专利名称：表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法。
背景技术：
hrp基因簇存在于多种植物致病性细菌中，它编码的Harpin蛋白是细菌致病性必需的一种蛋白，但对非寄主植物，它可引起植物的超敏感反应(Hypersensitive response)，其表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡，这就限制病原菌进一步扩散的可能性。超敏感反应是植物自身具有的一种保护反应，类似于高等动物所具有的广谱抗病菌虫害的免疫反应。Harpin蛋白本身对细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫无杀灭或抑制作用，而是通过与植物受体结合后产生某种信号，刺激或诱导植物自身的免疫机制来保护植物。因此用Harpin蛋白作为抗菌抑菌剂具有不污染环境、不产生抗性等优点，具有很大的市场潜力。
对于Harpin蛋白广谱抗菌的分子机理正处于研究阶段，现已知Harpin蛋白至少激活了3种植物信号转导途径，包括水杨酸依赖途径，乙烯/茉莉酮酸依赖途径和一种典型的抗细菌途径。通过这些途径诱导表达的与植物防御有关的基因包括PR1、PR2(水杨酸依赖途径控制)和PDF1.2、Thi2.1(乙烯/茉莉酮酸依赖途径控制)等。
Harpin蛋白必须首先与植物表面的受体结合才能激活植物自身的防御功能。这种受体首先在植物Arabidopsis中发现，命名为HrBP1，它全长284个氨基酸，分子量30kD，其后在其它12种单子叶和双子叶植物中发现了类似于HrBP1的蛋白，其氨基酸序列具有较高的保守性。国外现在对Erwinia amylovora，Pseudomonas syringae，Ralstoniasolanacearum，国内对Xanthomonas oryzae pv.oryzae中的hrp基因中的结构和功能进行了研究。
Harpin蛋白还具有促进植物生长和发育的功能。研究表明Harpin蛋白可以增强植物的光合作用，利于营养物质的摄取，因此可以促进种子萌发和植株发育，提高作物的产量和质量，增大植株个体，利于植物的早熟和结实。此外还有研究发现Harpin蛋白可以提高蔬菜、水果抗腐烂、霉变能力，延长贮藏时间。对这一现象的机制研究还不透彻，可能与细胞壁修饰基因，生长时相调节基因有关。
Harpin蛋白可以作为抗菌抑菌剂的活性成份广泛的应用于作物保护，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括主要的农作物和经济作物、蔬菜等。比如大米、小麦、大麦、黑麦、棉花、玉米、花生、甘薯、大豆、豌豆、莴苣、大蒜、甘蓝、甜菜、萝卜、菠菜、 洋葱、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、黄瓜、苹果、梨子、柑橘、草莓、葡萄、菠萝、烟草、番茄、高粱、甘蔗等；还包括一些装饰性植物如非洲堇、矮牵牛花、天竺葵、猩猩木、菊花、康乃馨、百日菊等。
Harpin蛋白应用于作物保护，具有不污染环境、对人畜安全，不产生抗药性等特点。能抑制或杀灭由细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫导致的对植物产生的侵染和侵害，是一种新型的抗菌抑菌剂。可用于防治假单胞菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属等引起的细菌类疾病；镰孢属、疫霉属等引起的真菌类疾病；烟草花叶病毒和番茄花叶病毒等植物病毒类疾病。还可以增强植物的光合作用，利于营养物质的摄取，具有促进植物生长和发育的功能。此外，对于农作物、蔬菜害虫如棉铃虫、甜菜夜蛾、菜青虫等也有一定的趋避和控制作用。
目前Harpin蛋白的获得可以有两种方法，一是从植物致病性细菌培养物中提取该蛋白，但工艺复杂，收获量小，价格高，远远不能满足市场需要；二是用基因工程的方法，即通过基因工程菌株发酵，大量生产具有生物活性的Harpin蛋白，作为植物抗菌抑菌剂的活性成分应用于作物保护。现在国内外报道的生产Harpin蛋白都以大肠杆菌为最终表达载体，需要用IPTG为诱导物促进目标蛋白的表达，该诱导物价格较贵，工业化生产成本较高。生产Harpin蛋白以酵母为最终表达载体的未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法。本发明涉及的是一种新型的hrp基因表达载体的构建，能够高效的，稳定的，低成本的表达出hrp基因蛋白，用于增强植物的抗逆能力，提高作物的产量和质量，有效防治病虫害。
一种表达hrp基因编码蛋白的酵母基因工程菌株，其特征是该菌株为一种酿酒酵母，名称为Saccharomyces cerevisiae hrpZ，简称hrpZ，已保藏在中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NOM203004。
基因工程菌株hrpZ的构建方法一、基因组DNA的提取及hrpZ基因的分离和克隆1.基因组DNA的提取从土壤中分离鉴定一株假单胞菌Pseudomonas syringae，按照QIAGEN公司基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。
2.hrpZ基因分离以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)扩增分离hrpZ基因，PCR引物序列如下正向5’-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCA-3’反向5’-AGTTCTCCGTCAGGCGGTTGTC-3’PCR反应条件预变性92℃-95℃，1-2分钟变性 90℃-95℃，30-60秒复性 65℃-72℃，30-60秒延伸 65℃-72℃，1-3分钟循环 30-50个终止延伸64℃-69℃ 15-30分钟PCR产物通过1％琼脂糖电泳检测，回收片断大小约为1.5kb的PCR产物用于克隆表达；3.hrpZ基因的克隆通过低熔点琼脂糖回收片段大小适当的PCR产物，克隆至大肠杆菌E.coli表达载体pCRT7/NT-TOPO MCS(INVITROGEN公司)中，克隆方法参见载体说明书。通过限制性内切酶Nde I、Hind III酶切鉴定构建的重组质粒。
感受态大肠杆菌细胞的制备和转化方法如下从35℃-38℃培养16-20hr的新鲜LB平板中取E.coli BL21单菌落，置3ml LB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶50-150比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD600＝0.3-0.5)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至4℃-7℃时，4,000rpm离10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞。所制感受态细胞置4℃冰箱，并在12-24hr内使用。
在100μl E.coli BL21菌株感受态细胞中加入8μl待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃冰浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入90μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.5g，250mMKCl10ml，5M Na0H调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm培养12-16小时后观察转化结果。
4.序列测定将hrpZ基因定向克隆至质粒pHP10中，使用INVITROGEN公司提供的正向和反向引物进行序列测定分析，hrpZ基因的核苷酸序列为
ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGAIAAGGATCCAACCCTTATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCATGAGTTCGTTGCAAACCTCTGCATCATTGTTCCCCGTGTCGCTCAACAGCGATGTGAGCGCCAACACCAGCACTTCCAGCAAAGAGCTCAAGGCTGTGATCGATCAGCTGGTTCAGGCGCTGACCCAAAGTGGGCAGCTCGATGAAACCTCACCGCTCGGCAAAATGCTCGCCAAGGCCATGGCTGCGGATGGCAAGTCGGCTAACAGCATCGATGACATCACTGCATCGCTCGACAAGCTGATCCACGAAAAGCTCGGCAACAATTTCGGTGCCTCTGCCGGCATCGGCGCGGGTGGCGGTGGCGGTGGCATTGGCGGGGCGGGTTCTGGTTCGGGTGTCGGTGGCGGTCTGAGCAGCGACGCGGGTGCCGGGCAATCCGATCTGATGAGCCAGGTCCTGAACGGCCTCGGCAAAGCCGTGCTGGACGATCTGCTGACACCGAGTGGTGAAGGCGGAACAACCTTTTCCAGTGATGACATGCCGACCCTGGAAAAAGTCGCCCGGTTCATGGACGACAACAAGGCCCAGTTCCCTACTCGGGACGGCGGCTCGTGGATGAACGAGCTGAAGGAAGACAATGGCCTGTATGCACAGGAAACCGCTCAGTTTCGTTCGGCTCTCGACGTCATTGGTCAACAGCTCGGCCAGCAACAAGGTGATGCCAGTGGCGTTACCAGTGGCGGCGGTCTGGGTTCGCCCGTGAGTGACAGCTCCCTGGGTAATCCTGCAATCGATGCCAACACAGGTCCCGCGGCCAATGGCAATGCCAGCGTCGACGTAGGTCAACTGATCGGTCAACTCATCGACCGTGGTTTGCAGTCGGTTTCGTCGGGTGGCGGTCTGGGTACACCGGTCGACAATTCCACGCAGCCGACAGGTGGCACGCCAGCGGCTAACCCGACGGGCAACGTGTCCAATCAGGACCTGGGTCAACTGCTGAACGGCTTGCTGCAACGCGGGCTGGAAGCGACGCTTCAGGATGCTGGCAACACCGGCGCCGACCTGCAATCGAGCGCTGCGCAAGTGGCAGCTCAGCTGATCAATGCGCTGTTGCAAGGCACCAATAACCAGACTAACCAGGCTGTGGCCTGAhrpZ基因编码的氨基酸序列为MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPTLMQSLSLNSMSSLQTSASLFPVSLNSDVSANTSTSSKELKAVIDQLVQALTQSGQLDETSPLGKMLAKAMAADGKSANSIDDITASLDKLIHEKLGNNFGASAGIGAGGGGGGIGGAGSGSGVGGGLSSDAGAGQSDLMSQVLNGLGKAVLDDLLTPSGEGGTTFSSDDMPTLEKVARFMDDNKAQFPTRDGGSWMNELKEDNGLYAQETAQFRSALDVIGQQLGQQQGDASGVTSGGGLGSPVSDSSLGNPAIDANTGPAANGNASVDVGQLIGQLIDRGLQSVSSGGGLGTPVDNSTQPTGGTPAANPTGNVSNQDLGQLLNGLLQRGLEATLQDAGNTGADLQSSAAQVAAQLINALLQGTNNQTNQAVA二、hrpZ重组酵母基因工程质粒的构建
1、基因来源用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自pHP 102、从pHP10中分离hrpZ基因用PCR的方法从pHP10中分离hrpZ基因，PCR引物如下正向5’CGTCTAGAACACCTTATGCAGAGTC 3’反向5’CGCGGCGCACCTCAGCTTCCTTT 3’PCR反应参数预变性92℃-95℃ 1-2分钟变性 92℃-94℃ 1-2分钟复性 52℃-55℃ 1-2分钟延伸 70℃-75℃ 1-2分钟循环 30-50个终止延伸70℃-75℃ 5分钟3、重组质粒的构建将琼脂糖电泳回收的PCR产物直接克隆至毕赤酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO(INVITROGEN公司)，转化大肠杆菌JM109，方法参见载体说明书。
4、包含hrpZ基因的重组质粒的验证通过内切酶Xba I酶切重组质粒，包含hrpZ基因的重组质粒将被切为hrpZ基因和载体两条带，大小分别为1.5kb和5.9kb，证明该重组质粒构建正确。
三、含hrpZ基因的酵母的转化和诱导1、酵母菌株研究用酵母为Saccharomyces cerevisiae。
2、酵母转化酵母转化过程如下(1)YPD培养基过夜培养酵母菌Saccharomyces cerevisiae，接种至新鲜的培养基中，培养至OD600值为0.5-0.7。
(2)离心收集细胞，用20ml缓冲液洗涤(9-11mM甘氨酸pH8.35，1M山梨醇，3％乙醇)。
(3)重悬细胞至2ml缓冲液中，分装。
(4)-80℃冻存。
(5)取200μl解冻的细胞加入1μg重组质粒DNA及50μg鲑鱼精子DNA载体。
(6)细胞解冻后应立即加入1ml转化缓冲液(18-22mM pH8.35甘氨酸，40％PEG1000)。
(7)30℃温浴1小时。
(8)离心收集细胞，沉淀用800μl细胞重悬缓冲液洗涤(10mMpH8.35甘氨酸，150mM NaCl)。
(9)离心收集细胞，沉淀重悬于300μl缓冲液中并涂布选择性培养基(尿嘧啶缺陷型酵母YPD培养基，依照INVITROGEN公司提供方法配制)。
3、酵母诱导(1)接种15ml含有1.5％-3％棉子糖或1.5％-3％葡萄糖的选择性培养基。
(2)过夜培养(3)沉淀菌体，洗涤2次。
(4)重悬菌体至含有1.5％-3％半乳糖的诱导性培养基中，菌体OD600值0.4。
(5)在第4、8、12、24小时取样检测hrpZ基因在酵母中的表达情况。
四、hrp基因工程蛋白的提取参见Sambrook等在《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)中的说明进行(1)培养并离心收集酵母菌细胞；以下所有步骤均在2℃-6℃进行。
(2)用1-2体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞。
(3)用2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠。
(4)将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中，并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘，但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积。装好搅拌杆和螺盖，确保将容器中所有空气排尽，高速搅拌60s，冰上放置1-2min，重复3-5次。
(5)沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清。加入2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5-10次，待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液。
(6)合并的上清液于4℃，12000g离心60min，收集上清即为抽提液。长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存。
SDS-PAGE电泳分析hrpZ基因的表达情况(1)凝胶的灌制参见Sambrook等《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀开灌胶，封一层0.1％SDS(二烷基硫酸钠)覆盖液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。
(2)上样及电泳在酵母诱导发酵液中加等体积2倍SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚蓝进分离胶，提高电压至150V，当溴酚蓝到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。
(3)固定、染色和脱色剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜(至少4小时以上)，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相。
(4)电泳结果如图2所示的hrpZ基因在酵母表达载体中的表达情况。
五、基因工程蛋白的活性测定室内采用叶片穿刺接种法检测基因工程Harpin蛋白的生物活性，即引发植物超敏感反应的能力。
材料和方法1供试烟草植株 武汉大学生科院基因工程药物及昆虫病毒分子生物学研究室盆栽苗，营养生殖期6-8真叶。
2.测定方法——点样测活法用不锈钢毫针，经75％酒精消毒后，酒精灯外焰灼烧、冷却，于选定的烟草真叶的叶尖区，用毫针垂直刺穿叶片，孔径1mm，每孔间隔2.0cm左右，依次刺上4-6个小孔。用10-100μl的移液器，移取待测样品各40μl，分别点加在烟草真叶已刺小孔上，画图依次标明各孔处理项目，重复2次，将点样的烟草植株置25℃的恒温室，管理、观察。
3.观察供试烟草点样叶片的超敏感反应每隔2小时对加样供试的烟草植株进行观察，观察加样部位有无萎缩、塌陷、枯死等现象反应。记录超敏感反应现象表现出的时间及程度。
本发明的有益效果是活性实验的结果表明，用该菌株生产的基因工程Harpin蛋白超敏感反应现象表现时间短，反应强烈，活性测定结果高于大肠杆菌表达载体表达的同类蛋白。这表明用酵母表达的该工程蛋白具有很强的生物活性。
在田间试验中，基因工程Harpin蛋白防治黄瓜细菌性角斑病防治效果达83.1％，对照化学农药为48.1％；对黄瓜花叶病毒病，基因工程Harpin蛋白的防治效果达100％，远远高于化学农药；对辣椒花叶病毒病和青枯病，基因工程Harpin蛋白的防治效果分别为95.7％、87.7％，均明显高于化学农药；防治茄子绵疫病，基因工程Harpin蛋白防效可达80.2％，明显优于化学农药的55.9％。
酵母表达过程中不需要价格较贵的诱导物。酵母工业化生产的技术路线成熟，适于工业化大生产。
图1 重组hrpZ酵母基因工程菌株构建流程图。
图2 hrpZ基因在酵母中的表达情况。
具体实施例方式
实施例1基因工程菌株HrpZ的构建方法一.基因组DNA的提取及hrpZ基因的分离和克隆1.基因组DNA的提取从土壤中分离鉴定一株假单胞菌Pseudomonas syringae，按照QIAGEN公司基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。
2.hrpZ基因分离以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板PCR扩增分离hrpZ基因，PCR引物序列如下正向5’-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCA-3’反向5’-AGTTCTCCGTCAGGCGGTTGTC-3’PCR反应条件预变性94℃ 1分钟变性 92℃ 45秒复性 66℃ 45秒延伸 68℃ 2分钟循环 30个终止延伸68℃ 20分钟PCR产物通过1％琼脂糖电泳检测，回收片断大小约为1.5kb的PCR产物用于克隆表达。
3.hrpZ基因的克隆通过低熔点琼脂糖回收片段大小适当的PCR产物，克隆至大肠杆菌表达载体pCRT7/NT-TOPO MCS(INVITROGEN公司，如图1)中，克隆方法参见载体说明书。通过限制性内切酶Nde I、Hind III酶切鉴定构建的重组质粒。
感受态大肠杆菌细胞的制备和转化方法如下从37℃培养16-20hr的新鲜LB平板中取E.coli BL21单菌落，置3ml LB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶100比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD600＝0.3-0.4)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至5℃时，4,000rpm离10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mo l/LCaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1 mol/L CaCl2重悬细胞。所制感受态细胞置4℃保藏，并在12-24hr内使用。
在100μl E.coli BL21菌株感受态细胞中加入8μl待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃冰浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入90μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl10ml，5M NaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm培养12-16小时后观察转化结果。
4.序列测定将hrpZ基因定向克隆至质粒pHP10中，使用INVITROGEN公司提供的正向和反向引物进行序列测定分析，hrpZ基因的序列测定结果如上所述。
二hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建基因来源用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自包含该基因的质粒pHP10。
1、从pHP10中分离hrpZ基因用PCR的方法从pHP10中分离hrpZ基因，PCR引物如下正向5’CGTCTAGAACACCTTATGCAGAGTC 3’反向5’CGCGGCGCACCTCAGCTTCCTTT 3’PCR反应参数预变性94℃ 1分钟变性 94℃ 1分钟复性 55℃ 1分钟延伸 72℃ 1分钟循环 30个终止延伸72℃ 5分钟2、重组质粒的构建将琼脂糖电泳回收的PCR产物直接克隆至毕赤酵母表达载体pYES2.1/V5-His-TOPO(INVITROGEN公司)，方法参见载体说明书。
3、包含hrpZ基因的重组质粒的验证通过内切酶XbaI酶切重组质粒，包含hrpZ基因的重组质粒将被切为hrpZ基因和载体两条带，大小分别为1.5kb和5.9kb，证明该重组质粒构建正确。
三酵母转化和诱导a酵母菌株研究用酵母为Saccharomyces cerevisiae。
b酵母转化酵母转化过程如下1、YPD培养基过夜培养酵母菌Saccharomyces cerevisiae，接种至新鲜的培养基中，培养至OD600值为0.6。
2、离心收集细胞，用20ml缓冲液洗涤(10mM甘氨酸pH8.35，1M山梨醇，3％乙醇)。
3重悬细胞至2ml缓冲液中，分装。
4、-80℃冻存。
5、取200μl解冻的细胞加入1μg重组质粒DNA及50μg鲑鱼精子DNA载体。
6细胞解冻后应立即加入1ml转化缓冲液(20mM pH8.35甘氨酸，40％PEG1000)。
7、30℃温浴1小时。
8、离心收集细胞，沉淀用800μl细胞重悬缓冲液洗涤(10mMpH8.35甘氨酸，150mM NaCl)。
9、离心收集细胞，沉淀重悬于300μl缓冲液中并涂布选择性培养基(尿嘧啶缺陷型酵母YPD培养基，依照INVITROGEN公司提供方法配制)。
c酵母诱导①接种15ml含有2％棉子糖或2％葡萄糖的选择性培养基。
②过夜培养③沉淀菌体，洗涤2次。
④重悬菌体至含有2％半乳糖的诱导性培养基中，菌体OD600值0.4。
⑤在第4、8、12、24小时取样检测hrpZ基因在酵母中的表达情况。
d基因工程蛋白的提取参见Sambrook等在《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)中的说明进行(1)培养并离心收集酵母菌细胞；以下所有步骤均在4℃进行。
(2)用1体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞。
(3)用2体积的玻璃珠破菌缓冲液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠。
(4)将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中，并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘，但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积。装好搅拌杆和螺盖，确保将容器中所有空气排尽，高速搅拌60s，冰上放置1-2min，重复3-5次。
(5)沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清，加入2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5-10次，待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液。
(6)合并的上清液于4℃，12000g离心60min，收集上清即为抽提液。长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存。
SDS-PAGE电泳分析hrp基因的表达情况(1)凝胶的灌制参见Sambrook等《分子克隆实验室手册》，(冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀开灌胶，封一层0.1％SDS(二烷基硫酸钠)覆盖液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。
(2)上样及电泳在酵母诱导发酵液中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚蓝进分离胶，提高电压至150V，当溴酚蓝到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。
(3)固定、染色和脱色剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜(至少4小时以上)，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相。
(4)电泳结果如图2所示的hrpZ基因在酵母表达载体中的表达情况。
权利要求
1.一种表达hrp基因编码蛋白的酵母基因工程菌株，其特征是该菌株为一种酿酒酵母，名称为Saccharomyces cerevisiae hrpZ，已保藏在中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NOM203004。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征是hrpZ基因的核苷酸序列为ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCCAACCCTTATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCATGAGTTCGTTGCAAACCTCTGCATCATTGTTCCCCGTGTCGCTCAACAGCGATGTGAGCGCCAACACCAGCACTTCCAGCAAAGAGCTCAAGGCTGTGATCGATCAGCTGGTTCAGGCGCTGACCCAAAGTGGGCAGCTCGATGAAACCTCACCGCTCGGCAAAATGCTCGCCAAGGCCATGGCTGCGGATGGCAAGTCGGCTAACAGCATCGATGACATCACTGCATCGCTCGACAAGCTGATCCACGAAAAGCTCGGCAACAATTTCGGTGCCTCTGCCGGCATCGGCGCGGGTGGCGGTGGCGGTGGCATTGGCGGGGCGGGTTCTGGTTCGGGTGTCGGTGGCGGTCTGAGCAGCGACGCGGGTGCCGGGCAATCCGATCTGATGAGCCAGGTCCTGAACGGCCTCGGCAAAGCCGTGCTGGACGATCTGCTGACACCGAGTGGTGAAGGCGGAACAACCTTTTCCAGTGATGACATGCCGACCCTGGAAAAAGTCGCCCGGTTCATGGACGACAACAAGGCCCAGTTCCCTACTCGGGACGGCGGCTCGTGGATGAACGAGCTGAAGGAAGACAATGGCCTGTATGCACAGGAAACCGCTCAGTTTCGTTCGGCTCTCGACGTCATTGGTCAACAGCTCGGCCAGCAACAAGGTGATGCCAGTGGCGTTACCAGTGGCGGCGGTCTGGGTTCGCCCGTGAGTGACAGCTCCCTGGGTAATCCTGCAATCGATGCCAACACAGGTCCCGCGGCCAATGGCAATGCCAGCGTCGACGTAGGTCAACTGATCGGTCAACTCATCGACCGTGGTTTGCAGTCGGTTTCGTCGGGTGGCGGTCTGGGTACACCGGTCGACAATTCCACGCAGCCGACAGGTGGCACGCCAGCGGCTAACCCGACGGGCAACGTGTCCAATCAGGACCTGGGTCAACTGCTGAACGGCTTGCTGCAACGCGGGCTGGAAGCGACGCTTCAGGATGCTGGCAACACCGGCGCCGACCTGCAATCGAGCGCTGCGCAAGTGGCAGCTCAGCTGATCAATGCGCTGTTGCAAGGCACCAATAACCAGACTAACCAGGCTGTGGCCTGAhrpZ基因编码的氨基酸序列为MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDPTLMQSLSLNSMSSLQTSASLFPVSLNSDVSANTSTSSKELKAVIDQLVQALTQSGQLDETSPLGKMLAKAMAADGKSANSIDDIFASLDKLIHEKLGNNFGASAGIGAGGGGGGIGGAGSGSGVGGGLSSDAGAGQSDLMSQVLNGLGKAVLDDLLTPSGEGGTTFSSDDMPTLEKVARFMDDNKAQFPTRDGGSWMNELKEDNGLYAQETAQFRSALDVIGQQLGQQQGDASGVTSGGGLGSPVSDSSLGNPAIDANTGPAANGNASVDVGQLIGQLIDRGLQSVSSGGGLGTFPVDNSTQPTGGTPAANPTGNVSNQDLGQLLNGLLQRGLEATLQDAGNTGADLQSSAAQVAAQLINALLQGTNNQTNQAVA
3.一种表达hrp基因编码蛋白的酵母基因工程菌株的构建方法，其特征包括一、基因组DNA的提取和hrpZ基因的分离与克隆；二、hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建；三、含hrpZ基因的酵母的转化和诱导；一、基因组DNA的提取和hrpZ基因的分离与克隆假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA的提取，以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板PCR扩增分离hrpZ基因；PCR扩增分离的hrpZ基因使用的载体为大肠杆菌载体pCRT7/NT-TOPO MCS，hrpZ基因克隆至质粒pHP 10中进行序列测定；二、hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自质粒pHP 10；用PCR的方法从pHP 10中分离hrpZ基因；使用直接克隆至毕赤酵母表达载体pYES2.1/V5-his-TOPO；三、含hrpZ基因的酵母的转化和诱导。
4.根据权利要求3所述的构建方法，hrpZ基因的分离和克隆，其特征是hrpZ基因分离，以假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA为模板PCR扩增分离hrpZ基因，PCR引物序列如下正向5’-ATGCAGAGTCTCAGTCTTAACAGCA-3’反向5’-AGTTCTCCGTCAGGCGGTTGTC-3’PCR反应条件预变性92℃-95℃，1-2分钟变性 90℃-95℃，30-60秒复性 65℃-72℃，30-60秒延伸 65℃-72℃，1-3分钟循环 30-50个终止延伸64℃-69℃ 15-30分钟PCR产物通过1％琼脂糖电泳检测，回收片断大小约为1.5kb的PCR产物用于克隆表达；hrpZ基因的克隆，通过低熔点琼脂糖回收片段大小适当的PCR产物，克隆至大肠杆菌表达载体pCRT7/NT-TOPO MCS中，通过限制性内切酶Nde I、Hind III酶切鉴定构建的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的构建方法，hrpZ基因的克隆，其特征是感受态大肠杆菌细胞的制备和转化方法如下从35℃～38℃培养16～20hr的新鲜LB平板中取E.coli BL21单菌落，置3ml LB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶50-150比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr，OD600＝0.3-0.5，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至4℃-7℃时，4,000rpm离心10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/LCaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞；所制感受态细胞置4℃冰箱，并在12-24hr内使用；在100μl E.coli BL21菌株感受态细胞中加入8μl待转化的连接产物DNA，DNA≤50ng，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃冰浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入90μl SOC培养液，培养液组成为蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl 0.5g，250mMKCl 10ml，5M NaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌；临用前加5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液；置37℃，150rpm培养12-16小时后观察转化结果。
6.根据权利要求3所述的构建方法，hrpZ重组酵母基因工程菌株的构建，其特征是基因来源用于构建酵母表达系统的hrpZ基因来自pHP 10；从pHP 10中分离hrpZ基因用PCR的方法从pHP 10中分离hrpZ基因，PCR引物如下正向5’CGTCTAGAACACCTTATGCAGAGTC 3’反向5’CGCGGCGCACCTCAGCTTCCTTT 3’PCR反应参数预变性92℃-95℃ 1-2分钟变性 92℃-94℃ 1-2分钟复性 52℃-55℃ 1-2分钟延伸 70℃-75℃ 1-2分钟循环 30-50个终止延伸70℃-75℃ 5分钟重组质粒的构建将琼脂糖电泳回收的PCR产物直接克隆至毕赤酵母，所用表达载体为pYES2.1/V5-His-TOPO；包含hrpZ基因的重组质粒的验证通过内切酶Xba I酶切重组质粒，包含hrpZ基因的重组质粒将被切为hrpZ基因和载体两条带，大小分别为1.5kb和5.9kb。
7.根据权利要求3所述的构建方法，含hrpZ基因的酵母的转化和诱导，其特征是酵母菌株研究用酵母为Saccharomyces cerevisiae，一、酵母转化酵母转化过程如下(1)、YPD培养基过夜培养酵母菌Saccharomyces cerevisiae，接种至新鲜的培养基中，培养至OD600值为0.5-0.7；(2)、离心收集细胞，用20ml缓冲液洗涤，缓冲液组成为9-11mM甘氨酸pH8.35，1M山梨醇，3％乙醇；(3)、重悬细胞至2ml缓冲液中，分装；(4)、-80℃冻存；(5)、取200μl解冻的细胞加入1μg重组质粒DNA及50μg鲑鱼精子DNA载体；(6)、细胞解冻后应立即加入1ml转化缓冲液，缓冲液组成为18-22mM pH8.35甘氨酸，40％PEG1000；(7)、30℃温浴1小时；(8)、离心收集细胞，沉淀用800μl细胞重悬缓冲液洗涤，缓冲液组成为10mM pH8.35甘氨酸，150mM NaCl；(9)、离心收集细胞，沉淀重悬于300μl缓冲液中并涂布选择性培养基，培养基为尿嘧啶缺陷型酵母YPD培养基；二、酵母诱导(1)、接种15ml含有1.5％-3％棉子糖或1.5％-3％葡萄糖的选择性培养基；(2)、过夜培养；(3)、沉淀菌体，洗涤2次；(4)、重悬菌体至含有1.5％-3％半乳糖的诱导性培养基中，菌体OD600值0.4；(5)、在第4、8、12、24小时取样检测hrpZ基因在酵母中的表达情况。
8.一种hrp基因工程蛋白的提取方法，其特征是(1)培养并离心收集酵母菌细胞；以下所有步骤均在2℃-6℃进行；(2)用1-2体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞；(3)用2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠；(4)将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中，并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘，但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积；装好搅拌杆和螺盖，确保将容器中所有空气排尽，高速搅拌60s，冰上放置1-2min，重复3-5次；(5)沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清，加入2-4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5-10次，待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液；(6)合并的上清液于4℃，12000g离心60min，收集上清即为抽提液；长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存；SDS-PAGE电泳分析hrpZ基因的表达情况(1)凝胶的灌制配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂N，N，N’，N’四甲基乙二胺，立即混匀并灌胶，封一层0.1％的二烷基硫酸钠覆盖液面，37℃下聚合30min，聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡；(2)上样及电泳在酵母诱导发酵液中加等体积2倍的二烷基硫酸钠凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚蓝进分离胶，提高电压至150V，当溴酚蓝到达底部前约1cm处结束电泳；(3)固定、染色和脱色剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相；(4)电泳结果得到hrpZ基因在酵母表达载体中的表达情况。
9.根据权利要求8所述的方法，提取的hrp基因工程蛋白的活性测定，其特征是基因工程蛋白的活性测定室内采用叶片穿刺接种法检测基因工程Harpin蛋白的生物活性，即引发植物超敏感反应的能力；材料和方法(1).供试烟草植株 武汉大学生科院基因工程药物及昆虫病毒分子生物学研究室盆栽苗，营养生殖期6-8真叶；(2).测定方法——点样测活法用不锈钢毫针，经75％酒精消毒后，酒精灯外焰灼烧、冷却，于选定的烟草真叶的叶尖区，用毫针垂直刺穿叶片，孔径1mm，每孔间隔2.0cm左右，依次刺上4-6个小孔，用10-100μl的移液器，移取待测样品各40μl，分别点加在烟草真叶已刺小孔上，画图依次标明各孔处理项目，重复2次，将点样的烟草植株置25℃的恒温室，管理、观察；(3).观察供试烟草点样叶片的超敏感反应每隔2小时对加样供试的烟草植株进行观察，观察加样部位有无萎缩、塌陷、枯死等现象反应，记录超敏感反应现象表现出的时间及程度。
全文摘要
表达hrp基因的酵母基因工程菌株及其构建方法，本发明涉及生物工程。该菌株名称为Saccharomycescerevisiae hrpZ，编号CCTCC NOM203004。该菌株的构建方法，包括假单胞菌Pseudomonas syringae基因组DNA的提取；以基因组DNA为模板PCR引物对hrp Z重组酵母基因工程菌株的构建；含hrpZ基因的酵母转化和诱导。用该菌株生产的基因工程harpin蛋白，该蛋白具有诱导植物超敏感反应，激活植物体内自我防御机制，促进植物生长。田间药效实验表明其对植物病虫害防治有良好的效果。通过酵母基因工程菌株发酵，大量生产具有生物活性的harpin蛋白，作为植物抗菌抑菌剂的活性成分应用于植物保护和促进植物生长，从而提高作物的产量和质量。
文档编号C12N5/10GK1454989SQ0310512
公开日2003年11月12日 申请日期2003年3月5日 优先权日2003年3月5日
发明者魏晨飞 申请人:江苏五彩精细化工股份有限公司