一种治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药的制作方法

专利名称：：一种治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药的制作方法
技术领域：
：本发明是属于中药制剂。
背景技术：
：动脉粥样硬化性疾病是人类致残、致死的重要疾病之首，动脉粥样硬化主要累及主动脉、冠状动脉、脑动脉和肾动脉，引起所供应的器官血供障碍，导致这些器官发生缺血性病理变化。可引起心绞痛、心肌梗塞、脑血管意外、脑萎縮、下肢坏死等疾病。动脉内皮的"损伤"和"血脂异常"的毒性环境，是促使动脉粥样硬化的主要原因之一。目前临床上动脉粥样硬化的措施主要包括1.运动运动可改善内皮依赖性的血管扩张功能，增加一氧化氮合酶的基因表达。运动疗法有一定的作用，但疗效有待进一步考证。2.替代疗法补充L-精氨酸、前列环素类似物等保护血管内皮物质。3.内皮源性收缩剂的抑制剂或拮抗剂如血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素n受体拮抗剂、内皮素拮抗剂、血栓素A2合酶抑制剂以及血栓素受体拮抗剂等，可减少血管紧张素、内皮素、血栓素A2等物质的产生，对防治动脉粥样硬化有一定的作用。这些制剂长期服用有诸多副作用如咳嗽、出血等。4.调脂治疗高胆固醇血症是诱发动脉粥样硬化的重要因素，参与促进血管内膜粥样斑块的形成。临床试验证实他汀类药物可以上调内皮型一氧化氮合酶的表达，改善内皮功能，稳定动脉粥样斑块，减少血管病变。但是他汀类药物的不良反应也越来越受到重视(l)肌病，这是一种较严重的不良反应的横纹肌溶解，可使肌肉组织破坏，释放出大量的肌红蛋白，血肌酸，磷酸激酶(CPK)含量明显升高(高于正常值的10倍)，肌红蛋白经肾脏排出体外，严重情况可导致肾衰竭甚至死亡。(2)对内分泌的影响。胆固醇合成的抑制可减少体内类固醇激素的分泌，有报道辛伐他汀可致勃起功能障碍。(3)胃肠道反应比较常见，症状通常为恶心、腹痛、腹泻、胃肠胀气。(4)肝损害，长期用药后，转氨酶可为正常值的3倍。另外，在他汀类药物的使用中，值得注意的是药物的相互作用，其不良反应在与其他药物合用时显著增加，后果也比较严重。5.内皮种植及基因治疗目前研究将自体血管内皮培养后经导管"种植"在剥脱内皮的血管上，有望改善该血管内皮功能，进而起到防治动脉粥样硬化的作用。但该项技术尚处于实验室阶段，未在临床广泛推广。以上诸多原因严重阻碍了许多防治动脉粥样硬化的方法和药物在临床中的应用。而其他调节血脂或改善动脉粥样硬化的治法或疗效甚微，或价格昂贵或尚在实验研究中。因此，利用天然药物毒副作用相对较小的特点，从中寻找新改善血管内皮的药物正成为世界医药学的研究热点，也是促进中医药科技发展的重要内容之一。研制毒副作用小，疗效显著、具有调节血脂，防治动脉粥样硬化多靶点综合治疗效应的中药复方制剂，不仅具有广泛的市场需求，也必将带来巨大的社会效益和经济效益。
发明内容本发明就是针对上述问题，提供一种以本虛标实立论，以健脾益气以治本，减少浊脂的生成，改善代谢；同时祛痰化瘀以治标，以阻抑动脉粥样硬化的发生发展的治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，本发明按下述重量配制绞股兰15-25g、茯苓IO-15g、半夏5-15g、丹参15-25g、川芎15-25g、石菖蒲10-15g、郁金10-20g、山楂10-25g、黄芪15-25g。本发明的有益效果经过实验证明，应用于脂代谢紊乱所致动脉粥样硬化性疾病，具有调节血脂、改善胰岛素抵抗、保护血管内皮功能以及防治动脉硬化的作用。具体实施例方式实施例1:本发明按下述重量配制绞股兰20g、茯苓10g、半夏10g、丹参15g、川芎20g、石菖蒲10g、郁金15g、山楂15g、黄芪25g。实施例2:本发明按下述重量配制绞股兰25g、茯苓15g、半夏10g、丹参20g、川芎15g、石菖蒲10g、郁金10g、山楂20g、黄芪20g。实施例3:本发明按下述重量配制绞股兰15g、茯苳10g、半夏5g、丹参25g、川芎25g、石菖蒲10g、郁金20g、山楂25g、黄芪15g。本成果在前期大量临床研究及一系列基础实验研究的基础上，从病理形态学、生化、分子和细胞生物学水平上充分证明本发明具有明显调节血脂和改善动脉粥样硬化的作用。实验一祛痰化瘀方的调脂作用l.材料与方法1.1动物选用Wister大鼠，体重400-450g，由沈医实验动物中心提供，批号N0:0909120，50只51.2分组及造模方法大鼠按体重、性别随机分成五组。正常组第一组造模组第二组模型空白组第三组二甲双胍组第四组脂必妥组第五组祛痰化瘀方组按Reaven的方法略加改动，复制IR大鼠模型。正常组喂养普通饲料，其中糖、脂肪和蛋白质占总热卡量的50%、20%和30%，造模组喂养高脂饲料，其中脂肪提供的热卡量高达59%，碳水化合物仅提供2096左右的热量，脂肪的主要成份为熟猪油，主要为饱和脂肪酸。二组总热卡量相同。1.3药物及给药方法盐酸二甲双胍东北第六制药厂生产。[卫药准字(1996)第000897号]脂必妥成都地奥九泓制药厂生产。[川卫药准字(1996)年012750号]祛痰化瘀方由黄芪、茯苓等组成，水煎浓縮，按成人剂量7倍量浓縮至2ml，曰一次灌胃。二甲双胍、脂必妥均按成人剂量的7倍量，制成2ml混悬液，日一次灌胃。共四周；祛痰化瘀方经水煎，按成人剂量7倍量浓縮至2ml，日一次灌胃，共四周。正常组及模空组给予生理盐水2ml，日一次灌胃，共四周。2.试剂与方法2.1血清甘油三脂、胆固醇采有酶比色法，试剂盒美国贝克曼公司。血清高密度脂蛋白用一步法，试剂盒日本第一化学公司；美国贝克曼CX5型生化分析仪。2.2实验前取血，用乙醚麻醉，眼眶静脉取血。实验后用20%乌拉坦麻醉(5ml/kg.ip)颈动脉取血后处死大鼠。3.统计学处计量资料用t检验，数据处理用华西医科大学卫生统计学教研室pems统计软件包。4.结果4.1造模后体重变化造模组大鼠造模后体重增加由32.74-34.08g，较正常组(其造模后体重增加11.89g)增加明显，说明高脂饲料可致大鼠体重明显增加，是引起肥胖的主要原因之一。4.2用药后各组血脂的变化模空组TG显著高于正常组，P〈0.01，模空组HDL低与正常组，P〈0.05。模空组TC与正常组比较，P〉0.05。祛痰化瘀方组TG低于模空组，P〈0.05。脂必妥亦对IR大鼠的TG有降低作用，但P〉0.05。祛痰化瘀方、二双胍、脂必妥、科素亚四组TC与模空组比较，P>0.05。祛痰化瘀方、二甲双胍、脂必妥、科素亚四组HDL与模空组比较，均P〉0.05。实验二祛痰化瘀方对高脂损伤引起的胰岛素抵抗的调节作用1.动物选用Wister大鼠，体重400-450g，由沈医实验动物中心提供，批号NO:0909120,50只。2.分组及造模方法大鼠按体重、性别随机分成五组。正常组第一组造模组第二组模型空白组第三组二甲双胍组第四组脂必妥组第五组祛痰化瘀方3.药物及给药方法盐酸二甲双胍东北第六制药厂生产。[卫药准字(1996)第000897号]脂必妥成都地奥九泓制药厂生产。[川卫药准字(1996)年012750号]祛痰化瘀方由黄芪、茯苓等组成，水煎浓縮，按成人剂量7倍量浓縮至2ml，日一次灌胃。二甲双胍、脂必妥均按成人剂量的7倍量，制成2ml混悬液，曰一次灌胃。共四周；祛痰化瘀方经水煎，按成人剂量7倍量浓縮至2ml，曰一次灌胃，共四周。正常组及模空组给予生理盐水2ml，日一次灌胃，共四周。4.统计学处理计量资料用t检验，数据处理用华西医科大学卫生统计学教研室pems统计软件包。5.结果用药前后各组IRI、ISI变化祛痰化瘀方组治疗前后IRI有显著性差异，P〈0.05，二甲双呱IRI治疗前后比较P〈0.05，脂必妥组IRI变化不明显，P>0.05。祛痰化瘀方与二甲双胍组比较，P〉0.05。用药前后各组ISI变化比较表治疗前后ISI差异显著，P<0.05，科素亚、二甲双胍二组治疗前后ISI变化显著，P〈0.05。祛痰化瘀方与二甲双胍组比较P>0.05。脂必妥组ISI变化不明显，P>0.05。6.结论祛痰化瘀方组治疗后血TG降低显著，P<0.05，IRI较治疗前显著降低，P〈0.05，ISI较治疗后升高显著，P〈0.05，提示祛痰化瘀方可明显改善大鼠的胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗现象，推断其机理与其具有降血脂作用有关。科素亚、二甲双胍组治疗前后IRI、ISI变化显著，P<0.05，亦有改善IR作用。实验三本发明对血管内皮损伤标记物vWF的影响及内皮形态的影响1实验材料1.1实验细胞人脐静脉内皮细胞细胞系(HUVECs)购自中国典型物保存中心(ECV——304)。1.2药物及试剂高脂血清、含药血清；小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司产品；DMEM-1640干粉美国GibcoBrl公司产品；MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝)及胰蛋白酶华美生物工程公司产品；二甲基亚砜等为国产分析纯，1.3主要仪器设备C02孵箱FisherScientific;1X50型倒置相差显微镜OLYMPUS;超净工作台南通仪器厂；XB-K-25细胞计数板；酶标仪LabsystemsMultiskanAscent;722s分光光度计上海校光仪器厂；MILLI-Q超纯水机美国MILLIRORE。2.实验方法2.1细胞培养2.l.l细胞复苏将冻存于液氮中的安瓶取出，迅速放入37-C水浴中使其在l分钟内融化，无菌条件下打开安瓶，将细胞悬液吸取到100ml培养瓶中，补足培养液10ml(109&小牛血清+90WDMEM)，置C02孵箱(5%C02，37°C)中培养，待细胞贴壁(约48小时后)，换培养液一次，至细胞长成单层并铺满瓶底时即可传代。2.1.2细胞传代吸去培养液，加lml0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖整个瓶底。室温(25'C以上)消化3-5分钟，镜下见细胞质回縮，细胞间隙增大时，加2ml含血清培养液，终止消化。弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，制成单个细胞悬液，计数细胞数量后分装入新的培养瓶中，补足培养液进行培养，如此反复循环，留取实验细胞。待细胞传至足够实验应用时，将所得细胞制成细胞悬液，调整细胞数为5X106,用于实验。2.1.3含药血清细胞毒性试验(MTT):用0.25%胰蛋白酶消化单层培养的细胞，用含10%小牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为IX105/ml，接种于96孔培养板中，每孔200yl细胞悬液。将培养板移入C02孵箱中，在37'C5%0)2及饱和湿度条件下，培养24小时后，弃培养液，分别加入DMEM1640培养液及加入各种药物血清培养液，详细分组见表1。(每组6孔)。表1MTT实验分组及血清比例<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以无含药的大鼠血清为对照组，继续培养24小时、48小时后，加入0.5%的MTT(5mg/ml)，每孔20y1，37。C继续孵育4小时。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150y1DMS0，37。C振荡10分钟，应用酶标仪检测490nm处OD值。24小时及48小时药物血清对细胞存活的影响可以用细胞存活率计算。细胞存活率=用药孔测定的平均0D值/对照孔测定的平均0D值X10(m2.2EC损伤模型制作及分组2.2.1生化指标生长良好的内皮细胞，制成单个细胞悬液，调整细胞数为5X106接种于96孔板(Costar公司)，补足培养液至20(H4，待细胞贴壁融合生长，倾去培养液，按不同比例加入高脂血清及含药血清。37°C5%C02孵箱中培养24小时及48小时。每组6孔。24小时空白组ECV+正常鼠血清20%——24H对照组ECV+高脂血清10%+正常大鼠血清10%——24H造模组ECV+高脂血清2096——24H中药组(高)ECV+高脂血清10%+中药血清(高)10%——24H中药组(常)ECV+高脂血清10%+中药血清(常)10%——24H西药组ECV+高脂血清10%+西药血清10%——24H48小时空白组ECV+正常鼠血清20%--24H去上清+正常鼠血清20%——24H对照组ECV+高脂血清2(m——24H去上清+正常鼠血清2096——24H造模组ECV+高脂血清2(m——24H去上清+高脂血清2(m——24H中药组(高)ECV+高脂血清20%——24H去上清+中药血清(高)20%——24H中药组(常)ECV+高脂血清20%——24H去上清+中药血清(常)20%——24H西药组ECV+高脂血清2(m——24H去上清+西药血清2096——24H其余培养液加无血清DMEM2.2.2形态指标细胞培养将细胞悬液加入100ml培养瓶中，补足培养液至10ml，余方法同前。高脂血清及含药血清的施加比例各种大鼠血清与培养液(无血清DMEM)之比为20:80与造模组比较P〈0.05;#与对照组比较p〈0.05;造模组24小时与48小时比较p〈0.05。透射电镜形态正常内皮细胞形态细胞膜清楚，细胞之内有较多线粒体，嵴清晰可见；粗面内质网清楚可见，其上附有核糖体；胞质内也可见到较多游离核糖体；核膜清楚。24小时(1)对造组细胞膜上绒毛减少，可见初级溶酶体及次级溶酶体，线粒体有空泡化。(2)造模组细胞膜上绒毛减少，细胞质内线粒体嵴断裂较严重(但能见到)；可见到次级溶酶体；内质网扩张。(3)中药组(常)细胞核有不明显切迹，粗面内质网轻度扩张，其上附有核糖体；线粒体嵴明显，偶见肿胀线粒体。(4)中药组(高)细胞膜上有较多绒毛，线粒体正常，线粒体嵴清楚；内质网无肿大，附着较多核糖体；细胞核有切迹。(5)西药组细胞膜上绒毛减少，内质网有轻度扩张，偶见空泡样线粒体，线粒体嵴可见；细胞形态有变异。48小时(l)对造组细胞膜上绒毛变短，线粒体空泡化较明显，内质网扩张，可见初级溶酶体。(2)造模组细胞膜上绒毛断裂消失，细胞质内线粒体完全空泡化；内质网扩张；细胞核扭曲有切迹。(3)中药组(常)细胞形态正常，细胞核有切迹，细胞膜上绒毛减少，内质网有轻度扩张；线粒体偶见空泡样，线粒体嵴可以见到。(4)中药组(高)细胞核光滑，线粒体嵴清楚可见；粗面内质网上附有核糖体；细胞之内可见游离核糖体；细胞膜上绒毛减少。(5)西药组细胞膜上绒毛减少，偶见线粒体空泡，初级溶酶体少见，内质网扩张，细胞核扭曲切迹明显。3.结论本发明对高脂血清损伤ECvWF的影响3.1vWF与EC损伤vWF由血管内皮细胞及巨核细胞合成和分泌，是一种存在于血浆、内皮细胞表面和血小板a颗粒的糖蛋白。vW具有两种主要的生物学功能，一种是在血管损伤处介导血小板的粘附、聚集和血栓形成；另一种是与週因子前体结合成vni因子/vWF复合物，使vm因子活性变得稳定。血管内皮细胞含有一定量的vWF，但当内皮细胞损伤、变性、脱落等时，内皮细胞产生vWF增多。在各种血管性疾病中得到广泛证实，vWF水平的增加是血管内皮细胞损伤的标志物之一。3.2本发明对vWF的影响本实验24小时的结果表明，以高脂血清(10%)与三种药物血清(10%)共同培养ECV，24小时后与所设对照组(10%高脂血清+10%大鼠血清)比较，其培养液中vWF量明显低于对照组，(p〈0.05)，具有统计学意义；本发明药物血清组优于西药组(P〈0.05)，具有统计学意义；而且高剂量组的效果优于常剂量组(P〈0.05)，具有统计学意义。表明本发明药物血清对于防止高脂血清所致ECV损伤、变性，导致其培养液中vWF增多，其效果优于阿托伐他汀，而且本发明高剂量组优于常剂量组。48时的结果表明，以高脂血清(20%)损伤ECV后，再施以药物血清(20%)或大鼠血清(对照组)，其培养液vWF检测显示中药高剂、常剂组及西药组明显低于对照组(p〈0.05)，具有统计学意义；本发明药物血清组优于西药组(p〈0.05)，具有统计学意义；而且高剂量组的效果优于常剂量组(P〈0.05)，具有统计学意义。表明对于高脂血清所致ECV损伤，本发明药物血清可降低其培养液中vWF含量，其效果优于阿托伐他汀，而且本发明高剂量组优于常剂量组。实验四本发明对高脂血清损伤的血管内皮细胞纤溶系统的影响1实验材料1.1实验细胞同上1.2药物及试剂高脂血清、含药血清如前方法自作；小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司产品；DMEM-1640干粉美国GibcoBrl公司产品；MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝)及胰蛋白酶华美生物工程公司产品；二甲基亚砜等为国产分析纯。人血桨GMP-140酶标试剂盒、t-PA、PAI活性测定试剂盒上海太阳生物技术公司；1.3主要仪器设备C02孵箱FisherScientific;1X50型倒置相差显微镜OLYMPUS;超净工作台南通仪器厂；XB-K-25细胞计数板；酶标仪LabsystemsMultiskanAscent;722s分光光度计上海校光仪器厂；MILLI-Q超纯水机美国MILLIRORE。2实验方法同上3.指标检测3.1标本留取PAI-1、t-PA均取96孔板培养液上清3.2检测方法t-PA、PAI-1活性测定发色底物法。4.统计方法计量资料以平均数士标准差(x土s)表示，组间比较经方差齐性检验后，作方差分析的q检验，以P〈0.05为有统计学意义，以SPSS11.0处理数据。5.结果t-PA、PAI-1活性测定结果见下表分组t-PAPAI24小时48小时24小时48小时空白组0.426±0.012*#0.389±0.007*#0.273±0.284*#0.880±0.306*#对照组0.295±0.090*0.166±0.007*6.060±0.283*6.053±0.263*造模组0.197±0.010#△0.092±0.011#7.713±0.133#△8.470±0.338#中药组(常)0.356±0.005*#0.284±0.008*#3.013±0.159*#3.700±0.133*#中药组(高)0.372±0.004*#0.320±0.004*#2.310±0.180*#2.870±0.126*#西药组0.318±0.004*#0.210±0.008*#3.480士0.144*#4.090±0.193*#注求与造模组比较p〈0.05;tf与对照组比较p〈0.05;造模组24小时与48小时比较P〈0.05。6.结论本发明对高脂血清损伤ECt-PA、PAI-1的影响本发明对t-PA、PAI-l的影响造模组t-PA下降、PAI-l升高已如前所述。以高脂血清(10%)与三种药物血清(10%)共同培养ECV，同时设对照组(10%高脂血清+10%大鼠血清)，24小时的结果表明，与对照组比较，含药血清三组的t-PA活性升高、PAI-1活性下降(p〈0.05)，均具有统计学意义；本发明药物血清组优于西药组(P〈0.05)，具有统计学意义；而且高剂量组的效果优于常剂量组(P〈0.05)，具有统计学意义。表明在本发明药物血清对于防止高脂血清所致ECVt-PA活性下降、PAI-1活性升高，进而改善损伤ECV所致的纤溶功能异常，于阿托伐他汀也具有此作用。48小时的结果表明，以高脂血清(20%)损伤ECV后，再施以药物血清(20%)或大鼠血清(对照组)，中药高剂、常剂组及西药组PAI-l活性明显低于对照组(p〈0.05)，具有统计学意义；对照组t-PA活性明显低于本发明组及西药组(p〈0.05)，具有统计学意义；表明本发明组及西药组均可以降低高脂血清损伤所致的ECVt-PA活性下降、PAI-l活性升高，调解t-PA/PAI-l的失调，其中本发明效果优于阿托伐他汀，而且高剂量组的效果优于常剂量组(P〈0.05)，具有统计学意义。表明对于高脂血清所致ECV损伤，本发明药物血清可以通过调节t-PA/PAI-1的失调，进而提高纤溶功能，改善高脂血清所致ECV损伤。其效果优于阿托伐他汀，而且本发明高剂量组优于常剂量组。实验五本发明对ECVP-Selectin的影响1.1材料1.1.l动物与细胞同上1.1.2药物与试剂阿托伐他丁(立普妥)，10mg/片，美国辉瑞公司生产。本发明颗粒剂。由辽宁中医学院附属医院制剂室制备，山羊抗人P—selectin单抗、FITC标记兔抗山羊IgG，北京中山生物技术有限公司。PCR扩增引物根据文献[4]资料设计引物，引物序列上游5，-CAATCACTTTTAGCCMATACC-3，；下游5，-TTATMTTCAGCMCCTGAACTG-3，。以P-肌动蛋白(P—actin)做内参e—actin上游5，—AAGGATTCCTATGTGGGC_3，；下游5，-CATCTCTTGCTCGMGTC-3，，由宝生物大连有限公司合成，20。C保存，使用前按说明稀释。Trizol:GiBCo。氯仿沈阳生威试剂厂。异丙醇、无水乙醇沈阳试剂一厂。RT-PCR试剂盒宝生物大连有限公司，批号108151.1.3主要仪器设备C02孵箱、PCR仪德国Whatman.Biometra;BI0FUGE28S低温高速离心机德国HZRAZUS;DY89-I型电动玻璃匀桨机宁波新芝科器研究所；JY92-II超声细胞粉碎机宁波新芝科器研究所；UV-300型紫外分光光度计英国；MILLI-Q超纯水机美国MILLIRORE;DYY-III5型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂；超净工作台南通仪器厂；MDF382E超低温冰箱日本SANY;SBH循环水式真空泵郑州长城。H.HWZI.600型电热恒温水浴箱河北省黄骅航天仪器厂；ChemiImager5500凝胶图像采集系统AlphaIrmotech。1.1.4指标检测采用双抗体夹心固相酶免疫试验方法PT-PCR方法检测ECPsmRNAWestern-Bloting检测内皮细胞P-Selectin蛋白表达1.2实验方法1.2.1细胞培养生长良好的内皮细胞，用0.259&胰蛋白酶消化，以5X106个细胞/孔接种于96孔板的细胞培养板，待细胞融合生长，加培养液及施加因素，37。C5%C02孵育，作用时间分别为24小时、48小时，分别检测培养液上清中P-Selectin。1.2.2实验分组及各种血清的比例同vWF。1.2.3标本留取取96孔本培养液上清。1.3检测方法及步骤1.3.1方法采用双抗体夹心固相酶免疫试验方法。1.3.2PT-PCR方法检测ECPsmRNA①细胞总RNA的提取取培养好的细胞，细胞浓度约5X106，用铲子刮落细胞，离心、清洗。向离心管中加入1mlTrizol，震荡，加0.2ml氯仿，震荡15秒，4°C/2000rpm离心15分钟，取上清0.5ml，加入异丙醇0.5ml，震荡，-20匸防置15分钟，4。C条件下2000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀加入75%乙醇lml，12000rpm离心15分钟，弃上清，室温干燥20分钟。加入10y1DEPC处理的三蒸水中。②提取RNA纯度检测取lul，加DEPC处理三蒸水791x1，紫外分光光度计分别检测260nm、280nm处OD值，以计算RNA纯度及浓度(RNA纯度=0D260/0D280)。所测纯度均在1.76-1.97。③由细胞提取的总RNA反转录为cDNA:按以下条件组成反转录反应液(共20IX1):MgC124ul10XRNAPCRBuffer2y1隐seFreedH208.5y1d野Mixture(各10mM)2u1RNaseInhibitor0.5ylAMVReverseTranscriptase氺l1n1Random9mers1y1实验样品RNAlul按以下条件进行反转录反应30'C—10分钟，45'C—30分钟，99'C—分钟，5°C—5分钟。④PCR反应PCR扩增P-Selectin片断(210bp)，以e-actin(532bp)做内参。按以下组成配制PCR反应液(共80ul):MgC126u110XRNAPCRBuffer灭菌蒸馏水TaKaRaTaq上游特异性PCR引物下游特异性PCR引物8u163.5ii10.5u1ly1lul反应条件94。C预变性2分钟开始循环，941C30秒一52。C30秒一72。Cl分钟，共30Cycles。最后72r:充分延伸10分钟。每对引物各做一次PCR反应。⑤电泳及成像反应产物放在一起走2%琼脂糖电泳(150v30min)，溴已锭浸泡10分钟，凝胶仪成像并分析。以上反应重复三次，取得一致性结果。1.3.3Western-Bloting检测内皮细胞P-Selectin蛋白表达①裂解膜蛋白留取好的细胞放于1.5mlEP管中，加40(H4蛋白裂解液。0匸冰水中超声破碎20秒，间隔20秒，反复5次。4t:静置过夜。于4°C/12000rpm离心1小时，取上清放于1.5mlEP管中。②定蛋白浓度(酚试剂法)取样品50W、标准蛋白(用PBS配制的lmg/ml的BSA)及空白水各50W。以上三组均加入碱性铜液2.5ml，放置20分钟，加入0.25ml酚试剂30分钟。分光光度计上以空白孔调零，测定650nm波长处光密度值。所测蛋白浓度=测定管OD置/标准蛋白OD值X1(mg/ml)。③聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):灌胶时先灌分离胶,20分钟左右待分离胶凝固后，再灌浓縮胶，加梳子，聚合后拔出梳子。向加样孔中加各组样品50Pg。湿式电泳槽加电泳液，120V，l小时。④转印(1)剪6块3腿滤纸和一块硝酸纤维素膜，其大小应与胶的大小相同。将剪好的3腿滤纸及硝酸纤维素膜在转移缓冲液中浸泡3-5分钟。(2)逐层安装转移装置将朔料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在朔料支架上放一块海绵。将3块3顧滤纸对齐放在海绵上，依次防置纤维素膜、凝胶、另外3块3薩滤纸及海棉。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡。最后用朔料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内(纤维素膜一侧靠正极，胶一侧靠负极)。(3)接通电源，电压50V，电流100mA，转移2小时。(4)转移结束后，去除朔料支架，依次去掉各层，然后将纤维素膜用TBS(TrisBufferNacl)洗涤5秒钟。⑤封闭将硝酸纤维素膜放在一平皿中，加封闭液(其量已浸过膜即可)。室温下轻轻振荡1-2小时，取出膜用TBS洗涤5分钟X2次。⑥靶蛋白与第一抗体反应及第二抗体反应P-Selectin用含1%BSA的T-Tween-20(TTBS)以1:300稀释，4'C孵育过夜.TTBS洗涤5分钟X2次。HRP标记兔抗山羊IgG，以1:2000稀释，室温孵育2小时，取出后TTBS洗涤5分钟X2，再以TBS洗涤5分钟。⑦显色与分析将膜放于发光试剂l分钟，暗盒中曝光l分钟，显影5分钟，定影5分钟。凝胶图像采集系统分析结果。1.4统计学处理所有数据以X士s表示，组间比较采用方差分析，应用SPsSlO.O软件处理。1.5结果本发明对EC可溶性P-Selectin的影响见下表分组例数24小时空白组63.999±0.156*#5.014±0.145*#对照组6造模组658.459±0.560△##中药组(常)626.192±0.967*#621.670±0.249*#35.062±0.224*#41.839±0.300*58.459±0.560△48小时5.014±0.1451.039±0.424*64.052±0.8566中药组(高)西药组#注求与造模组比较P〈0.05;#与对照组比较p〈0.05;小时比较p〈0.05。本发明对EC表面P-Selectin的影响(FCM)见下表分组例数荧光强度6小时空白组633.09±4.44*#对照组6100.99±10.19*33.370±0.420*#27.375±0.237*#39.794±2.034*A造模组24小时与4812小时30.55±5.03*#74.62±6.01*造模组6109.71±6.73△#87.44±4.37#中药组(高)656.64±5.57*#45.19±3.92*#中药组(常)666.44±5.24*#61.88±2.99*#西药组689.17±5.58*#81.93±3.81*#注*与造模组比较P〈0.05;#与对照组比较p〈0.05;造模组6小时与12小时比较p〈0.05。1.6.结论①本发明对可溶性Ps的影响巨核细胞和EC内Ps分子的mRNA存在着不同的剪接形式，其中一种缺少胞浆区mRNA编码的蛋白质被分泌到血液中，是血浆中可溶性Ps(solubleP-selectinsPs)的主要来源，同时EC表面表达的Ps也可以脱落进入血液，成为sPs。在结构上，sPs—般缺少其对应膜结合粘附分子的穿膜和胞浆部分，其分子量也比相应膜结合Ps为小，sPs通常具有Ps的结合活性，因此可能作为机体调节细胞粘附作用的一个途径发挥作用。本实验应用ELISA方法检测ECV培养上清液的Ps，相当于体内的sPs变化。实验结果表明，高脂血清培养的ECV其造模组Ps明显高于对照组及治疗组(p〈0.05)，具有统计学意义，表明高脂血清可致ECVsPs增加；24小时培养结果表明，本发明药物血清组sPs明显低于造模组、对照组及西药组，且高剂量组优于常剂量组，表明本发明药物血清具有阻抑高脂血清所致Ps表达，且呈剂量依赖性。阿托伐他汀组Ps明显低于造模组、对照组，表明阿托伐他汀药物血清也具有阻抑高脂血清所致sPs表达。48小时培养结果表明，造模组Ps明显高于24小时组(p〈0.05)，具有统计学意义，表明高脂血清作用时间的延长对Ps表达有影响。本发明药物血清组sPs明显低于造模组、对照组及西药组(p〈0.05)，均具有统计学意义，且高剂量组优于常剂量组，表明本发明药物血清具有降低高脂血清所致sPs表达水平，且呈剂量依赖性。阿托伐他汀组Ps明显低于造模组、对照组(P〈0.05)，均具有统计学意义，表明阿托伐他汀药物血清也具有降低高脂血清所致Ps表达水平。②本发明对EC表面Ps表达影响流式细胞仪(FlewCytometer)是集流体喷射、激光、空气技术、Y-射线能谱术、及计算机等技术与纤维莹光光度计密切结合的仪器，可检测单个细胞表面的活性物质表达。本实验应用FITC标记的荧光二抗与ECV表面Ps抗体结合，通过FCM检测的荧光强度分辩ECV表面Ps表达的高低。实验结果表明，以相同浓度高脂血清培养的内皮细胞，培养6小时时造模组Ps表达明显高于对照组(p〈0.05)，培养12小时Ps表达也明显高于对照组(P〈0.05)，且6小时的Ps表达明显高于12小时(p〈0.05)，均具有统计学意义。Ps正常贮存在静止血小板a颗粒及内皮细胞weibel-palade小体中，正常内皮细胞和血小板表面无Ps表达或呈持续低表达状态，当被炎性介质等刺激或内皮细胞损伤后，随着脱颗粒释放作用，颗粒膜与细胞膜发生融膜作用，导致Ps快速转位到细胞表面进行表达，表达在细胞表面Ps又可通过其胞浆内尾段与溶酶体相互识别介导Ps内移进入溶酶体降解，少数缺乏跨膜段和胞浆内尾段(或该段已降解)的Ps则回到Weibel-Palade小体或a-颗粒中。与本实验的ECVPs表达6小时高于12小时的结果，可能与Ps在ECV表面表达后内移进入细胞或脱落到培养液中有关。本发明药物血清组其培养6小时及12小时的内皮细胞Ps表达的荧光强度均明显低于造模组、对照组及西药组(P〈0.05)，均具有统计学意义，表明本发明药物血清具有阻抑高脂血清所致的Ps表达水平；阿托伐他汀组Ps明显低于造模组、对照组(P〈0.05)，均具有统计学意义，表明阿托伐他汀药物血清也具有阻抑高脂血清所致Ps表达水平。这可能与本发明能稳定血小板颗粒膜避免与细胞膜发生融膜，稳定内皮细胞，阻止Ps转位到细胞表面进行表达有关。③本发明对ECPsmRNA表达的影响以10%及20%的高脂血清培养ECV，从24小时结果表明，造模组PsmRNA表达明显高于空白组(P〈0.05)，具有统计学意义，表明高脂血清与正常大鼠血清相比，使ECVPsmRNA表达增加；而且施予20%高脂血清的造模组，其PsmRNA表达明显高于施予109&高脂血清的对照组(p〈0.05),具有统计学意义，表明在一定范围内，随着高脂血清含量的增加，ECVPsmRNA的表达也增高；从48小时结果表明，造模组PsmRNA表达明显高于空白组及对照组(p〈0.05)，均具有统计学意义，并且与24小时造模组结果比较，48小时PsmRNA表达明显高于24小时(p〈0.05)，具有统计学意义，表明相同浓度的高脂血清对内皮细胞损伤所致的PsmRNA高表达呈时间依赖性。本发明药物血清与高脂血清共同培养ECV，24小时后其PsmRNA表达明显低于对照组及西药组(P〈0.05)，均具有统计学意义，且高剂量组优于常剂量组，表明本发明药物血清可以在DNA转录水平防止高脂血清对ECV的损伤进而导致的PsmRNA高表达。阿托伐他汀组PsmRNA表达明显低于对照组(p〈0.05)，具有统计学意义，表明阿托伐他汀药物血清也可以在DNA转录水平防止高脂血清对ECV的损伤进而导致的PsmRNA高表达。48小时组结果表明，以本发明药物血清培养经高脂血清损伤的ECV，其PsmRNA表达明显低于对照组及西药组(p〈0.05)，均具有统计学意义，且高剂量组优于常剂量组，表明本发明药物血清可以改善高脂血清损伤所致的PsmRNA高表达，既从DNA转录水平减轻高脂血清对损伤ECV的p-选择素高表达。阿托伐他汀组PsmRNA表达明显低于对照组(p〈0.05)，具有统计学意义，表明阿托伐他汀药物血清也可以在DNA转录水平具有减轻高脂血清对损伤ECV的Ps高表达。有实验表明，当内皮细胞暴露于n-LDL24h后，PsmRNA表达较对照组增加，与本实验结果相符，高血脂导致PsdiRNA表达增加的机理有待于进一步的实验研究。④本发明对Ps蛋白表达影响Ps的western蛋白定量分析结果表明，24小时及48小时的造模组p-选择素蛋白明显高于空白组及对照组(p〈0.05)，均具有统计学意义，并且48小时Ps蛋白表达明显高于24小时(p〈0.05)，具有统计学意义，表明在一定的浓度范围内，高脂血清的浓度增加(从10%—20%),可以使Ps蛋白表达增加，而且表明相同浓度的高脂血清对ECV损伤所致的Ps蛋白表达的高表达呈时间依赖性；本发明药物血清与高脂血清共同培养ECV，24小时后其Ps蛋白表达表达量明显低于对照组及西药组(P〈0.05)，均具有统计学意义，且高剂量组优于常剂量组，表明本发明药物血清可以防止高脂血清对ECV的损伤进而导致的Ps蛋白高表达。阿托伐他汀组Ps蛋白表达表达明显低于对照组(p〈0.05)，具有统计学意义，表明阿托伐他汀药物血清也可以防止高脂血清对ECV的损伤进而导致的Ps蛋白表达高表达。以本发明药物血清培养经高脂血清损伤的ECV，其Ps蛋白表达表达明显低于对照组及西药组(P〈0.05)，均具有统计学意义，且高剂量组优于常剂量组，表明本发明药物血清可以改善高脂血清损伤所致的Ps蛋白表达的高表达。阿托伐他汀组Ps蛋白表达明显低于对照组(P〈0.05)，具有统计学意义，表明阿托伐他汀药物血清也可以减轻高脂血清对损伤ECV的Ps蛋白高表达。实验六本发明对ECVE-Selectin的影响1实验材料1.1实验细胞同上1.2药物及试剂，山羊抗人E—selectin单抗、FITC标记兔抗山羊IgG，北京中山生物技术有限公司。PCR扩增引物根据文献[4]资料设计引物，弓|物序列上游5，-CMTCACTTTTAGCCMATACC-3,;下游5，-TTATAATTCAGCAACCTGAACTG-3,。以e-肌动蛋白(P-actin)做内参e-actin上游5，-MGGATTCCTATGTGGGC-3，；下游5，-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3由宝生物大连有限公司合成，20'C保存，使用前按说明稀释。Trizol:GiBCo。氯仿沈阳生威试剂。异丙醇、无水乙醇沈阳试剂一厂。RT-PCR试剂盒宝生物大连有限公司，批号108152实验方法2.1细胞培养方法同上2.2细胞传代方法同上2.3EC损伤模型制作及分组方法同上2.4指标检测PT-PCR方法检测ECEsmRNAWestern-Bloting检测内皮细胞E-Selectin蛋白表达3.统计方法计量资料以平均数土标准差(x土s)表示，组间比较经方差齐性检验后，作方差分析的q检验，以P〈0.05为有统计学意义，以SPSS11.0处理数据。4.结果4.1本发明对ECE-SelectinmRNA影响(RT-PCR)造模组与对照组比较其培养液中vWF、TXB2升高，PGI2降低，E-SelectinmRNA表达、E-Selectin蛋白表达增加，普通光镜可见细胞膜肿胀，轮廓不清，细胞内有明显的暗色颗粒，透射电镜下见线粒体肿胀，嵴消失，内质网扩张，细胞核切迹等损伤改变；本发明与阿托伐他汀药物血清组与造模组比较，其培养液中vWF、TXB2降低，PGI2升高，EC表面E-SelectinmRNA表达、E-Selectin蛋白表达下降，普通光镜及透射电镜下可见EC损伤性改变好转；本发明组优于阿托伐他汀，且其高剂量组优于常剂量组5.结论①本发明具有防治高脂血清对EC的损伤，改善EC形态，保护EC功能的作用。②本发明保护EC功能的机理与其降低ECvWF、TXB2含量，提高PGI2含量，调整TXB2、PGI2平衡；③本发明具有阻抑ECE-Selectin表达的作用。④本发明保护EC，降低E-选择素表达的作用为其防治AS的主要作用机理之一。权利要求1、一种治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药，其特征在于按下述重量配制绞股兰15-25g、茯苓10-15g、半夏5-15g、丹参15-25g、川芎15-25g、石菖蒲10-15g、郁金10-20g、山楂10-25g、黄芪15-25g。2、根据权利要求1所述的一种治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药，其特征在于按下述重量配制绞股兰20g、茯苓10g、半夏10g、丹参15g、川芎20g、石菖蒲10g、郁金15g、山楂15g、黄芪25g。3、根据权利要求1所述的一种治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药，其特征在于按下述重量配制绞股兰25g、茯苓15g、半夏10g、丹参20g、川芎15g、石菖蒲10g、郁金10g、山楂20g、黄芪20g。4、根据权利要求1所述的一种治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药，其特征在于按下述重量配制绞股兰15g、茯苓10g、半夏5g、丹参25g、川芎25g、石菖蒲10g、郁金20g、山楂25g、黄芪15g。全文摘要一种治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药是属于中药制剂。本发明就是提供一种以本虚标实立论，以健脾益气以治本，减少浊脂的生成，改善代谢；同时祛痰化瘀以治标，以阻抑动脉粥样硬化的发生发展的治疗血脂异常和动脉粥样硬化的中药。本发明按下述重量配制绞股兰15-25g、茯苓10-15g、半夏5-15g、丹参15-25g、川芎15-25g、石菖蒲10-15g、郁金10-20g、山楂10-25g、黄芪15-25g。文档编号A61K36/88GK101618176SQ20081001216公开日2010年1月6日申请日期2008年7月4日优先权日2008年7月4日发明者民陈申请人:民陈