糖尿病等的治疗的制作方法

专利名称：糖尿病等的治疗的制作方法
糖尿病等的治疗本申请为申请日为2003年12月5日、申请号为200380105141.X (国 际申请号为PCT/US2003/038689)、发明名称为"糖尿病等的治疗"的发明 专利申请的分案申请。本申请要求2002年12月6日提交的美国临时申请系列号No . 60/431351、 2003年6月6日提交的美国临时申请系列号No . 60/476331 和2003年6月6日提交的美国临时申请系列号No . 60/476726的优先权，这些申请的内容各自纳入本文作参考。发明领域本发明涉及葡萄糖的调节和体内平衡，涉及糖尿病等葡萄糖调节受损 伤相关疾病的治疗或预防。发明背景糖尿病是-种由于胰岛素分泌、胰岛素活性或二者发生缺陷而致的以 高血糖为特征的疾病。I型糖尿病(以前称为胰岛素依赖性糖尿病 (IDDM))是-种朗格汉斯细胞作用于胰岛，破坏了机体产生胰岛素能力而 致的自身免疫性疾病。I型糖尿病占所有糖尿病例的10 % ，影响到美国 多达100万人。II型糖尿病(以前称为胰岛素非依赖性糖尿病(NIDDM)) 是-种由于机体不能产生足够的胰岛素或不能适当地利用胰岛素而致的代 谢性疾病。美国所有的糖尿病人中大约90 %患II型糖尿病。I型和II型 糖尿病都是由于胰岛素分泌、胰岛素活性或二者发生缺陷而致的以高血 糖为特征的代谢性疾病。糖尿病的流行以警报速度增加。1976-1994年之间美国成年人中糖尿 病人群从8.9%增加至12.3%。美国目前大约有1600万(约占人口的6% ) 人患糖尿病，每年新诊断糖尿病人80万人。(Harris等，Diabetes Care ,21 : 518-5241 ， 1998 ; Nathan ; N Engl 2 : J Med . , 347 : 1342 -1349 ， 2002 )。糖尿病在发生前、发生期间和发生后伴有广泛影响机体中各种器 官的病症和供发病；例如视网膜病变、肾病、神经病变等，导致失明、肾 功能衰竭等。糖尿病可能严重影响生活质量，甚至可致死亡。因此该领域 需要治疗和预防糖尿病及其相关讲发症发生和发展的有效方法。与糖尿病，通常与II型糖尿病发生相关的几种危险因素，具体是糖尿 病家族史、某些人种或种族、妊娠性糖尿病史、肥胖，特别是高水平的内 脏和腹部脂肪、久坐不动的生活类型、年龄、高血压、精神分裂症等；以 及葡萄糖代谢的改变，包括葡萄糖耐受受损(IGT )或前驱糖尿病。因此 该领域需要治疗和预防糖尿病相关危险因素发生和发展的有效方法。糖尿病等疾病与葡萄糖调节失控有关。糖尿病和高血糖可导致产生、 或在反应中产生各种疾病和病症，相关的疾病和病症包括动脉粥样硬 化、血管疾病如中风等；肥胖症、心血管疾病如充血性心力衰竭 (CHF )、心肌梗塞(MI )及下游影响等；或与这些疾病和病症相关的 危险因素。因此该领域需要治疗和预防，或最大程度减少发生糖尿病或高 血糖相关疾病危险因素的有效方法。本发明提供-种药物治疗方法回答了 这一需要，该方法与目前对于不同疾病和不同疾病的不同方面采用多种治 疗方法10不同，而是给予一种能靶向有关生理过程的某家族(成员)，并 实现协同作用的化合物，即可获得所需的治疗效果。糖尿病的目前治疗是控制血液中的葡萄糖水平(如实现血糖控制)， 以图再生天然的生理性葡萄糖体内平衡。由于生活类型的变化，如推荐控 制饮食和增加运动，因此此方法可能效果有限。这种生活类型的变化不可 能防止或战胜有关生理因素的发生，有可能延缓但不能防止该病的进展。 此外，病人对此法缺乏顺从性可能限制其效果。常用的治疗方法包括用胰岛素治疗，例如通过以仔细设计的时间方 式，常常需要每天一次或甚至一天多次注射需要给予的胰岛素。需要注射 胰岛素的这种治疗可能伴有低血糖症和高胰岛素血症的危险。另外这类治 疗是否成功常因病人缺乏顺从性而失效，即不能顺从推荐的治疗方案而失 败。其它基于胰岛素的治疗，如给予胰岛素促分沁素(能刺激胰腺分沁胰 岛素的化合)，也具有诱生低血糖等的类似危险。这些疗法，和现有的疗
法，如PPAR-y拮抗剂疗法等伴有其它作用，例如糖尿病的和自身的一种危险因素体重增加。因此需要有效治疗或预防糖尿病、高血糖症和糖尿 病相关危险因素，如体重增加和肥胖的方法和化合物，这些方法和化合物 常常可改进给药的容易性，并不会伴有其它糖尿病相关因素，如体重增加 等的发生或危险。对于糖尿病和相关疾病，需要更接近模拟达到葡萄糖体 内平衡的机体自身生理机制的治疗方法。当然这类治疗可能需要改进给药 的容易性、提高病人的舒适度以及病人顺从性。此外，糖尿病或相关疾病 的治疗需要这种治疗不会有加重或恶化所治疾病的作用。葡萄糖代谢，例如葡萄糖的合成、加工和利用等，是维持正常葡萄糖 平衡和体内平衡所必须的。葡萄糖代谢或调节的破坏可导致葡萄糖体内平 衡的破坏，导致血糖不适当的高水平(即高血糖症)或低水平(即低血糖 症)。高血糖症和低血糖症长期或严重地影响到生活质量，产生神经和血 管损伤。因此需要调节血糖代谢和体内平衡(达到血糖的控制)，和治疗 或预防与葡萄糖代谢和体内平衡改变或受损相关的疾病和病症，如糖尿 病、高血糖症等的有效方法。发明概述本发明涉及调节葡萄糖代谢和实现葡萄糖体内平衡的方法和化合物。 也提供使受试者降低血糖水平、降低胰岛素耐受、降低糖化血红素水平和 改善血糖控制的方法。提供治疗或预防糖尿病、高血糖症和其它血糖水平升高相关疾病的方法，例如治疗10或预防糖尿病相关疾病，如成为糖尿 病危险因素，或与糖尿病同时发生或糖尿病所导致的疾病的方法。在各种实施方案中，所述受试者是细胞、组织或器官。在其它实施方 案中，所述受试者是动物，优选哺乳动物，更优选人。当受试者是细胞 时，本发明具体考虑该细胞可以是分离的细胞，原核或真核细胞。当受试 者是组织时，本发明具体考虑是巧内源性组织和体外组织，如培养的组 织。在优选的实施方案中，所述受试者是动物，具体是哺乳动物类动物， 包括大鼠、家兔、牛、羊、猪、小鼠、马和灵长类动物。最优选实施方案 中，所述受试者是人。
本发明提供调节葡萄糖代谢的方法。
一方面，本发明方法包括调节受试者的糖代谢，系通过稳定受试者的HIFa调节其糖代谢。在各方面内容 上，HIFa是HIFkx 、 HIF2a或HIF3a。在一优选方面，稳定HIFa包括 给予受试者有效量的抑制HIF羟化酶活性的化合物。稳定HIFa可用本领域技术人员已有和已知的方法来进行，可包括采 用能与HIFa相互反应，或能修饰HIFa或与HIFa相互反应的因子的任何 制剂，如以HIFa为底物的酶。在某些方面，本发明考虑提供结构稳定的 HIFa变体，如稳定的HIF突变蛋白25等，或编码这种变体的多核苷酸。 在其它方面，本发明考虑要稳定HIFa，包括给予能稳定HIFa的任何制 剂。该制剂可包括多核苷酸，如反义序列；多肽；抗体；其它蛋白质；碳 水化合物；脂肪；脂质；和有机及无机物质，如小分子等。在一优选实施 方案中，本发明考虑，例如通过给予受试者能稳定HIFa的任何制剂来稳 定该受试者的HIFa，其中所述的制剂是能稳定HIFa的化合物，如小分子 化合物。本发明还涉及调节受试者葡萄糖代谢的方法，该方法通过给予受试者 有效量的本发明化合物来调节该受试者的葡萄糖代谢。在一优选方面，本 发明的化合物是能抑制HIF羟化酶活性的化合物。在最优选的方面，本发 明的化合物是能抑制HIF脯氨酞羟化酶活性的化合物。在另-优选方面， HIF羟化酶选自EGLN1 、 EGLN2禾Q EGLN3 。本发明还通过稳定受试者的HIFa ，或给予受试者有效量的能调节该 受试者葡萄糖代谢过程的本发明化合物，提供调节受试者葡萄糖代谢过程 的方法。在各种实施方案中，所述葡萄糖代谢过程选自葡萄糖摄取、葡萄 糖转运、葡萄糖储存、葡萄糖加工、葡萄糖利用和葡萄糖合成等。在具体实施方案中，本发明的方法通过稳定受试者的HIFa ，或通过 给予受试者有效量的能改变该受试者葡萄糖调节因子的表达的化合物，来 改变该受试者葡萄糖调节因子的表达。在一实施方案中，本发明提供的方法，通过稳定受试者的HIFa ，或 通过给予受试者有效量的能增加该受试者葡萄糖调节因子的表达的化合 物，来增加该受试者葡萄糖调节因子的表达。在其它实施方案中，所述葡 萄糖调节因子选自PFK-P、 PFK-L 、烯醇化酶-1 、 GluT-l 、乳酸脱氢
酶、醛縮酶-1、己糖激酶-1 、 IGFBP-1和IGF。在一具体方面，葡萄糖调节 因子的增加是持续性增加。 一方面，该葡萄糖调节因子是一种糖酵解因 子。另一方面，该糖酵解因子选自PFK-P 、 PFK-L 、烯醇化酶-1 、乳 酸脱氢酶、醛縮酶-1和已糖激酶-1 。本发明提供实现受试者葡萄糖体内平衡的方法。 一方面，本发明的方 法包括实现受试者葡萄糖体内平衡，这是通过稳定受试者的HIFa从而达 到该受试者的葡萄糖体内平衡。另一方面，本发明的方法包括实现受试者 葡萄糖体内平衡，这是通过给予受试者有效量的本发明化合物从而达到该 受试者的葡萄糖体内平衡。本发明提供降低受试者血糖水平的方法。 一方面，本发明的方法包括 降低受试者的血糖水平，这是通过稳定受试者的HIFot从而降低该受试者 的血糖体水平。另一方面，本发明的方法包括降低受试者的糖化血红素水 平，这是通过给予受试者有效量的本发明化合物从而降低该受试者的糖化 血红素水平。本文涉及治疗或预防具有发生糖尿病或具有发生糖尿病危险受试者的 糖尿病的方法。 一实施方案中，该方法包括治疗或预防具有发生糖尿病或 具有发生糖尿病危险受试者的糖尿病，这是通过稳定该受试者的HIFa从 而预防或治疗糖尿病。另一方面，本发明的方法包括治疗或预防受试者的 糖尿病，这是通过给予受试者有效量的本发明化合物从而治疗或预防该受 试者的糖尿病。本发明还提供治疗或预防受试者的血糖水平升高相关疾病的方法。一 实施方案，该方法包括治疗或预防受试者的血糖水平升高相关疾病，这是 通过稳定该受试者的HIFa从而预防或治疗血糖水平升高相关疾病。另一 方面，本发明的方法包括治疗或预防受试者的血糖水平升高相关疾病，这 是通过给予受试者有效量的本发明化合物从而治疗或预防该受试者的血糖 增高相关疾病。在各种实施方案中，所述疾病选自糖尿病、高血糖症、 肥胖、糖耐受受损、高血压、视网膜病变、神经病变、肾病、高脂血症和 血管疾病。本发明还涉及治疗或预防受试者糖尿病相关疾病的方法。 一实施方案 中，该方法包括治疗或预防糖尿病相关疾病，这是通过稳定该受试者的HIFa从而预防或治疗其糖尿病相关疾病。另一方面，本发明的方法包括 治疗或预防受试者的糖尿病相关疾病，这是通过给予受试者有效量的本发 明化合物从而治疗或预防该受试者的糖尿病相关疾病。在各种实施方案中，所述疾病选自高血压、肥胖、高血糖症、葡萄糖耐受受损、高脂血症、'肾病、神经病变、视网膜病变、动脉粥样硬化症和血管疾病。 一实 施方案中，所述受试者是患糖尿病的受试者。另一实施方案中，所述受试 者是具有患糖尿病危险的受试者。本发明提供降低受试者血液甘油三脂水平的方法。 一方面，本发明的方法可降低受试者的血液甘油三脂水平，这是通过稳定该受试者的HIFa 从而降低该受试者的血液甘油三脂水平。另一方面，本发明的方法可降低 受试者的血液甘油三脂水平，这是通过给予该受试者有效量的本发明化合 物从而降低该受试者的血液甘油三脂水平。本发明提供降低受试者胰岛素耐受的方法。 一方面，本发明的方法可 降低受试者的胰岛素耐受，这是通过稳定该受试者的HIFa从而降低该受 试者的胰岛素耐受。另一方面，本发明的方法可降低受试者的胰岛素耐 受，这是通过给予该受试者有效量的本发明化合物从而降低该受试者的胰 岛素耐受。本发明提供提高受试者血糖控制能力的方法。 一方面，本发明的方法 可利市受试者的血糖控制，这是通过稳定该受试者的HIFa从而提高该受 试者的血糖控制。另一方面，本发明的方法可提高受试者的血糖控制，这 是通过给予该受试者有效量的本发明化合物从而提高该受试者的血糖控 制。还有一方面，所述受试者是患有高血糖症的受试者。在各种实施方案中，本发明提供含有本发明化合物的配方或药物或药物组合物，以及制造和使用这些配方或药物或药物组合物的方法。 附图简述

图1A和1B显示用本发明化合物处理细胞中诱生的的醛縮酶和葡萄 糖转运蛋白-l(GluT-l )。图2A 、 2B和2C显示用本发明化合物处理动物中分别参与肾、肝和 肺中葡萄糖调节的基因的表达。 图3A和3B显示用本发明化合物处理动物的肾和肝中分别编码GluT-l和IGFBP-1的基因的剂量和温度反应。图4显示用本发明化合物处理的动物中血糖水平的降低。图5A和5B显示用本发明化合物治疗后，饮食诱导2型糖尿病动物模型中糖耐受的提高。图6显示用本发明化合物治疗的db/db小鼠中血红素糖化的降低。 图7A和7B显示用本发明化合物治疗动物的体重和心脏重量的变化。图8显示用本发明化合物治疗动物中内脏脂肪的减少。图9A 、 9B和9C显示用本发明化合物治疗后，饮食诱导肥胖动物模型中体重增巧重和腹部脂肪垫重量均得以减少。图10A和10B显示用本发明化合物治疗后，编码了可诱导的-氧化氮合酶(iNos)和肾上腺髓质素基因的表达。图11显示用本发明化合物治疗动物中的血液甘油三脂水平。图12A和12B显示用本发明化合物处理细胞中HIF-IQ的稳定性。发明的描述在描述本发明的组合物和方法之前，须理解本发明不限于所述的具体 方法学、程序、细胞系、试验和试剂，因为它们是可以改变的。也应理解 本文所用的术语目的是描述本发明的具体实施方案，不意味着限制本发明 的范围，本发明的范围由附属的权利要求书所限定。必须指出，如本文和权利要求书中所用，单数形式的"一个"、"一种" 和"这个"包括复数参比物，除非文中另有说明。因此，如本文所述和本领 域技术人员所知，例如参比某"片段"包括多个这类片段；参比某"化合物" 指参比一个或多个化合物和其等价物。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域 任何普通技术人员所共同理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述 的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述优选的方法、装 置和材料。本文所引用的所有出版物其内容纳入本文作参考，目的是描述 和公开这些出版物中报导的可能与本发明有关的方法学、试剂和工具。本 文中没有任何东西构成允许本发明有权凭借先前发明公开的内容倒填日 期。除非另有说明，实施本发明可采用属于本领域技术的化学、生物化 学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中有全面解释。见例如Gennaro ， A . R主编的雷明顿药物科 学(Remington 's Pharmaceutical sciences )， 第 18 版，1990 ， Mack Publishing co . ; Harman ， J . G ， Limird ， L . E禾卩Gilman , A . G .编，治疗的 药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics )，第10版，2001 ; McGraw-Hill Co ; Colowick ， S等编，Methods in Enzymology， Academic Press ， Inc . ; Weir , D . M禾卩Blacwell , C .C编的实验免疫学手册 (Handbook of Experimental Immunology )， 第I-IV巻，1986 ， Blackwell Scientific Publications ; Maniatis ， T等编的分子克隆实验手册(Molecular cloning : A Laboratory Manual )， 第二版，I-III巻，1989 ， Cold Spring Harbor Laboratory Press ; Ansubel ， F . M等编，分子生物学技术详细实 验室过程(Molecular Biology Techniques : An Intensive Laboratory Course ): 1998, Academic Press; Newton ，C.R.，禾卩Graham ， A .编，生物技术系 歹lj介绍 (Introduction to Biotechniques series )， 第二版，1997 ， SpringerVerlag 。 定义术语"葡萄糖调节"或"葡萄糖代谢的调节"本文用于指细胞、组织、器 官、器官系统或整个生物体通过改变例如葡萄糖代谢特异性加工的增加或 减少，来维持葡萄糖的体内平衡的过程。葡萄糖代谢或葡萄糖代谢过程包 括涉及葡萄糖合成、加工、转运、摄取、利用或储存的过程，和包括葡萄 糖异生和糖酵解。葡萄糖代谢和调节的具体方面包括能促进葡萄糖穿过细 胞膜及细胞保留或分泌葡萄糖的葡萄糖转运蛋白或酶的表达；参与葡萄糖 利用和形成的酶，如糖酵解酶和葡萄糖异生酶，的表达和/或活性的改 变；以及体内或培养基，包括例如间质中(即细胞外)和细胞内液、血液、 尿液等中葡萄糖分布的改变。术语"葡萄糖的体内平衡"指维持、恢复或达到正常或接近正常的血糖 水平。血糖的控制也可称为某机体内糖化血红素水平的正常化。
术语"代谢性疾病"和"代谢性失调"可互换使用，指与葡萄糖调节或血 糖控制受损或改变相关或恶化相关的(例如胰岛素耐受性)任何疾病。这 类疾病包括但不限于糖尿病、高血糖症、肥胖等。术语"高血糖症"本文用于一般指高于正常的血液葡萄糖水平。高血糖 症可通过该领域技术人员已接受和所用的任何方法测定。目前人的正常血糖水平认为在约70-120mg/dl之间，但取决于禁食状态而不同。餐前血糖 范围可在约80-120mg/dl ，而餐后二小时血糖可在约I80mg/dl或更低。此 外，禁食的个体正常血糖低于约110mg/dl。血糖水平约126mg/dl或更高 者通过认为是高血糖症，血糖高于约200mg/dl者一般视为糖尿病。术语"肥胖"指体内脂肪过多。肥胖可通过该领域技术人员己接受和所 用的任何方法测定。目前己接受的肥胖衡量方法是体重指数(BMI)，为 体重的公斤数与身高的公尺数平方相比的测量值。通常20岁以上成人的 BMI在18.5-24.9之间认为正常；10 BMI在25.0-29.9之间认为过重； BMI超过30.0认为是肥胖，BMI在40或超过40认为是病态肥胖(见例 如Gallagher等(2000 ) Am J ClinNurt 72 : 694-701 )。这些BMI范围依 据体重对疾病危险性的增加作用而定。与过重和肥胖有关的一些常见疾病 包括心血管疾病、高血压、骨关节炎、癌症和糖尿病。虽然BMI与机体 脂肪有关，但BMI与确切的机体脂肪之间的关系随年龄和性别而不同。 例如具有相同BMI的女性机体巧脂肪百分率可能比男性更高。肥胖的另一种衡量方法是机体脂肪百分率.现有的各种间接衡量杨体 脂肪的方法包括皮肤折皱测定、水密度测定、生物电阻分析(BIA )、 双能量X-线吸收测定、机体总钾测定和体内氮活化测定。水密度测定，或 水(中)静态测定(HW)通过测定受试者在水中和空气中重量之间的差异 来测定机体总体积。类似的，空气置换体积描记图(AP)通过测定将受试 者放在-空气体积固定的室中时引起的室体积减少，来测定机体总体积。 然后用经过验证的预测公式计算出机体总密度和组成。BIA以小电流通过 二电极间引起的电压下降来估计电阻或电流阻抗。机体水和电解质组成的 -种指标，电阻的水平，可用于从开发的回归公式估计瘦肉组织含量和机 体的水体积。假设痩肉组织的含水组分时，可用其它的回归公式估计机体 瘦肉量和脂肪量。女性体脂的百分率通常约17-27% ，虽然高达31%认为
也可接受。男性体脂百分率-般应为了0-20% ，虽然高达25%认为也可接受。术语"HIFa"指缺氧可诱导因子蛋白的a亚基。HIFa可以是人或其它哺 乳动物蛋白质，或其片段，包括人HIF-la( Genbank登录号 No .Q16665 ) 、 HIF-2a(Genbank登录号No . AAB41495 )和HIF-3a (Genbank登录号No . AAD22668 ):小鼠HIF-la(Genbank登录号No . Q61221 ) 、 HIF-2a ( Genbank登录号No . BAA20130和AAB41496 )和 HIF-3a( Genbank登录号No , AAC72734 );大鼠HIF-kx (Genbank登录号 No.CAA70701 ) 、 HIF -2a( Genbank登录号No . CAB96612 )和 HIF-3a( Genbank登录号No .CAB96611 );和牛HIF-la( Genbank登录号 No.BAA78675 )。 HIFa也可以是任何非哺乳动物蛋白质或其片段，包括 非洲爪蟾laevis的HIF-la( Genbank登录号No . CAB96628 )、黑腹果蝇 HIF-la ( Genbank登录号No . JC4851 )和鸡HIF-la (Genbank 5登录号 No BAA34234 ) 。 HIFa的基因序列也可用常规克隆技术获得，例如用上 述HIFa基因序列的全部或一部分作为探针来发现其它物种中的HIFa基因序列。HIFa的片段包含人HIF-la的氨基酸401-603区域(Huang等，同 上)、氨基酸531 -575区域(Jiang等，J Bio Chem . 272 : 19253-260 ， 1997 )、氨基酸556-575区域(Tanimoto等，同上)、氨基酸557-571区 域(Srinivas等，Biochem Biophys Res 10 Commun . 260 : 557-561 , 1999 )、氨基酸556 -575区域(Ivan和Kaelin , Science . 292 : 464-468 , 2001 )。另外，HIFa片段包括含有至少一个LXXLAP基序的任何片段， 如见于HIFa天然序列中的L397TLLAP和L别EMLAP。此外，HIFa的片段 包括保留了 HIFa的至少一种特征性功能和结构的任何片段。例如，用于 实施例14筛选试验的HIF肤可含有DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID No : 5 )。术语"HIF羟化酶"指能羟化HIFa蛋白质，特别是HIFa亚基中的氨基酸残基的任何酶。所述残基优选脯氨酸和域天冬酞胺残基。术语"HIF天冬酞胺基羟化酶"指能羟化HIF蛋白中任何天冬酞胺残基的任何酶，优选被HIF天冬酞基羟化酶羟化的天冬酞胺残基包括例如 HIF-loi的N803残基或其它HIFa同工型中的同源性天冬酞胺残。HIF天 冬酞胺基羟化酶包括抑制HIF因子20(FIH )、负责调节HIFa反式激活 的HIF天冬酞基羟化酶(Genbank登录号NoAA127308 ; Mahon等.Gene Dev . 15 : 2675 -2686 ， 2001 ; Lando等.Science295 : 858 -861 , 2002 ;和 Lando等.Gene Dev 16 : 1446 -1471 ， 2002 。也参见Elkins等.J Bio Chem C200644200 ， 2002 )。术语"HIF脯氨酞羟化酶"和"HIF PH "指能羟化HIF蛋白中脯氨酸残 基的任何25酶。优选被HIFPH羟化的脯氨酸残基包括基序LXXLAP中 的脯氨酸，如人HIF-la天然序列中L397TLLAP和L559EMLAP的脯氨酸。 HIF PH包括Taylor ( Gene 275 : 125 -132 , 2001 )所述的禾口 Aravind及 Koonin ( Genome BiolZ : REsEARCH0007 ， 2001 ) 、 Epstein等(Cell. 107 : 43 -54 ，2001 )和Bmick及McKnight ( Science 294 : 1337 -1340 , 2001 ) 所特征鉴定的Egl-Nine(EGLN)基因家族成员。HIF PH酶的例子包括人 SM-20 ( EGLN1 ) ( Genbank登录号No . AAG33965 ; Dupuy等。Genomics 69 : 348-54 , 2000 ) , EGLN2同工型l( Genbank登录号No . CAC42510 ; Taylor ，同上)，EGLN1 ( Genbank登录号No—060025 )和EGLN3 (Genbank登录号No,CAC42515 ; Taylor ，同上)；小鼠EGLN1H (Genbank登录号No . CAC42511) 、 EGLN2 ( Genbank登录号No . CAC42511 )和EGLN3(SM-20)( Genbank登录号No . CAC42517 )和大 鼠SM-20 (Genbank登录号No . AAA19321 )。此外，HIF PH可包括秀丽 隐杆线虫(Caenorhabditis elegan ) EGL-9 (Genbank ，登录号No , AAD56365 )和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster ) CG1114基因产物 (Genbank登录号No . AAF52050 ) 。 HIF PH也包括上述全长蛋白质的 任何活性片段。本文所用的"样品"可产生自任何来源，例如体液、分沁物、组织、细 胞或培养的细胞，包括但不限于唾液、血液、尿液、血清、血浆、玻璃 体液、滑膜液、脑脊液、羊水和器官组织(如活检组织)；从细胞分离的 染色体、细胞器或其它膜；基因组DNA 、 cDNA 、 RNA 、 mRNA等； 和清除的细胞或组织，或这类细胞或组织的印染物或印制品。样品可产生 自任何来源，如人体功非人哺乳动物受试者。也考虑样品来自任何患病动
物模型。样品可以是液体或可以固定或结合于一基质。样品可以是适合于 测定与代谢调节相关的转录物或蛋白质存在与否，或测定脂肪和葡萄糖水 平的任何物质。获得这类样品的方法是该领域技术水平之内的事。"受试者"如本文所用可包括分离的原核或真核细胞，或培养的组织。 优选项所述受试者包括动物、特别是哺乳动物，其包括大鼠、家兔、牛、 羊、猪、马和灵长动物，特别是人。发明内容本发明提供治疗或预防糖尿病、高血糖症和与葡萄糖代谢和/或体内 稳定改变或受损相关的其它疾病的方法和化合物。也提供用于治疗、预防 和延缓与糖尿病和与葡萄糖代谢和/或体内稳定改变或受损相关的其它疾 病的发生和/或发展的方法和化合物，因为这些方法和化合物或调节葡萄 糖代谢和实现葡萄糖的体内稳定。本发明涉及到以下发现，即稳定缺氧可诱导因子的a亚基(HIFcO可 导致降低血糖水平。本发明还涉及以下发现，即稳定HIFa可调节葡萄糖 代谢。此外，本发明还涉及以下发现，即本发明的化合物可用来降低血糖 水平、调节葡萄糖代谢和实现葡萄糖体内平衡。缺氧可诱导因子(HIF)是一种参与多和生物途径活动的生理因子。 HIFa在正常的氧环境下降解。在缺氧或低氧条件下，HIFa稳定而发挥一 些下游作用。最近确定羟化fflFa亚基中的特定残基可使HIFa定向降解， 从而防止了在正常氧环境下形成稳定的HIF复合物，确定了这种羟化是由 于某些HIF羟化酶活化所致(见例如Ivan和Kaelin . science 292 : 464-468 , 2001 : Jaakkola等，science 292 : 468 -472 ,2001 ; Epstein等，，cell 107 : 43 -54 , 2001 ; Bmick和McKnight Sciene 294 : 1337 -1340 , 2001 )。这些 HIF羟化酶属于2-酮戊二酸双加氧酶家族。这些酶是氧依赖性的，在低氧 或缺氧条，件下，HIFa残基的羟化受到抑制。已描述了可治疗性稳定 HIFa和通过抑制HIFa羟化来稳定HIFa (见国际出版物W003 / 0 49686 ，其内容纳入本文作参考)。方法 一方面，本发明提供了通过稳定受试者的缺氧可诱导因子的a亚基 (HIFa)来降低血糖水平或调节葡萄糖代谢的方法。另一方面，该方法通 过抑制受试者的HIFa羟化来降低血糖水平或调节葡萄糖代谢。在-优选项 方面，本发明的方法包括通过抑制受试者的HIF羟化酶活性来降低血糖水 平或调节葡萄糖代谢的方法。在最优选项方面，该方法包括通过抑制HIF 脯氨酸羟化酶的活性来降低血糖水平或调节葡萄糖代谢。稳定HIFa可用该领域技术人员已有的和知道的方法之-实施，可能包 括采用能巧与HIFa相互反应或结合或修饰HIFa的任何制剂，或能与 HIFa相互反应的因子，包括例如，以HIFa作为底物的酶。在某些方面， 本发明提供结构稳定的HIFa变体，如稳定的HIF突变蛋白等，或编码某 变体的多核苷酸(见例如美国专利No . 6,562,799禾B 6,124,131和 6,432,927)。在其它方面，本发明考虑稳定HIFa包括给予能稳定HIFa的 制剂。该制剂可由多核苷酸组成，如反义序列(见国际出版物WO2003 /0 45440 );多肽；抗体；其它蛋白质；碳水化合物；脂肪；脂质；和有机 及无机物质，如小分子等。在一优选项实施方案中，本发明通过给予受试 者能稳定HIFa的制剂来稳定HIFa，其中所述制剂是一种化合物，例如能 稳定HIFa的小分子化合物等。在其它实施方案中，本发明的方法包括通过抑制至少一种选自2-酮戊 二酸双加氧酶家族的酶活性来稳定HIFa。在一优选项实施方案中，所述 酶是HIF羟化酶，如EGLN-1 、 EGLN-2 、 EGLN-3 (见Taylor . Gene 275 : 125 -132 , 2001 ; Epstein等，Cell 107 : 43-54 ，2001 ; Bruick禾卩McKnight Sciene 294 : 1337 -1340 , 2001 )。然而特别考虑所述酶选自2 -酮戊二酸双 加氧酶家族的酶，包括例如原胶元赖氨酰羟化酶、原胶元脯氨酰3-羟化 酶、原胶元脯氨酰4-羟化酶a(I)和a(II)、胸腺嘧啶7-羟化酶、天冬酰胺卩-羟化酶、s-N-三甲基赖氨酸羟化酶和Y-丁酸甜菜碱羟化酶等。(见例如 Majamaa等。Biochem J . 229 : 127-133 , 1985 ; Myllyharju和Kivirikko . EMBO J . 16 : 1173 -1150 ， 1997 ; Thornburg等.32 : 14023 -14033 , 1993和 Jia等.Proc Natl Acad Sci USA 91 : 7227 -7231 ， 1 994 )。在某些实施方案中，所述方法包括通过抑制HIFa的某些残基，如脯 氨酰残基、天冬氨酰残基等的羟化来降低血糖水平或调节葡萄糖代谢。在
一优选实施方案中，所述残基是脯氨酸残基。在具体实施方案中，所述残基是HIF-la中的Ps64残基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸，或HIF-la 中的P4Q2残基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸等。在其它实施方案中， 本发明方法可包括抑制HIFa的天冬酰胺残基，如HIF-la的N柳残基或其 它HIFa同工型中的同源天冬酞胺残基的羟化。 化合物一方面，本发明提供了通过给予受试者本发明的化合物来降低血糖水 平或调节葡萄糖代谢的方法。本发明的化合物可以是能抑制或调节2-酮戊 二酸双加氧酶活性的任何化合物。2-酮戊二酸双加氧酶包括但不限于羟化酶。可羟化靶底物残基的羟化酶包括例如脯氨酰、赖氨酰、天冬氨酰(天冬酰胺)羟化酶等。羟化酶有时可通过底物来描述，如HIF羟化酶、 原胶元羟化酶等；和/或通过底物中的耙残基来描述，如脯氨酰羟化酶、 赖氨酰羟化酶等或通过二者来描述，如HIF脯氨酰羟化酶、原胶元脯氨 酰羟化酶等。代表性的2-酮戊二酸双加氧酶包括但不限于HIF羟化酶，包 括HIF脯氨酰羟化酶，如EGLNI 、 EGLN2和EGLN3、 HIF天冬酰胺羟 化酶，如HIF抑制因子(FIH)等；原胶元羟化酶如原胶元赖氨酰羟化酶、 原胶元脯氨酰羟化酶如原胶元脯氨酰3-羟化酶、原胶元脯氨酰4-羟化酶a(1) 和a(II)等；胸腺嘧啶7-羟化酶；天冬酰胺卩-羟化酶；s-三甲基赖氨酸羟化 酶；Y-丁酸甜菜碱羟化酶等。虽然酶活性20可包括与任何2-酮戊二酸双 加氧酶相关的活性，但特别考虑能羟化底物中的氨基酸残基。虽然特别包 括羟化底物中的脯氨酸和/或天冬氨酸残基，但也考虑羟化其它氨基酸。在某些实施方案中，本发明的化合物是能抑制羟化酶活性的化合物。 在优选实施方案中，本发明的化合物是能抑制HIF羟化酶的化合物。在不 同实施方案中，所述活性是由于HIF脯氨酰羟化酶，例如EGLN1、 EGLN2或EGLN3等所致。在其它实施方案中，所述活性是由于HIF天冬 酰胺羟化酶，例如但限于FIH所致。一方面，显示对一种或多种2-酮戊二酸双加氧酶有抑制活性的本发明 化合物，也可能显示对一种或多种其它2-酮戊二酸双加氧酶有抑制活性， 如能抑制HIF羟化酶活性的某化合物也可能抑制胶元脯氨酰羟化酶；能抑 制HIF脯氨酰羟化酶的某化合物也可能抑制HIF天冬酰胺羟化酶的活性。 一方面，本发明提供了通过给予受试者本发明的化合物来降低血糖水平或调节葡萄糖代谢的方法。本发明的化合物是能抑制HIF羟化酶活性的 小分子化合物。本发明的优选化合物是能抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的化 合物。可直接或间接抑制，可以是竞争性或非竞争性抑制等。特别提供本 发明的化合物和鉴定本发明其它化合物的方法。在正常情况下，葡萄糖是机体供应外周组织的主要能源。脑和其它神 经组织在正常情况下需要葡萄糖作为唯一的能源，即使在应激状态下，如 长期禁食时，需要大量的葡萄糖。肝脏是通过分解储存的糖原或从前体物 质如乳酸、丙酮酸、甘油和氨基酸合成来产生葡萄糖，调节血糖水平，防 止禁食时血糖水平下降的主要器官。维持葡萄糖的体内稳定，如葡萄糖的 内部平衡，需要在肝脏有葡萄糖产生和外周葡萄糖的摄取及利用之间保持 平衡。血糖的体内稳定，葡萄糖内部平衡的维持受到诸多生化因素的密切控 制和影响，包含各种生理过程。为达到葡萄糖的体内平衡，机体从几个水 平上调节葡萄糖，包括葡萄糖的摄取、转运、储存、加工、合成、利用等。因此葡萄糖的体内平衡受诸多因素的影响，包括例如外在因素如生 理需要、食物摄入等；和内在因素如胰岛素、糖原的循环水平等。葡萄糖水平升高葡萄糖正常调节的破坏可导致血糖水平变化，即与正常血糖水平相比 升高或降低。例如，慢性血糖水平升高是高血糖症、糖尿病等的特征，可 对机体的各种器官、组织和系统产生多种不良作用。糖尿病、高血糖症或 血糖水平升高与许多疾病和病症相关，包括动脉粥样硬化加速、慢性心脏 病增加、心肌梗塞、中风、微血管病变、血管损伤、导致手臂和腿部循环 减少的外周血管疾病、大血管拼发症、眼科疾病如糖尿病性视网膜病妾、黄斑退变、白内障等；肾病包括糖尿病性肾病、肾损伤等；神经损伤和其 它神经病变包括糖尿病神经病变、外周神经病变、自主性神经系统神经的 损伤等、高胰岛素血症、高脂血症、胰岛素耐受、葡萄糖代谢损伤、葡萄 糖耐受损伤、皮肤和结缔组织疾病、足部创伤和溃疡、糖尿病酮酸中毒
可通过测定循环葡萄糖水平或测定血液/血浆葡萄糖水平来鉴定葡萄 糖调节的变化或受损，和是否存在或有发生糖尿病、高血糖症等疾病的危 险。最常通过禁食时的血糖测定、随机血糖测定或口服葡萄糖耐受试验来 测定血糖水平。通过禁食时血糖试验来测定血糖水平。在此种分析中，反映禁食状态 时(即不吃水以外的食物或液体)血糖水平的测量数值通常保持在约70mg/dL-110mg/dL之间。如果禁食状态时血糖水平升高超过此典型示 范，例如到126mg/dL水平或更高，可作出糖尿病诊断。在一实施方案 中，本发明提供能将禁食状态时血糖水平保持在或达到正常禁食状态时血 糖水平，艮卩70mg/dL-110mg/dL之间的化合物和方法。在另一实施方案 中，本发明提供能将禁食状态时的低血糖水平(即低于正常禁食状态时的 血糖水平)升高或恢复到70mg/dL-110mg/dL之间的化合物和方法。在另一 实施方案中，本发明提供能将禁食状态时升高的血糖水平(即血糖水平高 于禁食状态正常水平)降低(减少)或恢复到约126mg/dL以下，和约 70mg/dL，更优选约120-7Omg/dL ，最优选约U0-70mg/dL的化合物和方 法。另一种血糖水平的测定方法是随机血糖试验。以这种方式测定的血糖水平 通常显示的值在低至中等100秒(mg/dL)。约180mg/dL或更高的随机 血糖水平是高血糖症，约180mg/dL或更高水平表明存在发生血糖调节受 损相关疾病如糖尿病的危险。因此， 一方面，本发明提供的方法和化合物 能使随机血糖试验测定的血糖水平维持或达到正常水平，即低至中等100 秒(mg/dL)。另一方面本发明的方法和化合物可用于使随机血糖试验测定 的降低到正常水平以下的血糖水平恢复达到正常水平，即低至中等100秒 (mg/dL)。还有一方面，本发明的方法和化合物可用于降低/减少高于正 常的，即高于低至中等100秒(mg/dL)的血糖水平。在各种方面，该方 法和化合物能将升高的血糖水平降低至约200-100 mg/dL水平面，更优选 至180-100 mg/dL水平，最优选至150-100 mg/dL水平。也可用口服葡萄糖耐受试验来鉴定受试者是否患有或有患葡萄糖调节 损伤、高血糖症、糖尿病的危险。在此试验中，让个体喝-杯糖水液禁食 过夜，几小时后测定血糖水平。具有正常葡萄糖耐受/调节的人，如无糖 尿病等者，在喝下糖水后测定的血糖水平升高然后迅速下降。喝糖水后二小时读取的正常血糖水平低于约140 mg/dL，在0时和2小时之间读取的所 有值都低于200 mg/dL。如果在口服葡萄糖耐受试验中测定的血糖水平在 约140-199 mg/dL范围内， 一般诊断为葡萄糖耐受受损。如果测定的血糖 水平约为20Omg/dL或更高， 一般诊断为糖尿病。本发明的方法和化合物 可用于在口服葡萄糖耐受试验后保持、恢复或达到正常血糖水平。 葡萄糖调节因子的表达一实施方案中，本发明提供能提高产物参与细胞葡萄糖摄取和利用的 基因的表达的化合物和方法。这种基因包括但不限于葡萄糖转运蛋白， 如葡萄糖转运蛋白(GluT) -1和GluT-3;葡萄糖酵解酶如醛縮酶-A、烯醇 化酶-1、己糖激酶-1、已酮激酶-2、果糖磷酸激酶-L和果糖磷酸激酶-P。 葡萄糖转运子及其利用的治疗性上调将有效降低胰岛素的耐受、降低血糖 水平，从而在代谢疾病病人，如2型糖尿病、高血糖症、葡萄糖控制受 损、葡萄糖耐受受损等的病人中产生有利的作用。一方面，本发明提供治疗或预防高血糖症的化合物和方法。这种化合 物和方法适合治疗或预防高血糖症相关疾病，如由于葡萄糖释放增加、葡 萄糖利用减少和/或葡萄糖摄取受损所致的血糖水平升高。这些疾病还与 胰岛素耐受、葡萄糖耐受受损、2型糖尿病和/或肥胖相关。一方面，本发明的方法提供了活化能调节葡萄糖和葡萄糖代谢(包括 全身加工和利用)水平和活性的基因表达文库的工具。该方法能补偿机体 调节这种加工天然机制的缺陷(例如不能产生胰岛素可对其反应)。本发 明提供的方法可治疗与葡萄糖控制受损相关的代谢性疾病或病症。这些疾 病包括但不限于葡萄糖耐受受损(IGT)或前糖尿病、糖尿病、高血糖症 等。本发明特别考虑选择性设计被特定器官摄入时可被激活的前药化合 物。例如，由于肝脏能产生参与脂肪体内平衡的许多蛋白质，本发明考虑 在本发明的方法中选择性地靶向肝脏。选择性上调肝脏中的一些基因，如 醛縮酶基因，可采用能被肝特异性酶从无活性转变成活性的化合物来实 现。例如，对某活性化合物起作用的羧酸可相应的醇代替。肝中的醇脱氢 酶(ADH)活性可将这类化合物转变成活性形式。因为其它器官缺少ADH
活性，该化合物只能在肝内被选择性激活。类似的，可使本发明方法中所 用的化合物靶向其它器官，如脂肪组织、肾、骨骼肌、心脏等。 胰岛素胰岛素是调节机体大多数细胞代谢平衡，刺激葡萄糖摄取的关键性激 素。当存在胰岛素时，大多数细胞采用葡萄糖作为它们的代谢燃料，脂肪 细胞利用葡萄糖合成脂肪，肝细胞将葡萄糖转变成糖原和脂肪。血胰岛素 升高随后立即血糖升高，几种与葡萄糖摄取相关的活动刺激了胰岛素分 泌。血糖水平随后降低时，胰岛素释放迅速减少，葡萄糖进入神经系统以 外的细胞受到抑制。不供应葡萄糖时细胞利用糖原和脂肪作为代谢燃料。 肝脏和脂肪细胞开始分解储存的糖原和脂肪。结果肝脏向血液提供葡萄糖 而不是从血液摄取葡萄糖，肝脏和脂肪组织都向血液提供脂肪酸。因此， 胰岛素水平低时降低了胰岛素敏感组织的葡萄糖摄取，促进了肝脏中的葡 糖异生和糖原分解(糖元破坏)，减少了糖原合成，并促进了储存糖原和 脂肪的代谢。机体不能产生胰岛素，或对胰岛素无反应，例如对胰岛素敏感性降 低，即胰岛素耐受等可导致各种疾病，包括糖尿病和高血糖症。葡萄糖转运受损原因与胰岛素耐受有关。本发明的方法可降低胰岛素 耐受以恢复受损的葡萄糖转运或提高葡萄糖转运。本发明提供降低或减少胰岛素耐受的方法。在某些方面，通过稳定HIF(x来降低胰岛素耐受。在 其它方面，提供了通过抑制HIFPH活性而降低胰岛素耐受的方法。胰岛素敏感性提高与胰岛素样生长因子结合蛋白-l(IGFBP-l)的高血浆 水平正相关。IGFBP-1血浆水平也与青少年的体重指数负相关(Travers 等，J Clin Endocrinol Metab . 83 : 1935 -1939 ， 1998 )。此外，低IGFBP-1 水平与2型糖尿病心血管危险增加相关(Gibson等.J Clin Endocrinol Metab 81 : 860-563 ，1996 )。因此，在恢复或维持胰岛素敏感性，即治疗 胰岛素耐受中，需要提高IGFBP-1的水平。此外，影响果糖磷酸-l-激酶(PFK)的基因缺陷可导致胰岛素耐受和2 型糖尿病。因为PFK是糖酵解级联反应中的速度限制性酶，糖酵解级联反 应中此酶活性的降低通常与胰岛素耐受和2型糖尿病明显相关。因此，提
高PFK和其它糖酵解因子，如醛縮酶、烯醇化酶、己糖激酶等的水平是恢 复或维持胰岛素敏感性，如降低胰岛素耐受所需要的。本发明的化合物显示能提高IGFBP-1、 PFK和其它糖酵解酶的表达(见 实施例4 )。因此，在一实施方案中，本发明提供协同表达某些基因(其 产物如IGFBP-1、 PFK等，参与葡萄糖加工和利用)的方法和化合物。在 另一实施方案中，本发明通过协同表达式这类基因，提供能提高胰岛素敏 感性，如降低胰岛素耐受等的方法和化合物。 一方面，该方法包括例如稳 定受试者的HIFa。本发明还通过给予受试者本发明的化合物，如能抑制 HIF羟化酶活性的制剂，来提供增加胰岛素敏感性的方法。糖化血红素糖尿病控制和供发症试验(DCCT)的结果证明血糖控制的改进减少了 供发症，包括非增殖性和增殖性视网膜病变(降低47%)、微白蛋白血症 (降低39%)、临床肾病(降低54% )和神经病变(降低60。/。)(DCCT 研究小组，NEnglJMed 329 :977 -986， 1993 )。此外，英国糖尿病预后 研究(UKPDs)证明血糖控制与微血管供发症减少相关，严格的血压控制 显著减少了大血管和小血管讲发症(UKPDS小组，Lancet 352 : 837 -853 , 1998 )。糖化血红素(也称为糖血红蛋白、糖基化血红素、HbAlc或HbAl)可 通过使各种糖分子(最常用葡萄糖)结合血红素分子而形成，其形成的速 率与血糖浓度成正比。糖化血红素水平的测定提供了前2-3个月的平均血 糖浓度的精确指数。临床上糖化血红素水平提供了对糖尿病病人血糖控制 的评估手段。正常(非糖尿病)的糖化血红素水平范围是4-6%。在糖尿病 个体的研究中，DCCT发现与具有较高水平HbAlc的糖尿病个体相比，将 HbAlc水平降低或维持到7.2%可导致视网膜病变减少76%、神经病变减 少60%、肾病减少50%、心血管疾病减少35%。本发明提供降低糖化血红素水平的化合物和方法。 一实施方案中，采 用本发明方法和化合物来维持、恢复或使糖化血红素水平达到约4 -6%。 在另-实施方案中，本发明的方法和化合物可降低糖化血红素水平低于约9 %，更优选低于约8%，最优选低于约7%。糖尿病和肥胖 肥胖是一种危险因素，有时是糖尿病的一种恶性副作用。肥胖的特征 是脂肪积蓄过量，具体是内脏或中枢脂肪水平过高。因此治疗或预防肥胖 可最大程度减少发生糖尿病的危险，事实上对糖尿病病人或诊断有糖尿病 风险的个体常开出减轻体重的处方。本发明的化合物在体内研究中己显示能防止或减慢体重的增加(见实 施例9和10)。因此， 一方面，本发明提供了通过减少或预防肥胖来治疗或预防糖尿病的方法。 一方面，该方法包括例如稳定受试者的HIFa。本 发明还提供了通过给予受试者本发巧明的化合物，如能抑制HIF羟化酶活 性的制剂，来治疗或预防该受试者肥胖的方法。如上所述，糖尿病与多种 疾病和病症相关。例如。心血管疾病(CVD)是2型糖尿病病人死亡的主 要原因。2型糖尿病病人比非糖尿病病人死于CVD高2-6倍。这些病人显 著数量死于慢性心脏病(CHD)。高脂血症在2型糖尿病病人中常见并引 起CHD。 2型糖尿病病人的常见脂质分布为，与非糖尿病个体相比甘油三 脂较高而HDL胆固醇较低。类似的甘油三脂和HDL胆固醇异常见于肥胖 (特别是具有内脏脂肪增加的个体)、高血压和胰岛素耐受(如代谢综合 征)的非糖尿病个体。甘油三脂水平升高已表明是心血管疾病的-种危险因 素。升高的甘油三脂是代谢综合征的-种重要成分。 糖尿病和高血压高血压，或血压升高是糖尿病的-种危险因素。此外，高血压及其相 关疾病的作用可伴随产生糖尿病或导致糖尿病。因此，治疗或预防高血压 可尽量减少糖尿病或发生糖尿病的危险，强调糖尿病这方面的治疗方法应 是有价值的。本发明提供这样-种方法。具体说，本发明的方法和化合物可用于治 疗糖尿病相关的高血压。例如，本发明的化合物可提高血压调节因子如肾 上腺髓质激素和一氧化氮合成酶的表达(见料施例12 )。因此， 一方面， 本发明通过降低或预防高血压，提供治疗或预防糖尿病的方法。 一方面， 该方法包括例如稳定受试者的HIFct。本发明还提供了通过给予受试者本 发明的化合物，如能抑制HIF羟化酶活性的制剂，来治疗或预防该受试者 高血压的方法。协同治疗方法
糖尿病与多种有害的同时发生或发展、重叠的和/或相继发生的疾病 相关。例如，高血压、血管和循环损伤、肥胖可导致糖尿病发生发展危险 性的增加。因此，可同时降低这类危险因素和症状的治疗方法是有价值 的。
本发明提供这类方法。具本说，本发明的方法和化合物可用于实现多 种效应。例如如上所述，肥胖是糖尿病发生的一种危险因素。此外，肥胖 可因糖尿病，例如由于特殊的治疗方法而发生。具体说，胰岛素介导了脂 质摄入脂肪组织，加重了肥胖，进而加重了胰岛素耐受。本发明因此一方 面提供治疗或预防肥胖和以协同方式提高胰岛素敏感性，来治疗或预防糖 尿病的方法。
本发明的化合物能降低血糖水平(见实施例6)、减少内脏和腹部脂肪(见实施例9 )、提高糖化酶的表达从而提高胰岛素敏感性(见实施例4) 和提高血压调节因子的表达(见实施例12)，因而能调节机体的血管张力， 维持正常血压水平或对抗血管张力的变化，如高血压的作用等。因此一方 面，本发明提供治疗或预防糖尿病的方法，该方法包括稳定受试者的 HIFct。来降低血糖水平面和减少内脏脂肪。另一方法还包括提高胰岛素敏 感性来治疗或预防受试者的糖尿病。另一方法还包括提高血压调节因子的 表达来治疗或预防受试者的糖尿病。 代谢性疾病本发明提供能调节代谢活动的化合物，和利用该化合物治疗代谢失调相关疾病或病症的方法。这类疾病包括但不限于糖尿病、高血糖症和肥 胖。
一方面，本发明提供利用所述化合物预防或治疗糖尿病的方法，该方法包括给予需要的病人治疗有效量的该化合物或其药学上可接受的盐，单 独给予或与药学上可接受的赋形剂一起给予。
一实施方案中，根据预测的情况，如葡萄糖体内平衡受损、葡萄糖耐受受损、高血糖症、糖尿病或肥 胖等情况给予该化合物。
另一方面，本发明提供利用该化合物治疗高血糖症的方法，该方法包 括给予需要的病人治疗有效量的该化合物或其药学上可接受的盐，单独给 予或与药学上可接受的赋形剂一起给予。 一实施方案中，给予诊断为伴有 发生高血糖症相关疾病如糖尿病的病人该化合物。可与各种其它治疗方法联合给予该化合物。 一实施方案中，该化合物 与外源性胰岛素如合成的人胰岛素联用。葡萄糖调节本发明的方法和化合物能提高烯醇化酶的表达。这些结果表明本发明 的方法和化合物可用于调节参与糖酵解的基因的表达。也提供了通过提高 糖羚化调节葡萄糖代谢的方法和化合物。本发明提供提高GluT-l表达的方法和化合物。 一方面，本发明的方法 能调节参与葡萄糖摄取的因子的表达。本发明的方法和化合物提供了增加 葡萄糖转运入细胞的治疗方法。治疗性上调葡萄糖转运因子将有效降低胰 岛素耐受，提高胰岛素敏感性，降低血糖水平，从而对高血糖症或糖尿病 病人产生有利作用。本发明的方法和化合物能提高肾、肝和肺中的葡萄糖调节因子，包括 磷酸果糖激酶-P、磷酸果糖激酶-L、醛缩酶-1、 GluT-l、乳酸脱氢酶、烯 醇化酶-l和已糖激酶-1的表达。 一实施方案中，本发明的方法可协同调节 其产物参与葡萄糖摄取和利用的基因的表达，从而可调节葡萄糖代谢。治 疗性上调葡萄糖的转运和利用将降低胰岛素耐受，提高胰岛素敏感性，降 低血糖水平，从而提供了治疗高血糖症或糖尿病的方法。利用本发明的方法和化合物可提高肾和肝中编码胰岛素样生长因子结 合蛋白-l(IGFBP-l)基因的表达。IGFBP-1血浆高水平与胰岛素敏感性提高 正相关。因此本发明的方法和化合物可用于提高胰岛素敏感性和增加葡萄 糖转运，从而调节葡萄糖代谢。治疗性提高胰岛素敏感性和葡萄糖转运将 降低血糖水平，从而提供了治疗高血糖症或糖尿病的方法。本发明提供的方法和化合物能提高细胞的葡萄糖摄取。本发明的方法 和化合物在胰岛素存在下可提高葡萄糖摄取，表明本发明的方法和化合物 可提高细胞的胰岛素敏感性，导致葡萄糖摄取的增加和葡萄糖调节的改 变。治疗性提高胰岛素敏感性和葡萄糖摄取可用于治疗患胰岛素敏感性降 低或胰耐受的全体，从而提供了治疗高血糖症或糖尿病的方法。
本发明的方法和化合物也可用于提高胰岛素激发的葡萄糖摄入组织。 本发明的方法和化合物可用于提高组织的葡萄糖摄入，提高其对胰岛素的 敏感性。葡萄糖摄入增加对血糖水平升高的个体，如高血糖症或糖尿病个 体，或实现或维持葡萄糖体内平衡有缺陷的个体，提供了降低其血糖水平 的方法。因此，本发明的方法和化合物可通过提高胰敏感性、提高葡萄糖 摄入和降低血糖水平来治疗高血糖症和糖尿病。用本发明的化合物治疗动物显示血糖水平呈剂量依赖性降低。通过改 变该化合物的剂量可将血糖水平保持在所需水平。因此一方面，本发明的 方法和化合物可用于调节血糖水平。另一方面，本发明的方法和化合物可 用于降低血糖水平。因此本发明的方法和化合物可用于治疗性降低血糖水 平。通过降低血糖水平，本发明提供了治疗高血糖症和糖尿病的方法。给 予本发明的化合物改进了饮食诱导肥胖和葡萄糖耐受受损动物模型中的葡 萄糖从循环中的廓清。提高葡萄糖廓清降低了血糖水平。因此一方面，本 发明的方法通过提高葡萄糖廓清或降低血糖水平可用于调节葡萄糖耐受受 损个体的葡萄糖代谢。治疗性提高葡萄糖廓清和降低血糖水平可用于治疗 病人，包括糖尿病病人或有发生糖尿病危险的病人。糖尿病的治疗本发明的方法和化合物能降低糖尿病动物模型的血糖水平。此外，本 发明的方法和化合物能恢复和实现糖尿病和葡萄糖耐受受损动物模型的葡 萄糖体内平衡。糖化血红素水平反映了糖尿病病人或高血糖症个体中的血糖控制和葡萄糖体内平衡的维持。降低糖化血红素水平表明本发明的方法 和化合物可用于改变个体的葡萄糖调节，从而恢复、达到或维持葡萄糖体 内平衡。因此，本发明的方法和化合物通过调节葡萄糖代谢，和恢复、达 到或维持葡萄糖体内平衡，可用于治疗高血糖症和糖尿病。用本发明的化合物和方法治疗动物降低了糖尿病动物模型中糖化血红 素的积累。糖化血红素水平反应了糖尿病患者或高血糖症患者对血糖水平 的控制和葡萄糖体内平衡的维持。糖化血红素的水平降低说明本发明的化 合物和方法可用于改变个体的葡萄糖调节，从而恢复、实现或维持葡萄糖 体内平衡。因此，本发明的化合物可方法可通过调节葡萄糖代谢并恢复、 实现或维持葡萄糖体内平衡来治疗高血糖症和肥胖。
用本发明化合物治疗的动物显示其体重增加呈剂量依赖性延缓。特别 地，用该化合物治疗的动物观察到内脏脂肪垫呈剂量依赖性减少。因此， 本发明的方法和化合物可用于减少脂肪储存和减少内脏脂肪。肥胖，特别 是伴有内脏、腹部或中枢脂肪过量的肥胖，与高血糖症和糖尿病相关。具 体说，伴有胰岛素敏感性降低、胰岛素耐受提高等的肥胖将导致高血糖症 和发生糖尿病。 一方面，本发明的方法和化合物通过减少内脏的脂肪可减 少发生高血糖症或糖尿病的危险。另一方面，本发明的方法和化合物通过 减少肥胖可降低发生高血糖症或糖尿病的危险。药物制剂和给药途径如该领域所熟知，本发明的组合物可直接输送或放在含赋形剂的药物 组合物中输送。本发明的治疗方法可包括给予患有代谢性疾病，具体是葡 萄糖调节相关疾病，如糖尿病、高血糖症等，或有患这类疾病危险的受试 者，治疗有效量的本发明化合物。在一优选实施方案中，所述受试者是哺 乳动物，在最优选的实施方案中，所述受试者是人。化合物或药物的有效量，如剂量，不难用常规实验确定，可通过有效 有和常规的途径和适当的制剂给药。该领域己有各种制剂和药物输送系统(见Gonnaro主编，2000，雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences )，同上和Hardman ， Limbird与Gilman编的治疗的药理学基础 (The Pharmacological Basis of Therapetics),同上)。合适的给药途径可包括，例如口服、直肠、局部、鼻内、肺内、眼 内、肠道内和肠胃道外给药。主要的肠胃道外给药途径包括静脉内、肌肉 内和皮下给药。第二种给药途径包括腹膜内、动脉内、关节内、心内、脑 池内、皮内、病灶内、眼内、胸膜内、气管内、尿道内和心室内给药。应 优选要治疗的指征与药物的物理、化学和生物学性能，表明制剂类型和所 用的给药途径，以及是否局部或全身输送。本发明化合物的药物剂量形式可提供的有一次性释放、控释、缓释或 靶向药物输送系统。常用的剂量形式包括例如，溶液、悬浮液、(小)乳 液、软膏、凝胶和贴片、脂质体、片剂、糖衣丸、软或硬胶囊、锭剂、卵 状小体(ovule)、植入物、无定形或结晶粉末、气溶胶和冻干制剂。取决 于使用的给药途径，可能需要特殊装置来施加或给予药物，例如，注射器
和针头、吸入器、泵、注射笔、施加器或专用瓶。药物剂量形式常包含药 物、赋形剂和容器/密封系统。可在本发明的化合物中加入一种或多种称 为无活性成分的赋形剂，以改善或有利于制造、稳定性、药物的给药和安 全性，可提供一种实现药物所需释放方式的工具。因此，加入该药物中的 赋形剂的类型取决于多种因素，例如药物的理化性能、给药途径和制造方 法。药学上可接受的赋形剂该领域己具有，包括各种药典中所列出的那些(见USP、 JP、 EP禾卩BP、 FDAweb页(www.fda.gov)，惰性成分指南 (Inactive Ingredient Guide) 1996 ， 和药物添加剂手册(Handbook ofPharmaceutical Additives),Ash 编；Synapse Information Resources Inc.2002)。可用该领域熟知的任何方法制备本发明化合物的药物剂量形式，如常 规的混合法、过筛、溶解、融化、制粒、糖衣丸制备、制片、悬浮、挤 压、喷雾干燥、研磨、乳化、(纳米/微米)包裹、陷夹或冻干加工。如 上所述本发明的组合物可包含一种或多种生理上可接受的无活性成分，以 有利于将活性分子加工到具有药物用途的制品中。适当的制剂取决于所需的给药途径。对于静脉注射，例如，该组合物 可配制成水溶液，如果需要，可采用生理相容性缓冲剂，包括例如，磷 酸、组氨酸或柠檬酸来调节制剂的pH ，和采用张力调节剂如氯化钠或葡 萄糖。对于经粘膜或鼻内给药，优选半固体、液体制剂或贴片，可含渗透 增强剂，这类渗透增强剂是该领域通常知道的。对于口服给药，可将该化 合物配制成液体或固体剂量形式，和一次性释放或控释/缓释制剂。适合 受试者口服的剂量形式包括片剂、丸药、糖丸、硬和软壳胶囊、液体、凝 胶、糖浆、糖水、悬浮液和乳液。该化合物也可配制在直肠组合物中，如 锭剂或保留灌肠剂中，如含有常规锭剂基质如可可油或其它甘油基质的灌 肠剂中。可采用赋形剂，包括填充剂、崩解剂、粘合剂(干的或湿的)、溶解 延缓剂、润滑剂、促滑剂、防粘剂、阳离子交换树脂、增湿剂、抗氧化 剂、防腐剂、着色剂和芳香剂。这些赋形剂可来源于合成的或天然的。这 类赋形剂的例子包括纤维素衍生物、柠檬酸、磷酸二钙、明胶、碳酸镁、 月桂酸硫酸镁/钠、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸盐、二氧
化硅、苯甲酸钠、山梨醇、淀粉、硬脂酸及其盐、糖(即葡萄糖、蔗糖、 乳糖等)、滑石粉、西黄耆胶粘浆、植物油(加氢的)和蜡。乙醇和水可 作为制粒辅助剂。在某些情况下，可能需要用掩蔽气味的膜、抗胃酸膜、 或释放延巧缓膜来包裹片剂。常常联用天然和合成的聚合物与着色剂、 糖、有机溶剂和水来包裹片剂，产生糖丸。当包裹药片、药粉、悬浮液或 溶液优选用胶囊时，可以相容的硬或软壳胶囊来输送。在一实施方案中，可局部，例如通过皮肤贴片、半固体开液体制剂， 如凝胶、(小)浮剂、软膏、溶液、(纳米/微米)悬浮液、或泡沫制剂 给予本发明的化合物。可采用例如，渗透促进剂；适当选择和组合亲脂 性、亲水性和两性赋形剂，包括水、有机溶剂、蜡、油、合成的和天然的聚合物、表面活性剂、促乳化剂，通过调节pH 、采用促混合剂，来调节药物对皮肤和其下组织的渗透。可采用其它技术，如离子电渗疗法，来调 节本发明化合物对皮肤的渗透。优选透皮或局部给药，例如在需要最低限 度全身接触的情况下局部输送药物。对于吸入给药或鼻内给药，本发明的化合物可以溶液、悬液、乳液或 加压包装的半固体气溶胶形式或采用螺旋桨推进的喷雾器，如甲烷和乙 烷、二氧化碳或任何其它合适的气体产生的卤化碳常规输送。对于局部施 加气溶胶，可采用丁烷、异丁烷和戊烷类碳氢化合物。就加压气溶胶而 言，可通过提供-输送确定量气溶胶的阀门来确定适当的剂量单位。可配 制用于吸入器或吹入器中的胶囊和明胶栓。这些胶囊或栓通常含有化合物 的混合粉末和适合的粉末基质，如乳糖和淀粉。通常以单位剂量形式，如在安瓿、注射器、注射笔或多剂量容器(常 含有防腐剂)中，提供配制的用于胃肠道外注射的除菌组合物。此组合物 可采取悬液、溶液或油性或水性乳液形式，可含有配制试剂，如缓冲剂、 强化剂、粘性增强剂、表面活性剂、悬而未决浮和分散剂、抗氧化剂、生 物相容性聚合物、螯合剂和防腐剂。取决于注射部位，到家载体可含水、 合成的油或植物油和/或有机促溶剂。某些情况下，如冻干产品或浓縮产 品时，可在给药之前重建或稀释胃肠道外给药制剂。可提供本发明化合物 控释或缓释的储存制剂，可包含纳米/微米级颗粒或纳米/微米级或非微 化晶体的可注射悬浮液。聚合物，除该领域熟知的那些外，如聚(乳酸)
聚(羟乙酸)，或其共聚物或用作控释/缓释基质。可以植入物和需要切 割的泵形式提供其它储存输送系统。本领域熟知适合静脉注射本发明分子的载体，其包括能形成离子化化 合物的含碱如氢氧化钠的和作为增强剂的蔗糖或氯化钠的碱性溶液，例 如，含磷酸或组氨酸的缓冲液。可加入共溶剂，如聚乙二醇。这些水系统 能有效溶解本发明的化合物，对全身给药只产生低毒性。溶液系统的各组 分比例可相当不同而不破坏其溶解性和毒性特征。另外，诸组分的身分可 以改变。例如，可采用低毒的表面活性剂，如聚山15梨醋或波洛沙姆， 可加入聚乙二醇或其它共溶剂、生物相容性聚合物如聚乙烯吡咯垸酮，其 它糖和聚醇来代替葡萄糖。对于目前治疗方法所用的组合物，起初可用本领域熟知的各种技术估 计治疗有效剂量。动物研究所用的最初剂量可根据细胞培养试验确定的有 效浓度而定。适合人用的剂量范围可用动物研究和细胞培养所获得的数据 确定。本发明的化合物或药物的治疗有效量或剂量，指该化合物或药物可导 致受试者的症状缓解或生存延长的量或剂量。这类分子的毒性和治疗效果 可通过在细胞培养或实验动物中进行标准的药学程序来确定，例如，通过测定LD50 (导致50%群体死亡的剂量)和ED50 (50 %群体治疗有效的 剂量)来确定。毒性和疗效的剂量比值是治疗指数，可用LD50/ED50比值 表示。优选显示高治疗指数的制剂。有效量或治疗有效量是所述化合物或药物组合物能诱导研究者、兽 医、医生或其它临床人员所认为的组织、系统、动物或人产生生物学或医 反应的量，例如能调节葡萄糖代谢、降低升高的或增加的血糖水平、治疗 或预防葡萄糖代谢改变相关疾病如糖尿病的量。优选项的剂量应落在包括ED50并有极小或没有毒性的循环浓度范围 内。剂量可在此范围内根据所用的剂量形式和/或给药途径而变化。应按 照本领域己知方法根据受试者状况的特征选择精确的制剂、给药途径、剂 量和剂量间隔。可个别调整剂量和间隔以提供能充分获得所需效果，如调节葡萄糖代 谢、降低血糖水平等的血浆水平的活性成分，即尽量减少有效浓度
(MEC)。各化合物的MEC不同但可从例如体外资料和动物实验估计。 需要获得MEC的剂量取决于个体的特征和给药途径。就局部给药或选择 性摄入而言，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。可根据多种因素，包括待治疗受试者的性别、年龄和体重、疾病的严 重程度、给药方式和医生的判断确定给予的制剂或组合物的量。如果需要，本发明的组合物可以装在含一个或多个单位剂量形式(含 有活性成分)的填装或分散装置中。例如，这种填装或装置可包括金属或 塑料泊，如起泡填装物或玻璃和橡皮塞如小瓶中。该填装或分散装置可装 有给药说明书。也可制备用相容性药学载体配制的含本发明化合物的组合 物，装其放在适当的容器中，贴上治疗某种标明疾病的标签。化合物及其筛选方法本发明的化合物是能抑制羟化酶活性的化合物，具体说，其中的羟化 酶活性是2-酮戊二酸双加氧酶活性。更优选羟化酶活性是HIF羟化酶的活 性。最优选羟化酶活性是HIF脯氨酞羟化酶的活性。本发明的方法是依靠稳定HIFa以实现受试者的特殊效果的方法。通 过给予受试者能稳定HIFa以实现受试者的特殊效果的化合物来完成本发 明的方法。最优选通过给予本发明的化合物来实施该方法。本发明的化合物示范性地用于本发明与稳定HIFa有关的方法中。具 体说，本发明提供能抑制羟化酶活性和/或HIFa羟化、稳定HIFcx等的化 合物，和筛选及鉴定其它化合物的方法。本发明的化合物包括能抑制羟化 酶活性的化合物，其中优选的羟化活性是2-酮戊二酸双加氧酶的活性。更 优选羟化酶活性是HIF羟化酶的活性。HIF羟化酶可羟化HIF蛋白，优 选HIFa亚基中的任何氨基酸，包括例如，脯氨酸或25天冬氨酸残基等。 在-特别优选的实施方案中，所述羟化酶活性是HIF脯氨酰羟化酶和/或 HIF天冬酰胺羟化酶的活性。本领域知道2 —酮戊二酸双加氧酶的抑制剂。例如，己鉴定到前胶原 脯氨酰4-羟化酶的几种小分子抑制齐U(见Majamaa等，Eur J Biochem 138 : 239 -245 , 1954 ; Majamaa等，Biochem J 229 : 127 -133 , 1985 ; Kivirikko和 Myllyharju , Matrix Biol 16 : 357 -368 ， 30 1998 ; Bickel等，Hepatology 28 : 404 -411 , 1998 ; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97 : 4736-4741 ，2000 ; Franklin等，Biochem J 353 : 333 -338 , 2001 ;所有文献的内容都 纳入本文作参考)。也己鉴定到HIF羟化酶的小分子抑制剂(见国际公开 号WO 02/07498l，WO 03/049686和WO 03/080566,所有文献的内容纳入本 文作参考)。本发明特别考虑采用能用本领域已知方法鉴定的这些和其它 的化合物。2-酮戊二酸双加氧酶家族中的所有酶对于它们的羟化酶活性都需要 氧、Fe2+、 2-酮戊二酸和抗坏血酸(见Majamaa等，Biochem J 229 : 127 -133 , 1985 : Myllyharju和Kivirikko EMBO J 16 : 1173-1180， 1997; Thomburg等，32 : 14023 -14033 ， 1993 ;和Jia等，Pro Natl Acad Sci USA 91 : 7227-7231 )。因此，本发明的化合物包括但不限于铁螯合 剂、2-酮戊二酸模拟物和修饰的氨基酸如脯氨酸或天冬氨酸同类物。在具体的实施方案中，本发明提供使用2-酮戊二酸的结构模拟物。这 种化合物可竞争性抑制靶子2-酮戊二酸双加氧酶与2-酮戊二酸的反应，并 非竞争性其与铁的反应(Majamaa等1954 ，同上；Majamaa等，1985 ， 同上)。特别考虑采用例如Majamaa等，同上；Kiviri硅。和Myllyharju ， Matrix Biol 16 : 357 -368 , 1995 ; Bickd等，Hepatology 28 : 404-411 ， 1998 ; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97 : 4736 -4741 ， 2000 ; Franklin , Biochem Soc Trans 19 : 8 12 -815 , 1991 : Franklin等，Biochem J 353 : 333 -338,2001和国际公开号WO 03/049686中所述的化合物，以上所有文献 的内容纳入本文作参考。示范性的化合物包括菲咯啉，其包括但不限于美国专利5，916，898和 6,200,974;国际出版物WO 99/21860中所述的那些；杂环羰基甘氨酸，包 括但不限于美国专利5，719，164和5,726,305中所述取代的喹啉-2-酞胺及 其酯；美国专利6,093,730中所述取代的异喹啉-3-酰胺及其酯；欧洲专利 EPO650961和美国专利5,658,933中所述的3-甲氧基吡啶羰基甘油及其酯； 美国专利5,620,995和6,020,350中所述的3-羟基吡啶羰基甘油及其酯；美 国专利5,607,954、 5,610,172和5,620,996中所述的5-亚磺酞氨基羰基吡啶 '羧酸盐及其酯。这些专利中列出的所有化合物，特别是权利要求化合物中 和工作实施例中列出的那些化合物都纳入本申请书中作参考。
因此，本发明的优选化合物包括，例如杂环酰胺。特别优选的杂环酰 胺包括，例如异喹啉、喹啉、吡啶、噌啉、咔啉等。此外，优选化合物的 结构类型包括蒽醌、氮杂芴、氮杂菲咯啉、苯并咪唑啉、苯并呋喃、苯并 吡喃、苯并噻吩、儿茶酚、二氢色原酮、(X-二酮、呋喃、N-羟基酰胺、N-羟基脲、咪唑、吲唑、吲哚、异噻二唑、异噻唑、异噁二唑、异噁唑、a-酮酸、a-酮酰胺、a-酮酯、a-酮亚胺、噁二唑、草酰酰胺、噁唑、噁唑 啉、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、哒嗪、吡啶、喹唑啉、菲咯啉、 四唑、噻二唑、噻唑、噻唑啉、噻吩和三唑。以下用于本发明实施例中的示范性化合物表明了本文所述本发明的方 法[(7-氯-3-羟基-喹啉基-2-羰基)氨基)]-乙酸(化合物八)，[(1-氯-4-羟基-异喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物B)， [(4-羟基-7-苯氧基-异喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物C )，4-氧-l，4-二氢-[l,10]菲咯啉基-3-羧酸(化合 物D),[(l-氯-4-羟基-7-甲氧基-异喹啉基-3-羰基)氨基]-乙酸(化合物E)， [(3-羟基-6-异丙氧基-喹啉基-2-羰基)氨基]-乙酸(化合物F), [(3-羟基-卩比啶基-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物G)，和[(7-节氧基-l-氯-4-羟基-异喹啉基-3-羰基) 氨基]-乙酸甲酯(化合物H)。可采用各种试验和筛选技术，包括下述的那些，来鉴定本发明的化合 物，即能制羟化酶活性的化合物。这些化合物适合用于本发明方法中。适 合用于本发明方法中的其它化合物，即能稳定HIFa的化合物可由该领域 技术人员用己有的试验和筛选方法作鉴定。试验通常可提供与反应底物的消耗，或与反应产物的产生有关的可检 测信号。检测例如可包括荧光团、放射性同位素、酶偶联物和本领域熟 知的其它可检测标记。结果可以是定量或定性的。标记物可有利于反应产 物的分离，如生物素或组氨酸尾可通过沉淀或亲和层析使反应产物从其它 反应成分中纯化出来。本领域标准化了测定羟化酶活性的试验。这类试验能直接或间接测定 羟化酶的活性。例如，某试验能测定酶底物，如靶蛋白、合成肽模拟物、 或其片段中存在的羟化残基，如脯氨酸、天冬氨酸等(见Palmerini等，J Chromatogr 339 : 285 -292 ， 1985 )。还原某化合物中存在的羟化脯氨酸或 天冬氨酸表明该化合物能抑制羟化酶活性。或者所述试验能测定羟化反应
的其它产物，如2-酮戊二酸形成的琥珀酸(见Cunliffe等，BiochemJ240: 617-619 ) 。 Kaule和G丽ler (Anal Biochem 184 : 291 -297 ， 1990 )描述 了一种测定2-酮戊二酸产生琥珀酸的示范性方法。上述这些方法可用于鉴定能调节HIF羟化酶活性的化合物。实施例 14中描述了示范性方法(见上)。靶蛋白可包括HIFa或其片段，如 HIF(556-575);例如实施例14中所述试验用的典型底物为 DLDLEMLAPYIPMDDDFQL(SEQ ID NO:5 )。所述酶包括，例如获自任何 来源的HIF脯氨酰羟化酶(见GenBank登录号No . AAG33965等)、HIF 天冬氨酰羟化酶(见GenBank登录号No.AAL27308等)。所述酶可存在 于细胞粗制裂解液中，或是部分纯化形式。例如，在Ivan等(Science 292: 464 -468 , 2001和Proc Natl Acad Sci USA 99 : 13459 -13464 ， 2002 )和 Hirsila等(J Bio Chem 278 : 30772 -30780 , 30 2003 )中描述了直接或间接 测定HIF羟化酶活性的方法；国际公开号WO 03/049686中描述了其它方 法。测定和比较缺少和存在所述化合物时的酶活性，将鉴定到能抑制 HIFot羟化的化合物。HIFa稳定性和/或HIF激活的试验可包括直接测定样品中的HIFa (见实施例14,同上)、通过测定与vonHippelLindau蛋白质相关的HIFa 减少(见国际公开号WO 00/69908)、或HIF应答性靶基因或报导构建物的 活化(见美国专利No.5,942，434)来间接测定HIFa。测定和比较缺少和存在 所述化合物时HIF和/或HIF-应答性靶蛋白质的水平，将鉴定到能稳定 HIFa和/或活化HIFa的化合物。可采用基于2-氧化[l-"C]戊二酸羟化-偶联脱羧基试验，鉴定能调节 HIF特异性脯氨酰羟化酶活性的化合物(见Hirsila等，J Bio Chem 278 : 30772-30780,2003 )。该反应25"C在1.0 ml的反应体积中进行，其中含 10-100微升洗涤剂如Triton-X-lOO、获自表达内源性HIF脯氨酰羟化酶或 重组HIF脯氨酰羟化酶的裂解细胞提取液、0.05pM DLDLEMLAPYIPMDDDFQL ( SEQ ID NO : 5 ) 、 0.005, FeS04 0.16jxM 2-氧化[1-4(:]戊二酸、2pM抗坏血酸、60pg过氧化氢酶、O.l(iM 二硫苏糖 醇和50pM Tris-盐酸缓冲液，调pH到7.8。 37°C进行反应20分钟。该反
应产生的"C02被捕捉在悬褂于反应混合物上方大气中浸泡碱液的滤纸 上，并在液闪计数器中计数。通过阅读本文内容本领域普通技术人员不难实施本发明的这些和其它 实施方案。实施例参见以下目的纯粹是说明本发明的实施例将能进-步了解木发明。提 供这些实施例只是为了说明本发明的权利要求。本发明不限于目的是说明 本发明-个方面的示范性实施例所述的范围。功能上相等的任何方法都在 本发明的范围内。本领域技术人员懂得按照以上描述并参考附图可对本发 明作出本文所述以外的各种修改，这类修改都属于本发明权利要求的范 围。实施例l:实验材料通常，用于本发明方法用的脯氨酰羟化酶抑制剂化合物是采用本领域 技术人员已知的标准化学方法合成的。用高效液本色谱分析化合物的纯 度，室温避光保存。在制备不同用途的制剂时，采用PULVERISETTE 7 行星式超微磨(FritshGMBH, Germany )以750rpm使化合物悬浮超粉化 20分钟以形成均匀大小的颗粒。在使用前立即制备经口管饲的超微粉化合物的悬浮液。给药时将化合 物悬浮在含0.5X羧甲基纤维素(CMC; Spectrum Chemical Gardena CA), 0.1 %聚山梨酯80 (Mallinckrodt Baker,Inc., Phillipsburg NJ)的水溶液中，用磁 搅拌器或旋转摇动持续搅拌。计算悬液的浓度达到给定体积和所需剂量水 平。另外的方法中，秤重化合物并置于适当大小的明胶胶囊中用于口服， 对照动物接受同样大小的空胶囊；或将化合物随意溶于代替水的lOOmM 的组氨酸(Mailinckrodt Baker)溶液中。对于注射给药，先将化合物与等摩尔量的氢氧化钠混合于10%的葡萄 糖(Spectmm)或25mM组氨酸加等渗氯化钠(Mailinckrodt Baker)的水溶 液中。实施例2 :葡萄糖调节因子的体外表达增加本发明化合物对参与葡萄糖调节和代tf的蛋白质和基因的表达的作用 如下。将人293A细胞(腺病毒转化的胎肾上皮细胞)铺满接种在装有含5% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基的35mm养皿中，37°C， 10。/。C02条件下培养l天。将培养基换成Opti-Meml ，继18-24小时。在 培养基中另入载体对照或化合物B ，再培养24、 48或72小时。将平板置 于冰上弃去培养上清液，加入裂解缓冲液-l(LB-l: 10mM Tris pH7.4, lmM EDTA,150mM氯化钠，0.5%IGEPAL)。刮下收集细胞裂解物，将其在冰 上培育15分钟，然后4。C离心3000xg5分钟分级。收集代表胞质组分的上 清液，用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件下分离胞质蛋 白，每泳道加入等到量的蛋白质。在150V下进行SDS-PAGE 2小时，将蛋白质转移到PVDF膜上，在 4°C 400mA 1.5小时。用T-TBS洗一次，加入用封闭缓冲液稀释到工作浓 度的抗醛缩酶抗体。4°C轻摇培育过夜。用T-TBS洗膜4次，然后与用封 闭缓冲液稀释的偶联第二抗体室温培育l小时。用T-TBA洗膜4次，然后 用X-光胶片和ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO或PICO化学发光底物 (Pierce Chemical Co. Rockford IL)按照制造商说明书显影和观察。如图1A所示，用化合物B处理24、 48和72小时的细胞中醛縮酶的 表达随时间而增加，但用载体对照处理的细胞中醛縮酶表达不见增加。化 合物B处理培养物未显示p-微管蛋白表达增加，表明醛縮酶的增加是特异 性的，与蛋白质表达的总体增加无关。这些结果表明本发明的化合物和方法可用于调节参与糖酵解基因的表 达，并提示用本发明化合物治疗可通过增强糖酵解而提高葡萄糖的利用率 和代谢。实施例3 :葡萄糖转运蛋白(GluT)-l的体外表达增加 在100mm培养皿中，37°C， 10% C02条件下在含10%胎牛血清的 DMEM培养基中培养人SSC-25 (鳞状上皮细胞癌)或大鼠H9c2 (心室心 肌细胞)至铺满。用PBS洗细胞2次，与载体对照、化合物D(10和25)或化合物C(5 、 10和20pM )培育16小时。将平板置于冰上， 弃去培养上清液，加入裂解缓冲液-l(LB-l : 10mMTrispH7.4，lmMEDTA， 150mM氯化钠，0.5。/。IGEPAL )。刮下收集细胞裂解物，冰上培育15分 钟，然后4°C离心3000xg5分钟。收集代表胞质组分的上清液，用SDS-
聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )在还原条件下分离胞质蛋白，每泳道加 入等到量的蛋白质。在150V下进行SDS-PAGE2小时，然后4°C 400mA 1.5小时或过夜， 将蛋白质转移到PVDF膜上，用T-TBS洗一次，加入用封闭缓冲液稀释到 工作浓度的抗-GluT-l抗体(Alpha Diagnostics )。 4°C轻摇培育过夜后， 用T-TBS洗膜4次，然后与用封闭缓冲液稀释的偶联第二抗体室温培育1 小时。用T-TBA洗膜4次，然后用X-光胶片和ECLSUPERSIGNALWEST FEMTO或PICO化学发光底物(PierceVhemicalCo.RockfordIL )按照制 造商说明书显影和观察。图IB所示资料表明化合物D和化合物C分别提高了 SSC-25和H9c2 细胞的介导葡萄糖摄入的主要可诱导葡萄糖转运蛋白，GluT-1蛋白的水 平。本发明的化合物和方法能够提高细胞的GluT-1表达提供了研究化合物 对葡萄糖体外摄取作用的工具。这些结果显示本发明的化合物和方法可用 于提高参与葡萄糖摄入的蛋白质的表达，因而为高血糖症、糖尿病或葡萄 糖体内平衡调节有缺陷的其它疾病病人，提供了增强葡萄糖摄入和降低血 糖水平的治疗方法。实施例4 :葡萄糖调节因子的体外表达增加为了确定基因随时间推移的诱导方式，从Simonsen.Inc获得雄性Swiss Webster小鼠(30-32克)24只并用口饲管口服4ml/kg体积的0.5%羧甲 基纤维素(CMC : Sigma-Aldrich , St. Louis Mo) ( Omg / kg /天)或1.25 % 化合物B(25mg/ml0.5。/。CMC)(10Omg/kg)治疗。在最后一次服药后4 、 8 、 16 、 24 、 48和72小时，用异氟垸麻醉。然后处死小鼠，分离得到 肾、肝、脑、肺和心脏的组织样品，储存于-2(TC的RNALATER溶液液 (Ambion)中。为了研究本发明化合物的剂量反应，将12只雄性Swiss Webster小鼠 (30-32克，获自Simonsen,Inc.,GilroyCA )每天一次用口饲管口服4ml/kg 体积的0.5%羧甲基纤维素(CMC : Sigma-Aldrich ， St丄ouis MO)、化合物D (25mg/ml，用0.5 % CMC配)、或化合物B (7.5和25mg/ml ，用0.5 % CMC 配)(分别30和lOOmg/kg/天)治疗4天。在最后一次服药后4小时，麻
醉并处死小鼠，分离得到约150mg的肝和每只肾，并储存在-2(TC的 RNALATER溶液液(Ambion )中。用以下方法分离上述实验所得组织的RNA :各器官制成50mg的 小方块，加入875微升RLT缓沖液(RNEARY试剂盒Qiagen Inc.， Valencia CA)，用旋转式POLYTRON匀浆器(Kinematica， Inc., Cincinnati OH)匀 浆化切片20秒。微离心匀浆液3分钟沉降不溶性物质，将上清液转移到一 新试管中，用RNEASY试剂盒(Qiagen)按制造商说明书分离得到RNA 。 该RNA洗脱在80微升水中，用RIBOGREEN试剂(Molecular Probes, Eugene OR )定量。然后用DNA — FREE试剂盒(Ambion Inc., Austin TX) 按制造商说明书除去RNA中的基因组DNA 。测定260和280吸光值确 定RNA的纯度和浓度。或者将组织样品切成小方块在TRIZOL试剂(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA)中用旋转式POLYTRON匀浆器(Kinematica) 匀浆化。匀浆液置室温另入0.2体积的氯仿强烈搅拌样品。室温培育混合 物几分钟，然后4。C 12,000g离心15分钟。收集水相加入0.5体积的异丙 醇。室温混合样品IO分钟，4°C 12，000g离心10分钟。弃去上清，沉淀用 75% EtOH洗涤，4°C 7 ， 5,000g离心5分钟。用DNA-FREE试剂盒 (Ambion Inc., Austin TX)按制造商说明书除去RNA中的基因组DNA 。 测定260和280吸光值确定RNA的纯度和浓度。用0.3M乙酸钠(pH5.2 )、 50ng/ml糖原和2.5体积的乙醇，-20°C沉 淀RNA—小时。离心样品用80%冷乙醇洗涤沉淀，干燥，重悬于水中。 用T7-dT )24第 一 链引物(Affymetrix, Inc., Santa Vlara CA )和 SUPERSCRIPT CHOICE系统(Invitrogen)按照制造商说明书合成双链 cDNA 。用等到体积25:14:1的酚氯仿异戊醇和PHASE LOCK GEL 插入物(brinkman， Inc., Westbury NY)抽提最终的cDNA。收集水相用0.5体 积的7.5M乙酸铵和2.5体积的乙醇沉淀cDNA。或者，用GENECHIP样 品清除模块(Affymetrix )接制造商说明书纯化cDNA 。用BIOARRAY HIGHY正LD RNA转录标记试剂盒(Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY )按制造商说明书在体外翻译反应中从cDNA合成生 物素标记的cRNA。用GENECfflP样品清除模块(Affymetrix)接制造商
说明书纯化最后标记的产物并片段化。在lx杂交缓冲液(lOOmM MES ，lM[Na+] ,20mM EDTA ,0.01 % Tween 20)中加入5吗探针，100吗/ml鲱鱼精子DNA ， 500ng/ml乙酰化BSA ， 0.03nM对照寡B2 (Affymetrix)和lx GENECHIP真核杂交对照物 (Affymetrix)，制备杂交混合物。将此杂交混合物依次在99°C和45°C培 育5分钟，然后离心5分钟。将鼠基因组U74AV2阵列(MG-U74AV2; Affymetrix)置于室温，然后与lx杂交液45'C摇动预杂交10分钟。该缓冲用80微升杂交混合物置换，以60rpm45。C将该阵列与计量 平衡液杂交16小时。杂交后用6xSSPE,0.1 %Tween20洗涤阵列一次，然 后洗涤并用R-藻红蛋白偶联的链霉亲和素(Molecular Probes, Eugene OR)、 生物素化羊抗链霉亲和素抗体(Vector Laboratories, Burlingame CA)禾口 GENECHIP Fluidics Station 400仪器(Affymetrix)按照制造商的micro—lvl 程序(Affymetrix)染色。用GENEARRAY扫描仪(Affymetrix)和微阵列 组软件(Affymetrix)分析此阵列。鼠基因组U74AV2阵列(MG-U74AV2 ; Affymetrix )提供了 Mouse UniGene Database build 74 (生物技术信息国家中心(National center for Biotechnology Information, Bethesda MD ))中的所有序列(约6000个)， 该序列己经功能性特征分析并有约6000个未注释的表达序列标签(EST) 簇。如图2A 、 2B和2C所示，编码参与葡萄糖调节酶的基因的表达，在 用化合物B处理后以协同方式增加。图2A 、 2B和2C提供的转录模式 包括血小板类型的磷酸果糖激酶(PFK)-P(A)、肝脏类型的PFK-L(B)、烯 醇化酶-l(C)、葡萄糖转运蛋白(GluT)-l (D)、乳酸脱氢酶-l(E)、醛縮酶-l(F) 和已糖激酶-l(G)。在时间曲线中，大多数mRNA水平在给予化合物后早 期达到峰值，24-48小时后回到对照水平。另外，不同器官之间编码糖酵 解酶的基因表达相类似，但肾(图2A)肝(图2B)和肺(图2C)在特定 mRNA相对表达水平的增加和增加的时间上表现不同。这些不同部分与向 各组织提供重要能源，特别在应激时提供能源的糖酵解活动程度不同相关。 这些结果表明本发明的化合物可特异性诱导糖酵解作用，这些作用可因组 织而不同。
如图3A所示，低剂量(30mg/ml)或高剂量(100mg/ml )化合物处 理可导致肾中GluT-l编码基因表达的剂量依赖性改变。此例中GluT-l表 达的增加提供了通过促进细胞摄取葡萄糖来调节血糖水平的机制。如图3B 所示，用化合物B处理导致肾和肝中IGFBP-1表达的几乎相同的瞬时诱 导，但一种组织与另一种组织相比表达水平在量上有所不同。IGFBP-I促 进了胰岛素样生长因子的转运，提高了 IGFBP-1的循环水平，以及提高了 胰岛素敏感性和葡萄糖的利用效果，这与例如持久的训练有关(见Marietta 等，Metabolism 52 : 821-826 ， 2003 )。因此，本发明的化合物可特异性诱 导血糖摄取的直接介导剂，并间接作用于血糖和葡萄糖调节的体液调节剂。实施例5 :葡萄糖的摄取增加胰岛素耐受使机体对胰岛素反应的能力降低。胰岛素耐受或胰岛素敏 感性降低，常与高血糖症、糖尿病和高胰岛素血症相关连。胰岛素耐受降 低或胰岛素敏感性增加可通过以下测定给予本发明化合物后葡萄糖的摄入 来测定。为了测定本发明化合物对体内葡萄糖摄入的影响，给DIO (饮食诱导 的肥胖)大鼠(Charles River)词喂高脂肪食物4周以诱导肥胖和胰岛素耐 受。或者，可采用ZDF大鼠或2型糖尿病的任何其它遗传动物模型。将 动物分成治疗和对照组。治疗动物接受所述化合物10天而其余接受高脂食 物。10天后在全麻下给禁食动物作颈静颈动脉和股动脉插管。用一种定量 测定胰岛素耐受的参比方法，即高胰岛素血-正常血糖维持程序进行胰岛素 连续灌注和10%葡萄糖灌注，速度足以将血浆葡萄糖水平维持在基础浓度。 收取血样品监测血糖水平并适当调节葡萄糖灌注速度。在正常血糖稳态条件下，机体所有组织的葡萄糖灌注速度等于葡萄糖 摄入速度，因此是组织胰岛素敏感性的一种衡量指标。在此维持程序之前 和稳态时灌注的[3-3司葡萄糖可估计基础的和胰岛素激发的全身葡萄糖流 通量。 一旦达到稳态葡萄糖水平(约60-75分钟)，加入作为药团的2-脱氧 -0-[1-14(:]葡萄糖来估计各组织中胰岛素激发的葡萄糖摄取。在药团注射后 1 、 3 、 5 、 10 、 20 、 30和45分钟，测定血样的葡萄糖和示踪物的浓 度。120分钟安乐死后收集组织样品测定葡萄糖的具体组织摄取。这些方法 对本领域技术人员来说是显然易见的。
用本发明化合物治疗的动物，其组织如肌肉和肝脏，通过对胰岛素敏 感性的提高和对胰岛素耐受的降低而提高了葡萄糖的摄取。给予本发明的 化合物后葡萄糖摄取的增加，表明本发明的化合物可用于胰岛素耐受的病 人，可胰岛素敏感性降低或受损的病人来治疗性降低其胰岛素耐受和提高 其胰岛素敏感性。因此，本发明的方法和化合物对高血糖症、糖尿病病人 或其它葡萄糖体内平衡调节缺陷病人，可提高其体内葡萄糖摄取和降低其 血糖水平。实施例6 :血糖水平的剂量依赖性降低如下研究了给予化合物对血糖水平的作用。给予从Simonsen， Inc.获 得的50只雄性Spraque Dawley大鼠(6-7周龄)0.5 % CMC (Sigma-Aldrich)或20 、 60 、 100 、 200mg/kg体重的化合物B ，通过口 饲管口服每天一次，连续14天。监测动物的体重变化和看得见的毒性和死 亡信号。第15天，让动物禁食过夜但可自由饮水，用异氟烷麻醉动物，打 开腹腔，收集下腔静脉血液。将约lml的一份样品收集到含EDTA的试管 中作血液学分析，将约lml的第二份样品收集到不抗凝的试管中作血清化 学分析。血样分析由IDEXX ( West Sacramento ， CA)进行。如图4所示，两次分开的实验表明，用本发明化合物治疗的动物显示 了血糖水平的剂量依赖性降低。化合物剂量与血糖水平之间的关系提示， 采用本发明方法和化合物以适当剂量可将血糖维持在理想水平。因此，本 发明的方法和化合物可用于调节，具体说降低血糖水平。因此，本发明的 方法和化合物可用于治疗性降低受试者的血糖水平，例如降低患有葡萄糖 调节疾病如高血糖症或糖尿病受试者的血糖水平。实施例7 :饮食诱导的2型糖尿病动物模型的葡萄糖耐受增强采用喂养高脂饮食产生严重肥胖、高血糖症和高胰岛素血症的 C57BL/6J小鼠作为饮食诱导肥胖、2型糖尿病和葡萄糖耐的模型。将获自 Jackson Laboratory (Bar Harbor ME)的40只雄性C57BL/6J小鼠分成以下实验组组l :载体对照动物，饲喂标准的小鼠口粮(n=10);组2 :饲 喂标准的小鼠口粮并口饲管给予75mg/kg/天的化合物E(r^10):组3 :载 体对照。动物饲喂高脂小鼠口粮(研究饮食45%脂肪)(n=10);组4 :动 物词喂高脂小鼠口粮和口饲管给予75mg/kg/天的化合物E (n=10)。饲养方
案持续进行14天，每天测定体重和食品消耗。在腹腔内葡萄糖耐受试验(IPGTT)前动物禁食4小时，采用kg体重2克葡萄糖负荷量。给予葡 萄糖后0、 15、 30 、 60和90分钟取血样作血糖水平测定。如图5A所示，服用标准食粮与给予的(RxChow)化合物或不用(VeChow)化合物的小鼠，与服食高脂饮食用化合物(RxHF)治疗的小 鼠，葡萄糖清除速率几乎相同和基本上相同。然而，高脂饮食不用化合物(VeHF)的小鼠葡萄糖清除速率比其它组小鼠低。计算各动物IPGTT曲线(AUC)下葡萄糖区域的差异，比较标准食粮加化合物(RxChow)和不用 化合物(VeChow)治疗的动物与高脂饮食不用(VeHF)的动物差异有统计 学意义(t检验，PO.OOl)。此外，当比较高脂饮食不用化合物(VeHF)的 动物与高脂饮食用化合物(RxHF)治疗的动物的葡萄糖AUC ，发现血糖 水平差异有统计学意义(t检验，P<0.05)。(见图5B)。然而如图5B所示， 标准饮食(RxChow )或高脂饮食(RxHF)治疗小鼠与标准饮食不用化合 物(VeChow)小鼠之间的葡萄糖AUC无统计学差异。这些数据表明，在饮食诱导的肥胖和葡萄糖耐受受损动物模型中，用 本发明化合物治疗的动物血中葡萄糖清除改善、血糖水平降低、葡萄糖机 耐受正常化和葡萄糖体内平衡得到恢复。这些结果提示受治疗动物的葡萄 糖利用和调节得到改善。本发明化合物恢复了饮食诱导的葡萄糖利用和调 节(如葡萄糖耐受受损)受损动物模型的正常葡萄糖耐受，表明本发明的 方法和化合物可用于治疗性恢复葡萄糖耐受受损病人的葡萄糖体内平衡。给予本发明化合物后葡萄糖利用和调节的改善和葡萄糖体内平衡的恢 复，也可用口服葡萄糖耐受试验(OGTT)测定。进行上述实施例7中所 述的类似实验来测定给予的化合物对血糖水平的作用。将40只C57BL/6J 小鼠分成以下实验组组l :载体对照动物，饲喂标准的小鼠口粮(11=10); 组2 :载体对照动物，饲喂高脂小鼠口粮(研究饮食45%脂肪)(n=10); 组3 :动物词喂高脂小鼠口粮并口饲管给予75mg/kg/天的化合物E (n=10):组4 :动物饲喂高脂小鼠口粮和口饲管给予75mg/kg/天的化合物 A(n=10)。饲养方案持续进行28天，每周测定体重。在OGTT前动物禁 食过夜，采用kg体重1克葡萄糖负荷量。给予葡萄糖后0、 30 、 60 、 90 、 120和180分钟取血样葡萄糖水平测定。 实施例8 :血红素的糖化降低各种糖(最常见葡萄糖)通过结合于血红素分子而形成糖化血红素， 其形成的速度与务葡萄糖浓度成正比。测定糖化血红素水平提供了前2-3 个月平均血糖浓度的精确指数。临床上糖化血红素水平可估计糖尿病病人 或高血糖症病人的血糖控制情况。如下用糖尿病小鼠模型研究了给予化合物对糖化血红素水平的作用。 使20只雄巧性db / db小鼠(Harlan)接受含载体(100pM组氨酸)或化 合物A(0.5mg/ml)的饮用水8周。研究开始前和治疗后4和8周，收集 尾静脉血样品，用HbAlcNow试剂盒(Metrika Inc.， Sunnyvale CA )测定 HbAlc水平。对照组8周时HbAlc水平y离基线显著上升(PO.05)。如图6所示， HbAlc从0周时的7.5%升高到8周时的10X。化合物治疗组的HbAlc不 随时间而升高，8周20时显著低于非治疗组。用本发明化合物治疗的动物 8周时的HbAlc水平约为7.5 %。这些数据显示，在2型糖尿病动物模型中本发明化合物治疗减少了糖 化血红素的累积。HbAlc反映了糖尿病病人的整体血糖控制。化合物降低 此模型HbAlc表明本发明的化合物可用于治疗性改善糖尿病或高血糖症病 人的血糖控制。实施例9 :体重的增加和降低脂肪储存减少如下研究了本发明化合物对动物体重损失和脂肪储存的作用。通过口 饲管口服给予40只获自Simonsen， Inc.的雄性Spmque Dawley大鼠(6-7 周龄)给予0.5% CMC( Sigma陽Aldrich )或20 、 60 、 100 、 200mg/kg体 重的化合物B ，每天一次，连续14天。监测动物的体重变化和看得见的 毒性和死亡信号。第15天，让动物禁食过夜但可自由饮水，用异氟烷麻醉 动物。将约lml的一份全血样品收集到含EDTA的试管中作血液学分析， 将约lml的第二份样品收集到不抗凝的试管中作血清化学分析。血样分析 由IDEXX( West Sacramento, CA)进行。收集血样后，切取隔膜处死动物。 记录各动物的显微镜观察结果，并收集肝、肾、心脏、脾、肺、胃、小肠 和大肠作组织学评估。
如图7A所示，用本发明化合物治疗的动物体重增加呈剂量依赖性减 少。动物检查表明，生长没有总体上延缓，因为治疗动物的大多数器官绝 对重量与对照的未治疗动物各器官重量相比，没有显著性差异。例如，化 合物治疗动物的心脏重量与对照相比，无统计学显著差异(图7B)。然而 治疗动物的器官相对重量比未治疗对照有显著增加。例如表示为机体总重 分数的心脏相对重量，与对照相比，用100mg/kg化合物治疗的动物显著 增加(p二0.036，单向图氏差异分析(one-way AM3VA/Tukey's test))。由于器官的绝对重量，如心脏的重量没有显著减少，故受治疗动物的 总体生长过程没有延缓。另外，由于相对于机体总重的器官重量显著增加， 故存在着其它组织的选择性损失。如图8所示当用化合物治疗时，显示内 脏脂肪呈剂量依赖性减少。上图的箭头显示用低剂量化合物治疗动物中存 在的内脏脂肪垫，而下图显示用高剂巧量化合物治疗的动物完全缺少脂肪 垫。这些结果表明，本发明的方法和化合物可用于调节体重、诱导体重的 损失或减少，而不会伴有肌肉的损失，并能减少内脏脂肪。综合在一起， 这些结果表明，本发明的方法和化合物可用于有效控制体重增加，特别是 减少内脏脂肪。这些方法和化合物对治疗或预防肥胖具有优越性，因此可 用于治疗或预防肥胖相关糖尿病。实施例IO :饮食诱导肥胖动物模型的体重增加降低 饲喂高脂食物发生严重肥胖、高血糖症和高胰岛素血症的C57BL/6J小鼠是饮食诱导肥胖、2型糖尿病和葡萄糖耐受受损的一种模型。将购自 Jackson Laboratory (Bar Harbor ME)的40只雄性C57BL/6J小鼠分成以下实验组组l :载体对照动物，词喂标准的小鼠口粮(n=10);组2 :载体对照动物，饲喂高脂小鼠口粮(研究饮食45%脂肪)(n=10);组3 :动 物词喂高脂小鼠口粮并口饲管给予75mg/kg/天的化合物E (n=10):组4 : 动物词喂高脂小鼠口粮和口饲管给予75mg/kg/天的化合物A(n^10)。此词 养方案持续进行28天，每周测定体重。处死动物收集它们的器官和脂肪垫 并秤重。如图9A所示，饲喂高脂饮食(组2)的动物体重显著高于饲喂标准口 粮(组l)的动物(P<0.05)。然而，饲喂高脂饮食但用化合物E或化合物 A治疗的动物(分别为组3和组4)显示体重增加明显为少(P<0.05)。 事实上，尽管高脂饮食，用化合物治疗动物的体重与饲喂正常饮食动物(组 3和组4与组l比较)的基本上相同。类似地，如图9B所示，饲喂高脂 食物的动物(组2)腹部脂肪垫比饲喂标准口粮的动物(组l)和饲喂高脂 食物并用本发明化合物治疗的动物(组3和组4)显著增加。如图9B所示，饲喂高脂食物并用化合物治疗的动物的脂肪垫重量与正常饮食动物的 基本相同。研究28天后也测定了动物各器官的重量。如图9C所示，肾、肝心脏 的重量在实验组之间无差异。这些结果表明，观察到的体重差异归因于脂 肪储存的减少，而不是生长速度的减少。这些数据显示，用本发明的化合 物治疗动物，消除了与高脂饮食相关的体重增加。本发明化合物这种防止 体重增加的作用，表明本发明化合物可用于在甚至不良的饮食摄取入时治 疗性减少体重增加。此外，本发明的方法和化合物可用于对体重增加的改 变，提示这类化合物可能用于治疗性调节肥胖病人的体重减轻。实施例ll :肥胖小鼠体重减轻按以下方法研究了给予本发明化合物对体重减轻的作用。从Jackson Laboratory, (Bar Harbor ME)获得C57BL/6J小鼠。饲喂高脂食物发生严重 肥胖、高血糖症和高胰岛素血症的C57BL/6J小鼠是饮食诱导肥胖、2型糖 尿病和葡萄糖耐受受损的一种模型。给小鼠饲喂高脂食物8周后变成肥胖。 将肥胖小鼠分成二实验组组l动物为对照的肥胖小鼠，组2动物为用本 发明化合物治疗的肥胖小鼠。另一组年龄相配的非肥胖小鼠也包含在本研 究中。每天用本发明化合物或用载体对照治疗动物。21天内每周二次测定 小鼠体重。第21天秤重小鼠并处死。分离腹部脂肪垫、肝、肾和心脏并秤 重作分析。给予化合物后体重减轻表明本发明的化合物可用于治疗性减少肥胖病 人的体重。实施例12 :参与血压调节基因的表达增加高血压是糖尿病和糖尿病相关疾病和病症的危险因素。如下研究了本 发明化合物对调节血压的作用。发用化合物B或化合物D治疗动物，如 实施例4所述制备RNA样品。用以下方法测定iNOSmRNA水平。用lpM 随机六聚引物、l吗总RNA和OMNISCRIPT逆转录酶(Qiagen)按制造 商说明书进行cDNA合成。用水5倍稀释得到的cDNA至100pL最终体 积。用FASTSTARTDNAMASTER SYBR GREEN I试剂盒(Roche)和基 因特异性引物，用LIGHTCYCLER系统(Roche)，按照制造商说明书， 以定量PCR进行基因表达相对水平的分析。样品加热至90 °C 6分钟，然 后总共42轮循环95°C 15秒，6(TC5秒，和72°C 10秒。可诱导的一氧化 氮合酶(iNOS) —特异性引物如下m-iNOS-F2 CCCAGGAGGAGAGAGATCCGATT (SEQ ID NO:l) m-iNOS-R2 AGGTCCCTGGCTAGTGCTTCAGA (SEQ ID NO:2)测定了 18S核糖体RNA基因表达的相对水平作为对照。用 QUANTITECT SYBR GREEN PCR试剂盒(Qiagen)和基因特异性引物，， 用LGHTCYCLER系统(Roche),按照制造商说明书，进行定量PCR 。 样品加热至9(TC 15分钟，然后总共42轮循环95。C15秒，60。C20秒， 和72°C 10秒。核糖体RNA-特异性引物如下185-mt-2B TAGGCACGGCGACTACCATCGA (SEQ ID NO:3)185陽rat-2B CGGCGGCTTTGGTGACTCTAGAT (SEQ ID NO:4)每次PCR运行包括包括标准曲线形和水空白对照。此外，在完成每次 PCR运行后跑解链杯以估计扩增的特异性。将样品的iNOS基因表达相对 于18S核糖体的RNA表达水平作标准化。如图IOA所示，编码iNOS基因的表达在用本发明化合物处理8小 时后升高，此后回落到对照水平。另外，iNOS的诱导是剂量依赖的，用本 发明二种化合物(化合物B和D )都可获得。这二种化合物是二种不同 的药效基团， 一种是菲咯琳衍生物， 一种是杂环酰胺，可用于本发明方法 中。这些结果表明，用本发明化合物治疗可提高iN0S (—种参与血管舒张 调节的蛋白质)的表达。因此，本发明的方法和化合物可用于诱导血管舒 张和降低血压。为了测定肾上腺髓质素mRNA的表达，如以上实施例4所述制备样 品并杂交分析。如图10B所示，用本发明化合物B治疗动物的各种组织 中肾上腺髓质素(代表参与血管舒张蛋白质的编码基因)增加。在用化合 物B治疗后的时间中，心脏、肾和肺中的肾上腺髓质激素mRNA水平显 示表达快速上升，然后在16-24小时内回落到对照水平。综合在一起，这些结果表明，本发明的方法和化合物可用于提供了通 过舒张机制激活参与调节血压基因表达的工具。这类基因包括但不限于 可诱导的一氧化氮合酶和紧上腺髓质素。治疗性上调血管舒张因子提供了 降低血压的有效方法，从而向代谢失调疾病如糖尿病病人提供了益处。通 过降低血压，本发明的方法和化合物可用于为治疗或预防糖尿病、高血糖 症和其它糖尿病相关代谢疾病等提供了方法。实施例13 :血清甘油三脂降低用糖尿病小鼠模型如下研究了给予化合物对甘油三脂水平的作用该研究采用在leptin受体中含纯合型功能丧失突变的20只雄性db/db小鼠 (Harlan, Indianapolis, Indiana )。与正常小鼠相比，db/db小鼠的甘油三脂 水平通常高1.5-2倍(Nishina等，Metabolism 43 : 549-553， 1994)。随年龄 增力H db/db小鼠的甘油三脂水平进行性增加(Tuman禾Q Doisy . Diabetologia 13 : 7-11 , 1977)。小鼠接受含载体(lOOpM组氨酸)或化合物 A(0.5mg/ml ，用lOO^M组氨酸配)的饮水8周。研究末，动物禁食过夜， 在全麻下从尾静脉插管中取血样品置于血清分离试管中。将血样品送到 Quality Clinical Labs ( Mountain View, CA)作分析。如图11所示，实验末对照的db/db小鼠甘油三脂的水平大约为 120mg/dL 。然而，用本发明化合物治疗的动物甘油三脂水平约为 85mg/dL ，显著低于对照。甘油三脂水平升高与心血管疾病危险升高相关， 升高的甘油三脂是代谢综合征的一种成分。因为本发明的方法和化合物可 有效降低或维持通常的甘油三脂升高相关疾病，如糖尿病、综合症X 、大 血管疾病或其它脂质代谢障碍血症中的甘油三脂水平，故本发明的方法可 用于治疗具有或有患这类疾病危险的个体。实施例14 :化合物和HIFa稳定的鉴定可采用基于2-氧化[1-14C]戊二酸羟化-偶联脱梭基试验，鉴定能调节 HIF特异性脯氨酞轻化酶活性的化合物(见Hirsila等，J Biochem 278 : 30772-30750 ， 2003)。该反应25°C在1.0ml的反应体积中进行，其中含 10-100微升洗涤剂如Triton-X-100 、获自表达内源性HIF脯氨酞经化酶 或重组HIF脯氨酞轻化酶的裂解细胞提取液、0.05pM DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID NO:5)、 0.005pM FeS04 0.16pM 2-氧 化[l-"C]戊二酸、2pM抗坏血酸、60吗过氧化氢酶、O.l(iM 二硫苏糖 醇和50 pM Tris-盐酸缓冲液，调pH至ij 7.8。 37°C进行酶反应20分钟。 该反应产生的14C02被捕捉在悬褂于反应混合物上方大气中浸泡碱液的滤 纸上，并在液闪计数器中计数。如下检测了用本发明的方法和化合物对HIFoc的稳定。将衍生自腺病 毒转化的胎肾上皮(239A)、宫颈上皮腺癌(Hda)、肝细胞癌(H印3B)、 鳞状上皮癌(SSC-25)的人细胞和肺成纤维细胞(HLF)(见美国典型培养物 保存中心，Manassas VA禾H Qbiogene， Carlsbad CA)分别接种在100mm培 养皿中，在37。C 、 20% 02 、 10%CO2下培养，培养基为HeLa细胞为 Dulbeeco改进的Eagle培养基(DMEM)， 2%胎牛血清(FBS ); HLF细 胞为DMEM ， 10 % FBS; 293细胞为DMEM ， 5%FBS; Hep3B细胞为极 限必需培养基(MEM ), Earle，s BSS (Mediatech In . Herndon VA)， 2mM L-谷 氨酞胺，O.lmM非必须氨基酸，lmM丙酮酸钠，10%FBS。当细胞层达到 铺满时，用OPTI誦MEM培养基(Invitrogen Life Technologies , Carlsbad CA) 替换原培养基，在37^C 、 20% 02 、 10% C02下培养细胞层约24小时。 然后在当前培养基中加入本发明化合物(化合物B 、 F 、 G和H之一) 或DMSO(0.5-1.0。/。)，继续培养过夜。培养后取出培养基，离心并保存待分析。用冷磷酸缓冲盐水(PBS) 洗涤细胞二次，然后用1.0ml的10mM Tris (pH7.4) , lmM EDTA， 150mM NaCl，0.5。/。IGEPAL (Sigma-Aldrich， St丄ouis MO)和蛋白酶抑制剂混合物 (Roche Molecular Biochemicals )冰上裂解细胞15分钟。4°C 3 ，OOOxg离 心细胞裂解物5分钟，收集胞质组分(上清液)。重悬细胞核用lOOpl 20mM HEPES (pH7.2) , 400mM NaCl ， lmM EDTA ，lmM 二硫苏糖醇和蛋白酶混合 物(Roche Molecular Biochemicals)裂解，4°C 13000xg离心5分钟，收集 核蛋白组分(上清液)。根据蛋白质浓度标准化核组分，加到4-12% TG凝胶上，在还原条件 下分级。在500mA下1.5小时，将蛋白质转移到PVDF膜(Invitrogen Corp., Carlsbad CA)上。用T-TBS， 2%牛奶室温封闭该膜1小时，与用T-TBS , 2 %牛奶1:250稀释的小鼠抗HIF-la抗体(BD Biosciences, Bedford MA) 培育过夜。用SUPERSIGNALWEST化学发光底物(Pierce , Rockford IL) 显色印迹。如图12A所示，本发明的代表性化合物(化合物D)以剂量依 赖方式稳定了各种类型细胞中的HIFoc，使细胞中积累了 HIFou或者，用核抽提试剂盒制备核组分，并用TRANSAMHIF-1 ELISA试 剂盒子(Active Motif)按照制造商说明书分析HIF-la。如图12B所示， Hep3B细胞当用本发明化合物处理时，显示了剂量依赖性稳定HIFa。图 12B也显示上皮细胞(293A)和肝细胞癌(Hep3B)用本发明各种化合物 (化合物B 、 F 、 G和H )处理后，与载体处理的对照细胞相比，显示 了HIFa的稳定和积累。除了本文所示和描述的以外，本领域技术人员懂得可根据上述描写对 本发明作各种修改。这些修改都落在本发明权利要求的范围内。本文引用的所有参考文献的内容纳入本文作参考。
<110>法布罗根股份有限公司(FibroGen, Inc.)V-京策尔一普卡尔(Guenzler-Pukall, Volkmar) S. J.克劳斯(Klaus, St印hen J.) L兰斯特姆帕罗博克(Langsetmo Parobok, Ingrid) T.W.西利(Seeley, Todd W.)<120>糖尿病等的治疗<130> FP0602.1 PCT<150> 60/431,351 <151〉 2002-12-06<150> 60/476,331 <151〉 2003-06-06<150> 60/476,726 <151> 2003-06-06<150> 未知 <151> 2003-12-04<160〉 5<170〉 Patentln version 3.2<210> 1 <211〉 23 〈212〉 DNA<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 1cccagg鄉a gagagatccg att<210> 2 <211> 23 <212〉 DNA<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 2aggtccctgg ctagtgcttc aga
<210> 3 <211> 22 <212〉 DNA<213> 黑鼠(Rattus rattus〉 <400> 3taggcacggc gactaccatc ga 22<210> 4 <211> 23 <212> DNA<213〉 黑鼠(Rattus rattus) <400> 4cggcggcttt ggtgactcta gat 23<210> 5 <211〉 19 <212> PRT<213> 智人(Homo sapiens) <400〉 5Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr lie Pro Met Asp Asp Asp 15 10 15Phe Gin Leu
权利要求
1. 稳定HIFα的制剂用于制造用于具有患糖尿病危险的个体治疗或预防糖尿病的药物的用途，其特征在于所述制剂是杂环羰基甘氨酸。
2. 如权利要求1所述的用途，其中所述杂环羰基甘氨酸是抑制HIF羟 化酶活性的化合物。
3. 如权利要求2所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羟化酶 活性。
4. 稳定HIFa的制剂用于制造治疗或预防患有与血糖水平升高相关疾 病的个体中的药物的用途，其特征在于所述制剂是杂环羰基甘氨酸。
5. 如权利要求4所述的用途，其中所述疾病选自高血糖症，肥胖，高 血压，高血脂症，肾病，视网膜病变，葡萄糖耐受受损，动脉粥样硬化和 血管疾病。
6. 如权利要求4所述的用途，其中所述杂环羰基甘氨酸是抑制HIF羟 化酶活性的化合物。
7. 如权利要求6所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羟化酶 活性。
8. 稳定HIFa的制剂用于制造的药物的用途，所述药物用于a. 调节葡萄糖代谢或葡萄糖代谢过程；b. 实现葡萄糖体内平衡；c. 降低血糖水平；d. 降低糖化血红素水平；e. 提高葡萄糖调节因子的表达；f. 改变糖酵解因子表达；g. 降低胰岛素耐受；或h. 提高血糖水平控制； 其特征在于所述制剂是杂环羰基甘氨酸。
9. 如权利要求8所述的用途，其中所述葡萄糖代谢过程选自葡萄糖摄 取，葡萄糖转运，葡萄糖储存，葡萄糖加工和葡萄糖利用。
10. 如权利要求8所述的用途，其中所述葡萄糖调节因子选自磷酸果糖 激酶-P，磷酸果糖激酶-L，烯醇化酶，葡萄糖转运蛋白-1，乳酸脱氢酶、醛 缩酶-1、己糖激酶-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-l和胰岛素祥生长因子。
11. 如权利要求8所述的用途，其中所述糖酵解因子选自磷酸果糖激酶 -P，磷酸果糖激酶-L，烯醇化酶-1，乳酸脱氢酶、醛縮酶-1、己糖激酶-1。
12.如权利要求8所述的用途，其中所述杂环羰基甘氨酸是抑制HIF羟 化酶活性的化合物。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰羟化酶活性。
全文摘要
本发明涉及调节葡萄糖代谢、实现葡萄糖体内平衡和降低血糖水平的方法和化合物。也提供了治疗或预防糖尿病、高血糖症和与葡萄糖代谢改变或受损相关的疾病和病症的方法和化合物。
文档编号A61K31/70GK101396559SQ20081017613
公开日2009年4月1日 申请日期2003年12月5日 优先权日2002年12月6日
发明者I·兰斯特姆帕罗博克, S·J·克劳斯, T·W·西利, V·京策尔-普卡尔 申请人:法布罗根股份有限公司