治疗糖尿病的方法

专利名称：治疗糖尿病的方法
技术领域：
本发明涉及糖尿病的治疗或预防，具体涉及多肽或相应核酸分子在治疗或预防1型或2型糖尿病，或者延迟其发病中的应用。
背景将本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请纳入本文作参考。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述了作者的主张，本申请人保留质询引用文献的准确性和针对性的权利。应明确理解，虽然本文提及了许多现有技术公开物，但在澳大利亚或任何其它国家，此参考文献不能说明任何这些文献形成了本领域常识的一部分。
糖尿病是影响人类的最常见的严重代谢病。可将其定义为慢性高血糖症，即由于相对或绝对缺少胰岛素的作用，血液中糖过多。
糖尿病分为两种主要形式1和2型糖尿病。1型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，它是与产生胰岛素的胰腺β-细胞几乎全部缺失相关的自身免疫病。这种β-细胞缺失导致终身的胰岛素依赖性。1型糖尿病可发生于任何年龄，估计约1％的新生儿在其生命中会患此病。2型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)指特征为血液中葡萄糖水平高(高血糖症)和胰岛素抗性的一组疾病，发生于胰腺β细胞功能受损的患者。1型患者中缺少胰岛素和2型糖尿病的胰岛素抗性导致从血流中吸收的糖减少，因此血液中累积过多糖。这两种类型的糖尿病都伴随着寿命预期缩短和重要病症，如血管病、失明和动脉粥样硬化。提出了称为LADA(成年人的潜伏性自身免疫糖尿病)的一种新型糖尿病，以描述诊断有2型糖尿病、也具有1型糖尿病的免疫学证据(因为他们呈抗-Gad抗体阳性)的成年人。
糖尿病是发达国家最普遍的慢性疾病之一，是死亡的主要原因。除临床发病率和死亡率外，糖尿病的经济成本巨大，仅在美国每年就超过$900亿，预计到2010年糖尿病的流行将增加两倍以上，主要是由于与肥胖相关的2型糖尿病。
非欧裔人群发生糖尿病的风险显著增加。不远的将来，糖尿病在亚洲，包括南亚会非常流行。这些个体在没有严重肥胖的情况下发生糖尿病，因此胰岛素缺陷可能是其疾病的主要成分。此外，在印度发现了与低胰岛素水平相关的两类糖尿病(涉及营养不良，纤维结石性胰腺糖尿病和蛋白质缺陷型胰腺糖尿病)。
胰岛素由胰腺郎格罕氏岛的β-细胞产生。在胰腺发育期间，胰岛前体细胞增殖，并最终分化为四种主要胰岛细胞类型之一。认为β-细胞的形成具体受各种生长因子、细胞因子和激素作用的调节。
β-细胞的数量和功能对维持葡萄糖代谢很重要，β-细胞数量和/或功能的严重降低导致糖尿病发病。现在确定的是，β-细胞质量(mass)是通过损失和从前体细胞新生之间的平衡维持的。当胰岛素抗性使胰岛素需求显著提高(例如由于肥胖)时，刺激了β-细胞新生。这导致β-细胞质量的扩大，并维持葡萄糖代谢。如果此代偿机制受损，例如在2型糖尿病中，就破坏了葡萄糖代谢。近年来的研究证明，在2型糖尿病的动物模型中，β-细胞新生受损。因此，刺激β-细胞新生的因素应该能有效预防糖尿病发病，从而代表了可能有用的治疗方法。
治疗所有形式的糖尿病的主要目的相同，即尽可能地将血糖水平降低接近到正常水平，从而最大程度降低该疾病的短期和长期并发症。
糖尿病的长期控制常常包括胰岛素治疗，不管患者是1型或2型。在健康个体中，胰岛素增加骨骼肌摄取的葡萄糖并降低肝脏产生的葡萄糖；然而，在患有2型糖尿病的个体中，胰岛素不能起到这种作用。因此，许多2型糖尿病患者不能对胰岛素治疗产生良好的反应，即使给予高剂量的胰岛素。
1型糖尿病的治疗必须包括给予取代剂量的胰岛素，通常通过胃肠道外途径给予胰岛素。与饮食疗法和血糖水平自我监测相结合，大部分1型患者可适当地控制血糖。在2型糖尿病中，初始疗法是最佳饮食方案、减少体重和进行锻炼。如果和当这些方法不再提供足够的代谢控制时，开始药物疗法。通常开给处方的是促进胰岛素分泌或通过其它方式降低葡萄糖水平的药物。降血糖药，如磺脲或双胍，是开给这些患者的主要药物。它们通过直接刺激β-细胞而刺激胰岛素产生；因此，这些药物的有效性依赖胰腺中存留的有功能β-细胞(β-细胞质量)的数量。
磺脲在大部分2型糖尿病中无效；在一项研究中，用磺脲治疗的30％新诊断的糖尿病患者在治疗的前六年内需要胰岛素。近来，据报道高达12％的2型糖尿病患者具有基因变异，即胰岛素受体底物-1中的Arg972变异，此变异使他们不能采用这些药物，因此他们需要胰岛素治疗。
肽生长因子参与了各种生理和病理过程，包括信号转导、细胞存活、分化、细胞粘附、细胞迁移、免疫应答、造血作用、炎症、组织修复、动脉粥样硬化和癌症。在几乎所有这些过程中，肽生长因子通过与跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)的胞外结构域相互作用行使其生物学作用。大部分RTK属于高度同源受体的小类群，它们结合相似配体并通过配体诱导的同源或异源二聚体形成维持受体间相互作用。配体诱导的二聚化发生后，胞质结构域中的这些受体特异性酪氨酸残基发生自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸残基用作具有SH2或磷酸酪氨酸结合(PTB)域的蛋白质(如Shc、Grb2和磷酸肌醇3’-激酶(PI3-激酶)的p85亚基)的高亲和停靠位点。这引起信号转导途径如促分裂原活化蛋白激酶途径的活化，导致复杂的胞内信号级联反应，最终产生靶细胞的特定事件。
最彻底研究的RTK亚家族之一是ErbB家族，该家族包括四种已知受体ErbB-1(也称为表皮生长因子受体(EGFR))、ErbB-2(也称为HER2或Neu)、ErbB-3和ErbB-4。这些受体广泛分布于不同组织，并且根据细胞类型和生理条件，用于介导生长抑制或诱导细胞增殖和分化。
许多肽生长因子是ErbB受体家族的配体。这组因子具有高度序列相似性，尤其是共有六-半胱氨酸的36-40个氨基酸残基的表皮生长因子(EGF)基序。此基序含有CX7CX4CX10CX1CX8C间隔，形成三个分子内二硫键(C1-C3、C2-C4、C5-C6)，具有特征性三环结构，包括C1-C3二硫环、C2-C4二硫环和C5-C6二硫环。
属于此家族的生长因子肽的EGF-基序似乎都是由含有精确定位的间隔内含子的两个外显子编码的，内含子对应于将前两个二硫环(A环，C1-C3；B环，C2-C4)与第三个环(C环，C5-C6)分开的边界。这些分子的共同特点是它们是作为较大的跨膜前体合成的，跨膜前体经蛋白水解切割后释放该生长因子的可溶性生物活性形式。
共有EGF-基序对于结合和活化ErbB受体酪氨酸激酶家族成员很重要。结合ErbB受体的配体诱导受体同源或异源二聚化、自身磷酸化和随后的下游信号转导途径活化，导致各种生理过程，包括细胞增殖、分化、迁移和存活。ErbB家族的哺乳动物配体包括EGF、转化生长因子-α(TGF-α)、肝素结合的EGF-样生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(epiregulin)、双调蛋白、神经-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神经调节蛋白(NRG)亚家族(包括四种基因(NRG1)、NRG2、NRG3和NRG4的产物)和β动物纤维素(BTC)。
起初从小鼠胰腺β-细胞癌(胰岛瘤)细胞系的条件培养基中纯化出BTC，它是对成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞和平滑肌细胞具有促分裂活性的32kDa糖蛋白。人BTC克隆自人乳腺癌细胞系MCF-7，牛BTC克隆自牛肾细胞系。
BTC合成为锚定于膜上的前体蛋白，前体蛋白可经蛋白水解切割释放可溶性成熟生长因子。成熟的BTC结合并活化ErbB1和ErbB-4同源二聚体，此外，还结合并活化所有可能的ErbB异源二聚体，包括高度致癌的异源二聚体ErbB2-ErbB3受体复合物。
许多研究强调，ErbB1受体和配体TGFα，具体是HB-EGF和BTC在胰腺发育和功能中可能很重要。在整个发育的胰腺中，ErbB配体的表达丰富。常常死于出生后头一个星期的ErbB1-/-小鼠普遍显示出胰腺上皮细胞增殖缺陷，伴随岛细胞延迟分化为产胰岛素的β-细胞，以及发育的胰岛内分泌细胞的迁移和结构形成受到破坏。这些缺陷表明，ErbB-1介导的信号转导对正常β-细胞发育很重要。ErbB-3-/-小鼠的胰腺发育也有严重缺陷。
许多研究证明，在胰腺发育和功能中，BTC而非EGF或TGFα可具有独特的非冗余作用。BTC在胰腺，特别是郎格罕氏岛中强烈表达，刺激各种胰腺细胞在体外和体内增殖和分化。由于胰腺的导管细胞表达ErbB-1和ErbB-4，所以认为BTC可结合并活化这些受体以刺激β-细胞新生。
数量大得惊人的膜蛋白进行另路剪接，另路剪接去除编码跨膜结构域的外显子序列，产生与膜结合形式功能不同的可溶形式。另路剪接导致的mRNA结构改变可产生在某些组织中、不同的发育阶段和/或在不同的细胞活化状态下差异表达的蛋白质变体。当另路剪接的外显子编码的蛋白质结构域在功能上对催化活性或结合作用很重要时，得到的蛋白质常常显示出不同、甚至是对抗性的活性。
我们最近鉴定了一种另路剪接的mRNA转录物，它编码人BTC的新同种型(国际专利申请号PCT/AU01/00010，GroPep Limited；Dunbar等，2000)。此同种型称为BTC-δ4，它缺少编码BTC基因的外显子4的147bp，导致产生编码缺失了EGF结构域的C-环和跨膜结构域的异常BTC前体的mRNA，而成熟分子的其余部分，包括A环和B环以及“铰链”缬氨酸框内融合于截短的C-末端胞质尾。保留疏水信号序列和缺少跨膜结构域说明，BTC-δ4可能是分泌蛋白。PCT/AU01/00010提出，此BTC剪接变体可用于调节ErbB受体介导的活性，因此可用于治疗与ErbB癌基因过度表达相关的疾病，如癌症。
然后我们证实，此剪接变体是分泌蛋白。然而，我们发现，BTC-δ4不结合或者活化ErbB1或ErbB4受体，不结合ErbB2或ErbB3同源二聚体；因此我们推论，BTC-δ4不具有功能活性，至少对于ErbB1和ErbB4受体以及ErbB2和ErbB3同源二聚体如此，BTC-δ4丢失的核心EGF基序可能是活性所必需的(Dunbar等，2000)。
报道了缺少EGF结构域的第三个二硫环的同种型HB-EGF(Loukianov等，1997)。在这种情况下，外显子III和IV之间94bp插入物引起移码和成熟前终止，产生保留信号肽、pro-region、肝素-结合域和EGF基序的前两个保守二硫环的蛋白，而九个氨基酸的短尾取代了第三个二硫环、跨膜和胞质域。
美国专利号6,825,159公开了β动物纤维素的变体，列为SEQ ID NO.38，该专利提示，此变体具有完整的β动物纤维素活性和降低的EGF活性。SEQ ID NO.38与本发明多肽的不同之处在于它包含了所有六个半胱氨酸并且C5-C6环中无缺陷。
发明概述尽管BTC-δ4与ErbB受体显然无法结合，但是我们发现，BTC-δ4刺激β-细胞分化、增加β-细胞质量、减少β-细胞功能的降低并增加β-细胞的胰岛素分泌。作为β-细胞分化刺激物，BTC-δ4比真正的BTC更有效；然而与真正的BTC相比，BTC-δ4没有细胞生长促进活性或此活性降低。
在第一个方面，本发明提供了在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的方法，该方法包括给予该对象能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
在第二个方面，本发明提供了在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的方法，该方法包括给予该对象一种核酸，该核酸编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
在第三个方面，本发明提供了能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽在糖尿病患者中治疗、预防该疾病或延迟其发病的应用，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
在第四个方面，本发明提供了编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽的核酸在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的应用，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
在第五个方面，本发明提供了能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽在能在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的药物制备中的应用，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
在第六个方面，本发明提供了编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽的核酸在能在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的药物制备中的应用，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
优选地，与真正的BTC相比，该多肽活化对象的ErbB1和ErbB4受体的能力显著降低，刺激岛细胞祖细胞向胰腺β细胞分化时没有刺激其它细胞类型的增殖。优选地，与真正的BTC相比，该多肽没有成纤维细胞生长促进活性或该活性降低。优选地，与真正的BTC相比，该多肽没有上皮细胞生长促进活性或该活性降低。
优选地，所述糖尿病是2型糖尿病或1型糖尿病。
在第七个方面，本发明提供治疗、预防糖尿病或延迟其发病的的组合物，该组合物包含能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽与药学上可接受的运载体，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
在第八个方面，本发明提供治疗、预防糖尿病或延迟其发病的的组合物，该组合物包含编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽的核酸与药学上可接受的运载体，与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
优选地，与真正的BTC相比，该多肽没有刺激细胞类型增殖的能力或此能力降低，与真正的BTC相比，该多肽没有活化ErbB1或ErbB4受体的能力或此能力降低。优选地，与真正的BTC相比，该多肽没有成纤维细胞生长促进活性或该活性降低。优选地，与真正的BTC相比，该多肽没有上皮细胞生长促进活性或该活性降低。
优选地，与真正的BTC相比，该多肽没有活化ErbB2或ErbB3同源二聚体的能力或该能力降低。
作为治疗的副作用，该多肽使对象发生癌症的风险可能低于真正BTC处理产生的风险。
优选地，该多肽与EGF家族的成员基本同源。更优选地，该多肽与表皮生长因子、转化生长因子-α、肝素结合的EGF样生长因子、表皮调节素、双调蛋白、神经-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神经调节蛋白亚家族成员(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)或β动物纤维素(BTC)基本同源。更优选地，该多肽与BTC-δ4基本同源。最优选地，该多肽是BTC-δ4。BTC-δ4多肽的氨基酸序列如图4(SEQ ID NO11-15)所示。
该多肽可以是(a)BTC的剪接变体，其中没有C5-C6二硫环，而编码真正BTC的基因中通常存在此二硫环；或
(b)序列与(a)分子基本同源的多肽，或(c)(a)分子的类似物、片段、突变体、衍生物或等位基因变体。
该多肽可以是(a)BTC的剪接变体，其中没有C5-C6二硫环，此二硫环通常由编码真正BTC的基因中存在的核酸序列编码，编码真正BTC多肽分子的核酸序列的其余部分，包括A环和B环以及“铰链”缬氨酸框内融合于编码截短的C-末端胞质尾的核酸序列；(b)序列与(a)分子基本同源的多肽；或(c)(a)的片段、类似物、变体或衍生物。
优选地，该多肽能够用作β-细胞分化因子、增加β-细胞质量、减少β-细胞功能的降低和/或增加β-细胞的胰岛素分泌。
所述片段、类似物、变体或衍生物可具有以下特征(a)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基，优选保守氨基酸残基取代；所述取代的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的残基；(b)一个或多个氨基酸残基包括取代基；(c)成熟多肽融合于另一种化合物，以增加该多肽的半衰期；或(d)融合于成熟多肽的其它氨基酸。
作为治疗的副作用，该多肽使对象发生癌症的风险可能低于BTC治疗产生的风险。
优选地，对象具有以下糖尿病风险因素中的一项或多项葡萄糖耐受受损、代谢综合征、1型或2型糖尿病家族史、肥胖、多囊卵巢综合征、高血压或高胆固醇。
应该明确理解，本发明的范围内包括应用肽生长因子的EGF家族的其它成员的变异形式，其能够用作体外和/或体内的β-细胞分化因子、在体外和/或体内增加β-细胞质量、减少β-细胞功能的降低和/或在体外和/或体内增加β-细胞胰岛素分泌，本文将其称为“类似的生长因子变体”。在这些变体形式中，通常存在于真正多肽中的氨基酸残基缺失，其缺失方式类似于BTC-δ4中的缺失。优选地，没有通常存在于真正分子中的C5-C6二硫环，类似于BTC-δ4中的缺失。选自EGF家族的合适的真正多肽包括表皮生长因子、转化生长因子-α、肝素结合的EGF样生长因子、表皮调节素、双调蛋白、神经-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)和神经调节蛋白亚家族成员(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)。预计这些变异形式的作用方式类似于本发明BTC-δ4多肽，条件是它们具有上述功能特征。
应理解，一旦知晓了本文所述多肽的氨基酸序列，就可通过本领域熟知的化学方法如固相多肽合成或重组方法合成BTC-δ4和其它生长因子的类似变体。
优选地，该多肽分子具有人类来源的氨基酸序列。然而，本发明也包括应用非人哺乳动物的BTC-δ4；本发明BTC-δ4多核苷酸不难用作以本领域常规方法分离其它哺乳动物细胞的相应多核苷酸的探针。
因此，本发明多肽可以是重组多肽、分离的天然产生多肽或合成多肽，优选重组多肽。
本发明方法可用于治疗2型糖尿病，以及预防2型糖尿病或延迟其发病。而且，由于1型糖尿病的特征是β细胞的缺失和β细胞功能的完全丧失，本发明也可用于治疗1型糖尿病，或者预防1型糖尿病或延迟其发病。
任选地，本发明多肽可与免疫抑制剂一起给药。合适的免疫抑制剂包括皮质类固醇、TNF-α抗体如英利昔单抗(Remicade)和可溶性TNF-α受体如依坦西普(Enbrel)。在1型糖尿病或LADA(任何新β细胞仍然受免疫攻击，除非抑制免疫攻击)中可优选这种联合疗法。
可以想像，与采用真正BTC相比，本发明方法使致癌风险降低。我们发现，BTC-δ4不能活化ErbB1和ErbB4受体，因此防止了ErbB-刺激的细胞增殖，从而降低或避免了成为治疗副作用的癌症风险。
特别考虑到，本发明方法和组合物适合用于人类糖尿病的医学治疗，它们也可用于兽医治疗，包括治疗伙伴动物如犬和猫，以及家畜如马、牛和绵羊，或动物园动物如非人灵长动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物。
通常以药物组合物的形式给予本发明多肽。制备药物组合物的方法和药物运载体是本领域熟知的，如《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第20版，Williams和Wilkins，美国宾夕法尼亚州等教科书所述。
运载体或稀释剂和其它赋形剂将取决于给药途径，本领域技术人员能够为各具体情况确定最合适的剂型。
可通过任何合适途径给予本发明化合物和组合物，本领域技术人员能够为所治疗的病症确定最合适的途径和剂量。剂量由主治医生或兽医确定，取决于所治疗病症的特性和状态、所治疗对象的年龄和健康状况、给药途径以及可能已经给予的在先治疗。
附图简要说明

图1A显示了用RT-PCR检测MCF-7细胞(泳道1)和人乳房皮肤成纤维细胞(泳道2)中的真正的人BTC和剪接变体人BTC-δ4。泳道3是无cDNA模板的对照。图1B显示用包含编码人BTC氨基酸D32-Y111的多核苷酸的cDNA探针进行的相应Southern印迹。
图2A比较了真正人BTC与剪接变体人BTC-δ4的部分核苷酸和推断出的氨基酸序列(以一字母氨基酸编码表示)。将图1A中获自MCF-7 cDNA的RT-PCR产物克隆入pBluescript II SK，并测序插入物。显示了147bp缺失点(用朝下的箭头表示)周围的序列。图2B显示了BTC-δ4 cDNA的完整核苷酸序列和推断出的氨基酸序列。
图3在假拟比对中比较了真正人BTC和剪接变体人BTC-δ4的完整氨基酸序列。BTC-δ4序列中的水平虚线表示与真正hBTC序列相比丢失氨基酸的位点。下面的示意图显示了与BTC-δ4相比真正人BTC的全局结构。
图4显示了BTC-δ4多肽的氨基酸序列(BTC-δ41-129、BTC-δ41-94、BTC-δ432-94、BTC-δ432-129、BTC-δ432-111和BTC-δ495-129)。
图5说明用于BTC和BTC-δ4的重组表达和纯化的构建物。图5A是分别用于BTC和BTC-δ4的构建物的示意图。图5B显示了用C4柱的分析RP-HPLC评价各BTC或BTC-δ4制剂纯度的结果。
图6显示出BTC-δ4是分泌蛋白。A用BTC-FLAG、BTC-δ4-FLAG或空载体(pcDNA3.1)瞬时转染COS-7细胞。转染72小时后，收集培养基并制备细胞裂解物。用抗-FLAG M2抗体的Western印迹分析培养基和细胞裂解物。B如上所述转染COS-7细胞，用抗-FLAG M2抗体的ELISA分析培养基或非渗透性固定细胞。需要注意，用抗-BTC胞外域抗体(R&D Systems)也能获得相似的Western印迹和ELISA结果(数据未显示)。
图7显示出BTC而非BTC-δ4刺激了Balb/c 3T3成纤维细胞增殖，也显示出BTC而非BTC-δ4在放射性受体试验中结合ErbB1和ErbB4。Balb/c 3T3成纤维细胞与单独的浓度增加的BTC或BTC-δ4(A)或在固定浓度的BTC存在下与浓度增加的BTC-δ4(B)一起孵育。在浓度增加的BTC或BTC-δ4存在下[125I]-标记的BTC与表达ErbB1的AG2804细胞(C、D)或ErbB4转染的CHO细胞(E、F)竞争性结合。
图8显示出BTC而非BTC-δ4分别诱导了AG2804和CHO-ErbB4细胞中的ErbB1和ErbB4受体酪氨酸磷酸化。未处理(-)或处理(10nmol/l BTC，10nmol/l BTC-δ4或10nmol/l BTC+10nmol/l BTC-δ4)的裂解物。用抗-ErbB1(AG2804)或抗-ErbB4(CHO-ErbB4)抗体使细胞免疫沉淀(IP)，然后用抗-磷酸化酪氨酸抗体(αPY)进行印迹和检测。也洗提印迹并用抗-ErbB1或抗-ErbB4抗体再检测。
图9显示出BTC和BTC-δ4诱导AR42J细胞分化。AR42J-B20细胞与2 nM活化素A以及1nM BTC(图A和C)或BTC-δ4(图B和D)一起孵育48小时，然后固定并用抗-胰岛素抗体(箭头“1”)和DAPI(箭头“2”)染色，DAPI染核。在活化素A和BTC-δ4处理的细胞中，许多细胞表达胰岛素，但核被片段化(箭头“3”)或丢失。放大倍数，图A和B×100；图C和D×400。
图10显示出BTC而非BTC-δ4改善了活化素-诱导的AR42J细胞凋亡。用2nM活化素A以及1nM BTC(A)或BTC-δ4(B)处理AR42J-B20细胞48小时。用箭头表示TUNEL-阳性细胞。
图11显示出将BTC-δ4给予STZ-处理的大鼠降低血浆葡萄糖浓度并提高葡萄糖耐受。A在第0天(一日龄的新生动物)注射STZ(85μg/g)，从第0天开始每天注射BTC或BTC-δ4(3pmol/g)，并测定血浆葡萄糖浓度，共计5天。值是平均值±S.E.○，STZ组(n＝5)；●，STZ/BTC-δ4组(n＝5)；△，STZ/BTC组(n＝5)；*对STZ组的P＜0.05。B在2月龄的大鼠上进行葡萄糖耐受测试。左图，血浆葡萄糖浓度的改变。右图，血浆胰岛素浓度的改变。值是平均值±SE。○，STZ组(n＝5)；●，STZ/BTC-δ4组(n＝5)；△，STZ/BTC组(n＝5)，(---)正常SD大鼠(n＝3)。*对STZ组的P＜0.05，**对STZ组的P＜0.01。
图12显示出在图11所述研究的第4天测定的PDX-1阳性导管细胞(A)和岛样细胞簇(ICC)(B)的数量。(A)PDX-1-阳性导管细胞(箭头“1”)PDX-1(箭头“2”)细胞角蛋白。(B)ICC(箭头“3”)细胞角蛋白(箭头“4”)胰岛素(箭头“5”)DAPI。STZ用盐水处理STZ-注射的大鼠。*对STZ的p＜0.05。**对STZ的p＜0.01。放大倍数，A×400；B×100。
发明详述除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的含义相同。虽然可采用与本文所属内容相似或等效的任何材料和方法来实施或测试本发明，但描述了优选的材料和方法。
定义本文所用单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括相应的复数含义，除非文中明确指出不是如此。因此，例如，提到“一种酶”包括多种这样的酶，提到“一种氨基酸”指一种或多种氨基酸。
在本发明说明书和所附权利要求书中，除了由于表达语言或必需含义文中另有要求，术语“包含”用于包括性描述，即说明存在所属特征，但不排除本发明各种实施方式中存在或加入了其它特征。
本文所用术语″对象″指患有需要用药学活性物质治疗的糖尿病的任何动物。对象可以是人，或者可以是家畜或伙伴动物。虽然具体考虑了本发明化合物适合用于人类的医学治疗，但其也可用于兽医治疗，包括治疗伙伴动物如犬和猫，以及家畜如马、牛和绵羊，或动物园动物如非人灵长动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物。
本文所用术语“治疗有效量”指能有效产生所需治疗反应，如预防或治疗易于通过给予药学活性物质治疗的疾病的本发明化合物的用量。
当然，具体的“治疗有效量”因各种因素而变化，如所治疗的具体疾病、对象的身体状况和临床史、所治疗动物的类型、治疗时间、并行治疗(如果有)的特性以及所用具体制剂和化合物或其衍生物的结构。
治疗组合物中的多肽浓度不重要，但应该是能有效治疗糖尿病或者预防或延迟其发病的含量。在采用BTC-δ4多肽的所有方法中，本文所用术语″有效量″指足以以95％置信水平引起统计学显著性反应(即仅由于概率引起的作用的p＜0.05)的量。可通过经验，根据体外细胞对该多肽或含有该多肽的制剂的反应和实验动物对该多肽或含有该多肽的制剂的反应来测定多肽用量。多肽用量应该足以在体内引发β-细胞分化、体内β-细胞质量增加、体内β-细胞功能下降减少和/或体内β-细胞胰岛素分泌增加。平均来看，体重约75kg的患者的日剂量至少为0.001mg/kg，优选0.01mg/kg，至约20mg/kg，优选1mg/kg体重。
本文所用″药物运载体″是用于将BTC-δ4和/或其它药学活性物质递送给对象的药学上可接受的溶剂、悬浮剂、赋形剂或运载体。运载体可以是液体或固体，根据计划给药方式选择。
本文所用术语“糖尿病”包括1型糖尿病和2型糖尿病，1型糖尿病也称为胰岛素-依赖性糖尿病(IDMM)，2型糖尿病也称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。
本发明的剪接变体称为BTC-δ4，本文将编码BTC-δ4的多核苷酸称为BTC-δ4多核苷酸。提到BTC时所用术语“真正的”指178个氨基酸的全长或成熟的可溶性BTC蛋白。
术语“基本同源的序列”指功能上等效于本文所述的特定BTC-δ4序列的多肽，特别公开的多肽序列中包括取代、缺失或插入。
提到本发明多肽时术语“片段”、“类似物”、“变体”和“衍生物”指保留了与此多肽基本相同的生物功能或活性的分子。因此，类似物包括前蛋白(proprotein)，它可通过切割前蛋白部分产生有活性的成熟多肽而活化。
术语“片段”应明确理解为包括全长序列的任意大小的部分或结构域，只要该片段有功能活性。术语″序列的片段″或″序列的一部分″指所述原始序列的截短序列。截短序列(核酸或多肽序列)的长度可以不同，最小尺寸为足以提供至少具有与所述原始序列相当的功能和/或活性的序列的尺寸，而最大尺寸并不重要。在一些实施方式中，最大尺寸通常基本上不大于提供原始序列的所需活性和/或功能所需的尺寸。截短的氨基酸序列的长度一般至少约为5个氨基酸。然而更一般地，该序列的长度至少约为50个氨基酸，优选至少约为60、80、100、120、150、200或220个氨基酸。片段序列可侧接其它氨基酸，或可根据本领域技术人员已知方法进行修饰。修饰的蛋白质必须保留天然蛋白质的至少一种生物学活性。该片段可用于氧化或还原形式，或者与偶联或保护基团联用。例如，可将它们偶联于运载体分子。
蛋白质“变体”包括图4所示蛋白的同系物和含有能使该蛋白二级结构保持不变的保守取代的蛋白质。这种保守取代的例子包括疏水性、大小和电荷与原始的氨基酸残基基本相同的氨基酸残基。这种取代通常是蛋白质化学领域的技术人员熟知的。例如，保守取代包括脯氨酸取代甘氨酸，反之亦然；丙氨酸或缬氨酸取代甘氨酸，反之亦然；异亮氨酸取代亮氨酸，反之亦然；组氨酸取代赖氨酸，反之亦然；丝氨酸取代天冬酰胺，反之亦然；苏氨酸取代半胱氨酸，反之亦然；丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸，反之亦然；谷氨酰胺取代天冬酰胺，反之亦然；色氨酸取代酪氨酸，反之亦然；精氨酸取代谷氨酸，反之亦然。
术语蛋白质“衍生物”包括用20种天然产生氨基酸的天然产生或合成的氨基酸同系物取代了一个或数个氨基酸残基的蛋白质。这种同系物的例子是4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等。
本文所用天然氨基酸残基是蛋白质中常见的20种氨基酸残基(即丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸和缬氨酸)，并且包括这些氨基酸的D形和L形。
本文所用合成氨基酸残基包括在蛋白质中发现的、天然情况下发现的或合成产生的任何其它氨基酸残基的D形和L形。合成氨基酸残基包括但不限于β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等。
在表示值的范围时，应明确理解，此范围包括该范围的上下限以及上下限之间的所有值。
应明确理解，本发明不限于本文所述的具体材料和方法，因为它们可以改变。也应理解，本文使用术语的目的仅仅是描述具体实施方式
，不旨在限制本发明范围，本发明范围仅受所附权利要求书的限制。
除非另有说明，本发明采用本领域技术人员能够使用的常规的化学、蛋白质化学、分子生物学和酶学技术。这些技术是本领域工作人员熟知的，并且在文献中有详细解释。参见例如，Coligan、Dunn、Ploegh、Speicher和Wingfield《蛋白质科学中的现有技术》(Current protocols in Protein Science)(1999)第I卷和第II卷(JohnWiley和Sons Inc.)；Sambrook，Fritsch和Maniatis《分子克隆实验室手册》(MolecularCloningA Laboratory Manual)(2001)；Shuler，M.L.《生物过程工程基本概念》(Bioprocess EngineeringBasic Concepts)(第二版，Prentice-Hall International，1991)；Glazer，A.N.、DeLange，R.J.和Sigman，D.S.《蛋白质的化学修饰》(ChemicalModification of Proteins)(North Holland Publishing Company，阿姆斯特丹，1975)；Graves，D.J.、Martin，B.L.和Wang，J.H.《蛋白质的共翻译和翻译后修饰化学原理和生物效应》(Co-and post-translational modification of proteinschemical principles和biological effects)(Oxford University Press，1994)Lundblad，R.L.(1995)《蛋白质修饰技术》(Techniques in protein modification).CRC Press，Inc.美国佛罗里达州伯克莱屯；和Goding，J.W《单克隆抗体原理和实践》(Monoclonal antibodiesprinciplesand practice)(Academic Press，纽约第三版。1996)。
本发明方法可包括(a)在给予第二种药学活性物质之前、一起或之后给予BTC-δ4，以治疗糖尿病；或(b)联合给予BTC-δ4和第二种药学活性物质，以治疗糖尿病。
本文所用缩写如下bp 碱基对BTC β动物纤维素CM 培养基DMEMDulbecco基础必需培养基EGF 表皮生长因子
EIA 酶免疫试验ELISA 酶联免疫吸附实验IDMM 胰岛素依赖性糖尿病IGT 葡萄糖耐受受损LADA 成年人的潜伏性自身免疫糖尿病NIDMM 非胰岛素依赖性糖尿病PCR 聚合酶链反应PP胰多肽PBS 磷酸盐-缓冲盐水RT-PCR逆转录酶PCRSD标准差SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳STZ 链脲霉素前驱糖尿病也称为葡萄糖耐受受损(IGT)，影响着约四千一百万美国人，它是2型糖尿病和心血管病的前兆。美国糖尿病协会(ADA)将前驱糖尿病定义为血糖水平高于正常值，但未高至诊断为2型糖尿病的水平的疾病。除了减少体重和增加锻炼活动以外，正进行临床试验来检测在前驱糖尿病进展为慢性疾病之前含有吡啶甲酸铬的营养补充物的功效。
可能引起糖尿病或可能与糖尿病综合征相关的基础病症包括代谢综合征(高血压、肥胖/超重和高胆固醇)、血色素沉着、慢性胰腺炎、多囊卵巢综合征(PCOS)、类癌瘤综合征、胰腺手术或外伤、垂体活性过高、肾上腺活性过高、胰功能不全、肢端肥大症、库欣氏综合征、囊肿性纤维化、腺癌、生长抑制素瘤、醛甾酮瘤-诱导的低钾血、嗜铬细胞瘤、原发性醛固酮症、沃尔弗腊姆综合征、短妖精貌综合征、Rabson-Mendenhall综合征、僵人综合征、自身免疫性淋巴增殖综合征；高催乳素血症；甲状腺功能亢进；POEMS或Crow-Fukase综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、M蛋白质和皮肤改变)；催乳素瘤；Kearns-Sayre综合征；烟酸过量和2型多发性内分泌缺陷综合征。
具体说，2型糖尿病的风险因素包括一种或多种IGT、2型糖尿病家族史、肥胖、高血压、高胆固醇和久坐的生活方式。已知某些种族，具体是非洲人、西班牙人和墨西哥裔美国人、澳大利亚原住民和太平洋岛国居民中2型糖尿病的发病率较高。也包括妊娠相关因素，因为之前有妊娠性糖尿病、流产、死产或分娩大婴儿或有先天缺陷的婴儿的病史都会伴有2型糖尿病发病率升高。
近来有报道称，与没有疾病的个体相比，1型糖尿病患者中称为小泛素相关性修饰物(SUMO-4)的基因突变似乎更频繁，在一些家族中此基因与1型糖尿病有关(Guo等，2004；Bohren等，2004)。
本领域熟知诊断糖尿病的方法。一般用两种测试诊断人的糖尿病(1)禁食的血糖水平诊断糖尿病的“黄金标准”是禁食过夜(午夜后不摄入食物)后血糖水平高。至少两次测定的值高于140mg/dl则可诊断为糖尿病。正常对象的禁食糖水平为70-110mg/dl。
口服葡萄糖耐受测试(OGTT)可在医生办公室或实验室进行口服葡萄糖耐受测试。在葡萄糖刺激后3小时中测定5次血糖水平。对象在禁食状态(除水外没有其它的食物或饮料摄入至少10小时，但不长于16小时)开始测试。取初始血液样品，然后给对象高葡萄糖的饮料(75克葡萄糖；妊娠妇女是100克)。然后在喝下高葡萄糖饮料后30分钟、1小时、2小时和3小时再取血液样品。在非糖尿病人中，葡萄糖刺激后血液中的葡萄糖水平升高，但其后迅速回到正常水平。在糖尿病患者中，葡萄糖刺激后葡萄糖水平升高到正常值以上，而回复到正常水平则要慢得多。
ErbB家族的哺乳动物配体包括EGF(Savage等，1972)、转化生长因子-α(TGF-α)(Marquardt等，1984)、肝素结合的EGF样生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等，1991)、表皮调节素(Toyoda等，1995)、双调蛋白(Shoyab等，1989)、神经-和胸腺-衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)(Higashiyama等，1997)、神经调节蛋白(NRG)亚家族和β动物纤维素(BTC)(Shing等，1993)，其中神经调节蛋白(NRG)亚家族包括四种基因的产物(NRG1)(Marchionni等，1993)、NRG2(Chang等，1997；Carraway等，1997)、NRG3(Zhang等，1997)和NRG4(Harari等，1999)。
BTC-δ4多肽和其变体总地如PCT/AU01/00010所述，将其全部内容纳入本文作参考。本领域可广泛获得产生多肽的合适方法。优选采用重组DNA技术。
例如，BTC-δ4多核苷酸序列分离自MCF-7细胞。它含有编码129个氨基酸的多肽的开放阅读框。该多核苷酸序列与人BTC相同，除了开放阅读框中缺失了147bp(编码49个氨基酸)，导致缺少C5-C6二硫环，该二硫环通常存在于EGF结构域中(参见图2B和3)。它的产生是人BTC基因外显子之一的mRNA另路剪接(外显子跳过)的结果。
BTC-δ4多核苷酸可获自表达BTC-δ4编码的mRNA的各种细胞来源。本发明人鉴定了BTC-δ4多核苷酸的许多合适的人细胞来源，包括但不限于肾、肝、胰和各种乳腺癌细胞系如MCF-7。
例如，编码BTC-δ4多肽的多核苷酸可获自从细胞来源分离和纯化的RNA克隆的cDNA。可用本领域熟知的技术制备克隆的cDNA文库，可用与BTC基因任何部分基本互补的核苷酸探针筛选该文库中的BTC-δ4编码的DNA。也可利用各种PCR克隆技术获得本发明的BTC-δ4多核苷酸。
因此，可利用寡核苷酸引物用PCR获得编码本发明BTC-δ4多肽的多核苷酸，所述引物包含编码BTC基因一部分的多核苷酸序列。该引物优选包含最末端的5′和3′编码区。该寡核苷酸引物更优选具有以下序列，或与以下序列基本同源的序列5′GAGCGGGGTTGATGGACCGG 3′(SEQ ID NO1)5′TTAAGCAATATTTGTCTCTTC 3′(SEQ ID NO2)用本发明载体，如克隆载体或表达载体转化或转染宿主细胞。本领域技术人员可以同样良好地利用各种表达载体/宿主系统来重组表达BTC-δ4多肽。这种系统包括但不限于微生物如用包含所需BTC-δ4多核苷酸编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用包含所需BTC-δ4多核苷酸编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用包含所需BTC-δ4多核苷酸编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)转染的昆虫细胞系统；或用包含所需BTC-δ4多核苷酸编码序列的合适的哺乳动物表达载体转染的动物细胞系统。
可用各种方法将合适的DNA序列插入载体。通常，用本领域技术人员熟知的方法将DNA序列插入合适的限制性核酸内切酶位点。
插入表达载体的DNA序列操作性连接于表达控制序列(启动子)，以指导mRNA合成。根据所用的宿主/载体系统，可采用任何合适的转录/翻译元件。例如，用原核细胞如大肠杆菌(E.coli)克隆时，可采用trc或T7启动子；用哺乳动物表达系统克隆时，可采用分离自哺乳动物细胞基因组的启动子(如小鼠金属硫蛋白启动子)或分离自这些细胞中生长的病毒的启动子(如人巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子)。也可利用重组DNA或合成技术产生的启动子转录插入序列。表达载体也含有用于启动翻译的核糖体结合位点和转录终止子。也需要特异性启动信号来有效翻译插入的编码序列。这些信号包括ATG启动密码子和相邻序列。在将整个BTC-δ4编码序列(包括其自身的启动密码子和相邻序列)插入合适的表达载体的情况下，不需要额外的翻译控制信号。然而，在仅插入一部分BTC-δ4编码序列的情况下，必须提供外源性翻译控制信号，包括ATG启动密码子。
而且，启动密码子必须与BTC-δ4编码序列的阅读框同相，以保证整个插入物的翻译。这些异源翻译控制信号和启动密码子可以是各种来源的，包括天然和合成来源。可通过包含转录衰减序列、增强子元件等提高表达效率。
此外，表达载体优选包含一个或多个可选择标记基因，以提供用于选择转化或转染的宿主细胞的表型特征，如真核细胞的新霉素(G418)抗性，或原核细胞如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性。
可用含有本发明DNA分子的载体，以及合适的启动子或控制序列转化或转染合适的宿主，使该宿主表达该蛋白。
合适宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌；昆虫细胞如果蝇(Drosophila)和Sf9；以及动物细胞如CHO、COS或293细胞。
可以常规方式用宿主细胞中的构建物产生重组序列编码的基因产物。或者，可用常规的肽合成仪以合成方法产生本发明多肽。
可用各种方法从重组细胞培养物中回收和纯化上述各种不同载体/宿主表达系统产生的本发明多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和反相高效液相色谱(HPLC)。如果需要，在完成所需多肽构型中可采用蛋白质再折叠步骤。
该多肽可以是纯化产物、分离自组织或细胞来源、化学合成步骤的产物、或通过重组技术用原核或真核宿主产生的产物。根据重组产生步骤中所用的宿主，本发明多肽可以是糖基化或非糖基化的。
可获得使本领域技术人员能够鉴定用于本发明的、序列与BTC-δ4或BTC-δ4的类似物、片段、突变体、衍生物或等位基因变体基本同源的多肽的方法，例如，通过评价该多肽在体外诱导胰细胞系分化的能力，或评价降低糖尿病动物模型的糖尿病症状严重程度的能力。
用于本发明的BTC-δ4的类似物、片段、突变体、衍生物或等位基因变体优选具有以下体外生物学特性(1)采用实施例5所述方法时，该多肽不取代人肺成纤维细胞(AG2804)的ErbB1或ErbB4受体上放射性标记的成熟BTC。
(2)采用实施例5所述方法时，该多肽不诱导人肺成纤维细胞(AG2804)的ErbB1或ErbB4受体的酪氨酸磷酸化。
(3)采用实施例6所述方法时，该多肽就像真正的BTC那样，与活化素A一起刺激AR42J-B20细胞分化，但与真正的成熟BTC相比，该多肽促进细胞存活的能力差得多。
可用含有常规无毒的药学上可接受的运载体、佐剂和载体的剂量单位剂型以口服、直肠、胃肠道外或吸入途径给予本发明化合物。本文所用术语胃肠道外包括皮下、静脉内、肌肉内、胸内、颅内、注射或输注技术。
本发明也提供了合适的局部、口服、气雾剂和胃肠道外药物剂型，用于本发明治疗的新方法。口服给予的本发明化合物可以是片剂、水性或油性悬浮剂、锭剂、药片、粉末剂、颗粒剂、乳剂、胶囊、糖浆或酏剂。口服用组合物可含有选自下组的一种或多种物质甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，目的是产生药学上精致和美味的制剂。片剂含有活性成分，混有无毒的药学上可接受的赋形剂，该赋形剂适用于生产片剂。
这些赋形剂可以是(例如)惰性稀释剂，如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是不包衣的，或者可以是用已知技术包衣的，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长时间内提供缓释作用。例如，可采用延时物质如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。也可用美国专利号4,256,108；4,160,452和4,265,874所述技术进行包衣，以形成用于控释的等渗治疗片剂。
可在胃肠道外通过注射或逐步灌注单独或一起给予用于本发明方法的BTC-δ4以及药学活性物质。给药可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、腔内或透皮给药。在体外研究中，可将药物加入或溶解于合适的生物学可接受的缓冲液并加入细胞或组织。
胃肠道外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇溶液/水溶液、乳剂或悬液，包括盐水和缓冲培养基。胃肠道外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠，乳酸化的林格氏静脉内载体包括液体和营养补充物、电解质补充物，如基于林格氏右旋糖的补充物等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、生长因子和惰性气体等。
通常，本文所用术语″治疗″等指影响对象、组织或细胞以获得所需药理和/或生理作用。该作用可以是预防性的，即完全或部分预防疾病或者其病征或症状，和/或可以是治疗性的，即部分或完全治愈疾病。本文所用术语″治疗″覆盖了脊椎动物、哺乳动物，特别是人的疾病的任何治疗或预防，包括预防可能倾向于发生疾病但仍未诊断患有此病的对象发生该疾病；抑制该疾病，即阻滞其发展；或者缓解或改善该疾病的效应，即引起疾病效应减退。
本发明包括用于改善疾病的各种药物组合物的应用。通过将BTC-δ4，其类似物、衍生物或盐以及一种或多种药学活性物质或BTC-δ4和一种或多种药学活性物质的组合合并为适合用运载体、赋形剂和添加剂或辅剂给予对象的形式，来制备本发明一种实施方式的药物组合物。
常用的运载体或辅剂包括碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、牛乳蛋白质、明胶、淀粉、维生素、纤维素和其衍生物、动物和植物油、聚乙二醇和溶剂，如无菌水、醇、甘油和多元醇。静脉内载体包括液体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。其它药学上可接受的运载体包括水溶液、无毒赋形剂包括盐、防腐剂、缓冲液等，如《《雷明顿药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第20版，Williams和Wilkins(2000)和《英国国家药典》(TheBritish National Formulary) 第43版，(British Medical Association and RoyalPharmaceutical Society of Great Britain，2002；http://bnf.rhn.net)所述，将其内容纳入本文作参考。根据本领域常规技术调整药物组合物的各种组分的pH和准确浓度。参见Goodman和Gilman的《治疗的药理基础》(The Pharmacological Basis forTherapeutics)(第7版，1985)。
优选以剂量单位的形式制备和给予药物组合物。固体剂量单位包括片剂、胶囊和栓剂。在对象治疗中，根据化合物活性、给药方式、疾病的特性和严重程度、对象的年龄和体重，可采用不同的日剂量。然而在某些情况下，较高或较低的日剂量可能是合适的。可通过单次给予单个剂量单位或几个较小剂量单位的形式，也可通过以特定间隔多次给予分开的剂量来给予日剂量。
可局部或全身给予治疗有效剂量的本发明药物组合物。当然，达到此目的的有效用量取决于疾病的严重程度以及对象的体重和总体状况。一般地，体外所用剂量可为药物组合物原位给药的用量提供有用指导，可用动物模型确定治疗细胞毒性副作用的有效剂量。例如，Langer，Science，2491527，(1990)中描述了各种考虑。口服剂型可以是硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合。它们也可以是软明胶胶囊的形式，其中活性成分与水或油性介质，如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬液通常含有活性物质，混有适合生产水性悬液的赋形剂。这种赋形剂可以是悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪树胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂，可以是(a)天然产生的磷脂如卵磷脂；(b)烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯；(c)环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如，十七碳乙烯氧基十六烷醇；(d)环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或(e)环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。
药物组合物可以是无菌可注射水性或油性悬液的形式。可根据已知方法用合适的分散剂或湿润剂以及如上所述的悬浮剂配制此悬液。无菌注射剂也可以是无毒的胃肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，如1，3-丁二醇的溶液。可采用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。因此，可采用任何无刺激性不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
也可以在脂质体递送系统的形式，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡中给予本发明化合物。可由各种磷脂，如胆固醇、十八烷胺硬脂胺或磷脂酰胆碱形成脂质体。
BTC-δ4的剂量水平通常约在每千克体重0.5mg-20mg的数量级，优选的剂量范围是每千克体重每天约0.5mg-10mg(每患者每天约0.5g-3g)。可与运载体材料组合以产生单一剂量的活性成分的用量将因所治疗宿主和具体的给药方式而改变。例如，用于人口服给药的制剂可含有约5mg-1g活性化合物与合适和方便量的运载体材料，运载体材料可约占总组合物的5-95％。剂量单位形式通常含有约5mg-500mg的活性成分。
然而应理解，用于具体患者的特定剂量水平取决于各种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合和进行治疗的具体疾病的严重程度。
此外，本发明多肽可与其它化合物组合，以提供操作性组合。旨在包括药学活性物质的任何化学相容性组合，只要该组合不消除BTC-δ4的活性。
测定BTC-δ4功效的体外模型AR42J-B20细胞的分化胰AR42J细胞衍生自化学诱导的胰肿瘤，表达外分泌和神经内分泌的特性(Rosewicz等，1992)。用活化素A处理后，AR42J-B20细胞停止生长，其形态显著改变(神经突延伸)。此外，活化素-处理的细胞表达编码GLUT2、ATP-敏感性K+通道和胰多肽(PP)的mRNA。因此，活化素A将AR42J细胞转变为内分泌细胞。
用BTC-δ4和活化素A处理这些细胞能将它们进一步转化为产生胰岛素的细胞。可在抗胰岛素抗体染色细胞后用免疫荧光法测定响应于BTC-δ4而产生的胰岛素。或者，可用AR42J克隆AR1898-0192定量测定AR42J细胞向胰岛素分泌细胞的转化。此克隆含有分泌型碱性磷酸酶(SEAP)基因，它位于大鼠胰岛素II基因启动子下游。用BTC-δ4刺激这些细胞导致碱性磷酸酶的合成和分泌入培养基，可用酶学方法测定。
永生化的上皮细胞系胰前体细胞系分离自携带温度敏感型SV40 T抗原的转基因小鼠(“永生化小鼠(immortomice)”)的胰导管(Sharma等，2001)。当在33℃培养这些小鼠的细胞时，表达SV40 T抗原，细胞变成条件性永生化细胞；然而在37℃，T抗原表达被关闭，细胞适当地分化。因此，这些细胞在33℃培养时不显示出岛/神经内分泌颗粒，不能表达岛标记。然而，在37℃培养约2周后，约50％的细胞死亡时，其余细胞开始分化为显示出原始的岛样胰岛素和胰高血糖素颗粒的细胞。移植到裸小鼠的肾囊下时，在两种温度下培养的细胞都发展出导管样和岛样表型。
将此细胞系用于快速灵敏的试验(与上述试验相似)，以测定胰岛素表达和β-细胞分化。在这种情况下，用大鼠胰岛素1启动子驱动绿色荧光蛋白(GFP)受体的表达。这种细胞系提供了非常灵敏的方法，通过测定活细胞中的GFP荧光鉴定β-细胞分化因子如BTC-δ4，所述β-细胞分化因子刺激β-细胞特异性基因如胰岛素的表达。
2型糖尿病的体内模型除链脲霉素(STZ)模型(参见实施例7)以外，2型糖尿病的许多其它动物模型均可用于测试BTC-δ4的体内活性。这些模型包括手术如大鼠的胰切除术产生的2型糖尿病模型(Bonner-Weir等，1983)和基于选择性饲喂的遗传模型。遗传模型包括Goto-Kakizaki(GK)大鼠、自发性糖尿病Torii(SDT)大鼠、Otsuka-Long-Evans-Tokushima肥胖(OLETF)大鼠、db/db小鼠和NOD/Ltj小鼠。
Goto-Kakizaki(GK)大鼠显示出与人糖尿病所见相似的代谢、激素和血管疾病。不像2型糖尿病的许多其它啮齿类模型，GK大鼠并不肥胖。Goto-Kakizaki大鼠的特征包括禁食高血糖症，在体内和分离的胰细胞中响应于葡萄糖的胰岛素分泌受损，以及肝和外周的胰岛素抗性。文献中已经描述了晚期并发症如视网膜病、微血管病、神经病和肾病。
在自发性糖尿病Torii(SDT)大鼠模型中，14周龄后雄性大鼠自发地发生葡萄糖不耐受，同时胰岛素分泌受损；20周龄后发生伴有显著高血糖症和显著低胰岛素血症的糖尿病。糖尿病Long-Evans大鼠的特征是18周龄后发生中度肥胖和晚期发病的高血糖症，以及与慢性糖尿病相关的并发症。虽然通过遗传分析鉴定了多个基因座，但这些大鼠中引起糖尿病的原因似乎是胰岛素抗性和胰岛素分泌受损的组合，类似人类的2型糖尿病。Otsuka-Long-Evans-Tokushima肥胖(OLETF)大鼠衍生自胰岛素抗性和胰岛素分泌受损的自发组合，类似人类的2型糖尿病。在这些大鼠中，胰岛素敏感性随衰老而降低，即与周龄匹配的对照Long-Evans Tokushima Otsuka(LETO)大鼠相比，在6周龄时正常，而在12周龄时降低40％，18周龄后降低80％。胰岛素分泌在40周龄时受损(14)，对岛β-细胞的脂毒性(lipotoxicity)可能参与了甘油三酯过高的OLETF大鼠的岛功能障碍发病。此外，与LETO大鼠相比，OLETF大鼠的胰β-细胞的再生能力降低(17)。因为糖尿病的慢性进行性形式，OLETF大鼠适用于研究前驱糖尿病期间的病理生理学改变。
db/db小鼠的瘦激素(leptin)受体基因中携带点突变，出生后8-10周自发性发生血糖水平升高和胰β细胞耗减。约4周龄时这些小鼠也变得显著肥胖。
NOD/Ltj小鼠的特征是胰岛炎，胰岛的白细胞浸润。约为12周龄的雌性，胰脏的胰岛素含量显著降低，雄性再过数周发生这种现象。糖尿病发病的标志是中度糖尿和未禁食的血浆葡萄糖高于250mg/dl。糖尿病NOD/Ltj小鼠的胰岛素分泌过少且血糖过多，这表明胰岛β细胞被选择性破坏。NOD/LtJ小鼠对IDDM的易感性是多基因性的，环境，包括饲养条件、健康状况和饮食对外显率具有强烈的影响。NOD/LtJ雌性比雄性的应用更广泛，因为IDDM症状的发生更早且发病率更高(30周龄时90-100％)。30-40周龄时NOD/LtJ雄性发生IDDM的频率是40-60％。雄性小鼠可用于某些应用，包括药物研究、IDDM的″加速转移″和一些体外研究。NOD小鼠的糖尿病易感性的主要组分是独特的MHC单倍型(H2g7＝Kd、Aad、Abg7、Enull、Db)。NOD小鼠也展现多种异常的免疫表型，包括抗原递呈细胞免疫调节功能缺陷、T淋巴细胞库的调节缺陷、NK细胞功能缺陷、巨噬细胞产生细胞因子的缺陷(Fan等，2004)和伤口愈合受损。它们也缺少α溶血补体组分C5。NOD/LtJ小鼠的听力也严重受损。已将引起免疫缺陷的各种突变、细胞因子基因靶向突变和影响免疫功能的转基因回交到NOD/Lt近交株背景中。
本领域技术人员可获得的测试本发明推定多肽以用于本发明的其它合适方法包括采用上述2型糖尿病的体内模型、测试β-细胞再生、改善葡萄糖不耐受和改进血糖(禁食血清葡萄糖)的控制、当血糖水平升高时刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌，低血糖和测定β-细胞功能标志的改善如静脉内葡萄糖耐受测试、精氨酸刺激和高血糖钳。这些试验也可应用于人类临床试验。
下面将通过参照以下非限制性实施例和附图的方式详细描述本发明。
实施例1用RT-PCR检测BTC-δ4并克隆入pBluescript II SK用Rneasy小抽试剂盒按照厂商说明书(Qiagen，Clifton Hill，Vic.，Australia)分离70-80％汇合的MCF-7细胞和人乳房皮肤成纤维细胞的总RNA。由乳房复位术中获得的一块皮肤制备正常的人乳房皮肤成纤维细胞。用补充有10％胎牛血清和青霉素-链霉素硫酸盐的DMEM将该皮肤作为外植体培养5天，直到成纤维细胞长成单层。然后，按照厂商说明书用Superscript II酶、寡聚dT引物(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)将总RNA(2μg)逆转录为cDNA。用PCR以正义引物和反义引物扩增对应于人BTC-β的cDNA。
正义引物为(5′CTCGTCGACGAGCGGGGTTGATGGACCGG-3′)(SEQ ID NO3)反义引物为(5′CTCCTGCAGTTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′)(SEQ ID NO4)。
下面划线的核苷酸对应于SalI(正义引物)和PstI(反义引物)限制性位点。用50μl60mM Tris-SO4、18mM(NH4)2SO4、1.5mM MgSO4(pH9.1)、0.2mM dNTP、200ng各引物、1U eLONGase(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)和1μl cDNA进行PCR。一开始在94℃孵育3分钟后，进行35个下述循环94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，68℃ 1分钟，最后在68℃延伸4分钟。用2％琼脂糖凝胶分离416bp BTC-δ4 PCR产物，用溴乙锭染色后在紫外灯下观察。PCR标记(Promega，Madison，WI)用作分子大小标准，结果见图1A。电泳后，通过0.4M NaOH将凝胶Southern转移到带正电的尼龙膜(Roche，Castle Hill，NSW，Australia)上。在预杂交缓冲液(5×SSC，5×Denhardt，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μg/ml鲑精DNA)中55℃孵育该印迹2小时，在含有用Gigaprime试剂盒(Geneworks，Adelaide，Australia)以随机引物法产生的32P-dCTP-标记的人BTC cDNA探针(D32-Y111)的相同缓冲液中杂交16小时。用2×SSC，0.1％SDS室温下洗涤5分钟两次，然后用0.5×SSC，0.1％SDS在55℃再洗涤15分钟两次。然后在-80℃用该印迹曝光Kodak XAR X-线胶片，结果见图1B。
通过以下方法克隆并测序BTC和BTC-δ4 PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离产物，用Concert试剂盒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)进行凝胶抽提后，回收片段。然后用SalI和PstI消化纯化的PCR产物，并亚克隆入SalI/PstI-消化的pBluescript IISK(Strategene，La Jolla，CA)，产生pBlue-BTC和pBlue-BTC-δ4，并引入大肠杆菌JM109。扩增重组质粒并用双脱氧核苷酸链末端法测序，测序采用含有M13 T7和T3启动子引物的Thermosequenase循环测序试剂盒(Amersham-Pharmacia Biotech，澳大利亚悉尼)。在两个方向上测序PCR产物，以验证序列；对两个独立克隆进行两次测序，结果见图2A和B。
实施例2用大肠杆菌表达和纯化重组BTC和BTC-δ4为了表征BTC-δ4的生物学活性，我们将相应的cDNA(Asp32-Ala129；无信号肽)克隆入pET-32a表达载体，在大肠杆菌BL21trxB(DE3)中将该蛋白表达为硫氧还蛋白融合物。此菌株的硫氧还蛋白还原酶缺陷，能够在胞质中形成二硫键。所用构建物的示意图见图5A。在细菌表达载体pET3.2a中BTC(Asp32-Tyr111)或全长BTC-δ4(Asp32-Ala129，减去疏水信号肽Met1-Ala31)的成熟形式表达为硫氧还蛋白融合蛋白。将pET3.2a-BTC和pET3.2a-BTC-δ4构建物转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，IPTG诱导后表达蛋白。诱导后，收集细胞并裂解，用Ni-NTA琼脂糖和RP-HPLC纯化BTC或BTC-δ4。表达后，裂解细胞，用Ni-NTA琼脂糖纯化融合蛋白。用肠激酶切割纯化的硫氧还蛋白融合蛋白，以释放BTC-δ4，用反相HPLC纯化BTC-δ4至均一。
通过PCR以pBlue-BTC-δ4(Dunbar等，2000)为模板用以下引物组扩增BTC-δ432-129的开放阅读框序列5′-CGTCCATGGCTGATGGGAATTCCACCAGAAGT-3′(SEQ ID NO5)(正义)和5′-CGTCTCGAGTCATTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′(SEQ ID NO6)(反义)。将NcoI和XhoI识别位点(下划线)分别连接于正义和反义引物。也用pET系统表达并纯化BTC的氨基酸32-111(BTC32-111)，作为阳性对照，如上所述(Seno等，1996)，或用质粒pET32a产生为硫氧还蛋白融合蛋白。在此构建物中，通过PCR以pBlue-BTC-δ4(Dunbar和Goddard，2000)为模板用以下引物组扩增BTC32-111的ORF序列5′-CGTCCATGGCTGATGGGAATTCCACCAGAAGT-3′(SEQID NO7)(正义)和5′CGTCTCGAGTCAGTAAAACAAGTCAACTGT-3′(SEQ ID NO8)(反义)。也将NcoI和XhoI识别位点(下划线)分别连接于正义和反义引物。扩增后，用NcoI/XhoI消化PCR产物，并克隆入NcoI/XhoI消化的pET32a载体，如上所述。用大肠杆菌JM109维持得到的质粒pETBTC-δ432-129和pETBTC32-111，转化入大肠杆菌BL21trxB(DE3)细胞进行表达。为了在BL21trxB(DE3)细胞中表达BTC或BTC-δ4，将单菌落接种到50ml培养物中，用LB培养基(补充有50μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml卡那霉素)37℃培养过夜，不断振荡。然后，用10ml此过夜培养物接种200ml新鲜的LB培养基。在37℃培养细胞至OD600nm为0.4-0.5，然后用IPTG(1mmol/l)诱导，3小时后离心沉淀(4000rpm，4℃，10分钟)，纯化前贮存于-80℃。
为了纯化表达为融合蛋白的BTC或BTC-δ4，在冰上融化冷冻的细胞沉淀，重悬于含有溶菌酶(100μg/ml)的18ml BugBuster蛋白质抽提试剂，室温下温和振荡孵育10分钟。孵育后，超声处理(3×5秒脉冲)细胞裂解物以降低粘度，离心使其澄清(20分钟，16000rpm，10分钟)。离心后，将澄清的细胞裂解物调整到10mmol/l咪唑中，与6ml Ni-NTA琼脂糖一起孵育，在50mmol/lNaH2PO4、0.3mol/l NaCl、10mmol/l咪唑(pH8.0)中4℃预平衡1小时，温和振荡。孵育后，离心树脂(5分钟，15000rpm，4℃)，去除上清，通过悬浮于50mmol/l NaH2PO4、0.3mol/l NaCl、40mmol/l咪唑(pH8.0)洗涤树脂。连续进行三次上述洗涤后，通过在12ml 50mmol/l NaH2PO4、0.3mol/l NaCl、250mmol/l咪唑(pH8.0)中孵育树脂15分钟洗脱蛋白质。得到的上清中含有BTC或BTC-δ4，然后更换几次肠激酶切割缓冲液(50mmol/l Tris-Cl，1mmol/lCaCl2，0.1％吐温-20，pH7.4)透析此上清过夜(Spectra/Por，3.5kDa MWCO，SpectrumLaboratories)。为了去除BTC或BTC-δ4的硫氧还蛋白融合伴侣，加入肠激酶，使终浓度为0.1单位/20μg蛋白质，并在37℃温和混合地孵育过夜。通过上述Ni-NTA琼脂糖亲和色谱进一步分离BTC或BTC-δ4与硫氧还蛋白融合伴侣。在这种情况下，在树脂上捕获切割的硫氧还蛋白融合伴侣，BTC或BTC-δ4富集于流过组分中。用反相HPLC进一步纯化流过组分中存在的BTC或BTC-δ4。简要说，用0.1％TFA1∶4(v/v)地稀释Ni-NTA琼脂糖流过组分，将其施加于C4 Prep-Pak反相HPLC柱(25mm×100 mm；300，15μm；Millipore-Waters)，流速为10ml/分钟。用0.1％TFA洗涤该柱，直到OD214nm回到基线，然后用150分钟在0.08％TFA的存在下以8-80％梯度(v/v)的乙腈洗脱该柱，流速为10ml/分钟。收集20ml组分，用SDS-PAGE和山羊抗人BTC胞外域(Asp32-Tyr111)抗体的Western印迹分析各等分(50μl)，以鉴定含有纯BTC或BTC-δ4的组分。集合含有BTC或BTC-δ4的组分，用分析RP-HPLC、电子喷雾离子化质谱和SDS-PAGE分析纯度。用40分钟通过Brownlee aquapore C4RP-HPLC柱(2.1×100mm)(Alltech)以8-80％线性梯度(v/v)的乙腈和0.08％TFA进行分析RP-HPLC，流速为0.5ml/分钟。结果见图5B。
电子喷雾离子化质谱测定的重组BTC和BTC-δ4的分子质量分别为9211.35±0.29Da和11450.26±0.23Da，与9249和11452Da的计算理论质量(数据未显示)一致。SDS-PAGE和银染后，获得约为9kDa和11.5kDa的单一条带，它们对应于还原或非还原条件下检测到的BTC和BTC-δ4。通过N-末端序列分析(5个循环)进一步验证了BTC和BTC-δ4的纯度，该分析给出预计的N-末端序列，纯度约＞95％。
或者，将BTC-δ432-129(含有起始甲硫氨酸残基)克隆入表达载体pET3b，重组蛋白溶解，从包含体再折叠，用阳离子交换柱和凝胶过滤柱色谱纯化，如前所述(Maeda等，2002)。本研究中制备的所有重组蛋白都被冻干并储存于-80℃待用。
实施例3构建用于哺乳动物表达的BTC-δ4表达质粒将全长BTC-δ4(1-129)克隆入载体pcDNA3.1(Invitrogen)，产生用于哺乳动物产生BTC-β(如下所述)的表达载体。简要说，用ApaI和BamHI消化实施例1的pBlue-BTC-δ4，琼脂糖凝胶电泳后纯化释放的插入物。然后将消化和纯化的插入物克隆入ApaI/BamHI-消化的pcDNA3.1中，转化到大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)中后鉴定重组克隆。为了产生“Flag-标记的”pcDNA3.1-BTC-δ4构建物(其中Flag表位DYKDDDDK插入氨基酸S35-T36之间，如图3所示)，将pBlue-BTC-δ4用作PCR模板，采用以下引物5′-CTCGGGAATTCC TCCTGAA-3′(SEQ ID NO9)(正义；下划线的核苷酸对应于EcoRI限制性位点；双下划线的核苷酸编码FLAG表位标签)和5′-CTCCTGCAGTTAAGCAATATTTGTCTCTTC-3′(SEO ID NO10)(反义；下划线的核苷酸对应于PstI限制性位点)。纯化得到的PCR产物，用EcoRI和PstI消化并克隆入EcoRI/Pst1-消化的pBlue-BTC-δ4中。然后，用ApaI/BamH1消化得到的Flag-标记的pBlue-BTC-δ4构建物，并克隆入ApaI/BamH1-消化的pcDNA3.1，产生pcDNA3.1-FLAG-BTC-δ4。
实施例4在COS-7细胞中表达和分析BTC和BTC-δ4 FLAG-标记的构建物正如EGF家族的其它成员，BTC合成为跨膜-锚定的前体蛋白(pro-BTC)，它经蛋白质水解切割后可产生含EGF-基序(Asp32-Tyr111)的可溶性BTC。保留了疏水性信号肽和不存在跨膜结构域说明，BTC-δ4可能是分泌蛋白。为了检验此推论，工程改造BTC或BTC-δ4的完整开放阅读框，以在氨基酸Ser35和Thr36之间额外掺入了FLAG表位，用于如实施例3所述的后续检测，将此开放阅读框克隆入表达载体pcDNA3.1，瞬时转染COS-7细胞后监测分泌。转染72小时后，收集培养物上清和细胞裂解物，并用ELISA和Western印迹分析分泌的和与细胞相连的BTC-FLAG和BTC-δ4-FLAG的存在。
在pcDNA3.1-FLAG-BTC-δ4和pcDNA3.1-FLAG-BTC的瞬时转染中，用DMEM/10％FBS将COS-7细胞接种到12孔板中，密度为2×105细胞/孔。孵育过夜后，用Lipofectamine 2000和Optimem-1培养基(均来自Invitrogen)按照生产商说明书以2μg构建物DNA转染细胞。12小时后，洗涤细胞两次，补充新鲜的Optimem-1培养基。转染72小时后，收集培养基(CM)，制备细胞裂解物。通过离心使CM澄清，用抗FLAG-M2抗体(Sigma)的ELISA或Western印迹分析培养基中BTC或BTC-δ4的存在。用抗FLAG-M2抗体的Western印迹分析细胞裂解物中存在的BTC或BTC-δ4。去除CM后用PBS洗涤细胞两次，然后用SDS-PAGE的样品缓冲液直接裂解细胞并加热到95℃5分钟，从而制备细胞裂解物。
在CM的ELISA分析中，将90μl CM与10μl 10×包被缓冲液(0.15mol/l Na2CO3，0.35mol/l NaHCO3，pH9.3)混合，加入96孔免疫吸附板中。板在4℃包被过夜，然后用PBS/0.1％吐温(PBS-T)中的2％BSA封闭。用PBS-T洗板4次，然后与PBS-T(2.5μg/ml)稀释的抗-FLAG抗体一起在37℃孵育1小时。孵育后，如上所述洗板，与PBS-T稀释的HRP-偶联的绵羊抗-小鼠抗体(1∶2000)一起孵育(HRP-偶联的绵羊抗-小鼠抗体来自Silenus Laboratories)。然后用PBS-T洗板4次，用邻苯二胺(OPD)底物发色，用2mol/l H2SO4终止。在490nm读出吸光度。结果表示为三次重复测定的平均值±标准差(SD)。为了用ELISA分析细胞表面上BTC或BTC-δ4的存在，去除CM，用PBS洗涤细胞3次。然后用4％多聚甲醛固定细胞，用抗-FLAG M2抗体染色，如上所述。
在用抗-FLAG M2抗体进行的Western印迹分析中，用SDS-PAGE(10-20％Tris-Tricine凝胶)分辨CM或细胞裂解物。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素(Hybond-Cextra；Amersham)上，用小鼠抗-FLAG M2抗体(2.5μg/ml)、随后用HRP-偶联的绵羊抗-小鼠抗体(1∶10000)检测膜。用Supersignal West Dura Extended Duration Substrate(Pierce)观察HRP-标记的蛋白质。
图6中小结了结果。如图6A和B所示，用Western印迹(～14kDa)或酶免疫测定(EIA)明确检测到培养物上清中的BTC-δ4-FLAG，细胞裂解物中或细胞表面上存在的非常少(图6A和B)。相反，BTC-FLAG主要存在于细胞裂解物中(～20kDa)和细胞表面上(图6A和B)。因此，不像膜-锚定的pro-BTC是细胞表面胞外域切割后分泌的，BTC-δ4缺少跨膜结构域，似乎是表达后直接分泌的。
实施例5BTC-δ4的ErbB-受体结合和促分裂活性为了研究BTC-δ4的生物学活性，我们起初测试了它刺激表达ErbB1的Balb/c3T3小鼠成纤维细胞增殖的能力。如前所述(Dunbar等，1999)测定BTC和BTC-δ4对Balb/c 3T3成纤维细胞的的促分裂活性。Balb/c 3T3细胞获自美国典型培养物保藏中心。
结果见图7A和7B。不出所料，BTC以剂量依赖方式刺激Balb/c 3T3增殖。相反，BTC-δ4不刺激细胞增殖，即使浓度高达100nmol/l。此外，在该细胞系中BTC-δ4不拮抗BTC的作用。
通过测定BTC或BTC-δ4竞争性取代ErbB1或ErbB4受体上的[125I]-标记的重组人BTC的能力确定BTC和BTC-δ4与ErbB受体的结合亲和力，所述ErbB1或ErbB4受体分别存在于AG2804成纤维细胞(Dunbar等，1999)或ErbB4稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO-ErbB4细胞；(Tzahar等，1996)，以色列魏茨曼学院的YosefYarden教授友情馈赠)上。为了完成此测定，在24-孔板中用DMEM/10％FBS将AG2804或CHO-ErbB4细胞培养至70-80％汇合。(人肺成纤维细胞。然后用结合缓冲液(100mmol/l Hepes，(pH7.6)，120mmol/l NaCl，5mmol/l KCl，1.2mmol/l MgSO4，8mmol/l葡萄糖，0.1％BSA)洗涤细胞两次，然后与[125I]-rhBTC(10000-15000cpm，用氯胺-T以Na[125I]标记，至比活性约为20μCi/μg)和浓度升高的未标记BTC或BTC-δ4(AG2804细胞是0-100nmol/l，CHO-ErbB4细胞是0-10nmol/l)一起在结合缓冲液中4℃孵育18小时。然后用冰冷的Hank’s缓冲盐溶液洗涤标记的细胞三次，并用1ml 0.5mol/l NaOH/0.1％(v/v)Triton X-100裂解30分钟。随后用γ-计数器(Wallac1470)测定细胞裂解物的放射性。在未标记配体过量100倍的情况下进行该生物试验测定非特异性结合。非特异性结合一般约为总结合的5％。
我们也比较了BTC和BTC-δ4刺激ErbB1或ErbB4的酪氨酸磷酸化的能力。在10cm培养皿中将过度表达ErbB1受体的细胞系AG2804或过度表达ErbB4受体的CHO细胞(CHO-ErbB4细胞；以色列魏茨曼学院的Yosef Yarden教授友情馈赠)培养至汇合，然后用无血清培养基孵育12-14小时，然后用10nmol/l BTC、BTC-δ4或二者的组合在室温下刺激细胞10分钟。刺激后，用PBS洗涤细胞两次，随后用裂解缓冲液(0.5ml)(50mmol/l Tris-Cl pH7.4，150mmol/l NaCl，1％脱氧胆酸，1％ TritonX-100，0.1％SDS，5mmol/l原钒酸钠，10mmol/l氟化钠，1mmol/l EGTA和完全蛋白酶抑制剂TM)裂解。通过离心(15000g 4℃离心20分钟)使细胞裂解物澄清，分别通过将裂解物与1μg兔多克隆抗-ErbB1抗体(1005)(Santa Cruz)或兔多克隆抗-ErbB4抗体一起在4℃温和振荡孵育2小时免疫沉淀ErbB1或ErbB4。
孵育后，加入蛋白-G琼脂糖，再在4℃孵育该混合物1小时。离心收集免疫复合物，用裂解缓冲液洗涤三次并在SDS-PAGE样品缓冲液中加热(3分钟，95℃)。用SDS-PAGE或10-20％Tricine凝胶分离蛋白质，转移到硝酸纤维素滤膜(Hybond C，Amersham)上。首先用抗-磷酸化酪氨酸单克隆抗体(PY20)探测膜，然后用HRP-偶联的绵羊抗-小鼠抗体探测。用酶-联化学发光(ECL)(Amersham)观察HRP-标记蛋白。为了验证上样量相等，洗提印迹，用兔多克隆抗-ErbB1或兔多克隆抗-ErbB4抗体和HRP-偶联的兔抗-绵羊抗体再探测。抗-ErbB1(1005)、抗-ErbB4(C-18)和抗-磷酸化酪氨酸(PY20)抗体购自Santa Cruz，HRP-偶联的兔抗-绵羊抗体购自Zymed Laboratories。
图7C-7F和图8中小结了结果。我们发现，BTC而非BTC-δ4可以取代人肺成纤维细胞(AG2804)上存在的ErbB1受体的[125I]-BTC(图7C和D)，并诱导ErbB1受体自身磷酸化(图8)。类似地，BTC而非BTC-δ4竞争结合ErbB4受体(图7E和F)并诱导ErbB4受体酪氨酸磷酸化(图8)。这些结果表明，与BTC相反，BTC-δ4没有显示出与ErbB1或ErbB4的亲和力。而且，BTC-δ4不活化ErbB1或ErbB4。
这些结果完全出乎意料。因为这意味着BTC-δ4不刺激细胞增殖，我们的发现提示，BTC-δ4比真正BTC的癌症诱导风险低。而且，似乎BTC-δ4通过一种仍未鉴定的受体发挥其作用，而不是通过ErbB1或ErbB4受体。可用本文所述方法，或用BIAcore试验继续进行进一步研究。
实施例6测定AR42J细胞的分化和凋亡已知天然BTC能刺激胰β-细胞分化(Mashima等，1996；Watada等，1996；Yamamoto等，2000；Li等，2001；Li L等，2003；Li等，2004)，有一些证据提示，这种作用可能通过独特的非ErbB细胞表面受体发生(Ishiyama等，1998)。
为了检测BTC-δ4对胰β-细胞分化的影响(如通过评价对胰岛素表达的诱导)，我们采用了模式细胞系AR42J-B20，它是AR42J的亚克隆，是一种分泌淀粉酶的胰肿瘤细胞系。在这些细胞中，BTC与活化素A协同作用，将它们转变为胰岛素分泌细胞(Mashima等，1996)。因此，活化素A将分泌淀粉酶的AR42J-B20转变为产生胰多肽(PP)的内分泌细胞。活化素A也诱导这些细胞凋亡，在没有存活因子时，许多活化素-处理的细胞在转变为产生PP的细胞后通过凋亡而死亡(Furukawa等，1999)。
BTC在AR42J-B20细胞中发挥两种作用首先，它抑制活化素A诱导的凋亡，其次，它将它们转变为产生胰岛素的细胞(Mashima等，1996；Furukawa等，1999)。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养AR42J-B20细胞，如前所述(Mashima等，1996)。
为了评价向产生胰岛素的细胞的分化，将细胞与2nmol活化素A和1nmol BTC或BTC-δ4一起孵育48小时。然后固定细胞，用抗-胰岛素抗体染色，如前所述(Mashima等，1996)，计数胰岛素-阳性细胞。用DAPI染核。
用末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL)技术(Wako Pure Chemicals，Osaka，Japan)评价凋亡。用3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)评价活细胞数量的改变(Carmichael等，1987)。
如图9A所示，彩色印刷时，AR42J-B20细胞响应于活化素A和BTC的组合分化为产生胰岛素的细胞。定量来看，48小时后78±6.5％的细胞(平均值±S.E.，n＝4)变成胰岛素阳性。活化素A和BTC处理的细胞具有延长的过程并表达免疫反应性胰岛素，如彩色印刷时的图9C所示。用活化素A和BTC-δ4的组合处理的细胞也变成胰岛素阳性；48小时后72±4.5％(n＝4)的细胞变成胰岛素阳性，如彩色印刷时的图9B所示。
与活化素A和BTC处理的细胞相比，活化素A和BTC-δ4处理的细胞的形态非常不同。一些胰岛素阳性细胞显示出延长的过程，但大部分看上去保持圆形。这些细胞的细胞核是皱缩的，在一些情况下呈片段化或不存在，如彩色印刷时的图9B和D所示，这是细胞通过凋亡死亡的特征。与凋亡现象一致，用活化素A和BTC-δ4处理的许多细胞是TUNEL-阳性，而仅有一小部分用活化素A和BTC处理的细胞变为TUNEL-阳性，如图10所示。
为了再次确认BTC-δ4对AR42J-B20细胞存活的影响，我们测定了活化素A和BTC或BTC-δ4处理后活细胞数的改变。48小时后，用活化素A和BTC处理的培养物中的活细胞数为接种的细胞数的78.8±4.2％。相比较，用活化素A和BTC-δ4处理的培养物中的活细胞数明显较低(21.8±3.2％)(P＜0.005)。总之，在刺激AR42J-B20细胞分化方面BTC-δ4与BTC同样有效；然而，BTC-δ4在促进这些细胞存活方面的功效要小得多。
实施例7将BTC-δ4给予STZ-处理的大鼠能降低血浆葡萄糖浓度并改善葡萄糖耐受。
为了研究BTC-δ4的体内β-细胞分化活性，我们将BTC-δ4给予STZ-处理的新生大鼠。试验方案由Gunma大学的动物护理委员会批准。用新鲜溶解于0.05mmol/l柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)的85μg/g链脲霉素(STZ)腹膜内(ip)注射一日龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠。将幼崽留在母亲身边直到4周龄。在STZ注射1天后(第1天)用Accu-Chek Active(Roche Diagnostics，德国)测试所有新生动物的血糖。只有当第一天血糖浓度在200和350mg/dl之间时，才将该动物包括在该研究中。第一天血糖＞350mg/dl的动物发生严重的糖尿病，在第2天或第3天这些动物的血糖浓度＞600mg/dl。
将3pmol/g BTC-δ4、BTC或盐水每天注射给STZ-处理的新生大鼠，从第0天起共计5天。在第一周每天测定禁食血糖浓度和体重，然后每周测定一次，共测定8周。STZ处理后2个月，禁食14小时后进行ip葡萄糖耐受测试(2g/kg体重)。
在第4天和第8周，以每100g体重1ml溴脱氧尿苷(BrdU)标记试剂ip注射动物(细胞增殖试剂盒，Amersham Pharmacia Biotech，英国)，3小时后处死。切除胰脏，称重，并分为两份。用4％多聚甲醛/PBS固定一份脾脏节段(4℃过夜)，加工后用于石蜡包埋。在各新生动物胰脏上以100μm的间隔连续切4个切片，成年动物的间隔是300μm，进行免疫染色和组织化学。在冷酸-乙醇中匀浆第二部分，在70℃水浴中加热5分钟，离心，将上清储存于-20℃，然后测定胰岛素。通过如前所述时间分辨的免疫荧光试验(Mashima等，1996)测定胰岛素。
如前所述(Li等，2001；Li等，2003)进行免疫组化。第一抗体的来源和稀释如下豚鼠抗-猪胰岛素，1∶1000(Gunma大学的Matozaki博士提供)；兔抗-PDX-1，1∶3000；单克隆小鼠抗-BrdU，1∶100(Amersham)；用于广谱筛选的兔抗-牛细胞角蛋白(Ckwss)，1∶1000(DAKO)。第二抗体的来源和稀释如下山羊Alexa Flour 568偶联的抗-豚鼠IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶联的抗-豚鼠IgG，1∶500；山羊Alexa Flour 568偶联的抗-小鼠IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶联的抗-小鼠IgG，1∶500；山羊Alexa Flour 568偶联的抗-兔IgG，1∶1000；山羊Alexa Flour 488偶联的抗-兔IgG，1∶500(Molecular Probes Inc.，俄勒冈尤金)。
通过装有PXL 1400冷却-电荷耦合器件照相机系统(Photometrics，美国亚利桑那州图森)的AX70落射荧光显微镜(Olympus，日本东京)用图像分析软件(NIH图像)在胰岛素-染色的切片上对β-细胞质量进行定量，所述照相机系统是用IP Lab Spectrum软件(Signal Analysis，弗吉尼亚维也纳)操作的。在一个切片(来自各包埋块的不同连续切片的三个切片)上至少随机测定40个视野(放大倍数×200)下的胰岛素-阳性细胞区域。如其它地方所述(Li L、Seno M、Yamada H、Kojima I，在90％胰切除的大鼠中β动物纤维素能促进β-细胞再生(Promotion of β-cell regeneration by betacellulin inninety percent pancreatectomized rats)，Endocrinology 1425379-5385，2001；Li L，Seno M，Yamada H，Kojima I在链脲霉素-处理的小鼠中β动物纤维素通过促进岛内前体细胞转化为β-细胞提高葡萄糖代谢(Betacellulin improves glucose metabolismby promoting conversion of Intraislet precursor cells to β-cells in streptozotocin-treatedmice)，Am J Physiol 285E577-E583，2003)。为了定量β-细胞新生，我们测定了岛样细胞簇(ICC)的数量(宽度小于5个细胞)。测定用抗胰岛素抗体染色的切片中ICC和岛的数量，测定这些切片的面积。就每个动物而言至少分析5个切片。结果表示为平均值±SE，见表1以及图11和12(图12彩色印刷时)。在两组之间的比较中，采用不成对t-检验。
表1.
给予BTC或BTC-δ4的STZ-处理的新生大鼠的特征。
数据是平均值±S.E.(n)。用BTC、BTC-δ4或盐水处理STZ-处理的新生大鼠，第8周测定各种参数。
*对STZ组的P＜0.05。**对STZ组的P＜0.01。
在STZ-处理的新生大鼠中，血浆葡萄糖浓度显著增加，在第二天达到峰值(＞400mg/dl)(图11A)，然后逐渐降低，但2个月后仍然显著高于对照大鼠(表1)。相反，STZ-处理的大鼠给予BTC-δ4后，在第1天血浆葡萄糖浓度显著较低，峰值大大降低(图11A)。随后血浆葡萄糖浓度也降低，直到2个月后(表1)。与BTC-δ4的作用相比，BTC改善高血糖症的能力较差(图11A，表1)。在2月龄时，进行腹膜内(ip)葡萄糖耐受测试。在STZ-处理的大鼠中，对ip葡萄糖-加载产生的葡萄糖反应显著受损，然而在给予BTC-δ4的STZ-处理的大鼠中，葡萄糖反应显著改善(图11B)。BTC-δ4也提高了胰岛素反应，但与正常大鼠相比，对ip葡萄糖-加载产生的胰岛素反应仍然被延迟。在BTC-处理的大鼠中，提高了葡萄糖耐受，但BTC的作用小于BTC-δ4(图11B)。而且，在BTC-δ4-处理的大鼠中胰岛素含量和β-细胞质量显著增加(表1)，在第4天对胰组织的组织学分析表明，BTC-δ4显著增加了PDX-1-阳性导管细胞和ICC的数量(图12，彩色印刷时)。
本领域技术人员显然明白，虽然出于阐述和理解的目的详细描述了本发明，但可在不背离本说明书所公开的发明构思范围的情况下对本文所述的实施方式和方法进行各种修饰和改变。
下面列出了本文引用的参考文献，将其纳入本文作参考。
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Ala<210>12<211>94<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>12Met Asp Arg Ala Ala Arg Cys Ser Gly Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Val Ile Leu His Cys Val Val Ala Asp20 25 30Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp35 40 45Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys Gly50 55 60His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys Gly65 70 75 80Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val85 90<210>13<211>63<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>13Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys20 25 30Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val50 55 60<210>14<211>98<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>14Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly1 5 10 15
Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gln Ser Lys Arg Lys20 25 30Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys35 40 45Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Pro50 55 60Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu Thr65 70 75 80Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr Asn85 90 95Ile Ala<210>15<211>35<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>15Pro Leu Arg Lys Arg Arg Lys Arg Lys Lys Lys Glu Glu Glu Met Glu1 5 10 15Thr Leu Gly Lys Asp Ile Thr Pro Ile Asn Glu Asp Ile Glu Glu Thr20 25 30Asn Ile Ala3权利要求
1.一种在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的方法，所述方法包括给予所述对象多肽，该多肽能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞，并且与真正的BTC相比，该多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
2.一种在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的方法，所述方法包括给予所述对象核酸，该核酸编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽，与真正的BTC相比，所述多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
3.能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽在糖尿病患者中治疗、预防该疾病或延迟其发病的应用，其中与真正的BTC相比，所述多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
4.编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽的核酸在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的应用，其中与真正的BTC相比，所述多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
5.能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽在用于在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的药物制备中的应用，其中与真正的BTC相比，所述多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
6.编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽的核酸在用于在患有糖尿病或处于患糖尿病风险的对象中治疗、预防该疾病或延迟其发病的药物制备中的应用，其中与真正的BTC相比，所述多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法或应用，其特征在于，与真正的BTC相比，所述多肽活化所述对象的ErbB1和ErbB4受体的能力显著降低。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法或应用，其特征在于，刺激岛细胞祖细胞向胰腺β细胞分化时没有刺激其它细胞类型的增殖。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述糖尿病是2型糖尿病。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法或应用，其特征在于，所述糖尿病是1型糖尿病。
11.一种治疗、预防糖尿病或延迟其发病的组合物，其包含能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽和药学上可接受的运载体，其中与真正的BTC相比，所述多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
12.一种治疗、预防糖尿病或延迟其发病的组合物，其包含编码能够刺激岛细胞祖细胞分化为胰腺β细胞的多肽的核酸和药学上可接受的运载体，其中与真正的BTC相比，所述多肽没有细胞生长促进活性或此活性降低。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，与真正的BTC相比，所述多肽没有刺激细胞类型增殖的能力或此能力降低。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，与真正的BTC相比，所述多肽没有活化ErbB1或ErbB4受体的能力或此能力降低。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，与真正的BTC相比，所述多肽没有活化ErbB2或ErbB3同源二聚体的能力或该能力降低。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，与用真正BTC治疗产生的风险相比，作为治疗的副作用而在对象中发生癌症的风险降低。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述多肽与EGF家族成员基本同源。
18.如权利要求17所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述多肽与表皮生长因子、转化生长因子-α、肝素结合的EGF样生长因子、表皮调节素、双调蛋白、神经和胸腺衍生的ErbB激酶激活物(NTAK)、神经调节蛋白亚家族成员(NRG1、NRG2、NRG3和NRG4)或β动物纤维素(BTC)基本同源。
19.如权利要求18所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述多肽与BTC-δ4基本同源。
20.如权利要求19所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述多肽是BTC-δ4。
21.如权利要求20所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述BTC-δ4多肽具有图4所示氨基酸序列(SEQ ID NO11)。
22.如权利要求1-12中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述多肽是(a)BTC的剪接变体，其中没有C5-C6二硫环，而编码真正BTC的基因中通常存在此二硫环；或(b)序列与(a)基本同源的多肽，或(c)(a)的类似物、片段、突变体、衍生物或等位基因变体。
23.如权利要求1-12中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述多肽是(a)BTC的剪接变体，其中没有C5-C6二硫环，而编码真正BTC的基因中通常存在此二硫环，成熟分子的其余部分，包括A环和B环以及“铰链”缬氨酸框内融合于截短的C-末端胞质尾；(b)序列与(a)基本同源的多肽；或(c)(a)的片段、类似物、变体或衍生物。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述多肽能够用作β-细胞分化因子、增加β-细胞质量、减少β-细胞功能的降低和/或增加β-细胞的胰岛素分泌。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，与用BTC治疗产生的风险相比，作为治疗的副作用而在对象中发生癌症的风险降低。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法、应用或组合物，其特征在于，所述对象具有以下糖尿病风险因素中的一项或多项葡萄糖耐受受损、代谢综合征、1型或2型糖尿病家族史、肥胖、多囊卵巢综合征、高血压或高胆固醇。
全文摘要
本发明提供了治疗或预防糖尿病的方法，该方法包括给予能够刺激胰岛β细胞活性但不结合或激活ErbB1或ErbB4受体的多肽。也提供了诊断糖尿病的方法，即采用该多肽和含有该多肽的组合物。
文档编号A61P3/10GK101090732SQ200580032419
公开日2007年12月19日 申请日期2005年8月5日 优先权日2004年8月6日
发明者A·J·邓巴, C·戈达德 申请人:谷柔派普有限公司