融合蛋白Penharpin及制备方法和用途的制作方法

专利名称：：融合蛋白Penharpin及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程技术、药物和植物病害防治领域，更具体地，本发明涉及对虾肽Pen-2(Penaeidin-2，以下简称Pen-2)与激发子Harpin的融合蛋白Penharpin，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白Penharpin的方法，以及含该融合蛋白Penharpin的药物组合物。本发明涉及的融合蛋白Penharpin同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性。融合蛋白Penharpin具有对虾肽Pen-2的抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有激发子Harpin诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质。该融合蛋白Penharpin在预防和治疗植物的细菌、真菌和病毒病中的应用，以及在防治植物病害、诱生和提高植物的抗病能力、促进植物生长、提高农作物产量中的应用。
背景技术：
：对虾肽Penaeidins是从南美白对虾血浆和血细胞的酸性抽提物中分离的一类具有生物活性的肽类物质，分子大小为5.48-6.62kDa。Penaeidin家族是阳离子抗菌肽，COOH-端含有6个半胱氨酸，形成3个二硫键，NH2-端富含脯氨酸。Penaeidin前体N端具有保守性很强的信号肽，经加工获得成熟肽。Penaeidin成熟肽有翻译后修饰的特性，或者C端酰氨化，或者N端通过焦谷氨酸环化(DestoumieuxD,BuletP,LoewD,etal.1997.C.-J.Kangeta1.2007)。Penaeidins是一组具有生物活性的对虾抗菌肽，目前已分离并鉴定的Penaeidins分另ij为Pen-l、Pen-2、Pen-3、Pen-4禾口Pen-5等。Penaeidin在凡纳滨对虾和白滨对虾中都存在，它们可能分别执行不同的生物学功能。Penaeidin的转录水平很高，对4下能产生大量不同的Penaeidin。Penaeidin分子中有两个结构域，一个是富含甘氨酸和脯氨酸的N端结构域，另一个是含有6个保守半胱氨酸残基的C端。Penaeidin所含有的两个不同的结构域，行使着不同的功能，共同发挥作用，从而使抗菌肽具有多功能的特点。对虾肽Penaeidin-2(Pen-2)是从南美白对虾血淋巴中分离到的阳离子抗菌肽。天然的Pen-2具有50个氨基酸残基，分子量为5562Da。Penaeidins同时具有抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的生物活性。Penaeidins通过多种抗菌模式发挥作用，对细菌起到快速杀死的作用，或者表现为抑制作用。Penaeidin的抗细菌活性主要是针对革兰氏阳性菌，并有种属特异性。Penaeidin能抑制许多细菌的生长，作用机制多种多样。有的Penaeidin缓慢杀死细菌，有的杀菌作用十分迅速。Penaeidins具有抗真菌活性，通过抑制抱子萌发而起到杀死不同品系真菌的作用，而当Penaeidins的浓度较低时，则会抑制真菌的生长，并且导致其形态异常。对虾肽Pen-2同时具有抗细菌和真菌的活性。对4下肽Pen-2和Pen-3a对于许多丝状真菌具有抗菌活性，最小抑菌浓度(MIC)低于10Umol/L。抗菌肽具有广谱杀菌作用、相对分子量较小、水溶性好等优点，且抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。目前，随着抗生素残留，耐药菌株的不断出现。不少病原菌对抗生素产生很强的耐药性，而抗菌肽几乎不产生抗性。抗菌肽有着许多传统抗生素无法比拟的优点，它们具有广谱的生物学活性，抗菌能力强，杀菌迅速，种类多，可供选择范围广，靶菌株不易产生抗性突变，与典型的抗生素具有协同作用，能中和内毒素等。同时，抗菌肽也是机体抵抗外源性感染的天然防御系统的重要组分之一，具有特异性与安全性。因此，研究能逐步替代抗生素的抗菌肽就显得极为重要，抗菌肽成为继青霉素等传统抗生素之后的一类重要新型抗菌药物。在医药领域中，德国和美国巳有多种抗菌肽应用于临床治疗手术后重度真菌感染和重度肺炎症状的报道。在食品和化妆品领域中抗菌肽主要用作保藏剂和防腐剂，取得了较好的效果。抗菌肽在医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程等方面将有着广阔的应用前景。从来源上，激发子(elicitor)可分为生物激发子和非生物激发子两大类。生物激发子指来自病原菌、非病原菌、寄主植物和非寄主植物的能够诱导植物产生防卫反应的物质。激发子Harpin是革兰氏阴性(G-)植物病原细菌产生的一类蛋白质激发子。植物过敏性反应(hypersensitiveresponse,HR)，是植物在受到病原细菌侵染、发生不亲和反应时所产生的一种特有现象(KlementZeta1,1963)。过敏反应是植物自身具有的一种保护反应，类似于高等动物所具有的广谱抗病菌虫害的免疫反应。病原菌所产生的一些多糖、脂多糖、糖蛋白、脂肪酸、蛋白质以及多肽等激发子诱导植物过敏性反应。病菌中参与过敏性反应的基因称为过敏性反应基因(hypersensitivereactionandpathogenicity;hrp)(DanielsMJetal,1993)。hrp基因一般成簇存在，hrp基因簇通常由多个转录单位组成。植物病原菌都有hrp基因簇，分子量为2000~4000，包括3~13个基因，它们既和致病相关，又与诱导寄主的过敏性反应相关(WillisDK,etal,1991)。1992年，Wei等首先从梨火疫病的病原细菌(五rw/"z'aaw;;/ovora)中分离到一种约44kDa、能激发HR的蛋白质激发子Harpin(hrpN基因编码，常用HarpinEa表示)，并将研究成果发表在《Science》上(Weietal.,1992)。hrp基因簇中的各个基因协同作用，功能上相当于一个调控单元，它们既与致病性有关，又与诱导寄主的过敏性反应相关(EzraDetal,2000;LeachJE,1996)。在基因组中，hrp基因往往是成串的，形成一个操纵子结构，能产生过敏反应的激发子Harpin的编码基因是其中的一个或几个(BeerSV，etal，1991)。激发子Harpin既能诱导非寄主植物产生过敏反应，其本身又是寄主的一种致病因子(HeSY,1993)。激发子Harpin通过与植物表面的受体结合、激活植物自身的防御功能，然后通过构型变化激活胞内有关酶的活性和蛋白质磷酸化，形成第二信使，信号得到放大，最终通过对特殊基因的调节而激发植物产生防卫反应(梁元存等，2001)。激发子Harpin激活植物防卫反应的途径主要有三种(1)一种未知途径激活植物抗细菌反应；(2)水杨酸途径激活植物的抗细菌、真菌、病毒反应；(3)乙烯和茉莉酸途径激活抗真菌反应。激发子Harpin具有调节离子通道、引起防卫反应和细胞死亡的功能。激发子Harpin能激发在细胞悬浮培养中活性氧的产生。已证明活性氧有三方面的抗病功能(1)传递诱导防卫反应的互作信号；(2)修饰寄主的细胞壁以抵御病原菌的侵染；(3)直接抑制病原菌的侵入(HeSY，1993)。激发子Harpin能够直接应用于植物病害防治(直接喷洒使用或构建多功能生防微生物)，也能够应用于转基因植物，产生广谱的抗病特性。激发子Harpin可用于防治假单胞菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属等引起的细菌类疾病；镰孢属、疫霉属等引起的真菌类疾病；烟草花叶病毒和番茄花叶病毒等植物病毒类疾病。此外，激发子Harpin能抑制细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫对植物的侵染和侵害，是一种新型的抗菌抑菌剂，广泛应用于植物保护，特别是单子叶植物和双子叶植物，其中包括主要的农作物和经济作物、蔬菜等。激发子Harpin具有促进生长和发育的功能，研究表明激发子Harpin能促进种子萌发和植物发育，提高作物的产量和质量，增大植株个体，利于植物的早熟禾口结实(BonasUetal，1994;Labyetal,1997;傅华欣，1999;高正良，1999)。激发子Harpin还可提高蔬菜、水果抗腐烂、霉变能力，延长Jt藏时间。另外，激发子Harpin对于农作物、蔬菜害虫如棉铃虫、甜菜夜蛾、菜青虫等也有一定的趋避和控制作用。激发子Harpin本身不具有任何杀菌活性，对植物病原不具有直接的抑制或毒杀效果，不存在促进有害生物种群抗性发展的选择压力。但是，激发子Harpin可以激活植物产生一系列抗性反应。研究表明，激发子Harpin对野生动物(如鸟、鱼、蜜蜂、水蚤和藻类植物等)无害。因此，激发子Harpin作为抗菌抑菌具有不污染环境，对人畜安全，不产生抗药性等优点，在生产上具有较好的应用前景。
发明内容本发明的目的是在于提供一种新的同时具有对奸肽Pen-2和激发子Harpin两者生物活性的融合蛋白Penharpin。融合蛋白Penharpin具有对虾肽Pen-2的抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有激发子Harpin诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质。-'本发明的另一目的是在于提供编码所述融合蛋白Penharpin的DNA，含有该DNA序列的载体，含有该载体的宿主细胞。本发明的再一个目的是在于提供一种制备所述融合蛋白Penharpin的方法。在本发明的第一个方面，提供了一种融合蛋白Penharpin,该蛋白包括对虾肽Pen-2的氨基酸序列、激发子Harpin的氨基酸序列、以及位于对虾肽Pen-2的氨基酸序列与激发子Harpin的氨基酸序列之间的1-20个氨基酸的连接肽序列。较佳的，所述的连接肽序列含4-15个氨基酸。更佳的，所述的融合蛋白包括SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。在本发明的第二个方面，提供了一种分离的DNA分子，该DNA分子编码上述的融合蛋白Penharpin。较佳的，所述的DNA分子编码包括SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。在本发明的第三个方面，提供了一种载体，该载体含有上述DNA分子。较佳的，所述的载体包括重组表达质粒pET-pen-hrp。在本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述载体。较佳的，所述的宿主细胞包括重组基因工程菌株五sc/en'c/n、co/z'OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，艮卩五.co"OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，CCTCCNo:M208071。该菌株含有上述重组表达质粒pET-pen-hrp。在本发明的第五个方面，提供了一种产生上述融合蛋白Penharpin的方法，该方法包括以下步骤培养上述宿主细胞，在能表达所述的融合蛋白Penharpin条件(其中包括诱导或非诱导条件)下，表达上述融合蛋白Penharpin,然后分离、纯化融合蛋白Penharpin。在本发明的第六个方面，提供了一种药物组合物，该组合物包含有效剂量的上述融合蛋白Penharpin,以及药学上可接受的增效剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、稀释剂或赋形剂或胶囊剂或载体。在本发明的第七个方面，提供了上述药物组合物在预防或治疗植物病害中的应用。所述的融合蛋白Penharpin或药物组合物在防治植物病害中的应用。本发明还涉及融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗细菌感染的药物中的应用。本发明还涉及融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗真菌感染的药物中的应用。本发明还涉及融合虔白Penharpin在制备治疗或预防抗病毒感染的药物中的应用。本发明将对虾肽Pen-2基因和激发子Harpin基因融合、重构、表达，产生对虾肽Pen-2和激发子Harpin的融合蛋白Penharpin,该融合蛋白Penharpin同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性。融合蛋白Penharpin具有对虾肽Pen-2的抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有激发子Harpin诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质。融合蛋白Penharpin成为一种新型的药物，应用于预防和治疗植物的细菌、真菌和病毒病，在防治植物病害、诱生和提高植物的抗病能力、促进植物生长、提高农作物产量中发挥作用。定义如本文所用，术语"对虾肽Pen-2和激发子Harpin的融合蛋白"、"对虾肽Pen-2-激发子Harpin融合蛋白"、"对虾肽Pen-2与激发子Harpin的融合蛋白Penharpin"、"Pen-2-Harpin融合蛋白"、"融合蛋白Penharpin"、"Penharpin融合蛋白"等可互换使用，均指将对虾肽Pen-2氨基酸序列和激发子Harpin氨基酸序列融合、重构而成的蛋白。其中，两个氨基酸序列之间可以有或者没有连接肽序列。如本文所用，术语融合蛋白Penharpin中"对虾肽Pen-2氨基酸序列"，指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列。该序列与天然的或变异的对虾肽Pen-2具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然对虾肽Pen-2基本上相同的生物活性。优选的对虾肽Pen-2氨基酸序列是天然对虾肽Pen-2氨基酸序列。如本文所用，术语融合蛋白中"激发子Harpin氨基酸序列"，指在所述融合蛋白Penharpin中的一部分氨基酸序列。该序列与天然的或变异的激发子Ha卬in具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与激发子Harpin基本上相同的生物活性。优选的激发子Harpin氨基酸序列是天然激发子Harpin氨基.酸序列。-'如本文所用，术语"连接肽"指位于对虾肽Pen-2氨基酸序列和激发子Harpin氨基酸序列之间、发挥连接作用的短肽。连接肽的长度为1-20个氨基酸，较佳的为4-15个氨基酸。技术人员可按照本领域的常规方法设计连接肽。如本文所用，术语"对虾肽Pen-2和激发子Harpin的融合基因"、、"pen-hrp融合基因"、"pen-hrp"等可互换使用，均指将对虾肽Pen-2基因pen和激发子Harpin基因hrp融合、重构而成的融合基因。其中，两个基因序列之间可以有或者没有连接肽DNA序列。如本文所用，编码融合蛋白Penharpin的DNA序列，可以全部人工合成，也可用PCR扩增或合成的方法分别获得编码对虾肽Pen-2和激发子Harpin的DNA序列，然后其进行拼接，构成本发明融合蛋白Penharpin的DNA序列。将该序列与合适的表达载体连接，然后转入合适的宿主细胞。培养上述宿主细胞，在能表达所述的融合蛋白Penharpin条件(其中包括诱导或非诱导条件)下，表达上述融合蛋白Penharpin，然后分离、纯化该融合蛋白Penharpin。如本文所用，术语"载体"包括克隆载体、表达载体、病毒载体、质粒和粘粒等。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如原核系统表达载体和真核系统表达载体等。将编码本发明新融合蛋白Penharpin的核苷酸序列插入上述载体中，表达融合蛋白Penharpin。本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括大肠杆菌和枯草杆菌等。真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞等。较佳的，该宿主细胞是大肠杆菌。本发明中，含有上述载体的宿主细胞经过培养，可在合适的条件下表达上述融合蛋白Penharpin,然后分离、纯化融合蛋白Penharpin。大肠杆菌表达系统具有以下优点(1)蛋白质表达量高。基因工程蛋白的表达量最高可以达到菌体蛋白总量的30-50%。(2)可表达N端含有6个连续组氨酸的融合蛋白，该6个连续的组氨酸有利于蛋白质的分离和纯化。组氨酸在一般蛋白中为稀有氨基酸，引入连续的6个组氨酸具有很高的特异性。6个组氨酸尾与金属离子有很强的结合能力，而且对目的蛋白的结构和功能的影响很小，通常生物学活性可以得以保持，不经去除6个组氨酸尾可直接研究目的蛋白的生物学活性。(3)大肠杆菌表达系统是一种安全的表达系统，目前己经成功地采用大肠杆菌表达系统表达了多种医用的蛋白质，安全无毒，对人畜及环境无毒无害。(4)利于产业化生产。在所有基因工程表达系统中，大肠杆菌的生产成本是最低的，而且己经有成型的发酵设备和生产方法，有利于实现产业化生产。在本发明的一个实施例中，将pen-hrp融合基因克隆入原核表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌5jc/zerz'c/n'aco/z'OrigamiB(DE3)pLysS,制备一禾中重组基因工程菌株￡^c/e"-c/z/aco//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，即￡.co/z.OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，CCTCCNo:M208071。pET-32a(+)载体是一种表达量很高的载体，培养￡.co"OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp),在表达所述的融合蛋白Penharpin条件(其中包括诱导或非诱导条件)下，表达融合蛋白Penharpin,然后分离、纯化融合蛋白Penharpin。融合蛋白Penharpin约占菌体蛋白总量的28%以上，表达的融合蛋白Penharpin主要形成可溶性蛋白。本发明的Penharpin融合蛋白具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的生物活性。在实施例中，Penharpin融合蛋白对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有不同程度的抗细菌活性，对多种细菌均有一定的抑杀作用。Penharpin融合蛋白对黑曲霉具有明显的抗菌活性。Penharpin融合蛋白可预防烟草花叶病毒(TMV)对烟草的侵染，并且Penharpin融合蛋白的对预防烟草花叶病毒(TMV)感染烟草的效果较激发子Harpin好。另外，Penharpin融合蛋白对TMV的感染有一定的治疗效果，病情指数较对照降低。Penharpin融合蛋白能引起烟草的过敏反应，并且将Penharpin融合蛋白和激发子harpin样品相比较，Penharpin融合蛋白处理组所引发的过敏反应较激发子Harpin处理组的反应程度强。Penharpin融合蛋白还能诱导烟草叶片中防御性物质过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)。在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效剂量的Penharpin融合蛋白，以及药学上可接受的增效剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、稀释剂或赋形剂或胶囊剂或载体。赋形剂可分为8类(1)填充剂，如植物淀粉、乳糖、钙盐、碳酸氢钠、枸橼酸、右旋糖酐、蔗糖、醇、甘油、山梨糖醇、木糖醇、水和局部用制剂的矿物油(液体石蜡)、凡士林、石蜡、羊毛脂、蜂蜡、皂土、硅酸镁铝等。(2)涂层剂，如明胶、聚合物、紫胶、谷蛋白、胶浆等；(3)甜味剂，如蔗糖、乳糖、右旋糖酐、果糖、玉米糖浆、阿司巴甜、环己酸氨基磺酸盐等；(4)调味剂，如从苹果、樱桃、可可、柑橘、苏丹可可果、姜、甘草、薄荷等提取出的天然香料，以及来源被公认安全的人工香料等物质。(5)着色剂/染料，如偶氮和单偶氮染料、喹啉染料、三苯甲烷染料、黄嘌呤染料等。(6)缓冲剂，如磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐等和一些混悬、乳化和硬化化合物；(7)防腐剂，如山梨酸、硫柳汞、苯甲醇等；(8)推进剂，如压縮气体、碳氟化合物等。因此，组合物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、纳米制剂等。组合物可制成单元或多元剂型，各种剂型包含为了产生所期望的植物病害防治效果的预定量活性成分——Penharpin融合蛋白，以及合适的药剂学稀释剂或赋形剂或胶囊剂等。该药物组合物在植物病害防治中，可根据植物病害具体情况采用有效剂量进行施药，这可以由生物防治人员确定。另外，本发明的Penharpin融合蛋白和药物组合物可与其它药物(如植病灵、多菌灵)联用，应用于植物病害的防治。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施在本发明的一个实施方案中，提供一种DNA片断的制备方法，该片段包含所述的编码Penharpin融合蛋白的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，本发明所述的Penharpin融合蛋白具有的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码Penharpin融合蛋白的核苷酸序列为SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，提供了一种Penharpin融合蛋白，该蛋白为基因工程融合蛋白，其N的氨基酸是载体所编码的，N端氨基酸是MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAIIA/DFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKIiTVAKLN60IDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHH120HHSSGIjVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEF167在本发明的一个实施方案中，所用pET-32a(+)质粒为Novagen公司产品，在pET-32a(+)质粒多克隆位点上游还带有His.Tag、S.;Tag及肠激酶和凝血酶酶切位点，表达Penharpin融合蛋白，其分子质量约65kDa。在本发明的一个实施方案中，提供了一种宿主细胞一一大肠杆菌，该宿主细胞包含编码本发明所述的Penharpin融合蛋白的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的Penharpin融合蛋白的DNA片断。在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌重组基因工程菌株，该菌株分类命名为5sc/2e"'c/z/aco//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，艮卩￡.co/!'OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2008年5月13日，保藏编号CCTCCNo:M208071,该宿主细胞包含本发明所述的Penharpin融合蛋白的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌重组基因工程菌株￡.co//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)的构建方法。其步骤是(1)南美白对虾Pen-2基因pen的扩增上游引物PEN1:(SEQIDNo,3)5'GTGAATTCTACAGGGGCGGTTACACA3Y下戈j线处为五coRI位点)。下游引物PEN2:(SEQIDNo.4)(下划线处为Z6。I位点)。含Pen-2基因pen的质粒pGEM-T/Pen为模板，利用PCR仪扩增，获得230bp目的基因。(2)重组质粒pGEM-T-pen的构建和鉴定回收PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体(购于Promega公司)上，转化五.co"JM109(购于Promega公司)感受态细胞，涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal，Promega公司产品)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG,Promega公司产品)和100pg/mL氨节青霉素(Amp)的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定，DNA测序分析鉴定重组质粒pGEM-T-pen。(3)激发子Harpin基因hrp的扩增上游引物HRPl:(SEQIDNo.5)线处为Z6al位点)。'下游引物HRP2:(SEQIDNo.6)5'GGCTGCAGAAGCTTTCAGGCCACAGCCTGGTTAGTCTG3'(下划线处为///"dill和PWI位点)。含Harpin基因hrp的质粒pGEM-T-hrp为模板，利用PCR仪扩增，获得1281bp目的基因。(4)重组质粒pGEM-T-hrp的构建和鉴定回收PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化E.co/!'JM109感受态细胞，涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal，Promega公司产品)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Promega公司产品)禾Q100pg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定，DNA测序分析鉴定重组质粒pGEM-T-hrp。(5)重组质粒pGEM-T-pen-hrp的构建和鉴定用XZ^I、户wl双酶切重组质粒pGEM-T-penDNA，用胶回收试剂盒(Omega公司产品)回收、纯化目的3.2kbDNA片断。用X6aI、户WI双酶切重组质粒pGEM-T-hrpDNA，用胶回收试剂盒回收、纯化目的1.2kbDNA片断。再将3.2kbDNA片断与1.2kbDNA片断连接，16'C连接15h后，产物转化cc^'JM109感受态细胞，涂布于含lOOpg/mL氨节青霉素(Amp)的LB平板上，筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定。(6)重组表达质粒pET-pen-hrp的构建和鉴定用￡coRI、i//"dIII分别双酶切表达载体pET-32a(+)和重组质粒pGEM-T-pen-hrpDNA，分别用胶回收试剂盒回收、纯化目的DNA片断，再将1.4kb的pen-hrpDNA片断与pET-32a(+)DNA片断连接，16'C连接15h后，产物转化co/z'OrigamiB(DE3)pLysS感受态细胞，涂布于含100pg/mL氨苄青霉素(Amp)，34pg/mL氯霉素和15ng/mL卡那霉素的LB平板上，筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定，DNA测序分析鉴定重组质粒pET-pen-hrp。该菌株命名为大肠杆菌重组基因工程菌株co/z'OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)。在本发明的一个实施方案中，提供了一种利用大肠杆菌重组基因工程菌株五.co/,'OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，表达Penharpin融合蛋白的方法。其步骤是(1)挑取单菌落接种于含100pg/mL氨苄青霉素(Amp),34ng/mL氯霉素和15ng/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37'C，250r/min下振荡培养8-12h。4'C放置过夜。(2)次日按4%接种量接入新鲜的含100pg/mL氨苄青霉素(Amp)，34ng/mL氯霉素和15pg/mL卡那霉素2YT液体培养基中，在37'C下继续振荡培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG至终浓度为0.4mmoI/L，在37°C下诱导表达3-5h,4'C离心收集菌体。(3)10%SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。在本发明的一个实施方案中，提供了一种纯化Penharpin融合蛋白的方法。(1)超声波破碎离心收集上清；(2)采用His'Bindresin柱(Novagen公司产品)，按照Novagen公司操作手册纯化Penharpin融合蛋白；(3)PBS缓冲液(pH7.3)透析处理纯化的Penharpin融合蛋白；(4)10%SDS-PAGE电泳，激光扫描检测Penharpin融合蛋白纯度。(5)采用Bradfordassay法，测定纯化的Penharpin融合蛋白浓度。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果在本发明的一个实施方案中，检测了Penharpin融合蛋白抗细菌的生物活性。釆用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。融合蛋白Penharpin具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抑菌活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL，对金黄色葡萄球菌(^ap/^/ococcws)、短小芽孢杆菌(5ac"/wpwmz'/ws)、苏云金芽孢杆菌(5ac!7/"s)、枯草芽孢杆菌(5ac〃/wswegafer/脂)、溶藻弧菌(附"'oa/g化o(y"cws)、副溶血弧菌(丑/6n'o户ara/zeff3o/;y"CMS)、鼠伤寒沙门氏菌(sa/歸we/Za妙/h'wm"z',)、大肠杆菌JM109(￡sc/ze"'c/2!'(3co〃JM109)、铜绿假单胞菌(Psewdo加o"asaerwg&osa)等有很好的抗菌活性。在本发明的一个实施方案中，检测了Penharpin融合蛋白抗真菌的生物活性。采用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对真菌的活性。融合蛋白Penharpin对黑曲霉(^perg辺w5m'ger)具有明显的抗菌活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL，对黑曲霉具有抑杀作用，抑杀率为47.7%。在本发明的一个实施方案中，检测了Penharpin融合蛋白抗烟草花叶病毒感染的生物活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为2.0pmol/mL，融合蛋白Penharpin、激发子Harpin均可预防烟草花叶病毒(TMV)对烟草的侵染，并且融合蛋白Penharpin的对预防烟草花叶病毒(TMV)感染烟草的效果较激发子Harpin好。此外，融合蛋白Penharpin和激发子Harpin对TMV的感染也有一定的治疗效果，病情指数较对照降低，其相对防效分别为14.63%和13.93%，融合蛋白Penharpin的相对防效高于激发子Harpin。在本发明的一个实施方案中，测定了Penharpin融合蛋白诱导烟草的过敏反应。采用叶片穿剌法，测定融合蛋白Penharpin诱导烟草的过敏反应。融合蛋白Penharpin和激发子Harpin均能引起烟草的过敏反应，并且将融合蛋白Penharpin和激发子Harpin样品处理组相比较，融合蛋白Penharpin处理组所引发的过敏反应较激发子Harpin处理组的反应程度强，￡.CO//OrigamiB(DE3)pLysS(pET)提取液样品处理组和PBS处理组均无反应。在本发明的一个实施方案中，测定了融合蛋白Penharpin对防御性物质的诱导作用。过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)都是植物防卫反应中起重要作用的酶，通过测定POD和SOD，确定融合蛋白Penharpin对烟草叶片中防御性物质POD和SOD的诱导作用。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为2.0pmol/mL。烟草叶片POD活性在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第10h时达到峰值，约为初始值的1.8倍，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片POD的活性也在第10h达到峰值，约为初始值的1.5倍。PBS处理组的酶活无明显变化。融合蛋白Penharpin处理组与激发子Harpin处理组相比，融合蛋白Penharpin处理组的叶片的POD酶活在各个时间点均高于激发子Harpin处理组。烟草叶片经过融合蛋白Penharpin喷施处理后，超氧化物歧化酶(SOD)的活性增加。SOD在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第6h时达到峰值，为初始值的1.5倍，然后逐渐回落，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片SOD的活性在第10h达到峰值，约为初始值的1.2倍。PBS处理组的酶活无明显的变化。与激发子Harpin处理组相比，融合蛋白Penharpin处理组的叶片的SOD酶活在较短时间内达到最大。对虾肽Pen-2和激发子Harpin具有各自独特的生物学活性。对虾肽Pen-2对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒均具有明显的抗微生物感染活性。激发子Harpin能刺激植物产生自然的免疫机制，使得植物能抵抗一系列的细菌、真菌和病毒病害。激发子Harpin还具有促进植物生长和发育的功能。目前，激发子Harpin能够直接应用于植物病害防治(直接喷洒使用或构建多功能生防微生物)，也能够应用于转基因植物而具有广谱的抗病特性。但是，激发子Harpin在应用过程中，存在施药次数多、抗植物病害效果有待提高的问题。至今为止，国内外未见对虾肽Pen-2在植物病害防治中应用的报道和文献。本发明所涉及的Penharpin融合蛋白同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性，在植物病害的防治中较单一的激发子Harpin的应用更有效，植物病害的防治效果更佳。同时，Penharpin融合蛋白的生产与对虾肽Pen-2、激发子Harpin的单独生产比较，降低了生产成本，也降低了植物病害防治的成本。本发明的优点如下(1)采用基因工程技术，制备了Penharpin融合蛋白，Penharpin融合蛋白同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性，与单一的对虾肽Pen-2和激发子Harpin生物活性相比较，该融合蛋白具有更有效、广谱的生物活性。(2)Penharpin融合蛋白的基因工程制备方法与其它方法如化学交联法相比，具有操作简单、表达量高、安全性高、成本低、有利于实现产业化生产。该方法的应用避免了化学交联法所存在的操作烦琐、交联效率低、产物不均一、蛋白质易失活、成本较高等缺陷。(3)釆用基因工程生产Penharpin融合蛋白，较单一生产对虾肽Pen-2和激发子Harpin,避免了重复劳动，降低了生产成本。(4)耷植物病害的防治应用中，Penharpin融合蛋白与单一的激发子Harpin的应用相比，对植物病害的防治效果更佳。(5)在植物病害的防治应用中，Penharpin融合蛋白与激发子Harpin应用相比，减少了施药次数，降低了植物病害防治的成本。Penharpin融合蛋白既具有对虾肽Pen-2的生物活性，又具有激发子Harpin的生物活性，是一种防治植物的病害、促进植物的生长、提高农作物产量的新型药物。本发明的上述和其它目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选实施例的详细描述和附图示出的内容得到，不同视图中相同的参考符号代表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施和效果。图1Pen-2基因pen的PCR扩增产物电泳图谱Lane1，LD2000marker;lane2,DNAfragmentsofpenwereamplifiedbyPCR.图2重组质粒pGEM-T-pen的PCR和酶切鉴定图Lane1，LD2000marker;lane2，DNAfragmentsofpenwereamplifiedbyPCR;lane3，recombinantpGEM-T-penvectordigestedby五coRI;lane4，recombinantpGEM陽T-penvectordigestedby五coRI/JT6aI;lane5,Markerni.图3Harpin基因hrp的PCR扩增产物电泳图谱Lane1,MarkerIII;lane2，DNAfragmentsofhrpwereamplifiedbyPCR.图4重组质粒pGEM-T-hrp的PCR和酶切鉴定图Lane1，MarkerHI;lane2，DNAfragmentsofhrpwereamplifiedbyPCR;lane3，recombinantplasmidpGEM-T-hrpdigestedbyI;lane4，recombinantplasmidpGEM-T-hrpdigestedby尸s/II.图5重组质粒pGEMT-pen-hrp的PCR和酶切鉴定图Lane1,LD2000marker;lane2，DNAfragmentsofpenwereamplifiedbyPCRwithPENlandPEN2;lane3，DNAfragmentsofhrpwereamplifiedbyPCRwithHRPlandHRP2;lane4，DNAfragmentsofpen-hrpwereamplifiedbyPCRwithPENlandHRP2;lane5，recombinantplasmidpGEM-T-pen-hrpdigestedby五coRI;lane6，recombinantplasmidpGEMT-pen-hrpdigestedby￡coRI/if/"dIII;lane7,MarkerIII,图6重组质粒pGEMT-pen-hrp的构建过程图图7重组表达质粒pET-pen-hrp的PCR和酶切鉴定图Lane1，DL2000marker;lane2，DNAfragmentsofpen-hrpwereamplifedbyPCRwithPENlandHRP2;Lane3，recombinantpET-pen-hrpvectordigestedby五coRI//f7打dEI;lane4,pET-pen-hrpvectordigestedby五coRI;lane5,MarkerIV图8重组表达质粒pET-pen-hrp的构建过程图图910%SDS-PAGE检测融合蛋白Penharpin的表达Lane1,五.co//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)未诱导；lane2,五.co//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导前；lane3,五.co//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a)诱导4h;lane4,五.coh.OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导3h;lane5,￡.co〃OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导4h;lane6，￡.co〃OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导5h;lane7,￡.co//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)诱导6h;lane8，分子量标准；lane9，纯化的融合蛋白Penharpin.图10融合蛋白Penharpin在烟草叶片上诱导产生的过敏反应1/6,Penharpinsample;2/5，harpinsample;3/4,PBSBuffer.图11融合蛋白Penharpin诱导POD，POD活性测定Time-coursemeasurementofsystemicactivationofphenolperoxidase(POD)intobaccoleavestreatedwithproteinPenharpinandHarpin.ControlleavesweretreatedwithPBS.Plantswereharvestedatdifferenttimeintervalsafterthebeginningoftreatment.图12融合蛋白Penharpin诱导SOD，SOD活性测定Time-coursemeasurementofsystemicactivationofSuperoxidedismutase(SOD)intobaccoleavestreatedwithproteinPenharpinandHarpin.ControlleavesweretreatedwithPBS.Plantswereharvestedatdifferenttimeintervalsafterthebeginningoftreatment.具体实施例方式通过结合下述具体实施例，阐明本发明。但是，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。..实施例1南美白对虾Pen-2基因pen的扩增和克隆1.扩增引物的设计和合成为了使所表达的Pen-Harpin融合蛋白具有生物活性，具备正确的空间构象，设计对虾肽Pen-2和Harpin蛋白之间连接肽为"GGSGSGGSSRGGSGS"。根据对虾肽Pen-2基因pen序列和连接肽"GGSGSGGSSRGGSGS"的核苷酸序列，设计一对引物PEN1和PEN2,PEN1和PEN2的核苷酸序列分别为上游引物PEN1:(SEQIDNo,3)5'GTGAATTCTACAGGGGCGGTTACACA3'f下戈'J线处为五coRI位点)。下游引物PEN2:(SEQIDNo.4)(下划线处为JHmI位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。2.目的基因pen的PCR扩增以PEN1禾BPEN2为引物，含Pen-2基因pen的质粒pGEM-T/Pen为模板，PCR扩增含有连接肽核苷酸序列的penDNA片断，其5'端和3'端分别含有￡coRI禾BX6aI酶切位点。PCR反应体系10xreactionbuffer,5pL;1.5mMMgC12，3fiL;0.2mMdNTP,20pmol上游弓|物P1,lpL;20pmol下游引物P2，lpL;5ULTaqDNA聚合酶1pL;模板6pL;加无菌水至终体积为50nL。PCR反应条件95°C,5min;94。C，30s;53°C，45s;72。C30s(35个循环)；72°C，5min。琼脂糖凝胶电泳结果如附图1所示。PCR扩增目的基因pen产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下观察，有一约为230bpDNA带，与目的基因pen结果相符。3.南美白对虾pen基因的克隆(1)目的基因pen片段的回收采用DNA胶回收试剂盒(Omega公司产品)，按照Omega公司DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段。具体操作步骤如下①PCR产物经1.2n/。琼脂糖凝胶电泳(lxTAE),用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。②在Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液BindingBuffer,65°C水浴7min,其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。③将融解的样品加入层析柱中，12000rpm离心lmin，弃去液体。加300pXBindingBuffer,离心弃去液体。力Q750|iLWashingBuffer,离心弃去液体。⑥重复步骤(5),l次。⑦空柱子12000rpm离心lmin以甩干液体。⑧将柱子放于1.5mLEppendorf管，力B入30pLElutionbuffer,37。C保温2min，12000rpm离心lmin，收集离心液，贮存于-20'C。(2)目的基因pen片段克隆入pGEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T-pen将以上纯化的PCR产物克隆于pGEM-T载体，pGEM-T载体购自Promega公司。反应体系为2xLigationbuffer,5.0fiL;pGEM-T载体，0.5|iL;PCR产物，4.0fiL;T4DNAIigase，0.5pL;无加菌ddH20至10pL。在冰上混合上述液体，16'C连接15h。(3)质粒的转化①感受态细胞的制备采用冷氮化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。挑取单个￡.co"JM109菌落，接种于5mLLB培养基中，37°C、220rpm培养过夜，次日取上述菌液按比例l:100再接种于50mLLB培养液中，37°C，220rpm振荡，待菌液OD值为0.6时，取1.5mL菌液加入无菌的Eppendorf离心管中4,000rpm离心10min,弃上清。力Q入800|iL冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4,000rpm离心10min,弃上清。加入100pL冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，4'C保存，710天内使用。②质粒转化￡.co〃JM109感受态细胞取上述连接产物lOpL加入lOOpL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴60分钟，42'C热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入390nL新鲜LB液体培养基，37°C,150rpm轻摇，50min。取lOOpL菌液涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal，Promega公司产品)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，，Promega公司产品)和Amp抗性的LB平板上，37'C培养过夜，观察结果，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR和酶切鉴定。(4)重组质粒pGEM-T-pen的鉴定随机.挑取10个单克隆白斑，扩大培养后用质粒提取试剂盒(Qia'gen公司产品)抽提质粒。以质粒pGEM-T-pen为模板，表明用引物PEN1、PEN2扩增出与预测结果相符的片断，目的基因pen已克隆入pGEM-T载体中。PCR与酶切鉴定结果见附图2。重组质粒pGEM-T-pen经五coRI和Z6aI双酶切，得到约3000bp禾卩230bp的预期DNA片断，pGEM-T-pen经五coRI单酶切，得到单一约3230bp的预期DNA片断。(5)pen核苷酸序列测定质粒pGEM-T-penDNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pGEM-T-pen质粒经全自动测序分析，pen基因核苷酸序列为tacaggggcggttacacaggcccgatscccaggccaccacccattggaagaccaccgttc60agacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatc120aagttcggaagctgttgtcacttagtaaaagga153实施例2激发子Harpin基因hrp的扩增和克隆1.扩增引物的设计和合成根据激发子Harpin基因hrp序列和连接肽"GGSGSGGSSRGGSGS"的核苷酸序列，设计一对引物HRP1和HRPP2，HRP1禾卩HRPP2的核苷酸序列分别为上游引物HRPl:(SEQIDNo.5)线处为I位点)。下游引物HRP2:(SEQIDNo.6)5'GGCTGCAGAAGCTTTCAGGCCACAGCCTGGTTAGTCTG3，(下戈U线处为W"dIII和尸"I位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。2.目的基因hrp的PCR扩增以HRP1和HRPP2为引物，含激发子Harpin基因hrp的质粒pGEM-T-hrp为模板，PCR扩增含有连接肽核苷酸序列的hrpDNA片断，其5'端含有X6aI酶切位点。3'端含有///"dill和PWI酶切位点。PCR反应体系lOxreactionbuffer,5pL:1.5mMMgC12，3pL;0.2mMdNTP，l^L;20pmol上游引物Pl，l^L;20pmol下游弓l物P2，lpJL;5ULTaqDNA聚合酶1;模板6^L;加无菌水至终体积为50nL。PCR反应条件95°C,5min;94°C,30s;53°C，45s;72°C30s(35个循环)；72。C,5min。琼脂糖凝胶电泳结果如附图3所示。PCR扩增目的基因hrp产物经0.7%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下观察，有一约为1281bpDNA带，与目的基因hrp产物结果相符。3.目的基因hrp的克隆(1)目的基因hrp片段的回收方法同实施例1。(2)目的基因hrp片段克隆入pGEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T-hrp将以上纯化的PCR产物克隆于pGEM-T载体，pGEM-T载体购自Promega公司。反应体系为2x乙igationbuffer,5都L;pGEM-T载体，0.5^L;PCR产物，4.0(iL;T4DNAligase，0.5nL;无加菌ddH20至10(xL。在冰上混合上述液体，16'C连接15h。(3)质粒的转化方法同实施例1。(4)重组质粒pGEM-T-hrp的鉴定随机挑取10个单克隆白斑，扩大培养后用质粒提取试剂盒(Qiagen公司产品)抽提质粒。以质粒pGEM-T-hrp为模板，结果表明用引物HRP1、HRP2扩增出与预测结果相符的片断，目的基因已克隆入pGEM-T载体中。PCR与酶切鉴定结果见附图4。重组质粒pGEM-T-hrp经Z6aI和尸WI双酶切，得至lj约3000bp禾n1281bp的预期DNA片断，pGEM-T-hrp经PWI单酶切，得到单一约4281bp的预期DNA片断。(5)hrp核苷酸序列测定质粒pGEM-T-hrpDNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pGEM-T-hrp质粒经全自动测序分析，hrp核苷酸序列为atgcggggttCtC3tC3tC3tC3tC3tC5tggt3tggctsgcatgactggtggscagcs360atgggtcgggatctgtacgacgatgacgataaggatccaacccttatgcagagtctcagt120cttsacagcatgsgttcgttgcaaacctctgc3tcsttgttccccgtgtcgctcaacagc180gstgtgsgcgCC33C3CC3gcacttccagcaggctgtgatcgstcagctg240gttc己ggcgctgacccaaagtgggcsgctcgatgsaacctcaccgctcggcassstgctc300gccssggccatggctgcggstggcssgtcggctaacagcatcg3tgscatcsctgcatcg360ctcgacaagctgstccacgsasagctcggcaacaatttcggtgcctctgccggc3tcggc420gcgggtggcggtggcggtggcattggcggggcgggttctggttcgggtgtcggtggcggt"0ctgagcagcgacgcgggtgccgggcaatccgstctgatgagccaggtcctgs3cggcctc540ggcsasgccgtgctggscgatctgctgacaccgsgtggtgaaggcggssc33CCttttCC600agtga_tga_catgccgaccctggaaaaagtcgcccggttcstggacgacaacasggcccag660ttccctactcgggacggcggctcgtggstgsscgsgctgsaggsagacaatggcctgtat720gcacaggaaaccgctcagtttcgttcggctctcgacgtcattggtcaacagctcggccag780caacasggtgatgccagtggcgttaccagtggcggcggtctgggttcgcccgtgagtgac840eigctccctgggtaatcctgcaatcgatgccaacacaggtcccgcggccsaitggcaatgcc900agcgtcgacgtsggtcaactgatcggtcaactcatcgaccgtggtttgcagtcggtttcg960tcgggtggcggtctgggtacaccggtcgacaattcceicgcagccgacaggtggcscgcca1020gcggct33cccgacgggcaacgtgtccaatcaggacctgggtcssctgctgaacggcttg1080ctgcaacgcgggctggaagcgacgcttcaggatgctggcaacaccggcgccgacctgcaa1140tcgagcgctgcgcasgtggcagctcagctgatcaatgcgctgttgcaaggcaccaataac1200cagactaaccaggctgtggcctga1224实施例3pen-hrp融合基因的合成和基因工程菌林五.co〃OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)的构建1.重组质粒pGEM-T-pen-hrp的构建和鉴定用X6aI、I双酶切重组质粒pGEM-T-penDNA，用胶回收试剂盒回收、纯化目的3.2kbDNA片断。用Jr6aI、I双酶切重组质粒pGEM-T-hrpDNA，用胶回收试剂盒回收、纯化目的1.2kbDNA片断。再将3.2kbDNA片断与1.2kbDNA片断连接，16'C连接15h后，产物转化co//JM109感受态细胞，涂布于含lOOpg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37'C培养过夜。随机挑取10个阳性克隆，经扩大培养后，用质粒提取试剂盒抽提质粒，采用PCR和Z6flI、I酶切鉴定重组质粒pGEM-T-pen-hrp。以质粒pGEM-T-pen-hrp为模板，用引物PEN1、PEN2、HRP1禾BHRP2扩增出与预测结果相符的片断，表明目的基因pen-hrp已按照分子设计要求克隆入pGEM-T载体中。PCR与酶切鉴定结果如附图5。重组质粒pGEM-T-pen-hrpDNA经￡coRI+///"dIII双酶切，得到约3.0kb禾n1.4kb的二个DNA片断，pGEM-T-pen-hrpDNA经5coRI单酶切，得到单一约4422bp的DNA片断。重组质粒pGEM-T-pen-hrp的构建过程如附图6。3.重组表达质粒pET-pen-hrp的构建和鉴定用￡coRl、历"dm分别双酶切表达载体pET-32a(+)和重组质粒pGEM-T-pen-hrpDNA，分别用胶回收试剂盒回收、纯化目的DNA片断，再将1.4kb的pen-hrpDNA片断与pET-32a(+)DNA片断连接，16。C连接15h后，产物转化co/iOrigamiB(DE3)pLysS感受态细胞，涂布于含100ng/mL氨苄青霉素(Amp),34ng/mL氯霉素和15pg/mL卡那霉素的LB平板上，37'C培养过夜。随机挑取10个阳性克隆，经扩大培养后，用质粒提取试剂盒抽提质粒，PCR和￡coRI、//z'"dm酶切鉴定pET-pen-hrp重组表达质粒。以质粒pET-pen-hrp为模板，用引物PEN1、PEN2、HRP1和HRP2扩增出与预测结果相符的片断，表明目的基因己克隆入pET-32a(+)载体中。PCR与酶切鉴定结果如附图7。重组质粒pET-pen-hrpDNA经￡coRI+i/Z"dIII双酶切，得到约5875bp禾口1422bp的二个DNA片断，pET-penDNA经￡coRI单酶切，得到单一约7297bp的DNA片断。重组表达质粒pET-pen-hrp的构建过程如附图8。4.pen-hrp融合基因核苷酸序列测定质粒pET-pen-hrpDNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pET-pen-hrp质粒经全自动测序分析，结果表明6个His序列融合在pen基因前，pET-pen-hrp质粒在从5'到3'方向上依次含有pen基因、GGSGSGGSSRGGSGS连接肽编码序列和hrp基因，融合蛋白序列阅读框没有移码。pen-hrp融合基因的DNA序列如SEQIDNo.l所示。其中，融合蛋白编码区为第1-1422位，pen编码区为1-153，hrp编码区为199-1422，GGSGSGGSSRGGSGS连接肽编码区为154-198。该融合基因所编码的融合蛋白Penharpin的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，共473个氨基酸。上述所构建的含有质粒pET-pen-hrp的菌株为五.co/!'OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp),菌种保藏号CCTCCM208071。实施例4基因工程融合蛋白Penharpin的表达挑取用甘油保存的菌种五.co/;OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp),接禾中于含100yg/mLAmpicillin，34yg/mLchloramphenicol和15ug/mLkanamycin(sulfate)的LB液体培养基中，37°C，250r/min下振荡培养8-12h。次日按4%接种量接入新鲜含100lig/mLAmpicillin，34yg/mLchloramphenicol禾口15ug/mLkanamycin(sulfate)的2YT液体培养基中，37。C培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG(终浓度为0.4mM)，37'C下诱导表达，诱导后3h，4h，5h，6h分别取样，离心沉淀，去上清，加入300uLPBS(PH6.9)缓冲液，超声波破碎，12,000g离心10min,上清加入5XSDS-PAGE样品缓冲液，参照《分子克隆》进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R250染色检测分析表达结果。结果如附图9所示。10%SDS-PAGE电泳结果表明在IPTG诱导后基因工程菌株能够表达融合蛋白Penharpin,表达产物分子量与预期相符，约为65kDa。实施例5融合蛋白Penharpin的纯化(1)挑取用甘油保存的菌种￡.co//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)，接禾中于含100ug/mLAmpicilHn，34ug/mLchloramphenicol禾口15ug/mLkanamycin(sulfate)的LB液体培养基中，37°C，250r/min下振荡培养8-12h。次日按4%接种量接入新鲜含100ug/mLAmpicillin，34ug/mLchloramphenicol禾口15ug/mLkanamycin(sulfate)的2YT液体培养基中，37'C培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG(终浓度为0.4mM)，37。C下诱导表达，诱导表达4h后，5000g离心收集菌体。(2)重悬于BindingBufferpH7.920mmol/LTris-HCl,5mmol/LNaCl中，4'C，进行超声波破碎菌处理(处理30min，每次10s,间隔30s)。12，000g离心20min两次，收集上清，上清即为Penharpin融合蛋白的提取液。(3)N广+柱层析样品处理Penharpin融合蛋白的提取液经0.45Um的滤膜过滤，用lXBindingBuffer定容至100ml1^++柱层析样品。用10床1XBindingBuffer,20床无菌水清洗柱床；用10床1XChargeBuffer(5mMNiS04),结合Ni";再用10床1XBindingBuffer平衡柱床后，备用(l床即是柱内介质的体积)。样品经蠕动泵以循环方式通过Ni"+柱，使带有6XHis的蛋白样品流动相充分与Ni"柱中的N广+相结合，过夜后从Ni"柱出口收集未与N广+结合的样品(穿漏液)。分别采用50床1XBindingBuffer;75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni十+柱结合的非目的蛋白。用1XEluteBuffer(1M咪唑+0.5MNaCl+20mMTris'HClpH7.9)洗脱与Ni+十柱结合的目的蛋白，分部收集，lmL/管。1^++柱用lXEluteBuffer继续洗脱，洗样柱中全部蛋白；再用1XStripBuffer(lOOmMEDTA+0.5MNaCl+20mMTris'HClpH7.9)洗柱子。通过SDS-PAGE检验目的蛋白在洗脱液中的分布，参照《分子克隆》进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R250染色检测分析表达结果。结果如附图9所示。纯化样品经10%SDS-PAGE检测，有约为65kDa的单一条带。实施例6融合蛋白Penharpin纯化样品中蛋白质含量的确定将15mL经N广+柱洗脱、收集的融合蛋白Penharpin纯化样品装入经处理的透析袋中，放入盛有1000mLPBS缓冲液(PH6.9)烧杯中透析、过夜。以上操作均在4'C进行。用Bradford法确定融合蛋白Penharpin含量，用mg/mL标定。Bradford法具体操作如下(1)将0、1、2、3、4、5、6uLlmg/ml牛血清白蛋白(BSA)标准溶液依次加入酶标微孔板中，用PBS补足50uL。(2)向每孔中加入200ULBradford试剂工作液(0.1%考马斯亮蓝G250，5%乙醇，8.5%磷酸)。振荡、混匀后，室温放置2分钟。(3)用酶标仪测BSA蛋白各浓度的OD570值(入=570nm)。以BSA蛋白质浓度为横坐标，以BSA蛋白各浓度的OD570值为纵坐标制作标准曲线。(4)用同样方法测定样品的OD570值，用标准曲线中确定样品的浓度。实施例7融合蛋白Penharpin抗细菌的生物活性采用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。实验菌种包括金黄色葡萄球菌(5Y叩/^/oco""sa訓ws)、短小芽孢杆菌(5acz'〃ws;wotz7z^)、苏云金芽孢杆菌(5。"'肠Aw"'wg7.e"jz's)、枯草芽孢杆菌(5ac〃/ws附egafe〃'謂)、溶藻弧菌(附"'oa/g/"o/y"面)、畐U溶血弧菌(5/6r/o尸。ra/2e附0一cMS)、大肠杆菌JM109(五sc/zer/c/n'aco〃JM109)、铜绿假单胞菌(尸sewrfowo"osaerwg/wosa)、、鼠伤寒沙门氏菌(sa/OTO"e〃。"p/2i加Mn'M777)(中国典型培养物保藏中心提供)。培养细菌至对数生长期，测OD6qq，将菌浓度调整到2-7x105CFU/ml。用无菌微量加样器向无菌96孔微孔板中加入待测样品50uL，用肉汤培养基倍比稀释，再向各孔中加入50uL菌液，混匀，37。C培养12h。同时设阳性(氨苄青霉素，Amp)对照组、空白对照组。各孔分别加入5mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液10uL,继续培养4h。向各孔中加入90uLDMSO,混匀并使蓝色晶体充分溶解于DMSO中，测量ODs70。细菌存活率按下列公式计算。细菌存活率=(A570样品处理/A570空白处理)X100%。融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌的活性测定结果见表1。细菌存活率表明融合蛋白Penharpin对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有不同程度的抗细菌活性，对多种细菌均有一定的抑杀作用。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL,对金黄色葡萄球菌的抑杀率为22.8%、短小芽孢杆菌的抑杀率为40.4%、苏云金芽孢杆菌的抑杀率为31.2%、枯草芽孢杆菌的抑杀率为47.4%、溶藻弧菌的抑杀率为23.4%、副溶血弧菌的抑杀率为28.4%、大肠杆菌JM109的抑杀率为56.3%、铜绿假单胞菌的抑杀率为38.5%、鼠伤寒沙门氏菌的抑杀率为43.8%。表l融合蛋白Penharpiii抗细菌活性测定<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例8融合蛋白Penharpin抗真菌的生物活性采用噻唑蓝(MTT)法，检测融合蛋白Penharpin对真菌的活性。实验菌种——黑曲霉("/g")(中国典型培养物保藏中心提供)。28'C培养黑曲霉7天至长出孢子。用无菌水冲洗培养基表面，获得孢子悬液，将孢子浓度调整到2-7X105spores/mL。用无菌微量加样器向无菌96孔微孔板中加入待测样品50uL，用查氏培养基(査氏培养基200mL:NaN030.4g，K2HP040.2g,KC10.1g，MgSO40.1g，FeS04'7H200.004g，蔗糖6g)倍比稀释，再向各孔中加入50UL孢子悬液，混匀，28'C培养18h。同时设阳性(两性霉素，AmB)对照组、空白对照组。各孔分别加入5mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液10UL，继续培养4h。向各孔中加入90uLDMSO，混匀并使蓝色晶体充分溶解于DMSO中，测量OD5M。真菌存活率按下列公式计算。真菌存活率=(A570样品处理/A570空白处理)X100%。融合蛋白Penharpin对黑曲霉的活性测定结果见表2。黑曲霉菌存活率表明融合蛋白Penharpin对黑曲霉具有明显的抗菌活性。实验中融合蛋白Penharpin的终浓度为1.4pmol/mL,对黑曲霉具有抑杀作用，抑杀率为47.7%。表2融合蛋白Penharpin抗真菌活性测定<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例9融合蛋白Penharpin抗烟草花叶病毒感染的生物活性1.烟草花叶病毒(TMV)样品的制备取适量感染烟草花叶病毒(TMV)的烟草叶片，剪碎。将剪碎的叶片放入研钵中，加入少量的石英砂和0.2MPBS，在冰浴中彻底研磨。将研磨好的叶片组织离心，4'C4000rpm离心30min。取上清即为病毒粗提液。配置20%的蔗糖溶液。将20%蔗糖溶液加至离心管底层，将粗提纯的病毒悬浮液加在最上层。20,000g离心60min，弃上清液，取沉淀。沉淀充分悬浮于0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.4)中，12,000rpm离心20min，取上清液。将20°/0蔗糖溶液加至离心管底层，上清液加在最上层。20,000g离心60min,弃上清液，取沉淀。沉淀充分悬浮于0.01mo/LPBS缓冲液(pH7.4)中，12,000rpm离心20min,取上清液。上清液20,000g离60min,取沉淀。沉淀悬浮于适量0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.4)中，即为纯化的TMV病毒样品。在透射电镜下观察所获得的烟草花叶病毒(TMV)。2.融合蛋白Penharpin对烟草花叶病毒(TMV)感染的预防作用取长势一致的盆栽烟草植株，随机分为三组(A、B、C)，每组9个样本。A、B、C各组分别涂抹PBS、2pmol/mL激发子Harpin样品和2pmol/mL融合蛋白Penharpin样品。涂抹各样品5天后，以常规摩擦接种法接种TMV。接种后观察记录样本的发病情况。烟草对烟草花叶病毒(TMV)感染按下述标准分级别(1)0级无任何症状(2)1级明脉或心叶有轻微花叶(3)3级心叶及中部叶片花叶(4)5级心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形，皱縮或植株轻度矮化(5)7级重花叶，多数叶片畸形，皱縮或植株明显矮化(6)9级重花叶，畸形，植株明显矮化甚至死亡烟草对烟草花叶病毒(TMV)感染的发病率、病情指数、相对防效分别按下列公式计算。发病率(％)=(各处理样本发病数/各处理总样本数)X100病情指数-E(病级数X病样本数)/(最高病级X各处理总样本数)X100相对防效(％)=[(对照平均病情指数一处理平均病情指数)/对照平均病情指数]xioo融合蛋白Penharpin对烟草花叶病毒(TMV)感染的预防作用试验结果见表3。涂抹融合蛋白Penharpin、激发子Harpin5d后，再接种TMV,则烟草植株的病情指数和发病率均较PBS对照有较大幅度的减少，相对防效分别为76.6%和38.7%,发病率分别减少了70%和33.3%。结果表明融合蛋白Penharpin、激发子Harpin均可预防烟草花叶病毒(TMV)对烟草的侵染，并且融合蛋白Penharpin的对预防烟草花叶病毒(TMV)感染烟草的效果较激发子Harpin好。表3融合蛋白Penharpin对烟草花叶病毒感染的预防作用测定<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>3.融合蛋白Penharpin对烟草感染烟草花叶病毒(TMV)的治疗作用取长势一致的盆栽烟草植株，随机分为三组(A、B、C)，每组9个样本。等量接种TMV。接种5d后，A、B、C各组分别涂抹PBS、2pmol/mL激发子Harpin样品和2pmol/mL融合蛋白Penharpin样品。接种后观察并记录发病情况。TMV感染分级别标准、发病率，病情指数和相对防效的计算方法同上述2。融合蛋白Penharpin对感染烟草花叶病毒(TMV)的烟草的治疗作用试验结果见表4。试验结果表明，融合蛋白Penharpin和激发子Harpin对TMV的感染均有一定的治疗效果，病情指数较对照降低，其相对防效分别为M.6%和14.0%,融合蛋白Penharpin对治疗感染TMV的烟草的相对防效略高于激发子Harpin。表4融合蛋白Penharpin对烟草感染烟草花叶病毒的治疗作用测定<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>实施例10融合蛋白Penharpin诸导烟草的过敏反应测定采用叶片穿刺法测定融合蛋白Penharpin诱导烟草的过敏反应。不锈钢毫针用酒精棉球擦拭，并在酒精灯上灼烧，待冷却后在烟叶叶面穿刺小孔，将处理好的样品20ul，分别点加在上述小孔上，控制水渍斑直径为2cm，标明各孔处理。采用重组基因工程菌株五.co/z'OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp)经诱导表达，制备融合蛋白Penharpin的提取液样品。以五.co/z'OrigamiB(DE3)pLysS(pET-hrp)经诱导表达，制备激发子Harpin提取液样品。设五.co//OrigamiB(DE3)pLysS(pET)经诱导表达所制备的提取液样品，以及PBS(5mmol/L，pH6.5)为对照。穿刺处分别点上述融合蛋白Penharpin的提取液样品、激发子Harpin提取液样品、￡.co〃OrigamiB(DE3)pLysS(pET)提取液样品和PBS样品。将烟草置20'C-25°C温室培养，分别于12h、24h、36h和48h后观察叶片反应及反应程度。12h后，融合蛋白Penharpin和激发子Harpin样品穿刺点样的孔周围出现萎縮，24h后出现塌陷，36h后出现枯斑，而对照PBS无此现象。融合蛋白Penharpin在烟草叶片上诱导产生的过敏反应结果见图10。试验结果表明融合蛋白Penharpin和激发子Harpin均能引起烟草的过敏反应。将融合蛋白Penharpin和激发子Harpin样品处理组相比较，融合蛋白Penharpin处理组所引发的过敏反应较激发子Harpin处理组的反应程度强，￡.co/z'OrigamiB(DE3)pLysS(pET)提取液样品处理组和PBS处理组均无反应。实施例11融合蛋白Penharpin对防御性物质的i秀导作用过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)都是植物防卫反应中起重要作用的酶，通过测定POD和SOD，确定融合蛋白Penharpin对烟草叶片中防御性物质POD和SOD的诱导作用。1.样品处理'取三株健康的烟草，并分别涂抹三组样品A,PBS缓冲液；B,2pmol/mL激发子Harpin样品；C，2pmol/mL融合蛋白Penharpin。在涂抹后0h，2h,4h，6h,8h，10h，12h,14h，采集烟叶叶片样品，称重，置于EP管中，-20'C保存备用。2.过氧化物酶(POD)活性的测定参照Hydo方法进行(HydoHetaI.1971)。向样品EP管中加入100w150mMpH6.8PBS研磨。4°C,12000rpm离心5min，上清即为酶粗提液。反应体系为15ul酵粗提液，300^10.3%H2O2，285u10.2%愈仓寸木酷，300pl0.1MpH6.8PBS。所设对照不加酶，力HpH6.8PBS。25'C水浴10min，反应后立即冰浴，加300U120%三氯乙酸终止反应。测OD450,并记录。烟草叶片经过融合蛋白Penharpin涂抹处理后，过氧化物酶(POD)活性增加。过氧化物酶(POD)活性测定结果见图11。烟草叶片POD活性在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第10h时达到峰值，约为初始值的1.8倍，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片POD的活性也在第10h达到峰值，约为初始值的1.5倍。PBS处理组的酶活无明显变化。融合蛋白Penharpin处理组与激发子Harpin处理组相比，融合蛋白Penharpin处理组的叶片的POD酶活在各个时间点均高于激发子Harpin处理组。3.超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定釆用NBT(氯化硝基氮兰四唑)光还原反应法，测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性。向样品EP管中加入lOOu150mMpH7.8PBS缓冲液研磨。4°C12000rpm离心5min。上清即为酶粗提液。反应体系为10u1酶粗提液；60u1220mM甲硫氨酸；60nl1.25mMNBT;60ul0.33mM核黄素；810^1pH7.8PBS。所设对照不加酶，加pH7.8PBS缓冲液。25°C，40001ux光照下反应20min，反应后立即黑暗终止反应。测OD570,并记录。烟草叶片经过融合蛋白Penharpin涂抹处理后，超氧化物歧化酶(SOD)的活性增加。融合蛋白Penharpin诱导SOD，SOD活性测定结果见图12。SOD在经过融合蛋白Penharpin处理后4h即开始升高，在第6h时达到峰值，为初始值的1.5倍，然后逐渐回落，到第14h时酶活值回落到接近初始水平。激发子Harpin处理的叶片SOD的活性在第10h达到峰值，约为初始值的1.2倍。PBS处理组的酶活无明显的变化。与激发子Harpin处理组相比，.融合蛋白Penharpin处理组的叶片的SOD酶活在较短时间内达到最大。SEQUENCELISTING(1)一般信息-(i)发明名称融合蛋白Penharpin及制备方法和用途(ii)序列数目6(2)SEQIDNo.1的信息<110>武汉大学融合蛋白Penharpin及制备方法和用途融合蛋白Penharpin核苷酸序列2Patentlnversion3.111422腿重组DNA<120〉<130><160><170><210><211>〈212〉<213><220〉〈221〉<222><223><220><221><222〉<223>〈220〉<221>〈222><223>〈220><221><222〉<223〉〈400〉tsc鄉TyrArg13g3ccaArgProteagatSerAspgtsEiaaValLysCDS(1).pen(i)..(1422)gene(153)linkerDNA(154)..(198)hrpgene(199)..(1422)1ggcGlyccgProgetAla35ggaGlyggtGlyttcPhe20cgcArgggtGlytacTyr5agaArgaatAsnggcGlyacaggcccgThrGlyProcctgtttgcProValCystgctgcateCysCyslie40tctggatctSerGlySer3t3ccc3gglieProArg10aatgcatgcAsnAlaCys25aagttcggaLysPheGlyggcggttctGlyGlySerccaccacccProProProtacagacttTyrArgLeu30agetgttgtSerCysCys45tctagaggtSerArgGlyattlie15tecSercacHisggcGlyggaGlygtcValttaLeutctSer4896144192<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>ThrctgLeu305ggtGlyArg290tatTyrcaaGinAspGlyGlySerTrpMetAsnGluLeuLysGluAspAsnGly295gctcagtttcgtAlaGinPheArggcaAlacagGinggcggcggtGlyGlyGlygcaAlaAspgttVal385ccgProateliegtsVal370tcgSer3caThrcaggacctgGinAspLeugcgAlagctAlaaatAsn4653CgThrgcgAla450AsncttLeu435GincagGincaggaaGinGlugat.Asp355ggtGlytcgSerggtGlyetcggcLeuGly325ctgggtLeuGly340gccaacAlaAsncaBctgGinLeuggtggcGlyGlyggcacgGlyThr405ggtcaBGlyGin420caggatGinAspgtggesValAlaactsacThrAsn3CCThr310cagGinC33GintcgcccSerProac3ggtThrGlyc犯ggtGinGlygtgagtValSer3tClieggtGly390ccaProggtGly375ctgLeugcgAlactgctgLeuLeugctggcAlaGlygctAlacagGin470C3gGin455gctAlacccPro360c犯Gin345gcgAlaetcLeug3tAsp330gacAspgccAlaateliegctAla犯cAsn犯cAsn440ctgLeuaacAsnggcGly425accThratelietcgSer315gccAla乙ys300gctAlaetcLeugacAspgtcVal3gtSeragetecSerSer肪tggcAsnGlyggtacEiccgGlyThrProccgPro410ttgLeuggcGlyaatAsngacAspgtcVal395acgThrctgLeugccAlagcgAlacgtArg380gacAspggcGlyCEiaGinAspctgLeu柳gtggcctgaValAlaggcGlyctgLeuaatAsn365ggtGlygttValggtGly350gccAlattgLeu犯ttecAsnSeraacgtgAsnValcgcArgctgLeu445ttgLeugggGly430GincaaGin3CCThr335aatAsnageSerceigGinacgThrtecSer415ctgLeuattlie320agtSercctProgtcValtcgSercagGin400satAsngaaGlutcgageSerSerggcaccGlyThr9601008105611041152120012481296134413921422<210〉2<211>473〈212〉PRT<213〉重组DNA〈柳〉2TyrArgGlyGlyTyrThr15ArgProProPheArgProGlyValProCyslieAsnPro10AlaArgCysProTyrProArgProLeulie15SerGlyValSerAspAla35GlyValLys50GlySer65MetThrLysAspLeuGinSerAla130GinLeu145ProLeuAlaAsnGluLysGlyGly210GlyGly225GinValProSerLeuGluThrArg290LeuTyr305GlyGinGlyGlyAlalieAspValMetGlyProThr115AsnValGlySerLeu195GlyLeuLeuGlyLys275AspAlaGinGlyAsp355Gly20ArgGlyArgGlyThr訓SerThrGinLyslie180GlyGlySerAsnGlu260ValGlyGinLeuLeu340AlaGinAsnGlyGlyGin85LeuAlaSerAlaMet165AspAsnGlySerGly245GlyAlaGlyGluGly325GlyAsnLeuCysSerSer70GinMetSerThrLeu150LeuAspAsnlieAsp230LeuGlyArgSerThr310GinSerThrlieCysGly55HisMetGinLeuSer135ThrAlaliePheGly215AlaGlyThrPheTrp295AlaGinProGlyGlylie40SerHisGlySerPhe120SerGinLysThrGly200GlyGlyLysThrMet280MetGinGinValPro360Gin25LysGlyHisArgLeu105ProLysSerAlaAla185AlaAlaAlaAlaPhe265AspAsnPheGlySer345AlaLeuPheGlyHisAsp90SerValGluGlyMet170SerSerGlyGlyVal250SerAspGluArgAsp330AspAlalieGlySerHis75LeuLeuSerL>euGin155AlaLeuAlaSerGin235LeuSerAsnLeuSer315AlaSerAsnAspSerSer60HisTyrAsnLeuLys140LeuAlaAspGlyGly220SerAspAspLysLys300AlaSerSerGlyArgCys45ArgGlyAspSerAsn125AlaAspAspLyslie205SerAspAspAspAla285GluLeuGlyLeuAsn365Gly30CysGlyMetAspMet110SerValGluGlyLeu190GlyGlyLeuLeuMet270GinAspAspValGly350AlaLeuHisLeuGlySerAlaSer80AspAsp95SerSerAspVallieAspThrSer160LysSer175lieHisAlaGlyValGlyMetSer240LeuThr255ProThrPheProAsnGlyVallie320ThrSer335AsnProSerValGinSer370ValSer385ProThrGinAspAlaThrAlaAla450AsnAsn465SerGlyLeuLeu435GinGinGlyGlyGly420GinValThrGlyThr405GinAspAlaAsnGly390ProLeuAlaAlaGin470375LeuAlaLeuGlyGin455AlaGlyAlaAsnAsn440LeuValThrAsnGly425ThrlieAlaProPro410LeuGlyAsn380ValAsp395ThrGlyLeuGinAlaAspAlaLeu460AsnAsnArgSerThrGin400ValSerAsn415GlyLeuGlu430GinSerSerLeu445LeuGinGlyThr(3)SEQIDNo.2的信息:<110>武汉大学〈120〉融合蛋白Penharpin及制备方法和用途<130>融合蛋白Penharpin氨基酸序列<160>1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>473<212>PRT<213〉多肽<220><221>PenharpinPEPTIDE<222>(1)..(473)<223〉<220><221>Pen-2PEPTIDE<222>(1)..(51)〈223>〈220〉<221>linkerPEPTIDE<222〉(52)..(66)〈223><220>〈221〉HarpinPEPTIDE〈222>(67)..(473)<223〉<400>1TyrArgGlyGlyTyrThrGlyProlieProArgProProProlieGly151015ArgProProPheArgProValCysAsnAlaCysTyrArgLeuSerValSerValGly65MetLysLeuSerGin145ProAlaGluGlyGly225GinProLeuThrLeu305GlyGlyAlaAspAspLys50SerThrAspGinAla130LeuLeuAsnLysGly210GlyValSerGluArg290TyrGinGlylieValAla35GlyMetGlyProThr115AsnValGlySerLeu195GlyLeuLeuGlyLys275AspAlaGinGlyAsp355Gly20ArgAsnCysCysGlyArgGlyThr100SerThrGinLyslie180GlyGlySerAsnGlu260ValGlyGinLeuLeu340AlaGinGlySerGly55GlySerHis70GinGinMet85MetGinLeuAlaSerAlaMet165AspAsnGlySerGly245GlyAlaGlyGluGly325GlyAsmLeuSerThrLeu150LeuAspAsnlieAsp230LeuGlyArgSerThr310GinSerThrlieLeuSer135ThrAlaliePheGly215AlaGlyThrPheTrp295AlaGinProGlyGlylie40SerHisGlySerPhe120SerGinLysThrGly200GlyGlyLysThrMet280MetGinGinValPro360Gin25LysGlyHisArgLeu105ProLysSerAlaAla185AlaAlaAlaAlaPhe265AspAsnPheGlySer345AlaLeuPheGlyHisAsp90SerValGluGlyMet170SerSerGlyGlyVal250SerAspGluArgAsp330AspAlalieGlySerHis75LeuLeuSerLeuGin155AlaLeuAlaSerGin235LeuSerAsnLeuSer315AlaSerAsnAspSerSer60HisTyrAsnLeuLys140LeuAlaAspGlyGly220SerAspAspLysLys300AlaSerSerGlyArg30CysCysHisLeu45ArgGlyGlySerGlyAspSerAsn125AlaAspAspLyslie205SerAspAspAspAla285GluLeuGlyLeuAsn365GlyMetAlaSer80AspAspAsp95SerSerMet110SerValGluGlyLeu190GlyGlyLeuLeuMet270GinAspAspValGly350AlaLeuAspVallieAspThrSer160LysSer175lieHisAlaGlyValGlyMetSer240LeuThr255ProThrPheProAsnGlyVallie320ThrSer335AsnProSerValGinSer370375380ValSerSerGlyGlyGlyLeuGlyThrProValAspAsnSerThrGin385390395400ProThrGlyGlyThrProAlaAlaAsnProThrGlyAsnValSerAsn405410415GinAspLeuGlyGinLeuLeuAsnGlyLeuLeuGinArgGlyLeuGlu420425430AlaThrLeuGinAspAlaGlyAsnThrGlyAlaAspLeuGinSerSer435440445AlaAlaGinValAlaAlaGinLeulieAsnAlaLeuLeuGinGlyThr450455柳AsnAsnGinThrAsnGinAlaValAla465470(4)SEQIDNo.3的信息:<110>武汉大学<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途〈130〉引物PENl核苷酸序列〈160〉1<170〉Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉26<212>腿〈213>寡核苷酸<400〉1gtgaattctacaggggcggttacaca26(5)SEQIDNo.4的信息:<110>武汉大学〈120〉融合蛋白Penharpin及制备方法和用途<130>引物PEN2核苷酸序列<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>48<212〉DNA<213〉寡核苷酸〈400〉1ggtctagaagaaccgccagatccagagccacctccttttsctaagtga48(6)SEQIDNo.5的信息:<110>武汉大学<120>融合蛋白Penharpin及制备方法和用途<130〉引物HRPl核苷酸序列<160>1〈170>Patentlnversion3.1<210>1〈211〉43<212〉腿〈213〉寡核苷酸<400>1ggtctagaggtggctctggatctatgcggggttctcatcatea43(7)SEQIDNo.6的信息<110>武汉大学<120〉融合蛋白Penharpin及制备方法和用途<130>引物HRP2核苷酸序列<160>1〈170〉Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉38〈212〉纖〈213>寡核苷酸<400>1ggctgcagaagctttcaggccacagcctggttagtctg38权利要求1.一种融合蛋白Penharpin，其特征在于，该蛋白具有对虾肽Pen-2的氨基酸序列、激发子Harpin的氨基酸序列、以及位于对虾肽Pen-2的氨基酸序列与激发子Harpin的氨基酸序列之间的连接肽序列。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述的连接肽序列由1-20个氨基酸构成。3.根据权利要求1所述的融合蛋白Penharpin，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。4.一种分离的DNA分子，其特征在于该DNA分子编码权利要求1所述的融合蛋白Penharpin。5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于所述的DNA分子的核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。6.—种载体，其特征在于包含权利要求4所述的DNA分子。7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于包括重组表达质粒载体pET-pen-hrp。8.—种宿主细胞，其特征在于包含权利要求6所述的载体。9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于包括一种重组基因工程菌株五^eWc/2faco//OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen-hrp),CCTCCNo:M208071。10.—种产生权利要求1所述的融合蛋白Penharpin的方法，其特征在于该方法包括以下步骤培养权利要求8所述的宿主细胞，在能表达所述的融合蛋白条件，其中包括诱导或非诱导条件下，表达所述的融合蛋白Penharpin,然后分离、纯化该融合蛋白Penharpin。11.一种药物组合物，其特征在于该组合物包含有效剂量的权利要求1所述的融合蛋白Penharpin。12.权利要求l所述的融合蛋白Penharpin或权利要求11所述的药物组合物在防治植物病害中的应用。13.—种融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗细菌感染的药物中的应用。'14.一种融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗真菌感染的药物中的应用。15.—种融合蛋白Penharpin在制备治疗或预防抗病毒感染的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种融合蛋白Penharpin及制备方法和用途，编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白Penharpin的方法，以及含该融合蛋白的药物组合物。融合蛋白Penharpin同时具有对虾肽Pen-2和激发子Harpin的活性，即具有抗细菌、真菌和病毒等微生物的生物活性，同时具有诱导烟草过敏反应的生物功能，能诱导植物中防御性物质，如过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)。融合蛋白Penharpin可以用于如细菌、真菌和病毒等微生物感染的植物病害的防治，对植物病害有良好的防治效果，并能诱生和提高植物的抗病能力、促进植物的生长、提高农作物产量。文档编号A61P31/00GK101284876SQ200810047840公开日2008年10月15日申请日期2008年5月28日优先权日2008年5月28日发明者菡夏,孟小林,徐进平,健王,伟鲁申请人:武汉大学