缓或逆转记忆力和学习力丧失的方法，包括使有效量PKC活化剂接触已鉴定为记忆力丧失的对象的蛋白激酶C(PKC)以减缓或逆转记忆力丧失的步骤。本发明提供了刺激细胞生长、神经元生长、树突生长、树突棘形成、树突棘密度，以及将ELAV易位到近端树突，和重塑突触的方法。本发明还提供了使蛋白激酶C(PKC)活化剂接触PKC以刺激蛋白质的合成从而巩固长期记忆的方法。本发明还提供了使蛋白激酶C(PKC)活化剂接触PKC来下调PKC的方法。
文档编号A61K31/365GK101541322SQ200780028657
公开日2009年9月23日 申请日期2007年1月29日 优先权日2006年7月28日
发明者D·L·阿尔康, J·洪帕桑 申请人:布朗歇特洛克菲勒神经科学研究所