治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法

专利名称：：治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药
技术领域：
，特别是涉及一种治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法。
背景技术：
：随着全球人口老龄化，阿尔茨海默氏病(Aizheimer'sdisease,AD)的发病率呈逐年上升的趋势。由于缺乏有效的治疗手段，AD已成为继心、脑血管疾病和肿瘤之后第4位危害人类健康的致死性疾病。据统计我国60岁以上的老年人口总数占人口总数的10%左右，约有5%为AD患者。因此，寻找防治AD的有效药物已经成为生命科学中亟待解决的问题。目前国内外广泛用于临床的抗老年痴呆药物中确实有一批疗效确切、使用较安全的化学药品，但是，如同大多数化学药一样，应用于临床的神经系统化学药也越来越多地显示副作用。事实证明大量经过中药治疗的AD患者，不仅智能状况大为改善，而且还能延年益寿。采用中医药治疗AD在世界范围内越来越被人们所接受。国内乃至世界范围内从中医中药、天然药物出发，利用现代科学技术研究开发预防和治疗老年性痴呆的药物，合乎当今世界范围内"回归自然"的潮流。现代医学认为6-淀粉样肽、Tau蛋白、载脂蛋白(APOE)、神经递质的改变、基因突变、自由基、金属元素、营养及代谢障碍、肿瘤、激素、免疫系统机能障碍、慢性病毒感染、脑外伤等都会引起老年痴呆。在临床应用中，王德华等人的补肾固本法即用愚聪汤(制附子、淫羊藿、肉桂、首乌、石菖蒲等)以温肾助阳生髓，临床症状明显改善，神志渐清，记忆恢复，总有效率达94.1%。邵念方等用补肾活血法，针对肾虚血瘀、脑络受阻，以补肾通络开窍治疗。治疗后血脂及部分血液流变学指标亦较治疗前明显改善。其方用益智胶囊(首乌、枸杞子、人参、石菖蒲、川芎、赤芍)。孙继铭的补肾豁痰法认为该病是以肾精气虚损为根本，痰瘀闭窍为发病关键。提出治呆必补肾，肾精足则脑髓充；治呆必开穷，开穷得神明，故以益肾豁痰开穷恢复神明。其方用益肾豁痰汤(熟地、肉苁蓉、山萸肉、制南星、僵蚕、法夏、竹茹)。周乐全等比较补肾益智方(由枸杞子、何首乌、人参、牡丹皮、冰片等组成)及双益平对痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响，结果提示，中药补肾益智方治疗大鼠老年痴呆有着剂量相关性，且效果要优于双益平。发明人在文献调研时，发现有很多中药复方治疗老年性痴呆的临床报道。为了继承和发扬中医药学特色和优势，积极开发具有自主知识产权的抗老年性痴呆新药，拟对贵州省中医的保密经验方进行抗老年痴呆活性物质的研究。该处方具有补脾益气、补肾填精、养血安神、平肝息风、活血化瘀、豁痰开窍等功效。临床用于治疗老年人记忆力减退、疲劳、多梦等症。本发明在此经验方的基础上，充分利用科学理论和先进技术手段，以中医理论为指导优化组方，运用现代化技术研制预防和治疗老年痴呆的传统中药复方制剂。
发明内容本发明所要解决的技术问题是在抗衰老保密经验方的基础上，以中医理论为指导，利用科学理论和先进技术，研制一种疗效好、毒副作用小的治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案按照重量份计算，治疗老年痴呆的中药制剂是由中药原料人参5070份、炙黄芪100140份、淫羊藿80100份、延胡索80100份、天麻100140份、当归80100份、制何首乌100140份、黄精100140份和石菖蒲100140份制备而成。优选的，它是由中药原料人参60份、炙黄芪120份、淫羊藿90份、延胡索90份、天麻120份、当归90份、制何首乌120份、黄精120份和石菖蒲120份制备而成。本发明还提供了前述治疗老年痴呆的中药制剂的一种优选制备方法，包括如下步骤(1)醇提取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取，滤过，得醇提液，减压回收乙醇，药液备用；(2)水煮取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材加水煎煮，滤过，滤液减压浓縮备用；(3)制剂成型合并醇提药液和水煮药液，浓縮至稠膏，真空干燥，按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。具体为(1)醇提取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用820倍量85%乙醇回流提取13次，每次l3h，滤过，得醇提液，减压回收乙醇，药液备用；(2)水煮取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用816倍量水煎煮13次，每次l3h，滤过，滤液减压浓縮备用；(3)制剂成型合并醇提药液和水煮药液，浓縮至稠膏，于608(TC真空干燥，按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。进一步的，治疗老年痴呆的中药制剂的制备方法(1)醇提取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取2次，每次2h，第一次加16倍量乙醇，第二次加14倍量乙醇，滤过，得醇提液，减压回收乙醇，药液备用；(2)水煮取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用水煎煮3次，每次2h，第一次加14倍量水，第二次和第三次加12倍量水，滤过，滤液减压浓縮备用；(3)制剂成型合并醇提药液和水煮药液，浓縮至稠膏，于7(TC真空干燥，按常规制剂工艺制成药剂学意义上的各种剂型。方解本处方中的人参、制何首乌、天麻、石菖蒲为君药，具有补气益精固气，息风开窍宁神之功；黄精、制黄芪、当归为臣药，具有补脾益气升阳，养血活血化淤之效；淫羊藿、延胡索为佐药，能补肝益肾壮骨，活血行气解郁。诸药合用，使气血得补肝肾得养，淤化气行，心神安宁，脑窍遂醒。故能抗衰老，防治老年痴呆等证。本发明在保密经验方的基础上，进行了大量的实验，具体如下一、制备工艺及其研究1、工艺路线的设计1.l工艺路线设计经过对各药材活性部位或成分的相关文献调研，综合各药味的有效成分或有效部位的理化性质和提取方法，初步设定天参益智胶囊的提取制备工艺可按以下几条设计路线进行(1)该复方各药材的主要活性成分或活性部位都具有一定的水溶性，按传统工艺一起加水煎煮，滤过，回收浓縮，干燥，得浸膏样品。(2)据文献报道该复方中人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索发挥益智功效的主要活性成分或活性部位在一定的醇水中的提取率最好，选择人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索五味药材以一定浓度的醇水提取，而制何首乌、当归、黄精、石菖蒲四味药材一起加水煎煮，然后醇提液和水煎液分别回收浓縮至稠膏后合并，干燥得浸膏样品。(3)据文献报道人参、天麻、炙黄芪所含多糖具有一定的抗氧化、增强免疫力的功能，故选择人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索五味药材先以一定浓度的醇水提取，其药渣再与制何首乌、当归、黄精、石菖蒲四味药材一起加水煎煮，然后醇提液和水煎液分别回收浓縮至稠膏后合并，干燥得浸膏样品。1.2益智作用相关活性筛选发明人参照以上三条工艺路线制备样品，进行了对抗beta淀粉样肽毒性作用、对细胞胆碱酯酶活性影响、对细胞a7尼古丁受体蛋白表达的影响的活性筛选，结果如下(方法学见后"本发明胶囊剂治疗AD的分子作用机制研究")1.2.1对抗beta淀粉样肽毒性作用结果表明，各样品均能不同程度对抗beta淀粉样肽引起的MTT还原率的下降；其对抗性比较2^3>1。与空白组相比，*P〈0.05;**P〈0.01'与模型组相比，#P〈0.05;##P〈0.01。1.2.2对细胞胆碱酯酶活性影响结果表明不同工艺所制备的样品都能抑制细胞胆碱酯酶活性，其抑制活性2>3>1。与空白组相比，*P〈0.05;**P〈0.01。1.2.3对细胞a7尼古丁受体蛋白表达的影响结果表明，不同工艺所制备的样品均能不同程度的上调细胞a7尼古丁受体蛋白的表达，上调能力依次为2>1。与空白组相比，*P〈0.05;**P〈0.01。1.3工艺路线优选根据l.2益智作用相关活性筛选结果，工艺2和3制备的样品在抗beta淀粉样肽毒性作用、抑制细胞胆碱酯酶活性能力、上调细胞a7尼古丁受体蛋白表达能力上无差别，结合生产的实际情况，工艺2制备路线较工艺3简洁。故选择按工艺路线2来制备样品，即方中人参、天麻、炙黄芪、淫羊霍、延胡索五味药材醇提，制何首乌、当归、黄精、石菖蒲四味药材一起水提。视出膏情况及实验实际情况选择精制工艺，并根据成型性确定其辅料种类及加入量2、工艺条件筛选2.1醇提工艺条件筛选2.1.1药材吸水率的考察称取3份1/10处方量的药材人参6g、天麻12g、炙黄芪12g、淫羊藿9g、延胡索9g置于容器中，加入水600mL，浸泡至心，将多余水滤去，称重，按下式计算吸水率。结果醇提部分药材的平均吸水率为218.1%，结果见表l，故在醇提工艺中第一次提取时比第2次多加2倍量的提取溶媒。药渣湿重_药材干重吸水率(％)=-X100%药材干重表l醇提工艺吸水率试验样品序号药材干重(g)药渣湿重(s)吸水率(100%)平均吸水率(100%)1犯.l149.6211.0247.8154.5223.2218.1348.3154.6220.12.1.2醇提次数的选择称取2/50处方量醇提药材，第一次按16倍量85%乙醇回流提取2.Oh，第二次14倍量2.0h，第三次14倍量1.5h，每次醇提液单独滤过，分次测定淫羊藿苷、天麻素、紫堇碱的含量及醇浸膏得率，结果见表2。表2醇提次数的选择<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*指第三次醇提取占总醇浸膏量、淫羊藿苷提取量、总黄酮提取量白勺比例。试验结果表明，以浸膏得率为指标，第三次醇提所占比例为7.46%;以淫羊藿苷提取量为考察指标，第三次醇提所占比例为2.08%;以天麻素提取量为考察指标，第三次醇提所占比例为2.59%;以紫堇碱提取量为考察指标，第三次醇提所占比例为2.58%，说明两次醇提已基本完全，故采用醇提两次的工艺。2.1.3正交试验优选提取工艺根据文献资料和试验结果，提取时间、加醇量、乙醇浓度是影响提取率的主要因素，按每个因素3水平，用U(34)正交表安排试验(表3)。以醇浸膏得率、淫羊藿苷提取量、天麻素提取量、紫堇碱提取量为评价指标，对醇提工艺进行探讨。2.1.3.1材料与仪器仪器HP1100高效液相色谱仪(包括HP1100泵，HP1100紫外检测器，HP1100柱温箱，HP1100/WND-3D工作站)，旋转蒸发仪(东京理化)，紫外分光光度仪(岛津UV-2401)。材料淫羊藿苷对照品、天麻素对照品(由中国药品生物制品检定所提供。批号:110737-200312，110807-2002205)，紫堇碱对照品(由贵阳医学院药学院分析化学教研室提供，经波谱数据鉴定为紫堇碱，由HPLC面积归一化法测定其纯度大于98.5X，乙腈(色谱纯)，纯净水(乐百氏纯净水)，甲醇(色谱纯)，其他试剂均为分析纯。2.1.3.2方法与结果表3因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a.醇浸膏得率的测定按U(34)正交表安排试验，称取2/50处方量药材，按设定方案进行提取，滤过，滤液合并，测定总体积V总；精密吸取50mL的醇提液于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干，于105'C干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速称重。按下式计算浸膏得率，结果见表4。醇浸膏得率(％〕=-xioo%b.淫羊藿苷、天麻素和紫堇碱的含量测定按U(34)正交表安排试验，称取2/50处方量药材，按设定方案进行提取，滤过，滤液合并，定容至一定体积；照高效液相色谱法(《中国药典》(2005年版一部附录33页VID)测定淫羊藿苷、天麻素的含量，计算淫羊藿苷、天麻素和紫堇碱的提取量，结果见表4。色谱条件①淫羊藿苷以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈水(30:70)为流动相，流速lmL.min—、波长270nm;柱温4CTC。②天麻素色谱柱DiamonsilTMC18(5ym，250X4.6mm);流动相乙腈-水(2:98);柱温40。C;检测波长220nm;流速:lmL.min—、进样量10yL。③紫堇碱DiamonsilTMd8柱(5ym，250X4.6mm)，柱温3(TC;检测波长280nm，流动相0.1%的磷酸(三乙胺调pb6):乙睛(48:52)，流速lmL/min。对照品溶液的制备分别精密称定淫羊藿苷对照品、天麻素对照品、紫堇碱对照品，置于容量瓶中，溶解，定容，摇匀，淫羊藿苷对照品溶液浓度为129yg"mL—、天麻素对照品溶液浓度为209ygmL—、紫堇碱对照品溶液浓度为65.6ygmL一1。样品溶液的制备按正交实验设计方案进行提取，滤过，滤液合并，定容至一定体积，即得各样品溶液。测定法取各样品溶液过0.45um微孔滤膜，滤液即为供试品液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10yL，注入液相色谱仪，测定，即得。表4醇提工艺正交试验设计表及结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注醇提工艺采用4个评价指标，采用综合评分进行数据分析，淫羊藿苷权重系数为0.3，紫堇碱权重系数为0.3，天麻素权重系数为0.3，浸膏得率权重系数为O.1。综合评分=(淫羊藿苷/淫羊藿苷最大量X0.3+紫堇碱/紫堇碱最大量X0.3+天麻素/天麻素最大量XO.3+浸膏得率/浸膏得率最大量XO.1)X100方差分析将正交试验结果进行方差分析，结果见表5。表5醇提工艺评价指标方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*P<0.05，F0.05(2，2)=]L9.00从表4结果直观分析，各因素影响提取工艺中的各评价指标的顺序为A〉B〉C，其中醇提浓度的影响最大；表5方差分析结果表明，以提取工艺中的天麻素为评价指标，乙醇浓度和乙醇倍量均有显著性意义(P〈0.05);以浸膏得率为评价指标，乙醇倍量具有显著性意义(P〈0.05);对各评价指标进行综合评价，乙醇浓度具有显著性意义(P〈0.05);最佳工艺条件为A;jBid。验证试验称取2/50处方量药材，按最佳方案A3B工d进行验证试验，结果与正交试验结果吻合。说明该工艺稳定，可行，结果见表6。因此，确定醇提工艺为14倍量85%乙醇回流提取2次(第一次用16倍量的85%乙醇)，每次2h。表6醇提工艺验证结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2.水煎煮工艺条件筛选2.2.1药材吸水率的考察称取3份1/10处方量的药材当归9g、制何首乌12g、黄精12g、石菖蒲12g于容器中，加入10倍量水，浸泡至透心，将多余的水滤去，称重，按上文药材吸水率公式进行计算吸水率。结果煎煮工艺中水煮药材的平均吸水率为171.9%，结果见表7，即相当于煎煮工艺中第一次提取时多加2倍量的水。表7醇提工艺吸水率试验<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2.2正交试验优选煎煮工艺根据文献资料和预试验结果，煎煮次数、加水量、煎煮时间是影响煎煮工艺的主要因素，按每个因素3水平，用U(34)正交表安排试验(表8)。以总糖、二苯乙烯苷、浸膏得率为评价指标，对煎煮工艺进行探讨。2.2.2.1材料与仪器仪器HP1100高效液相色谱仪(包括HP1100泵，HP1100紫外检测器，HP1100柱温箱，HP1100/WND-3D工作站)，旋转蒸发仪(东京理化)，紫外分光光度仪(岛津UV-2401)、HHS电热恒温水浴锅(上海医疗器械三厂)。材料D-无水葡萄糖、二苯乙烯苷对照品(由中国药品生物制品检定所提供。批号:110833-200503，0844-200503)，其他试剂均为分析纯2.2.2.2方法与结果表8因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>a.浸膏得率的测定按U(34)正交表安排试验，称取l/25处方量药材当归3.6g、何首乌4.8g、黄精4.8g、石菖蒲4.8g，按设定方案进行煎煮，滤过，测定滤液总体积V总。同上文"醇浸膏得率测定法"处理，计算浸膏得率，结果见表9。b.总糖测定(硫酸苯酚法)样品处理称取l/25处方量药材，按UC正交表安排试验，得煎煮液，滤过，滤液，量取溶液体积，为样品液，参照《中国药典》(2005年版一部58页)玉竹多糖测定法测定。葡萄糖对照品溶液的制备精密称取0.0305g无水葡萄糖标准品，置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得(每lmL含0.61mg葡萄糖)。标准曲线制备分别精密吸取标准对照储备液OmL、0.5mL、1.OmL、1.5mL、2.OmL、2.5mL、3.0mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取各浓度的对照品溶液2mL于具塞试管中，精密加入4。/。的苯酚液lmL，迅速加入浓硫酸7mL，摇匀，置4(TC水浴中保温30min，取出，置冰浴中冷却5min，取出，在波长为485nm处测定吸收度值，得回归方程为Y=0.04074X+0.0041，r=0.9995，本品在范围内呈线性关系。样品液测定精密吸取样品液O.lmL，置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取各样品液2mL于具塞试管中，照标准曲线项下方法自"精密加入4y。的苯酚液lmL"起，依法测定吸光度，随行空白，计算总糖量。结果见表9。c.二苯乙烯苷的含量测定按U(34)正交表安排试验，称取l/25处方量药材，按设定方案进行提取，滤过，滤液合并，定容至一定体积；照高效液相色谱法(《中国药典》(2005年版一部附录33页VID)测定二苯乙烯苷的含量，计算二苯乙烯苷的提取量，结果见表9。色谱条件DiamonsilTMd8柱(5ym，250X4.6mm)，柱温3CTC;检测波长320nm，流动相乙睛水(25:75)，流速lmL/min。对照品溶液的制备精密称定二苯乙烯苷对照品0.0106g，置于50mL容量瓶中，稀乙醇溶解，定容，避光保存，对照品液浓度为212.0yg*mL—、样品溶液的制备按正交实验设计方案进行提取，滤过，滤液合并，定容至一定体积，即得各样品溶液。测定法取各样品溶液过0.45um微孔滤膜，滤液即为供试品液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10yL，注入液相色谱仪，测定，即得。表9煎煮工艺正交试验设计表及结果试验号列号评价指标ABCD(空白)总多糖(g)二苯乙烯苷(mg)浸膏得率(％)综合评分(％)111114.83815.88620.9759.55212226.70819.01224.4372.90313336.59117.78327.2872.21421236.87320.90130.7480.08522316.89318.78732.6778.19623128.42622.89929.5289.45731327.58822.56731.9086.49832138.17720.32027.8383.54933218.59227.26734.56100.00忌、I18.53719.69821.84020.823糖II22.19121.77722.27222.722<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注煎煮工艺采用3个评价指标，采用综合评分进行数据分析，总糖权重系数为0.4，苯乙烯苷权重系数为0.4，浸膏得率权重系数为0.2。综合评分=(总糖/总糖最大量X0.4二苯乙烯苷/二苯乙烯苷最大量X0.4+浸膏得率/浸膏得率最大量X0.4)X100方差分析将正交试验结果进行方差分析，结果见表io。表IO煎煮工艺评价指标方差分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>从表9结果直观分析，以煎煮工艺中总糖为评价指标，各因素影响的顺序为A〉B〉C;以煎煮工艺中二苯乙烯苷为评价指标，各因素影响的顺序为A〉B〉C;以煎煮工艺中浸膏得率为评价指标，各因素影响的顺序为A〉C〉B;各评价指标综合评分的结果显示各因素影响的顺序为A>B>C，其中煎煮次数的影响最大；表10的方差分析结果表明，分别以煎煮工艺中总糖、二苯乙烯苷、浸膏得率为评价指标以及各评价指标综合评分，煎煮次数均有显著性意义(p〈0.05)，最佳工艺条件为A3B3C2。验证试验称取2/50处方量药材当归3.6g、何首乌4.8g、黄精4.8g、石菖蒲4.8g按最佳工艺A3B3C2进行验证试验，结果与正交试验结果吻合。说明该工艺稳定，可行，结果见表ll。因此，确定水提工艺为14倍量水煎煮3次(第一次为16倍量水)，每次2小时。表ll水提工艺验证结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.2.3水煎液除杂工艺的选择中药水提液中常含有淀粉、多糖、蛋白质、果胶等，使制得的固体制剂服用剂量过大，一般应对提取液进行纯化，减少服用剂量，多采用一定浓度的醇进行醇沉除杂。因此，我们对水煎液进行了纯化工艺研究，分别考察了不同浓度的乙醇进行醇沉、对水煎液进行离心及静置后取上清液等除杂方法，通过测定浸膏、二苯乙烯苷及总糖的转移率，从而确定所采用的除杂工艺，结果见表12。表12除杂工艺结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>从表12结果可知，经不同浓度的乙醇醇沉后，浸膏转移率降低的同时总糖和二苯乙烯苷的转移率亦在降低，而总糖的转移率变化较二苯乙烯苷显著。当乙醇浓度高于40%时，其总糖的转移率低于50%，而经离心法和静置法处理后浸膏得率、二苯乙烯苷和总糖转移率均无明显变化。而总糖是本产品中的功效成分之一，以及结合人每天口服给药的剂量来考虑，如经除杂后仍需加入一定的辅料制成成品，而除杂中要除去的淀粉、蛋白质、果胶等均可作天然的辅料，可减少辅料的加入量。因此，在保证药效的基础上，从经济和能源投入节约的角度出发，水煎液经过滤处理后不进行除杂工艺处理。2.3浓縮、干燥工艺的优选中药提取液在浓縮、干燥过程中，由于受热时间较长，其所含某些有效成分可能会不同程度地被破坏而使含量降低。减压浓縮具有效率高，耗时短的优点，同样真空干燥具有干燥时间短，所得干燥制品疏松易碎等优点，故本工艺选择减压浓縮真空干燥。以天麻素、淫羊藿苷、总糖的转移率为评价指标，对不同温度条件下的干燥工艺进行了考察。结果天麻素、淫羊藿苷、总糖的转移率随温度的增高而降低，6(TC和7(TC的差异较小，但6(TC干燥的效率较7(TC低，从生产效率出发，确定真空7(TC进行干燥(真空度应控制在-0.08MPa以下)，见表13。表13浓縮、干燥考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>二、急性毒性实验1、受试药物处理试验前用5%。羧甲基纤维素钠(CMC)配置成相应浓度的混悬液2、受试动物昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(黔)2002-0001，清洁级，普通饲料饲养。3、实验方法预实验表明本制剂毒性较低，测不出LD5(j，故进行最大耐受量测定。取小鼠40只(雌雄各半)，随机分为2组，每组20只。禁食(不禁水)12h。空白对照组按0.4ml/10g给予5X。CMC灌胃；制剂组按0.4ml/10g灌胃给药，2h后重复给药一次，剂量为15.2g/kg。末次给药后lh恢复供食、供水，观察4h内、14天内动物反映情况及死亡情况，实验结束处死动物，解剖动物观察主要脏器改变。4、实验结果给药后小鼠在2h内活动稍有减少，约4h左右活动恢复正常。在观察14天内，动物外观、行为、进食及大小便正常，体重增加(表14)，观察期无动物死亡。实验结束处死动物，解剖，肉眼观察主要脏器无异常改变。小鼠最大耐受量为15.2g/kgd。表14对小鼠急性毒性实验体重变化的影响G士s,n=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>5、结论本实验研究结果表明，最大耐受量为15.2g/kgd，观察期内未见动物出现毒性反应及死亡，表明本药口服用药安全。三、药效学实验部分(一)、本发明胶囊剂健脑实验及与老化相关酶和老化代谢产物测定1、实验材料1.1实验动物SD大鼠雌雄均有，2-3月龄，体重200-220g，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK(黔)2002-0001，清洁级，普通饲料饲养。1.2主要药品和试剂本发明胶囊剂棕褐色粉末，批号040908。脑复康吡拉西坦Piracetam，天津红日药业股份有限公司，规格0.4g/片，批号050102。A1C13.6H20:分析纯，广东汕头西陇化工厂，批号040308。ANTI-ChAT:武汉BOSTER公司，批号050125。ANTI-P-Amyloid(1-40):武汉BOSTER公司，批号050125。TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒:武汉BOSTER公司，批号050204。ANTI-Glutamate:武汉BOSTER公司，批号050125。即用型Sabc拭剤盒武汉BOSTER公司，批号050308。DAB显色试剂盒武汉BOSTER公司，批号050401。TBS缓冲液试剂武汉BOSTER公司，批号041116。抗体稀释液武汉BOSTER公司，批号040117。AchE试剂盒南京建成生物工程有限公司，批号20050513。SOD试剂盒南京建成生物工程有限公司，批号20050520。MDA试剂盒南京建成生物工程有限公司，批号20050430。冰醋酸分析纯，上海化学试剂有限公司，批号041010。1.3剂量设置本发明胶囊剂和阳性对照药脑复康用药剂量均按实验动物与人临床用药剂量的折算系数法计算胶囊剂剂量小鼠急性毒性实验最大耐受量为15.2g/kg，则大鼠等效量为10.8g/kg，以大鼠等效量的1/10，1/25，1/50作为大鼠的高、中、低剂量，分别为1.08g/kg、0.43g/kg、0.22g/kg。脑复康剂量临床成人用量每次2-4片(按3片计)，每日3次。成人体重以60kg计算，则成人每日用量为O.06g/kg，则大鼠每日用药量为O.40g/kg。2.实验方法2.1造模用Morris水迷宫将筛选合格大鼠，随机分为正常对照组(n=10)和造模组(若干只)。正常对照组给等容的生理盐水灌胃，饮用自来水。造模组给AlCl3溶液，浓度为50g丄—\按500mg.kg—^d—^每日上午九时灌胃，持续2个月。造模组自第三个月开始自由饮用浓度为1.6g.L—^勺AlCl3溶液，持续3个月。定期进行水迷宫实验测定大鼠学习记忆的变化情况。2.2分组及治疗造模5个月时经Morris水迷宫检测，造模组大鼠学习记忆水平明显下降，与正常对照组有显著差异。造模成功后，进一步将造模组大鼠随机分为痴呆模型组(5%。CMC0.6mL.kg—1,d—"、本发明胶囊剂低(0.22g.kg—1,d—"、中(0.43g.kg—1,d—"、高(1.08g.kg—1,d—"剂量组及阳性对照组(脑复康0.4g.kg—、d—。。正常对照组(5%。CMC0.6mL.kg—、d—丄)，各组灌胃给药，每日一次，连续3个月。2.3检测指标及方法2.3.1学习记忆能力检测指标逃避潜伏期、搜索距离、空间探索时间和探索距离。方法于造模前，造模过程中第50天、100天和150天，以及治疗结束时进行行为学检测，观察大鼠造模前后和TSYZ治疗后的学习记忆变化情况。2.3.2脑组织指标检测2.3.2.1标本制作治疗结束后，以10X水合氯醛300mg.kg—^复腔注射麻醉大鼠后，迅速断头取出大脑，置于冰盘上，精确称重。以失状面为界将大脑均分为两半，其中一半脑组织按每克组织加1OmL冷的生理盐水用匀浆器制成10%的组织匀浆，于-80°C低温冰箱保存，用于检测AChE和SOD活性及MDA含量。另一半脑组织，取视交叉后5mm后的冠状位脑片(包含海马)，用4X中性甲醛溶液4'C保存过夜，次日石蜡包埋，连续作冠状切片，片厚3ym，每例标本取连续5张切片分别作HE(Hematoxylin-eosinstaining)染色及免疫组化染色，用于病理学检査及分析大鼠海马神经细胞Af3p4()、ChAT、Glu的表达水平，TUNEL法检测大鼠海马神经细胞凋亡水平。2.3.2.2大脑组织生化指标检测检测大脑组织AChE和SOD活性及MDA含量，均按试剂盒说明操作，光化学方法测定。2.3.2.3大脑海马组织病理学检测海马组织病理切片HE染色，进行细胞形态学观察。2.3.2.4大脑海马组织免疫组化指标检测APi-4o表达、ChAT活性、Glu含量检测(l)切片脱蜡入水；(2)3XH202浸泡15min，蒸馏水洗3次X3min;(3)高压煮沸3min(p朋.0，0.01M枸橼酸缓冲液)，冷却至室温；(4)0.01MPBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，加入5XBSA，室温15min封闭；(5)加入稀释后的一抗50yl(APi—4o1:50、ChAT1:50、GLU1:35)，于4。C冰箱过夜；(6)0.01MPBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，加入即用型二抗，37。C湿盒中孵育20min;(7)0.01MPBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，加入l:100Sabc夏合物，37。C湿盒中孵育20min;(8)0.01MPBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，DAB显色10min;(9)苏木素复染；(10)1%盐酸酒精分化3min，水洗；(11)0.5%氨水返蓝，水洗；(12)梯度酒精脱水；(13)二甲苯透明；(14)中性树胶封片，镜下观察并分析。细胞凋亡检测(TUNEL法)(1)切片脱蜡入水；(2)3XH202浸泡15min，蒸馏水洗3次X3min;(3)37。C胰酶消化10min;(4)0.01MPBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，加入标记缓冲液20yl，弃去多于标记缓冲液，加入混合液20yl(TdT1y1+d-UTP1y1+标记缓冲液18yl)，于湿盒中37。C反应90min;(5)0.01MTBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，加入5%BSA，室温10min封闭；(6)甩去切片上多余液体，加入l:IOO生物素地高辛抗体；(7)O.OIMTBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，加入l:100Sabc夏合物，37。C湿盒中孵育20min;(8)0.01MTBS(pH7.2-7.4)冲洗3次X3min，DAB显色10min;(9)苏木素复染;(10)1%盐酸酒精分化3min，水洗；(11)0.5%氨水返蓝，水洗；(12)梯度酒精脱水；(13)二甲苯透明；(14)中性树胶封片，镜下观察并分析。病理切片图像分析在10X40光学显微镜下，通过SONY摄像头将动物组织免疫组化图像采集并输入BI0MIAS-99图像分析系统进行图像分析。平均灰度值(MG)测定每张切片(每例动物标本)随机选取5个400倍视野，每个视野选取5个阳性表达区域，测量MG，以5个视野的MG的平均值表示其阳性表达率，切片染色越浅，MG数值越大，阳性表达率越低。2.3.3脑指数(cerebralcoefficient)的测定2.3.4数据处理数据处理采用均数士标准差(；±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析检验。P〈0.05为有显著性差异。3、实验结果3.1.正常大鼠Morris水迷宫学习成绩造模前对筛选合格的60只大鼠进行定向航行训练并记录其学习成绩，大鼠的学习成绩明显提高，到第6天时经检验其成绩与第5天无明显差异，停止训练。3.2.AlCl3诱导AD模型大鼠的学习记忆水平及海马组织病理学改变大鼠染铝5个月后，模型组在定向航行实验中的逃避潜伏期以及搜索距离明显延长，空间探索实验中在原安全岛所在象限的搜索时间以及探索距离明显减少，与正常对照组比较有显著性差异(P〈0.01)。提示造模组大鼠出现空间学习记忆障碍，造模成功。(见表15、16)表15A1CL诱导AD模型大鼠定向航行的成绩(逃避潜伏期，搜索距萬，i±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>'P〈0.05，P〈0.01vsControl_表ISA1C1;诱导M)模型大鼠空间探索的成绩(空间探索时间，探索距离，；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>P〈0.05，P〈0.01vsControl3.3对AlCl3诱导AD模型大鼠的治疗作用3.3.1对A1C13诱导AD模型大鼠学习记忆的影响与模型组比较，胶囊剂组灌胃三个月后，明显縮短大鼠在定向航行实验中的逃避潜伏期和搜索距离；大鼠在空间探索实验中在原安全岛象限的探索时间及探索距离明显延长，表明胶囊剂对痴呆大鼠学习记忆能力有明显的改善作用(见表1_7、18)表17对MCL诱导犯横3^鼠定向航行成绩的影响(x土s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>'P〈0.05，P〈0.01vsControl;P〈0.05，P〈0.01vsModel表18对AlCL诱导^)模型大鼠空间探索成绩的影响。'土s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*P〈0.05，**P〈0.01vsControl;#P〈0.05，##P〈0.01vsModel3.3.2对AlCl3诱导AD模型大鼠大脑AChE、S0D、MDA的影响与正常组比较，模型组大鼠脑组织AChE活性明显增高，SOD活性降低，MDA含量增高(P〈0.05，P〈0.01)。与模型组比较，胶囊剂组大鼠脑内AChE活性有不同程度的下降，SOD活性升高，MDA含量降低(P〈0.05，P〈0.01)。提示TSYZ对AlCl3引起AChE活性升高具有明显的抑制作用和明显的抗氧化作用(见表19。表19对A1C13诱导AD模型大鼠脑组织S0D、MDA的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>P〈0.05，P〈0.01vsControl;"P〈0.05，""P〈0.01vsModel3.3.3对A1C13诱导AD模型大鼠海马组织病理学的影响在光镜下观察大鼠海马组织HE染色切片，结果显示正常对照组神经细胞大小、形态及排列正常，胞体为圆形或多角形；细胞结构完整，胞膜、胞核轮廓清楚；神经细胞无肿胀及坏死。模型组神经细胞大小、形态不一，排列紊乱；明显神经细胞空泡变性改变细胞浆染色变浅，其内有大小不等圆形或类圆形空泡；有明显的神经元坏死表现核体积增大，核结构模糊、固縮、碎裂或消失。低、中、高剂量组及脑复康组神经细胞大小、形态及排列恢复正常，细胞结构完整，胞膜、胞核轮廓清晰可辨；细胞无明显肿胀；少量神经细胞空泡变性；无明显神经细胞坏死特征。3.3.4对AlCl3诱导AD模型大鼠海马ChAT的影响测定结果显示模型组大鼠海马神经元胞浆染色浅，大量神经元结构破坏消失，MG值较正常组明显增高(P〈0.01)。胶囊剂组大鼠海马神经元胞浆染色为较深的黄褐色，神经元结构清晰，MG值明显降低(P〈0.01)，提示胶囊剂能有效的激活AD大鼠海马ChAT活性，对AlCl3引起ChAT活性降低具有明显的抑制作用，从而促进ACh的合成(见表20)。表20TSYZ对AlCl3诱导AD模型大鼠海马ChAT的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>P〈0.05，—P〈0.01vsControl;"P〈0.05，冊P〈0.01vsModel3.5对AlCl3诱导AD模型大鼠海马Af3l-40表达的影响经图像分析测定结果表明，模型对照组切片中可见明显的胞膜及胞浆黄染，细胞核结构模糊，大小、形态不一，神经元消失，与正常组比较，MG明显降低(P〈0.01)，提示模型组脑内AI3i-4()含量增高。与模型组比较，胶囊剂组海马胞膜及胞浆染色较浅，神经元轮廓清晰，排列恢复正常，MG均明显增高(P〈0.01)，提示胶囊剂组Af3p4o含量减少，对AlCl3引起的大鼠脑内Aep4o增多具有明显的抑制作用(见表21)。表21对A1C1,诱寻AD模型大鼠海马A^-;。的影响(；±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>P〈0.05，—P〈0.01vsControl;"P〈0.05，冊P〈0.01vsModel3.6对AlCl3诱导AD模型大鼠海马Glu表达的影响结果表明，模型组大鼠海马神经元胞浆染色较深，大量神经元消失，MG值较正常组明显减少(P〈0.01)，提示模型组大鼠海马兴奋性Glu含量增高。与模型组比较，胶囊剂组海马神经元胞浆染色较浅，神经元结构清晰，排列恢复正常，MG值均明显增高(P〈0.01)，提示胶囊剂可降低AD大鼠海马中兴奋性Glu含量，对AlCl3引起的大鼠脑内Glu增多具有明显的抑制作用(见表22)。表22TSYZ对A1C1,诱导AD模型大鼠梅马Glu表达的影响O±s，n=10〕<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>3.7对A1C13诱导AD模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响TUNEL法检测神经细胞结果表明与正常组比较，模型对照组切片中神经细胞核内呈深染的棕黄色颗粒，即凋亡小体，神经元消失，MG值明显减少(P〈0.01)，提示模型组神经细胞凋亡增加。与模型组比较，胶囊剂组神经细胞染色较浅，大小、形态及排列恢复正常，MG值均明显增高(P〈0.01)，提示制剂组神经细胞凋亡减少，对AlCl3引起的大鼠脑内神经细胞凋亡具有明显的抑制作用，见表23。表23TSYZ对A1C1,诱导M)模型大鼠梅马神经细胞调亡的影响^±s,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>3.8对AlCl3诱导AD模型大鼠脑指数的影响结果表明，模型组大鼠脑指数较正常组显著降低，提示模型组大鼠大脑明显萎縮，脑重减轻；与模型组比较，TSYZ可显著增加脑指数(P〈0.05)，对脑萎縮有拮抗作用，从而增强脑功能，延缓其衰退(见表24)。表24对A1CL虎导AD模型大鼠脑指敷影晌(5±s，n=10)组别剂量(g.kg-1)脑指数(g/kg)对照组0.350.063模型组0.280.039+低剂量0.220.310.060中剂量0.430.340.064"高剂量1.080.350.070"脑复康0.400.概131"P〈0.05，—P〈0.01vsControl;"P〈0.05，P〈0.01vsModel5、结论胶囊剂对AlCl3诱导的AD大鼠模型学习记忆能力有较好的改善作用，其治疗AD的可能作用机制为l.提高ChAT活性、降低AChE活性，从而提高Ach含量，保护和增强中枢胆碱能系统功能。2.抑制脑内兴奋性Glu的表达，拮抗Glu介导的神经毒性作用。3.抑制脑内AP的沉积，干预AP神经毒性。4.抑制大脑神经细胞凋亡，保护神经细胞功能。5.清除自由基，抗氧化应激。(二)本发明胶囊剂抗衰老作用机制研究1.实验材料1.1.实验动物昆明种小鼠雌雄各半，体重22士2g，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号SCXK(黔)2004-0001。普通饲料饲养，清洁级，光照时间12/12，室温22-23°C。1.2主要药品和试剂本发明胶囊剂棕褐色粉末。D-半乳糖美国Amresco公司。健脑胶囊(JNJN):青岛国风药业股份有限公司。2.剂量设置胶囊剂小鼠急性毒性实验最大耐受量为0.076g10g—、即7.6gkg—\取最大耐受量的1/3，1/6，1/12分别作为高、中、低剂量(2.5g'kg—、1.25g'kg—、0.63g'kg—4。3.统计方法实验数据用^is表示，组间比较釆用t检验。4.实验方法昆明种小鼠(雌、雄各半)进行Morris水迷宫实验，直到定向航行实验成绩稳定为止(连续两天成绩差异无显著性)。将经Morris水迷宫筛选合格的84只小鼠随机分为6组(n=14)，正常对照组(NS14mL.kg—^、模型组(NS14mLkg—^、复方高、中、低(2.50gkg—、1.25gkg—、0.63gkg—1)剂量组及阳性对照组(健脑胶囊，简写JNJN，0.03gkg—1)。除正常对照组外，其余各组均采用皮下注射5^D-半乳糖溶液0.5mL"kg—工造模，同时连续灌胃给药45天。采用Morris水迷宫实验，检测学习记忆能力，小鼠眼眶采血，分离血清，置一8(TC超低温冰箱中保存备用，测定小鼠血清GSH-PX、SOD、AChE、ChAT活性及MDA5.实验结果5.1对D-半乳糖衰老模型小鼠学习记忆的影响各给药组与模型组、阳性对照组间无显著性差异(P>0.05)。灌胃给药后大鼠定向航行实验成绩及空间探索实验成绩显示，大鼠灌胃后学习记忆水平提高，探索时间縮短、搜索距离减小，与模型组比较有显著性差异(P〈0.05或0.01)。(见表25)表25抗痴呆灌胃后小鼠空间探索实验成绩(^±s)组别n剂量(g/kg)空白对照组11探索时间(s)探索空间/总空间(%)17.73±10.42647.63±476.85模型组1357.02±36.31高剂j112.524.35±23.39中剂j141.2525.47±21.681403.18±1047.37A一635.21±364.46'—660.97±484.46低剂j110.6312.77±11.33JNJN110.0346.80±39.16262.27±206.631278.76±1310.17P〈0.05，P〈0.01vsNS"P〈0.05，""P〈0.01vsModel5.2对D-半乳糖衰老模型小鼠血清GSH-PX活性的影响模型组大鼠血清中GSH-PX活性降低，与正常对照组有显著性差异(P〈0.05)，灌胃结药后大鼠血清中GSH-PX活性升高，与模型组比较有显著性差异(P〈0.05)，见表26。表26对D-半乳糖衰老模型小鼠血清GSH-PX活性的影响±s〕组别11剂量(gkg-l)GSH-PX(U)空白对照组11544.90±41.86<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>P〈0.05，—P〈0.01vsNS"P〈0.05,""P〈0.01vsModel5.3对D-半乳糖衰老模型小鼠血清SOD活性和MDA含量的影响表27显示，模型组小鼠脑组织中SOD活性降低，MDA含量升高，与正常对照组有显著性差异(P〈0.05或0.01)，灌胃给药后小鼠脑组织中SOD活性升高，MDA含量降低，与模型组比较有显著性差异(P〈0.05或0.01)。表27对D-半乳糖衰老模型小鼠血惰中S0D活性和roA含量的影响5±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>P〈0.05，P〈0.01vsNS"P〈0.05，""P〈0.01vsModel5.4对D-半乳糖衰老模型小鼠血清AChE、ChAT活性的影响表28显示，模型组小鼠脑组织中ChAT活性降低，AChE活性升高，与正常对照组有显著性差异(P〈0.05或0.01)，灌胃给药后小鼠脑组织中ChAT活性升高，<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>JNJN110.030.909±0.59946.207±26.705P〈0.Q5，—P〈0.Q1vsNS"P〈0.05，""P〈0.01vsModel6.结论本发明胶囊剂高、中、低剂量组小鼠学习记忆成绩均较模型组有不同程度提高;血清GSH-PX、SOD和ChAT活力均升高，AChE活力降低，MDA含量降低；结论复方胶囊剂对AD有较好的防治作用。(三)本发明胶囊剂补肾作用的实验研究1.实验材料1.1.实验动物实验动物及实验条件同"抗衰老"实验1.2主要药品和试剂本发明胶囊剂，棕褐色粉末。修正牌肾宝合剂，国家准字Z36021192，江西汇仁药业。地塞米松注射液，批号20021016，漯河南街村全威制药有限公司。2.剂量设置同"抗衰老"实验3.统计方法实验数据用^is表示，组间比较采用t检验。4.实验方法72只小鼠随机分为6组(11=12)，正常对照组(NS14mL'kg—^、模型组(NS14mLkg—4、复方高、中、低(2.50g.kg—、1.25g.kg—、0.63g.kg—4剂量组及阳性对照组(修正牌肾宝合剂0.03g'kg—4。除正常对照组外，其余各组均采用灌胃给予地塞米松0.2mg/10g，30天建立小鼠肾虚模型，灌胃给药14天，末次给予受试物30min后，将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上，使其肌肉处于紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃上跌落下来的时间，第3次跌落时终止实验，累计三次的时间作为爬杆时间。继续灌胃给药l天，于末次给药后3分钟，将小鼠放入盛有15g钠石灰的广口瓶内，每次每组1只，用凡士林将瓶口密封，立即计时，以停止呼吸为标准小鼠存活时间；实验结束，称量小鼠体重、胸腺、脾、肾、肾上腺、子宫、卵巢、睾丸、精囊重量并计算各内脏系数。5.实验结果5.1对小鼠内脏系数的影响对小鼠内脏系数无明显影响，各给药组与模型组比较无显著性差异(P〉0.05)(见表29)。表29对小鼠内赃系数的影响(irg/10g，S±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>各给药组常压耐缺氧时间延长，较模型组差异极为显著，P〈0.01(见表31)表31对小鼠常压耐缺氧存活吋间的影响〔；±》<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>6.结论复方胶囊剂可提高机体的抗疲劳和抗应激能力，对肾虚有较好的治疗作用。四、本发明胶囊剂治疗AD的分子作用机制研究(一)、对beta淀粉样蛋白引起的神经细胞中尼古丁受体表达降低及细胞毒性损害的招抗作用1材料和主要化学试剂本发明胶囊剂。源于人脑的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)(购自GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures公司)。AP25—35(购自Sigma公司)。DMEM培养液(购自GibcoIntrovagen公司)。小牛血清(购自华美公司)。MTT比色法主要试剂(购自Sigma公司)。羊抗a3、a7及鼠抗b-肌动蛋白(b-Actin)多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自SantaCruzBiotechnology公司。聚乙烯二氟(PVDF)膜(购自Amersham公司)。ECL-Plus发光试剂(购自Amersham公司)。高效显影胶片(购自Amersham公司)。Trizol(购自Sigma公司)。丽LV逆转录酶、RNA酶抑制剂、无RNA酶的DNA酶(购自Premega公司)。OligodT、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP等(均购自上海生工公司)。TBA比色法试剂盒(购自南京建成公司)。其它化学试剂(均购自Sigma公司)。2方法2.1细胞培养用含10%小牛血清、双抗(青霉素25U/ml，链霉素25U/ml)的DMEM作为培养基，5%C02、饱和水汽、37'C恒温培养。2.2MTT比色法筛査中药安全浓度向96孔细胞培养板中加入一定数量(约1X10"孔)待检测细胞，待细胞生长稳定后加入本发明胶囊剂，终浓度分别为0mg/ml，0.005mg/ml，0.025mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，lmg/ml，5mg/ml，10mg/m，1培养24小时后测定MTT7K平。2.3细胞分组诱导及相应的药物干预(1)正常对照组不经药物处理，培养期为48小时。(2)Af3处理组在培养的细胞中力口入10uMAf325—35，培养时间为48小时(A{325—35用PBS溶解后，37。C孵育34小时)。(3)单纯VE处理组加入20yMVE，培养期为48小时。(4)VE和AP处理组先加入20yMVE培养24小时后，按照Ab处理组的方法处理。(5)单纯中药处理组加入中药培养48小时。(6)中药和Af3处理组先加入中药预培养24小时后，再按照Ab处理组方法进行处理。2.4药物处理后MTT还原率测定向96孔细胞培养板中，加入一定数量(约1X10"孔)待检测细胞，分组药物处理细胞后测定MTT水平。2.5尼古丁受体亚单位蛋白表达测定参照Guan等的方法进行提取细胞膜蛋白及用蛋白印迹(Westernblotting)方法检测尼古丁受体亚单位a3、a7亚单位蛋白水平。以Labworks软件分析结果时以{3-Actin蛋白条带作为内参照，计算a3、a7蛋白条带与e-Actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为a3、a7基因蛋白质表达的相对水平比。2.6尼古丁受体亚单位mRNA的表达水平测定Trizol法提取细胞总RNA，并用无RNA酶的DNA酶消化DNA杂质(按照试剂说明书进行)。采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定mRNA水平。用Labworks软件检测时以环孢素亲和素(Cyc)基因作为RT-PCR产物的内参照，计算a3、a7基因与Cyc基因扩增条带表达量像素灰度的百分比值作为a3、a7基因mRNA表达的相对水平。nAChR受体亚单位a3、a7和环孢素亲和素引物序列见表32。表32.RT-PCR引物序歹l」<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>收集培养神经细胞的培养液，测定丙二醛(脂质过氧化的中间产物)含量，操作按照试剂盒说明书进行。2.8统计学分析将每组所得结果用均数士标准差表示，结果用SPSS12.O统计软件进行单因素方差分析。3.结果3.1.中药安全浓度筛査本发明胶囊剂浓度〉0.5mg/ml时SH-SY5Y神经细胞MTT还原率出现下降趋势，浓度>lmg/ml时细胞MTT还原率明显降低，表明该浓度对细胞有毒性作用。因此选择O.25mg/ml作为本次研究本发明胶囊剂的安全浓度。3.2药物处理后MTT还原率测定药物处理后MTT还原率测定发现，10mMAf325—35处理细胞后引起MTT还原率明显降低；0.25mg/ml胶囊剂及20yMVE处理不影响细胞功能；而用胶囊剂及VE预处理细胞后可明显减弱Ab对细胞的毒性作用，Ae组与VE+Ae组和X+Af3组之间的差异有统计学意义(P〈0.01);胶囊剂与VE对抗Ab细胞毒性的作用强度类同，其间的差异无统计学意义。3.3尼古丁受体蛋白表达水平尼古丁受体a7和a3亚单位蛋白质表达水平半定量结果表明，10mMA{325—35处理细胞后引起尼古丁受体a7和a3亚单位蛋白质表达水平明显降低；单纯O.25mg/ml胶囊剂处理细胞可上调尼古丁受体a7亚单位蛋白质表达水平；而20yMVE处理不影响该受体蛋白水平；用胶囊剂及VE预处理细胞后可减弱Ab对细胞a7和a3亚单位蛋白质表达水平的下调作用，A{3組与ve+ae组和x+ae组之间的差异有统计学意义(p〈0.0l或p〈0.os);胶囊剂对抗ae降低a7亚单位蛋白质表达水平的作用强于VE，VE+A{3组与X+A{3组之间的差异有统计学意义(P〈0.05)。胶囊剂与VE对抗Ae引起的下调a3亚单位蛋白质表达水平作用类同，VE+A{3组与X+A{3组之间的差异无统计学意义。3.4尼古丁受体mRNA表达水平尼古丁受体a7和a3亚单位mRNA表达水平半定量结果表明，10mMA{325-35处理细胞后引起尼古丁受体a7和a3亚单位mRNA表达水平明显降低；0.25mg/ml胶囊剂和20yMVE处理不影响该受体mRNA表达水平；用胶囊剂及VE预处理细胞后可减弱Ab对细胞a7和a3亚单位mRNA表达水平的下调作用，Af3组与VE+Af3组和X+Af3组之间的差异有统计学意义(P〈0.01);胶囊剂与VE对抗A{3引起的a7亚单位mRNA表达水平下调作用相当，VE+A{3组与X+A{3组之间的差异无统计学意义。而用胶囊剂对抗A{3引起的a3亚单位无此作用，A{3组与X+A{3组之间的差异没有统计学意义，VE+Ae组与X+Af3组之间的差异有统计学意义(P〈0.05)。3.5脂质过氧化代谢产物MDA水平结果表明，10mM八{325-35处理细胞后引起细胞脂质过氧化水平明显升高；用0.25mg/ml胶囊剂和20yMVE处理不影响MDA含量；而胶囊剂和VE预处理细胞后可减弱Ab所引起的脂质过氧化水平升高，但是胶囊剂的此种作用比VE弱(表33)。表33.TBA法测定MDAG±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>4、结论安全浓度的胶囊剂对a7在蛋白质表达水平有上调作用；能对抗A{3引起的a3和a7尼古丁受体亚单位蛋白质水平降低及a7亚单位mRNA表达低下、但对a3亚单位无明显影响；能减弱AP引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高。提示胶囊剂能在蛋白质水平上调尼古丁受体a7亚单位，对抗A6引起的尼古丁受体表达降低及神经毒性作用。(二)、对SH-SY5Y神经细胞胆碱酯酶的影响1.材料与试剂复方胶囊齐U;SH-SY5Y细胞株购于GermanCollectionofMicro-organismsandCellCultures公司(德国)；小牛血清购自华美公司；DMEM培养基、无酚红DMEM培养基购自HyClone公司；A{3P42购自Sigma公司；考马斯亮蓝法蛋白定量试剂购自南京建成公司；胆碱酯酶测定试剂硫代乙酰胆碱(ATC)、硫代丁酰胆碱(BTC)、5，5'-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、BW284C51(AChE的抑制剂)、iso-0MPA(BuChE的抑制剂)，均购自Sigma公司；细胞蛋白提取试剂苯甲酰磺酰氟(PMSF)、复合蛋白酶抑制剂(Completecompletion)购自Sigma公司。2.细胞培养及分组处理细胞培养同上，当细胞长到培养瓶底约70。/。时换无酚红的DMEM处理12小时，再分为5组处理A组空白对照组；B组Af3单独处理组在培养的细胞中加入A{3p",其终浓度为10mmol/L，培养时间为48小时；C组复方制剂单独处理组，其终浓度为O.5g/L，培养24小时;D组先加复方制剂预处理再加Af3p42处理组先加复方制剂处理24小时后，再按照B组操作；E组先加Af3p42预处理再加复方制剂处理组先力QA{3P42处理48小时后，再按照C组操作。3.细胞蛋白定量细胞处理完毕时分别收集培养基及细胞于l.5mLEPP管中。往收集细胞的管中加入细胞裂解液约300mL及PMSF和复合蛋白酶抑制剂于冰上裂解l小时后离心40分钟(12000g，4°C)，收集上清，采用考马斯亮蓝法对各组细胞进行蛋白定量，按照试剂盒说明书进行操作。4.细胞培养基胆碱酯酶的测定ChE的测定参考Ellman比色法及参考文献，测定时使加入的培养基含有相同的蛋白质克数。5.统计学处理每组所得结果用^i^表示，结果用单因素方差分析方法进行统计分析，以P〈0.05认为差别有统计学意义。6.结果6.1各处理组AChE活性值A6i—42单独处理组AChE活性值(24.69±1.41nmolmin—1mL—4较空白对照组(16.86±0.41nmolmin—1mL—4升高46.44%，差别存在统计学意义(P〈0.05);先加复方胶囊剂再加A{3P42处理组(17.73±0.59nmolmin—1mL—4、先加A{3P42再加复方胶囊剂处理组(17.02±1.13nmolmin—1mL—4分别与AP42单独处理组相比，其AChE活性值分别降低39.26%、45.06%，差别存在统计学意义(P〈0.05);复方胶囊剂单独处理组(11.08±1.05nmolmin—1mL—4AChE活性值也较空白对照组降低，差别存在统计学意义(P〈0.05)。说明了复方制剂具有胆碱酯酶抑制剂的功能。6.2.各处理组BuChE活性值各处理组BuChE活性值分别为空白对照组ll.88±0.33nmolmin—1mL—、AP42单独处理组13.21±2.49nmolmin—1mL—、复方胶囊剂单独处理组IO.36±1.83nmolmin—1mL—、先加复方胶囊剂再加APi—42处理组12.45±2.54nmolmin—1mL—、先加AP1-42再加复方胶囊剂处理组10.98±0.93nmolmin—1mL—、而BuChE活性值在各组间差别无统计学意义(P>0.05)。7.结论复方胶囊剂能降低Ae诱导的类AD细胞AChE活性，具有类似胆碱酯酶抑制剂的功能。与现有技术相比，本发明在抗衰老保密经验方的基础上，以中医理论为指导，利用科学理论和先进技术，研制出了一种疗效好、毒副作用小的治疗老年痴呆的中药制剂，经实验研究证明，该中药制剂对AlCl3诱导的AD大鼠模型学习记忆能力有较好的改善作用，对AD有较好的防治作用，可提高机体的抗疲劳和抗应激能力，对肾虚有较好的治疗作用。对其治疗AD的分子作用机制研究发现，该中药能在蛋白质水平上调尼古丁受体a7亚单位，对抗AP引起的尼古丁受体表达降低及神经毒性作用，减弱AP引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高，降低A{3诱导的类AD细胞AChE活性。同时本发明还提供了一种适合工业生产的、优选的制备方法。具体实施方式实施例l:人参60g、炙黄芪120g、淫羊藿90g、延胡索90g、天麻120g、当归90g、制何首乌120g、黄精120g和石菖蒲120g制备方法(1)醇提取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用85%乙醇回流提取2次，每次2h，第一次加16倍量乙醇，第二次加14倍量乙醇，滤过，得醇提液，减压回收乙醇，药液备用；(2)水煮取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用水煎煮3次，每次2h，第一次加14倍量水，第二次和第三次各加12倍量水，滤过，滤液减压浓縮备用；(3)制剂成型合并醇提药液和水煮药液，浓縮至稠膏，于7(TC真空干燥，即得治疗老年痴呆的中药制剂的活性成分，在活性成分中加入淀粉适量，制粒，装胶囊，制成胶囊IOOO粒，每粒O.35g。功能主治补气健脑、扶正固本、开窍益智、活血化瘀；用于预防和治疗老年痴呆症所致记忆力减退。用法用量口服，一日3次，一次4粒。实施例2:人参50g、炙黄芪100g、淫羊藿100g、延胡索100g、天麻140g、当归80g、制何首乌100g、黄精100g和石菖蒲140g(1)醇提取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用20倍量85%乙醇回流提取1次，提取3h，滤过，得醇提液，减压回收乙醇，药液备用；(2)水煮取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用10倍量水煎煮3次，每次lh，滤过，滤液减压浓縮备用；(3)制剂成型合并醇提药液和水煮药液，浓縮至稠膏，于6(TC真空干燥，即得治疗老年痴呆的中药制剂的活性成分，在活性成分中加入辅料，混匀，压片，制成片剂1000片。用法用量口服，一日3次，每次4片。实施例3:人参70g、炙黄芪140g、淫羊藿80g、延胡索80g、天麻100g、当归100g、制何首乌140g、黄精140g和石菖蒲1000g(1)醇提取人参、天麻、炙黄芪、淫羊藿、延胡索五味药材用10倍量85%乙醇回流提取3次，每次lh，滤过，得醇提液，减压回收乙醇，药液备用；(2)水煮取当归、制何首乌、黄精、石菖蒲四味药材用16倍量水煎煮1次，煎煮3h，滤过，滤液减压浓縮备用；(3)制剂成型合并醇提药液和水煮药液，浓縮至稠膏，于8(TC真空干燥，即得治疗老年痴呆的中药制剂的活性成分，在活性成分中加入辅料，按常规工艺制成软胶囊1000粒。用法用量口服，一日3次，每次4粒。权利要求1.一种治疗老年痴呆的中药制剂，其特征在于按照重量份计算，它是由中药原料人参50～70份、炙黄芪100～140份、淫羊藿80～100份、延胡索80～100份、天麻100～140份、当归80～100份、制何首乌100～140份、黄精100～140份和石菖蒲100～140份制备而成。全文摘要本发明公开了一种治疗老年痴呆的中药制剂及其制备方法，它是由中药原料人参、炙黄芪、淫羊藿、延胡索、天麻、当归、制何首乌、黄精和石菖蒲经醇提、水煮工艺制备而成，本发明是以中医理论为指导，利用科学理论和先进技术，研制而出的一种疗效好、毒副作用小的治疗老年痴呆的中药制剂，经实验研究证明，该中药制剂对拟AD大鼠模型的学习记忆能力有较好的改善作用。同时，可提高机体的抗疲劳和抗应激能力，对肾虚有较好的治疗作用。此外本发明还提供了一种适合工业生产的、优选的制备方法。文档编号A61K36/8988GK101269179SQ20081030097公开日2008年9月24日申请日期2008年4月10日优先权日2008年4月10日发明者官志忠,俊罗,肖海涛,郝小燕,齐晓岚申请人:贵阳医学院