专利名称：：杏香兔耳风总酚酸提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种杏香兔耳风总酚酸提取物及其制备方法，属于天然药物有效成分制备领域。技术背景杏香兔耳风(AinsliaeafragransChamp.)是菊科兔耳风属植物，具有清热解毒、利湿、止血等功效，民间以全草入药，用于治疗肺结核吐血、跌打损伤、无名肿痛、空腔炎、水肿、慢性子宫颈炎等疾患，为《江西省中药材标准》1996年版收载，其成药复方杏香兔耳风颗粒及片为中药保护品种。有报道对金葡菌、乙型链球菌、脊髓灰质炎病毒、单纯疽疹病毒(HSV-1)、麻疹病毒等有抑制作用。现代研究表明，杏香兔耳风药材含酚类、黄酮类、有机酸类、倍半萜内酯类、三萜类等成分，其中包括绿原酸、咖啡酰奎宁酸、无羁萜酮、三十二垸酸、3-谷甾醇、黄酮类化合物柽柳素及其苷等，其中酚酸类化合物为其有效的抗病毒成分，绿原酸常作为兔耳风的质量控制指标。现有剂型中，兔耳风常是经粗步提取后直接制成单位机制，日服用量大。中国专利申请200510087008.7中，公开了一种制备兔耳风总有机酸的方法，其采用的是水提取浓缩后往浓縮液中加盐酸调pH，而在兔耳风药材中，存在一些剂性相对较小的有机酚酸类成分，在水中游离后溶解度不是很好，这样的提取操作会导致一些有效成分的损失。
发明内容本发明的目的在于提供一种制备杏香兔耳风总酚酸提取物的方法，本发明提取时采用乙醇提取，提取后的回收液在含乙醇约30%的情形下加盐酸调pH使酚酸类成分从中游离而溶于乙醇溶液中，克服了对一些极性相对较小的酚酸类成分不易溶解于水肿而随沉淀一起损失的缺陷，且最终提取物得率高，提取物中酚酸含量也有较大提高。本发明杏香兔耳风酚酸类提取物的制备方法可以通过如下方式制备而得，杏香兔耳风干燥药材，粉碎成粗粉，以40%-70%的乙醇提取，过滤，取滤液，滤液减压浓縮，加乙醇使溶液乙醇浓度为20°/。-40%，每毫升溶液相当于原药材0.8-1.0g，往溶液中加盐酸调pH至1.0-3.0，静置，冷处放置12-24小时，离心或过滤，取清液，清液减压浓縮至无醇，浓缩物加蒸馏水溶解分散，将分散物上以处理好的大孔吸附树脂柱上，先用去离子水洗脱至水洗液颜色变淡，改用含水乙醇洗脱，至酚酸显色反应呈阴性，收集乙醇洗脱液，合并，减压浓縮，干燥，即得兔耳风酚酸提取物。本发明中，在用盐酸调pH使酚酸完全游离时，优选将pH调至约l.O。本发明中，大孔吸附树脂柱所用填料可以选自AB-8型、NKA-9型、D-101型、HP-20型大孔树脂，洗脱树脂柱时，所使用的乙醇优选为70%的乙醇。采用本发明方法制备所得到的杏香兔耳风提取物中，提取物总酚酸含量大于60%，总酚酸中包括有机酚酸和一些黄酮类成分，提取物以绿原酸计，绿原酸的含量不低于l°/o，其含量范围为1%~5%之间，其含量的不同视不同产地的药材而不同，本发明采用江西产杏香兔耳风，其药材中绿原酸含量约为0.25%，所得提取物中，绿原酸含量约为3.6%。本发明中，提取总酚酸类成分的药材除可以为杏香兔耳风外，还可以是兔耳风属中的其它兔耳风药材。本发明提取物具有抗炎抗病毒的作用，可用于制备具有抗炎看病毒的药物。杏香兔耳风药材有效成分的具体提取方案为取杏香兔耳风干燥药材1000g，粉碎成粗粉，加8倍量的70%的乙醇回流提取3次，每次1.5小时、过滤，合并各次提取滤液，60'C减压浓縮，加乙醇调至浓縮液中，使药液最终含醇量约为30%，每毫升药液相当于杏香兔耳风原药材约0.9g，然后加1N的盐酸调pH至pH约为1.0，充分搅拌均匀，室温放置18小时，离心，取上清液，上清液继续减压浓縮至无醇，将浓縮物上已处理好的AB-8型大孔吸附脂柱，先以去离子水洗脱至水洗脱液颜色变淡，改用70%的乙醇洗脱，至FeCB显色反应呈阴性，合并70%的乙醇洗脱部分，减压浓縮，真空干燥，得杏香兔耳风酚酸提取物51.3g，依此法制备三批样品。提取物中绿原酸含量的测定。色谱条件色谱柱DiamonsilTMC180DS柱(5ym，200mmX4.6腿)，流动相甲醇-2%冰醋酸(20:80)，流速lml/min，检测波长327nm，柱温25°C，理论塔板数按绿原酸计不得低于3000.对照品、供试品的制备对照品溶液的配置精密称取绿原酸对照品适量，置棕色容量瓶中，加5(m的甲醇制成每毫升含30yg绿原酸；供试品溶液的配置精密称取杏香兔耳风提取物O.lg，置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，微孔滤膜过滤，备用。依次测定各批提取物中绿原酸含量，结果见表l表l三批杏香兔耳风提取物中绿原酸含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>三批样品中绿原酸在提取物中的平均含量为3.63%。提取物中总酚酸含量的测定。标准曲线的绘制精密称取干燥至恒重的原儿茶醛对照品10.4mg至50ml容量瓶中，加无水乙醇溶解，稀释至刻度。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、l.OmL至lOmL容量瓶屮，加无水乙醇至2mL，再分别加0.3%的十二烷基硫酸钠0.8mL及0.6%三氯化铁-0.9%铁氰化钾(1:0.9)混合溶液0.4mL，混匀，在暗处放置5min，加0.1mol/L的HCl溶液至刻度，暗处放置20min，随行无水乙醇溶液做空白对照，用紫外-可见分光光度计于500nm处依次测定吸光度，各浓度吸收度依次为0.122、0.256、0.376、0.498、0.621，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为A=0.024C+0.0026,A为吸收度，C为浓度，R二0.9998。曲线如附图6样品溶液的制备精密称取杏香兔耳风提取物40.2、40.8、40.5mg，置50mL容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至刻度，过0.5um微孔滤膜，备用，三份样品各精密吸取0.5mL至10mL容量瓶中，显色过程同对照品处理，以500nm处测定其吸收度，计算总酚酸含量。含量测定结果见表1表1三批提取物总酚酸含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三批样品提取物中总酚酸提取物的平均含量为65.77%。图1为本发明绿原酸对照品液相色谱图；图2为本发明杏香兔耳风液相色谱图；图3为本发明第一批杏香兔耳风总酚酸提取物液相色谱图;图4为本发明第二批杏香兔耳风总酚酸提取物液相色谱图;图5为本发明第三批杏香兔耳风总酚酸提取物液相色谱图;图6为原儿茶醛紫外-可见分光光度标准曲线图。具体实施例以下从提取物制备实施例简单说明本发明，但所列举的实施例并不是为了限制本发明实施方案。实施例1取杏香兔耳风干燥药材lOOOg，粉碎成粗粉，加10倍量的40%的乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并各次提取滤液，6(TC减压浓縮，加乙醇调至浓縮液中，使药液最终含醇量约为20%，每毫升药液相当于杏香兔耳风原药材约l.Og，然后加1N的盐酸调pH至pH约为2.0，充分搅拌均匀，室温放置24小时，离心，取上清液，上清液继续减压浓縮至无醇，将浓縮物上已处理好的NKA-9型大孔吸附脂柱，先以去离子水洗脱至水洗脱液颜色变淡，改用60%的乙醇洗脱，至FeCl3显色反应呈阴性，合并60%的乙醇洗脱部分，减压浓缩，真空干燥，得杏香兔耳风酚酸提取物55.7g。实施例2取兔耳风干燥药材1000g，粉碎成粗粉，加12倍量的60%的乙醇回流提取3次，每次1小时，过滤，合并各次提取滤液，6(TC减压浓縮，加乙醇调至浓縮液中，使药液最终含醇量约为40%，每毫升药液相当于杏香兔耳风原药材约0.8g，然后加lN的盐酸调pH至pH约为1.5，充分搅拌均匀，室温放置12小时，离心，取上清液，上清液继续减压浓縮至无醇，将浓縮物上已处理好的HP-20型大孔吸附脂柱，先以去离子水洗脱至水洗脱液颜色变淡，改用70%的乙醇洗脱，至FeC13显色反应呈阴性，合并70%的乙醇洗脱部分，减压浓縮，真空干燥，得杏香兔耳风酚酸提取物4S.7g.实施例3对大肠杆菌所致大鼠慢性盆腔炎的作用Wister大鼠40只，随机分为四组，依次为假手术组、模型组、杏香兔耳风总酚酸提取物组和妇科千金片组，杏香兔耳风给药量为60mg/kg.d"，每天给药1次，连续给药21天，然后测定大鼠免疫功能并进行大鼠子宫形态学观察，结果表明，杏香兔耳风总酚酸提取物给药GOmg/kg-d—1,凝集素效价为85.8±1.7，与模型组(36.9±1.7)相比，大鼠血清凝集素效价显著升高，PO.01;本发明提取物给药组淋巴细胞转化指数为1.6±0.6，与模型组1.2±0.2相比，具有显著性差异，PO.Ol，淋巴细胞转化指数明显提高。组织形态学观察发现，模型组肉眼观察子宫肿胀、发硬，与周围组织粘连，形成硬结，镜下见宫壁粘膜与肌层结构模糊，多数上皮细胞变性坏死脱落，宫壁各层组织充血水肿伴随大量嗜酸性粒细胞及少量淋巴细胞细胞浸润，粘膜层、肌层中有多量成纤维细胞增生给药组大鼠慢性盆腔炎病理改变明显减轻；杏香兔耳风60mg/kg.cf1组，肉眼观子宫略微增大，镜下宫壁各层结构尚清晰，少数上皮细胞脱落，内膜浅层组织充血水肿伴中等量嗜酸性粒细胞浸润，粘膜中仅有极少量成纤维细胞增生。上述结果说明杏香兔耳风总酚酸提取物对大肠杆菌所致大鼠慢性盆腔炎有明显治疗作用。权利要求1、一种杏香兔耳风总酚酸提取物，其特征是所述提取物通过下述方法制备取杏香兔耳风干燥药材，粉碎成粗粉，以40％-70％的乙醇提取，过滤，取滤液，滤液减压浓缩，加乙醇使溶液乙醇浓度为20％-40％，每毫升溶液相当于原药材0.8-1.0g，往溶液中加盐酸调pH至1.0-3.0，静置，冷处放置12-24小时，离心或过滤，取清液，清液减压浓缩至无醇，浓缩物加蒸馏水溶解分散，将分散物上已处理好的大孔吸附树脂柱上，先用去离子水洗脱至水洗液颜色变淡，改用含水乙醇洗脱，至酚酸显色反应呈阴性，收集乙醇洗脱液，合并，减压浓缩，干燥，即得兔耳风酚酸提取物。2、根据权利要求1所述的酚酸提取物，其特征是洗脱柱用的含水乙醇优选为70%的乙醇。3、根据权利要求1所述的酚酸提取物，其特征是加盐酸调pH值优选为1.0。4、根据权利要求1所述的酚酸提取物，其特征是所述的酚酸提取物含有有机酚酸类和黄酮类成分。5、根据权利要求3所述的酚酸提取物，其特征是所述的有机酚酸类成分包括绿原酸。6、根据权利要求1所述的酚酸提取物，其特征是所述的酚酸提取物中总酚酸的含量大于60%。7、根据权利要求1所述的酚酸提取物，其特征是以绿原酸计，提取物中绿原酸的含量为1%5%。8、根据权利要求6所述的酚酸提取物，其特征是提取物中绿原酸的含量为2%~4%。9、如权利要求1-8中任一权利要求在制备治疗妇科炎症药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种杏香兔耳风总酚酸提取物及其制备方法，杏香兔耳风药材经70％乙醇回流提取后，乙醇提取液浓缩至少体积并控制溶液中乙醇含量为20％-40％，以盐酸调pH至1-3后，静置过滤，清液浓缩后上大孔吸附树脂柱，水洗后再以乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液浓缩干燥即得本发明提取物，其总酚酸含量可达60％以上，提取物中绿原酸可达3％以上。本发明提取物具有抗炎作用，可以用于制备具有治疗妇科炎症的药物。文档编号A61P31/12GK101332216SQ20081011190公开日2008年12月31日申请日期2008年5月20日优先权日2008年5月20日发明者熊国裕申请人:北京星昊医药股份有限公司